一种牛乳基配方乳粉中乳铁蛋白含量的测定方法

技术领域

本发明属于蛋白检测技术领域，具体而言，涉及一种牛乳基配方乳粉中乳铁蛋白含量的测定方法。

背景技术

乳铁蛋白(lactoferrin，Lf)是一种主要由乳腺上皮细胞分泌的非血红素铁结合糖蛋白，约占总乳蛋白的10％～20％。与酪蛋白和其他乳清蛋白成分相比，乳铁蛋白具有多种生物活性，如抗微生物、促进肠道发育、促进铁吸收、免疫调节等功能。近年来，乳铁蛋白作为天然化合物在疾病防治、营养补充、食品和药品开发等方面发挥重要作用，尤其是在酸奶、婴幼儿配方奶粉、保健品等产品所占比例较大，具有很高的营养价值。

GB14880—2012《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》中将其列为营养强化剂，允许在婴幼儿配方食品中使用，并规定其在婴幼儿配方食品中的使用限量为≤1.0g/kg。自此，乳铁蛋白被广泛添加到婴幼儿配方奶粉中，但是我国还没有建立相应的国家标准。目前，乳铁蛋白检测方法有反相高效液相色谱法、酶联免疫法、分光光度法和毛细管电泳分析法等。

反相高效液相色谱是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，可以检测蛋白质、多糖等大分子化合物，具有高分离度和高检测灵敏度，但对样品纯度要求较高，检测结果的重复性差。酶联免疫法具有样品分离效果好、方法检测限低、灵敏度高等特点，但所用试剂盒价格较高，不适合长期大量检测乳铁蛋白。紫外分光光度法检测步骤简单、容易操作，但准确度较差。高效毛细管电泳法是在样品经脱脂、酸法去除酪蛋白和硫酸铵沉淀富集、纤维素滤膜过滤净化等方法进行预处理后，采用毛细管电泳仪进行分离检测，检测成本不高，前期准备简单，但乳铁蛋白分离效果不佳，易导致结果重复性差，色谱带宽，样品回收率低。因此，婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白的分析一直是一项具有挑战性的工作，故针对婴幼儿配方食品中乳铁蛋白的高效、准确的检测方法的研究对其应用具有重要意义。。

发明内容

本发明首先涉及一种牛乳基配方乳粉中乳铁蛋白检测方法，包括如下步骤：

(1)试样中的乳铁蛋白首先经磷酸盐缓冲液提取得样品提取液，样品提取液用肝素亲和柱净化，洗脱液洗脱后得到具有活性的乳铁蛋白洗脱液；

(2)二硫苏糖醇还原，碘乙酰胺烷基化，酶解；

(3)酶解液经MonoSpin C18小柱脱盐后，液相色谱-串联质谱正离子模式测定，内标法定量。

所述磷酸盐缓冲液是将十二水合磷酸氢二钠，二水合磷酸二氢钠和乳铁蛋白提取试剂溶解于水制得。

所述乳铁蛋白提取试剂为表面活性剂，成分为氯化钠和吐温20的混合水溶液，能够降低肝素亲和柱的非特异性吸附，增强肝素和乳铁蛋白的特异性结合，同时对乳铁蛋白具有保护作用。

所述洗脱液是将十二水合磷酸氢二钠，二水合磷酸二氢钠和氯化钠溶解于水制得。

优选的，

步骤(1)中，

试样与磷酸盐缓冲液用量比为1g：20～40mL，提取步骤为：在4℃，12000r/min条件下离心10min，立即吸取中间层，取其中的5～10mL作为样品提取液；

步骤(2)中，

使用胰蛋白酶进行酶解，酶解条件为37℃条件下酶解2～6h；

步骤(3)的流程为，

1)将MonoSpin C18脱盐柱置于2mL离心管中，分别加入200μL乙腈和200μL0.1％甲酸进行活化，2300g条件下离心1min；

2)将酶解液全部加入柱中，使用同体积的碳酸氢铵溶液洗涤孔板3遍(总上样量在400～800μL)，2300g条件下离心2min，使柱子充分吸附肽段；

3)添加200μL0.1％甲酸进行清洗，2,300×g条件下离心1min；

4)将MonoSpin C18脱盐柱移至新的1.5mL离心管中，添加100～400μL60％乙腈洗脱酶解肽段，2300g条件下离心2min，收集滤液待用；

5)脱盐后试样经甲酸水-乙腈溶液稀释后，添加内标工作液进行LC-MS/MS测定。

液相条件(液相系统为CORUI SMYG高效液相色谱)：

1)梯度洗脱程序：

0～1.0min，流动相A90％，流动相B10％；

1.0～4.0min，流动相A65％，流动相B35％；

4.0～4.1min，流动相A10％，流动相B90％；

4.1～4.5min，流动相A10％，流动相B90％；

4.5～4.6min，流动相A90％，流动相B10％；

4.6～6.0min，流动相A90％，流动相B10％；

所述流动相A为质量浓度0.1％甲酸水；所述流动相B为0.1％甲酸乙腈；

柱温：25℃；

进样体积：5μL；

流速：0.35mL/min；

质谱条件(质谱系统为AB SCIEX 6500串联质谱)：

离子源：电喷雾离子源；

扫描方式：正离子扫描；

检测方式：多反应离子监测(MRM)；

脱溶剂气、锥孔气及碰撞气均为高纯氮气或其他合适气体；

更进一步的，

所述乳铁蛋白含量＝(液相色谱串联质谱检测的上机检测浓度×5000(肝素亲和柱的洗脱体积)×稀释倍数×82620(乳铁蛋白的相对分子质量)×100)/(肝素亲和柱的上样液中样品质量×10^9)mg/100g。

内标标准肽段1：SFQLFGSPPGQ*R，

内标标准肽段2：GSNFQLDQLQG*R，

其中，*R＝(

本发明的有益效果在于，

本发明的目的在于提供一种乳铁蛋白的检测方法，具有准确度好、特异性强和灵敏度高等特点，可用于牛乳基婴幼儿配方奶粉中的乳铁蛋白含量的测定，具体的，

(1)乳铁蛋白提取试剂为表面活性剂，能够降低肝素亲和柱的非特异性吸附，增强肝素和乳铁蛋白的特异性结合，同时对乳铁蛋白具有保护作用。

(2)为解决了肝素柱洗脱液与质谱方法不兼容的问题，选用MonoSpin C18小柱进行脱盐。

(3)本发明选用的肝素柱可与乳铁蛋白特异性吸附，能有效排除杂蛋白的干扰，实现对样本中乳铁蛋白的富集和检测，可用于样品中具有活性的完整乳铁蛋白含量测定；肝素柱对变性蛋白和肽段无特异性吸附，结合肝素柱的使用，可以扩大产品的应用范围；MonoSpin C18小柱可有效解决了肝素柱吸附与质谱方法不兼容的问题；仪器分析时长为6min，有通量优势。

(4)本发明提供的乳铁蛋白检测方法具有较高的线性范围，回收率在96.05％～108.47％，结果稳定，精密度在4.77％～5.75％。

附图说明

图1、肽段SFQLFGSPPGQR工作曲线。

图2、肽段GSNFQLDQLQGR工作曲线。

图3、乳铁蛋白肽段SFQLFGSPPGQR标准色谱图(0.08pmol/μL)(上图：乳铁蛋白提取离子流图；中图：乳铁蛋白肽段SFQLFGSPPGQR提取离子流图；下图：乳铁蛋白内标肽段SFQLFGSPPGQ*R提取离子流图)。

图4、乳铁蛋白肽段GSNFQLDQLQGR标准色谱图(0.08pmol/μL)(上图：乳铁蛋白提取离子流图；中图：乳铁蛋白肽段GSNFQLDQLQGR提取离子流图；下图：乳铁蛋白内标肽段GSNFQLDQLQG*R提取离子流图)。

具体实施方式

本发明提供了一种乳铁蛋白检测方法，方法步骤为：

(1)试样中的乳铁蛋白首先经磷酸盐缓冲液提取，肝素亲和柱净化，洗脱液洗脱后得到具有活性的完整乳铁蛋白；

(2)经二硫苏糖醇还原，碘乙酰胺烷基化，酶解；

(3)酶解液经MonoSpin C18小柱脱盐后，液相色谱-串联质谱正离子模式测定，内标法定量。

磷酸盐缓冲液(结合缓冲液)的配置：30.083g十二水合磷酸氢二钠，2.496g二水合磷酸二氢钠，20mL50x乳铁蛋白提取试剂(来自肝素亲和柱试剂盒，美正生物科技公司，QC0140)，定容至1000mL即得到乳铁蛋白提取用结合缓冲液。

洗脱液的配置：7.52g十二水合磷酸氢二钠，0.624g二水合磷酸二氢钠，29.2g氯化钠，加入400mL去离子水溶解，最后定容至500mL。

样品制备(亲和层析处理)：称取1g试样，准确称取1.0g(±0.05g)试样，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至40mL，涡旋振荡至样本全部溶解，然后在4℃，12000r/min条件离心10min，立即轻轻取出中间层，取其中的10mL作为样品液。上样完成后，向肝素亲和柱(美正生物科技公司，QC0140)内加入5mL洗脱液，全部收集5mL洗脱液。

二硫苏糖醇溶液(DTT)：准确称取0.028g二硫苏糖醇，溶于2mL水中，用于蛋白质中二硫键的还原，需现用现配。

碘乙酰胺溶液(IAA)：准确称取0.074g碘乙酰胺，溶于2mL水中，用于蛋白组学中半胱氨酸和组氨酸的烷基化，需现用现配，避光处理。

样品制备(酶解)：取500μL洗脱液于2mL离心管中，加入40μL DTT，涡旋混合，于60±2℃水浴中加热30min，冷却至室温后再加入40μL IAA，涡旋混合，避光反应30min。取20μL反应后试样于96孔板中，加入60μL碳酸氢铵溶液与40μL胰蛋白酶，混匀，37±2℃恒温酶解2h。

样品制备(C18脱盐)：将MonoSpin C18脱盐柱置于2mL离心管中，分别加入200μL乙腈和200μL0.1％甲酸进行活化，2,300×g条件下离心1min；将120μL酶解液全部加入柱中，使用同体积的碳酸氢铵溶液洗涤孔板3遍(上样量共480μL)，2,300×g条件下离心2min，使柱子充分吸附肽段；添加200μL0.1％甲酸进行清洗，2,300×g条件下离心1min；将MonoSpinC18脱盐柱移至新的1.5mL离心管中，添加120μL60％乙腈洗脱酶解肽段，2,300×g条件下离心2min。

样品制备(液相色谱)：条件包括：梯度洗脱程序：0～1.0min，流动相A90％，流动相B10％；1.0～4.0min，流动相A65％，流动相B35％；4.0～4.1min，流动相A10％，流动相B90％；4.1～4.5min，流动相A10％，流动相B90％；4.5～4.6min，流动相A90％，流动相B10％；4.6～6.0min，流动相A90％，流动相B10％。所述流动相A为质量浓度0.1％甲酸水；所述流动相B为0.1％甲酸乙腈。

液相色谱检测的条件还包括：柱温：25℃；进样体积：5μL；流速：0.35mL/min。色谱柱：Phenomenex2.1×50mm，1.3μm，C18。

样品制备(质谱)：质谱条件包括：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应离子监测(MRM)；脱溶剂气、锥孔气及碰撞气均为高纯氮气或其他合适气体。

乳铁蛋白的标准曲线的建立过程包括：

标准肽段1：SFQLFGSPPGQR，纯度≥95％；

标准肽段2：GSNFQLDQLQGR，纯度≥95％；

内标标准肽段1：SFQLFGSPPGQ*R，*R＝(

内标标准肽段2：GSNFQLDQLQG*R，*R＝(

表1标准肽段和内标肽段特征离子参考质谱条件

标准贮备液：精密称定标准肽段1、2与内标标准肽段1、2，用甲酸水-乙腈溶解并稀释至刻度，配制成浓度为100pmol/μL的标准肽段和内标标准肽段贮备液，-20℃以下保存，有效期12个月。

标准中间液：精密量取标准肽段和内标标准肽段贮备液各1mL于10mL容量瓶中，用甲酸水-乙腈稀释至刻度，配制成浓度为10pmol/μL的标准中间液，-20℃以下保存，有效期6个月。

标准工作液：分别精密量取上述标准中间液各1mL于10mL容量瓶中，用甲酸水-乙腈稀释至刻度，配制成浓度为1pmol/μL的标准工作液。2～8℃保存，有效期1周。

表2、标准曲线的配制

准确移取如下表2各标准工作液与内标工作液，用甲酸水-乙腈溶液定容至1.0mL，得各肽段的浓度为0.0002、0.0004、0.0008、0.002、0.008、0.016、0.04和0.08pmol/μL，相当于2.5、5、10、25、100、200、500和1000mg/100g，供液相色谱串联质谱测定，以浓度为横坐标，标准与内标的峰面积比值为纵坐标进行线性拟合获得线性回归曲线与方程，每个浓度点独立3次实验，标准曲线结果如下图1、图2所示。

由图1可知，肽段SFQLFGSPPGQR的线性方程为y＝12x+0.00104，r

由图2可知，肽段GSNFQLDQLQGR的线性方程为y＝11.9x+0.000891，r

乳铁蛋白含量＝(液相色谱串联质谱检测的上机检测浓度×5000(肝素亲和柱的洗脱体积)×稀释倍数×82620(乳铁蛋白的相对分子质量)×100)/(肝素亲和柱的上样液中样品质量×10^9)mg/100g。

取脱盐后试样50μL，加入100μL甲酸水-乙腈溶液与150μL 0.2pmol/μL内标工作液，进行稀释。

稀释倍数＝(还原/烷基化的总样品量(580μL)×酶解后的总样品量(120μL)×脱盐后总样品量(120μL)×最终稀释后的总样品量(300μL))/(用于还原/烷基化的样品量(500μL)×用于酶解的试样体积(20μL)×脱盐前样品量(120μL)×用于最终稀释的试样体积(50μL))＝41.76。

牛乳铁蛋白加标回收率见表3、精密度实验结果见表4。

表3牛乳铁蛋白加标回收率实验结果

表4牛乳铁蛋白精密度实验结果

实施例1、市售婴幼配方奶粉乳铁蛋白检测

将不同品牌的市售婴幼配方奶粉(美赞臣幼儿配方奶粉(12-36)月龄

美赞臣儿童配方奶粉、金领冠幼儿配方奶粉(12-36)月龄)，分别称1.0g(精确至0.01g)于50mL离心管中，分别加入结合缓冲液定容至40mL后混匀；然后在4℃，12000r/min条件离心10min，离心后用10mL移液器将中间层液体部分吸出，取10mL作为上样液上样肝素亲和柱，用4mL洗脱液洗脱。

取500μL洗脱液于2mL离心管中，加入40μL DTT，涡旋混合，于60±2℃水浴中加热30min，冷却至室温后再加入40μL IAA，涡旋混合，避光反应30min。取20μL反应后试样于96孔板中，加入60μL碳酸氢铵溶液与40μL胰蛋白酶，混匀，37±2℃恒温酶解2h。

将MonoSpin C18脱盐柱置于2mL离心管中，分别加入200μL乙腈和200μL0.1％甲酸进行活化，2,300×g条件下离心1min；将120μL酶解液全部加入柱中，使用同体积的碳酸氢铵溶液洗涤孔板3遍(上样量共480μL)，2,300×g条件下离心2min，使柱子充分吸附肽段；添加200μL0.1％甲酸进行清洗，2,300×g条件下离心1min；将MonoSpin C18脱盐柱移至新的1.5mL离心管中，添加120μL60％乙腈洗脱酶解肽段，2,300×g条件下离心2min。

取脱盐后试样50μL，加入100μL甲酸水-乙腈溶液与150μL 0.2pmol/μL内标工作液，进行稀释。稀释后进行LC-MS/MS测定，所得结果见表5。

表5、不同品牌婴幼配粉的检测结果

实施例2、奶粉加热后乳铁蛋白检测

称取1.0g(精确至0.01g)奶粉于50mL离心管中，分别加入结合缓冲液定容至40mL后混匀；

取500μL洗脱液于2mL离心管中，加入40μL DTT，涡旋混合，于60±2℃水浴中加热30min，冷却至室温后再加入40μL IAA，涡旋混合，避光反应30min。取20μL反应后试样于96孔板中，加入60μL碳酸氢铵溶液与40μL胰蛋白酶，混匀，37±2℃恒温酶解2h。

将MonoSpin C18脱盐柱置于2mL离心管中，分别加入200μL乙腈和200μL0.1％甲酸进行活化，2,300×g条件下离心1min；将120μL酶解液全部加入柱中，使用同体积的碳酸氢铵溶液洗涤孔板3遍(上样量共480μL)，2,300×g条件下离心2min，使柱子充分吸附肽段；添加200μL0.1％甲酸进行清洗，2,300×g条件下离心1min；将MonoSpin C18脱盐柱移至新的1.5mL离心管中，添加120μL60％乙腈洗脱酶解肽段，2,300×g条件下离心2min。

取脱盐后试样50μL，加入100μL甲酸水-乙腈溶液与150μL 0.2pmol/μL内标工作液，进行稀释。稀释后进行LC-MS/MS测定，所得结果见表6。

表6婴幼配粉失活前后的检测结果

实施例3、水解奶粉乳铁蛋白检测

称取1.0g(精确至0.01g)水解奶粉(为经水解蛋白工艺处理的配方奶粉，给过敏婴儿食用)于50mL离心管中，分别加入结合缓冲液定容至40mL后混匀；然后在4℃，12000r/min条件离心10min，离心后用10mL移液器将中间层液体部分吸出，取10mL作为上样液上样肝素亲和柱，用4mL洗脱液洗脱。

取500μL洗脱液于2mL离心管中，加入40μL DTT，涡旋混合，于60±2℃水浴中加热30min，冷却至室温后再加入40μL IAA，涡旋混合，避光反应30min。取20μL反应后试样于96孔板中，加入60μL碳酸氢铵溶液与40μL胰蛋白酶，混匀，37±2℃恒温酶解2h。

MonoSpin C18脱盐柱置于2mL离心管中，分别加入200μL乙腈和200μL0.1％甲酸进行活化，2,300×g条件下离心1min；将120μL酶解液全部加入柱中，使用同体积的碳酸氢铵溶液洗涤孔板3遍(上样量共480μL)，2,300×g条件下离心2min，使柱子充分吸附肽段；添加200μL0.1％甲酸进行清洗，2,300×g条件下离心1min；将MonoSpin C18脱盐柱移至新的1.5mL离心管中，添加120μL60％乙腈洗脱酶解肽段，2,300×g条件下离心2min。

取脱盐后试样50μL，加入100μL甲酸水-乙腈溶液与150μL 0.2pmol/μL内标工作液，进行稀释。稀释后进行LC-MS/MS测定，所得结果见表7。

表7、不同品牌婴幼配粉水解后的检测结果

实施例4、婴幼配粉脱盐前后的乳铁蛋白检测结果

称取1.0g(精确至0.01g)奶粉于50mL离心管中，分别加入结合缓冲液定容至40mL后混匀；然后在4℃，12000r/min条件离心10min，离心后用10mL移液器将中间层液体部分吸出，取10mL作为上样液上样肝素亲和柱，用4mL洗脱液洗脱。

取500μL洗脱液于2mL离心管中，加入40μL DTT，涡旋混合，于60±2℃水浴中加热30min，冷却至室温后再加入40μL IAA，涡旋混合，避光反应30min。取20μL反应后试样于96孔板中，加入60μL碳酸氢铵溶液与40μL胰蛋白酶，混匀，37±2℃恒温酶解2h。

将MonoSpin C18脱盐柱置于2mL离心管中，分别加入200μL乙腈和200μL0.1％甲酸进行活化，2,300×g条件下离心1min；将120μL酶解液全部加入柱中，使用同体积的碳酸氢铵溶液洗涤孔板3遍(上样量共480μL)，2,300×g条件下离心2min，使柱子充分吸附肽段；添加200μL0.1％甲酸进行清洗，2,300×g条件下离心1min；将MonoSpin C18脱盐柱移至新的1.5mL离心管中，添加120μL60％乙腈洗脱酶解肽段，2,300×g条件下离心2min。

取脱盐后试样50μL，加入100μL甲酸水-乙腈溶液与150μL 0.2pmol/μL内标工作液，进行稀释。稀释后进行LC-MS/MS测定，所得结果见表8。

表8、婴幼配粉脱盐前后的检测结果

由以上实施例可以看出，本发明选用的肝素柱可与乳铁蛋白特异性吸附，能有效排除杂蛋白的干扰，实现对样本中乳铁蛋白的富集和检测，可用于样品中具有活性的完整乳铁蛋白含量测定，测定结果更接近标定值；

肝素柱对变性蛋白和肽段无特异性吸附，结合肝素柱的使用，可以扩大产品的应用范围；MonoSpin C18小柱可有效解决了肝素柱吸附与质谱方法不兼容的问题，且不影响定量；仪器分析时长为6min，有通量优势。

最后需要说明的是，以上实施例，仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。