L-酪氨酸的分离纯化方法及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，具体而言，涉及L-酪氨酸的分离纯化方法及其制备方法。

背景技术

L-酪氨酸(L-tyrosine)，一种含有酚羟基的芳香族极性α-氨基酸，分子量：181.18900，CAS号：60-18-4，白色有光泽细小针状结晶，无臭、味苦，难溶于水(0.04％,25℃)，342～344℃时分解，不溶于无水乙醇、乙醚和丙酮，可溶于稀酸或稀碱。等电点5.66，比旋光度(°)：[α]D22－10.6°(C＝4，1mol/L盐酸中)，[α]D18－13.2°(C＝4，3mol/L氢氧化钠溶液中)。酪氨酸为非必需氨基酸，是机体多种生成物的原料，酪氨酸在体内可通过不同代谢途径转化为多种生理物质，酪氨酸的缺乏会导致智能下降、尿黑症、白化病等症状，因此酪氨酸在医药、食品、化工等行业具有广泛应用。

随着酪氨酸的广泛应用，酪氨酸的生产规模逐渐增大，酪氨酸生产中的缺陷也被放大，严重制约着酪氨酸生产的可持续发展。目前酪氨酸的生产方式主要有：传统的蛋白水解提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶法。提取法是以干酪素、动物的毛发、蹄壳、角等天然蛋白质资源为原料，酸解碱中和，碱溶等电点结晶，这就必然导致其原料成本高、来源有限、生产周期长、环境污染大。化学合成法不能直接合成L-酪氨酸，需由DL-酪氨酸进一步经过光学拆分，这就必然导致其生产条件严苛，能源消耗大，生产规模小，工业化程度不高。微生物发酵法，是通过谷氨酸棒杆菌优良变异株对糖蜜等廉价碳源进行发酵获得L-酪氨酸，优良菌株的筛选和稳定是制约其发展的限制性因素。酶法是β-酪氨酸酶将苯酚-丙酮酸-氨或苯酚-L-丝氨酸等底物转化成L-酪氨酸的反应，虽然毒性大且腐蚀性强的苯酚使得该方法的发展受到制约，但高转化率、高收率、工艺的易操作性、规模化生产的高可行性等优点使得酶法生产L-酪氨酸的方式依然不可小觑。

现有技术中，酶法生产L-酪氨酸的发酵液杂质主要为菌体，蛋白和色素、底物。纯化重点均在反复等电点结晶，工艺虽然简单，但过程繁杂，酸碱使用量极大，产出废水多，底物苯酚未处理，环境污染问题严重，收率较低且L-酪氨酸品质不高。鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供L-酪氨酸的分离纯化方法及其制备方法。本发明实施例提供的分离纯化方法高效低污染，具体其不仅能直接分离提取得到L-酪氨酸且生产排放的废水实现了零酸排放零和苯酚排放。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供一种L-酪氨酸的分离纯化方法，包括：(1)将含有L-酪氨酸的发酵液和酸混合并加热，使得L-酪氨酸完全溶解；

(2)继续加热至蛋白完全变性；

(3)加入活性炭，保持温度搅拌后过滤形成澄清液；

(4)保持所述澄清液的温度，并调节所述澄清液的pH至1-5.66后降温析晶；

(5)过滤形成L-酪氨酸晶体和母液；

(6)将所述母液进行纳滤分别形成含苯酚和L-酪氨酸的截留液和通过液；

将所述通过液进行反渗浓缩形成清液和含酸的反渗浓缩液；

其中，所述清液循环至纳滤或者反渗中用作清洗液(即顶水液)也可以循环至前端工艺的析晶的清洗等，所述反渗浓缩液循环至步骤(1)用于溶解L-酪氨酸；

(7)将步骤(6)的所述截留液通过大孔吸附树脂形成含L-酪氨酸的穿出液，所述穿出液用于发酵制备L-酪氨酸的发酵装置的润洗；

对大孔吸附树脂进行洗脱后浓缩洗脱液形成含苯酚的洗脱浓缩液，所述洗脱浓缩液循环至于制备L-酪氨酸的发酵端进行使用。

在可选的实施方式中，步骤(1)中加热的温度为60-80℃，所述发酵液和所述酸的质量体积比为：1:1-1:1.4；所述酸为无机酸，优选为盐酸。

在可选的实施方式中，步骤(2)中继续加热的时间为1-2小时。

在可选的实施方式中，步骤(3)中活性炭的用量为发酵液质量的10-30倍，保持温度搅拌的时间为0.5-1小时。

在可选的实施方式中，步骤(4)中调节pH采用的物质为碱液，优选为氢氧化物溶液或者氨水，优选为氢氧化钠溶液；

优选地，氢氧化钠溶液的浓度为300-500g/L，所述碱液的流加速率为200-500ml/min；

优选地，降温至8-12℃析晶，降温速率为20-30℃/h。

在可选的实施方式中，对步骤(5)过滤形成的L-酪氨酸晶体进行依次进行洗晶、固液分离和干燥，

优选地，步骤(5)的过滤和上述固液分离均采用的是板框式过滤，板框压力为0.8-1.0MPa；

优选地，固液分离后的L-酪氨酸晶体的含水≤10％；

优选地，干燥条件为：温度为60-80℃，真空度为-0.098Mpa。

在可选的实施方式中，步骤(6)中纳滤的压力为0.1-0.2Mpa，通量为200-450L/h；

反渗浓缩的压力为0.2-0.4Mpa，通量为200-250L/h；

优选地，步骤(6)纳滤采用的纳滤膜为分子量为50-70D的卷式纳滤膜。

在可选的实施方式中，步骤(7)中大孔吸附树脂选择SD300、XDA8G和D101中任意一者；

步骤(7)中洗脱大孔吸附树脂采用的溶剂为醇类溶剂，优选为乙醇，优选为20-25％乙醇。

在可选的实施方式中，步骤(1)中采用的发酵液是发酵后未经过任何处理的发酵产物。

第二方面，本发明提供一种L-酪氨酸的制备方法，包括前述实施方式任一项所述的L-酪氨酸的分离纯化方法。

本发明具有以下有益效果：本发明实施例通过采用1次结晶和膜脱酸、反渗除水、树脂吸附苯酚-回收的连用技术，减少了酸耗量，上述过程的酸水分离和酸、水循环使用，实现了纯化过程废水0排放，苯酚的回收使用实现了苯酚0排放，且分离纯化得到的L-酪氨酸品质好，收率高，可广泛用在医药、食品、化工、日化等领域。具体地，本发明实施例的分离纯化具体以下优点：

(1)酸溶过程中加热，保证L-酪氨酸溶解充分的同时，减少了酸耗量，同时也减少了后期碱调结晶的碱耗量。

(2)酸环境下的持续高温加热，保证了酸溶液中的蛋白变性完全，降低溶液黏度，有利于活性炭的滤除以及成品透光度的提升，也为实现1次结晶得成品提供了物质基础。

(3)纳滤-反渗-大孔树脂的联用使得L-酪氨酸和苯酚等其他成分、盐酸、水的有效分离，实现了盐酸和水、苯酚的0排放。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例提供一种L-酪氨酸的分离纯化方法，包括：

(1)将含有L-酪氨酸的发酵液和酸混合并加热，使得L-酪氨酸完全溶解。

需要说明的是，发酵液和酸混合并加热可以是二者先混合而后再加热二者的混合液，也可以是加热发酵液而后流加酸。本发明实施例采用的是，发酵液搅拌加热，流加酸直至L-酪氨酸完全溶解，而后停止加酸。

上述发酵液可以是发酵后未经过任何处理的发酵产物，也可以是发酵后经过简单的后处理的发酵产物粗品，本发明实施例中采用的发酵液来自于杭州唯铂莱生物科技有限公司的L-酪氨酸发酵产物48-60kg，测定其中苯酚残余量约为600-1800g、L-酪氨酸含量为40-60kg。本发明实施例采用的发酵液仅仅是一种举例，并不限于该发酵液。

上述步骤(1)中采用的酸为无机酸，例如可以为盐酸、硫酸等。只要其可以使得L-酪氨酸溶解，且不会与发酵液中的溶质反应形成杂质的酸均可。本发明实施例采用的是盐酸，例如为37％的稀盐酸。

加热的温度为60-80℃，例如为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃以及80℃等60-80℃之间的任意数值。加热加酸溶解L-酪氨酸能够减少酸的使用量。

发酵液(w/kg))和所述酸(V/L)的质量体积比为：1:1-1:1.4，例如为，1:1、1:2、1:3和1:4等1:1-1:4之间的任意数值。

(2)继续加热至蛋白完全变性；

具体地，L-酪氨酸完全溶解后，停止加酸，而后再继续加热至蛋白完全变性。可以采用高液分析加酸后的发酵液判断蛋白是否完全絮凝，一般持续加热1-2小时，发酵液中的蛋白能够完全絮凝。

(3)加入活性炭，保持温度搅拌后过滤形成澄清液；

具体地，加入活性炭搅拌，以吸附色素和变性蛋白，且搅拌吸附过程中保持高温防止L-酪氨酸析出。

其中，活性炭的用量与发酵的液质量比为1：10-1：30，例如为1:10、1:15、1：20、1:25以及1:30等1:10-1:30之间任意数值，保持温度搅拌的时间为0.5-1小时，例如为30分钟、45分钟以及1小时等0.5-1小时之间的任意数值。

过滤时也依然保持含活性炭的发酵液的温度，防止L-酪氨酸溶出，过滤可以采用现有的固液分离方式，本发明实施例采用的将含活性炭的发酵液流经预涂助滤剂的衬氟板框，压滤除炭，得到澄清液，该澄清液中蛋白去除量≥98％，透光度T≥99.0％。

(4)保持所述澄清液的温度，并调节所述澄清液的pH至1-5.66后降温析晶；

具体地，将上述澄清液引入结晶罐，并始终保持澄清液的温度，而后缓速流加调节pH的物质，使得pH为1-5.66，例如为1、2、3、4、5、5.5以及5.66等1-5.66之间的任意数值。

其中，调节pH采用的物质为碱液，优选为氢氧化物溶液或者氨水，优选为氢氧化钠溶液；氢氧化钠溶液的浓度为300-500g/L，例如为350g/L、400g/L、450g/L以及500g/L等300-500g/L之间的任意数值；所述碱液的流加速率为200-500ml/min；例如为200ml/min、250ml/min、300ml/min、350ml/min、400ml/min、450ml/min以及500ml/min等200-500ml/min之间的任意数值。且搅拌速度为30-45rpm，例如为30rpm、32rpm、35rpm、38rpm、40rpm和45rpm等30-45rpm之间的任意数值。

调节至所需pH后，降温析晶，具体是降温至8-12℃，例如8℃、9℃、10℃、11℃以及12℃等8-12℃之间的任意数值，其中降温速率为20-30℃/h，例如为20℃/h、21℃/h、22℃/h、23℃/h、24℃/h、25℃/h、26℃/h、27℃/h、28℃/h、29℃/h以及30℃/h等20-30℃/h之间的任意数值。

(5)过滤形成L-酪氨酸晶体和母液；

具体地，析晶后进行过滤，例如采用板框式过滤进行固液分离，形成的L-酪氨酸晶体采用1-2倍纯水清洗，每次清洗后再采用板框式过滤进行固液分离。其中，固液分离的板框压力为0.8-1.0MPa，例如为0.8MPa、0.85MPa、0.9MPa、0.95MPa以及1.0MPa等0.8-1.0MPa之间的任意数值。

且洗晶并分离后的晶体的含水≤10％；上述晶体再进行干燥，例如真空干燥，干燥条件为：温度为60-80℃，真空度为-0.098Mpa。例如温度为60℃、65℃、70℃、75℃以及80℃等60-80℃之间的任意数值。

本发明实施例仅通过1次结晶便能分离纯化得到成品，且成品的纯度≥99.9％，透光度T≥95.0％，收率≥95％。

而过滤形成的母液与上述洗晶后固液分离得到的洗晶水混合，并等待下一步处理。

(6)将上述母液进行纳滤分别形成含苯酚和L-酪氨酸的截留液和通过液；其中，将所述通过液进行反渗浓缩形成清液和含酸的反渗浓缩液；其中，所述清液循环至纳滤中用作顶水液，所述反渗浓缩液循环至步骤(1)用于溶解L-酪氨酸。

具体地，将上述母液和洗晶水的混合溶液进入分子量为50D或者70D的卷式纳滤膜中，通过纳滤膜的通过液串联至反渗膜进一步酸水分离，提高盐酸的浓度和纯度，使得反渗浓缩液循环至步骤(1)用于溶解L-酪氨酸。同时，通过反渗膜的清液返回至卷式纳滤膜中用作顶水液进行稀释顶水。

其中，纳滤的压力为0.1-0.2Mpa，例如为0.1MPa、0.15MPa以及0.2MPa等0.1-0.2MPa之间的任意数值。通量为200-450L/h；例如为200L/h、250L/h、300L/h、350L/h、400L/h以及450L/h等200-450L/h之间的任意数值。

反渗浓缩的压力为0.2-0.4Mpa，例如为0.2MPa、0.25MPa、0.3MPa、0.35MPa和0.4MPa等0.2-0.4MPa之间的任意数值。通量为200-250L/h；200L/h、210L/h、220L/h、230L/h、240L/h以及250L/h等200-250L/h之间的任意数值。

(7)将步骤(6)的所述截留液通过大孔吸附树脂形成含L-酪氨酸的穿出液，所述穿出液用于发酵制备L-酪氨酸的发酵装置的润洗；

具体地，将上述步骤(6)的所述截留液通过大孔吸附树脂，截留液中的苯酚被大孔吸附树脂吸附，而L-酪氨酸则通过大孔吸附树脂形成含L-酪氨酸的穿出液，该穿出液用于发酵制备L-酪氨酸的发酵装置的润洗，以增加样品收率。

其中，大孔吸附树脂选择SD300、XDA8G和D101中任意一者。

对大孔吸附树脂进行洗脱后浓缩洗脱液形成含苯酚的洗脱浓缩液，所述洗脱浓缩液循环至于制备L-酪氨酸的发酵端进行使用。

具体地，利用醇类溶剂，例如20-25％乙醇对大孔吸附树脂进行洗脱，使得苯酚被洗脱至乙醇中，而后对洗脱液进行浓缩去除乙醇，回收乙醇并形成含苯酚的洗脱浓缩液，所述洗脱浓缩液循环至于制备L-酪氨酸的发酵端进行二次利用。

本发明实施例提供的分离纯化方法提高酶催化生产L-酪氨酸的纯化效率和减少纯化过程中的酸水、苯酚排放，具体地，本发明实施例仅通过一次结晶、纳滤-反渗-大孔吸附树脂联用能够真正实现纯化或生产过程中盐酸和水、苯酚的0排放，且成品的收率和纯度均高，成品纯度≥99.9％，收率≥95％。

虽然本发明实施例提供的L-酪氨酸的分离纯化方法得到的L-酪氨酸的纯度相对现有分离纯化的纯度98.2％提升了1.5％左右，收率提升了5％，但是本领域技术人员公知，当成品的纯度达到一定程度时，成品的纯度极难提升，因此，即使纯度提升1.5％也是极为困难的。同理当成品的收率达到一定程度时，成品的收率极难提升，因此，即使收率提升5％也是极为困难的。对于纯度和收率的提升而言，由于杂质(如小分子蛋白质等)不能完全去除，部分小分子杂质可以同所需的产品一同通过相应的过滤筛选，因此会导致产物在高纯度的情况下，其纯度及收率进一步提升比较困难，但是，本发明中的脱色除蛋白及后续的多个步骤(如高温、纳滤、树脂吸附等)，均有利于杂质的进一步去除，实现了在产品高纯度的情况下，纯度及其收率进一步提升的目标。

本发明实施例还提供一种L-酪氨酸的制备方法，包括前述实施方式任一项所述的L-酪氨酸的分离纯化方法。

对于L-酪氨酸成品品质检测，本发明实施例提供下述方法：

精密称定L-酪氨酸1.0000g，利用外标法，以采购上海阿拉丁生化科技股份有限公司的99％含量的L-酪氨酸为标准品，通过高效液相色谱仪进行本发明实施例纯化后的L-酪氨酸含量测定。

精密称定L-酪氨酸0.5000g，溶解在1mol/L盐酸溶液中，采用紫外-可见光分光光度计法，在430nm波长下检测其透光度T。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

(1)酸溶：取发酵产物约55kg，将37％盐酸流加至发酵产物中，同时将温度加热至70℃，直至发酵产物溶解完全；其中，发酵产物(w/kg)：盐酸(V/L)＝1:1.1。

(2)蛋白变性：步骤(1)的加酸后的溶液70℃加热，持续1h。

(3)脱色除蛋白：步骤(2)中样液以发酵产物的质量计，按活性炭(w)：发酵产物(w)＝1:10的比例加入活性炭，70℃搅拌吸附30min后，脱炭机脱炭。

(4)结晶：步骤(3)脱除活性炭后的澄清液维持70℃，进入结晶釜，搅拌速度为40rpm，加入NaOH碱液调节pH＝4，流加速度为300ml/min，降温至10℃析晶结束，降温速率为20℃/h。

(5)固液分离：析晶后物质利用板框过滤，压力为0.8Mpa，过滤后的固体少量纯水洗晶，压滤至晶体含水量为10％，进入真空干燥箱，真空度-0.098Mpa，温度为80℃。

(6)酸水分离：取步骤(5)得到洗晶水和母液的混合液，进入分子量为50D的卷式纳滤膜中，通过纳滤膜的通过液串联至反渗膜，卷式纳滤膜压力为0.2Mpa，通量为450L/h，反渗膜压力为0.25Mpa，通量为250L/h。

(7)苯酚吸附：取步骤(6)的纳滤膜的截留液测定苯酚浓度为1.09g/L、L-酪氨酸浓度为8.36g/L，以3BV/h的速度流入2L D101大孔树脂柱中，流至柱平面，上柱结束，静置30min，25％浓度的乙醇进行洗脱2BV，得到的洗脱液经液相色谱检测，其含量为0，然后洗脱液60℃浓缩除醇，除醇后的样液返至催化端作为水，二次发酵使用，而穿出液用于发酵制备L-酪氨酸的发酵装置的润洗。

L-酪氨酸成品品质检测：精密称定L-酪氨酸1.0153g，外标法液相检测纯度为99.4％。精密称定L-酪氨酸0.5171g，溶解在10ml 1mol/L盐酸溶液中，紫外-可见光分光光度计测得其在430nm波长下的透光度T＝95.4％，收率＝95.2％。

实施例2

(1)酸溶：取发酵产物约57kg，将37％盐酸流加至发酵产物中，同时将温度加热至80℃，直至发酵产物溶解完全；其中，发酵产物(w/kg)：盐酸(V/L)＝1:1。

(2)蛋白变性：步骤(1)的加酸后的溶液80℃加热，持续1h。

(3)脱色除蛋白：步骤(2)中样液以发酵产物的质量计，按活性炭(w)：发酵产物(w)＝1:10的比例加入活性炭，80℃搅拌吸附30min后，脱炭机脱炭。

(4)结晶：步骤(3)脱除活性炭后的澄清液维持80℃，进入结晶釜，搅拌速度为40rpm，加入NaOH碱液调节pH＝4.21，流加速度为300ml/min，降温至10℃析晶结束，降温速率为20℃/h。

(5)固液分离：析晶后物质利用板框过滤，压力为1.0Mpa，过滤后的固体少量纯水洗晶，压滤至晶体含水量为8.9％，进入真空干燥箱，真空度-0.098Mpa，温度为80℃。

(6)酸水分离：取步骤(5)得到洗晶水和母液的混合液，进入分子量为50D的卷式纳滤膜中，通过纳滤膜的通过液串联至反渗膜，卷式纳滤膜压力为0.15Mpa，通量为430L/h，反渗膜压力为0.25Mpa，通量为250L/h。

(7)苯酚吸附：取步骤(6)的纳滤膜的截留液测定苯酚浓度为0.92g/L、L-酪氨酸浓度为7.99g/L，以3BV/h的速度流入0.9L XDA8G大孔树脂柱中，流至柱平面，上柱结束，静置30min，20％浓度的乙醇进行洗脱3BV，得到的洗脱液经液相色谱检测，其含量为0，然后洗脱液60℃浓缩除醇，除醇后的样液返至催化端作为水，二次发酵使用。

L-酪氨酸成品品质检测：精密称定L-酪氨酸1.0010g，外标法液相检测纯度为103.21％。精密称定L-酪氨酸0.5037g，溶解在10ml 1mol/L盐酸溶液中，紫外-可见光分光光度计测得其在430nm波长下的透光度T＝97.6％，收率＝95.4％。

实施例3

(1)酸溶：取发酵产物约55kg，将37％盐酸流加至发酵产物中，同时将温度加热至80℃，直至发酵产物溶解完全；其中，发酵产物(w/kg)：盐酸(V/L)＝1:1。

(2)蛋白变性：步骤(1)的加酸后的溶液80℃加热，持续1h。

(3)脱色除蛋白：步骤(2)中样液以发酵产物的质量计，按活性炭(w)：发酵产物(w)＝1:20的比例加入活性炭，80℃搅拌吸附30min后，脱炭机脱炭。

(4)结晶：步骤(3)脱除活性炭后的澄清液维持80℃，进入结晶釜，搅拌速度为30rpm，加入NaOH碱液调节pH＝3，流加速度为300ml/min，降温至10℃析晶结束，降温速率为20℃/h。

(5)固液分离：析晶后物质利用板框过滤，压力为1.0Mpa，过滤后的固体少量纯水洗晶，压滤至晶体含水量为9.0％，进入真空干燥箱，真空度-0.098Mpa，温度为80℃。

(6)酸水分离：取步骤(5)得到洗晶水和母液的混合液，进入分子量为50D的卷式纳滤膜中，通过纳滤膜的通过液串联至反渗膜，卷式纳滤膜压力为0.2Mpa，通量为450L/h，反渗膜压力为0.4Mpa，通量为250L/h。

(7)苯酚吸附：取步骤(6)的纳滤膜的截留液测定苯酚浓度为1.21g/L，L-酪氨酸浓度为7.16g/L，以3BV/h的速度流入1.00L XDA8G大孔树脂柱中，流至柱平面，上柱结束，静置30min，20％浓度的乙醇进行洗脱3BV，得到的洗脱液经液相色谱检测，其含量为0，然后洗脱液60℃浓缩除醇，除醇后的样液返至催化端作为水，二次发酵使用。

L-酪氨酸成品品质检测：精密称定L-酪氨酸0.9995g，外标法液相检测纯度为102.98％。精密称定L-酪氨酸0.5001g，溶解在10ml 1mol/L盐酸溶液中，紫外-可见光分光光度计测得其在430nm波长下的透光度T＝96.9％，收率＝96.3％。

实施例4

(1)酸溶：取发酵产物约56kg，将37％盐酸流加至发酵产物中，同时5将温度加热至80℃，直至发酵产物溶解完全；其中，发酵产物(w/kg)：

盐酸(V/L)＝1:1。

(2)蛋白变性：步骤(1)的加酸后的溶液80℃加热，持续1h。

(3)脱色除蛋白：步骤(2)中样液以L-酪氨酸质量计，按活性炭(w)：

L-酪氨酸(w)＝1:30的比例加入活性炭，80℃搅拌吸附60min后，脱炭机0脱炭。

(4)结晶：步骤(3)脱除活性炭后的澄清液维持80℃，进入结晶釜，

搅拌速度为45rpm，加入NaOH碱液调节pH＝1，流加速度为200ml/min，

降温至10℃析晶结束，降温速率为20℃/h。

(5)固液分离：析晶后物质利用板框过滤，压力为1.0Mpa，过滤后的5固体少量纯水洗晶，压滤至晶体含水量为8.8％，进入真空干燥箱，真空度-0.098Mpa，温度为80℃。

(6)酸水分离：取步骤(5)得到洗晶水和母液的混合液，进入分子量为50D的卷式纳滤膜中，通过纳滤膜的通过液串联至反渗膜，卷式纳滤

膜压力为0.2Mpa，通量为450L/h，反渗膜压力为0.4Mpa，通量为250L/h，0卷式纳滤膜浓液150L，反渗浓液60L。

(7)苯酚吸附：取步骤(6)的纳滤膜的截留液测定苯酚浓度为0.87g/L、L-酪氨酸浓度为4.79g/L，以3BV/h的速度流入1.5L XDA8G大孔树脂柱中，流至柱平面，上柱结束，静置30min，20％浓度的乙醇进行洗脱3BV，得到的洗脱液经液相色谱检测，其含量为0，然后洗脱液60℃浓缩除醇，除醇后的样液返至催化端作为水，二次发酵使用。

L-酪氨酸成品品质检测：精密称定L-酪氨酸0.9867g，外标法液相检测纯度为101.06％。精密称定L-酪氨酸0.5032g，溶解在10ml 1mol/L盐酸溶液中，紫外-可见光分光光度计测得其在430nm波长下的透光度T＝96.0％，收率＝95.7％。

对比例1

(1)酸溶：取发酵产物约56kg，将37％盐酸流加至发酵产物中，同时将温度加热至80℃，直至发酵产物溶解完全；其中，发酵产物(w/kg)：盐酸(V/L)＝1:1。

(2)蛋白变性：步骤(1)的加酸后的溶液80℃加热，持续1h。

(3)脱色除蛋白：步骤(2)中样液以L-酪氨酸质量计，按活性炭(w)：L-酪氨酸(w)＝1:30的比例加入活性炭，80℃搅拌吸附60min后，脱炭机脱炭。

(4)结晶：步骤(3)脱除活性炭后的澄清液维持80℃，进入结晶釜，搅拌速度为45rpm，加入NaOH碱液调节pH＝1，流加速度为200ml/min，降温至10℃析晶结束，降温速率为20℃/h。

(5)固液分离：析晶后物质利用板框过滤，压力为1.0Mpa，过滤后的固体少量纯水洗晶，压滤至晶体含水量为8.8％，进入真空干燥箱，真空度-0.098Mpa，温度为80℃。

(6)酸水分离：取步骤(5)得到洗晶水和母液的混合液，进入分子量为50D的卷式纳滤膜中，通过纳滤膜的通过液串联至反渗膜，卷式纳滤膜压力为0.2Mpa，通量为450L/h，反渗膜压力为0.4Mpa，通量为250L/h，卷式纳滤膜浓液150L，反渗浓液60L。

(7)苯酚脱除：取步骤(6)的纳滤膜的截留液测定苯酚浓度为0.67g/L、L-酪氨酸浓度为3.24g/L，浓液加入60gNaOH，调pH至弱碱性，分解苯酚和L-酪氨酸后，废液排入污水处理系统，不再进行回收利用。

L-酪氨酸成品品质检测：精密称定L-酪氨酸0.9456g，外标法液相检测纯度为100.10％。精密称定L-酪氨酸0.5401g，溶解在10ml 1mol/L盐酸溶液中，紫外-可见光分光光度计测得其在430nm波长下的透光度T＝95.8％，收率＝95.0％。

对比例1结论：考虑到苯酚的氧化还原性，该法只是暂时做到零排放，然后苯酚对水体的污染实际并未消除。

对比例2

(1)酸溶：取发酵产物约56kg，将37％盐酸流加至发酵产物中，同时将温度加热至80℃，直至发酵产物溶解完全；其中，发酵产物(w/kg)：盐酸(V/L)＝1:1。

(2)蛋白变性：步骤(1)的加酸后的溶液80℃加热，持续1h。

(3)脱色除蛋白：步骤(2)中样液以L-酪氨酸质量计，按活性炭(w)：L-酪氨酸(w)＝1:30的比例加入活性炭，80℃搅拌吸附60min后，脱炭机脱炭。

(4)结晶：步骤(3)脱除活性炭后的澄清液维持80℃，进入结晶釜，搅拌速度为45rpm，加入NaOH碱液调节pH＝1，流加速度为200ml/min，降温至10℃析晶结束，降温速率为20℃/h。

(5)固液分离：析晶后物质利用板框过滤，压力为1.0Mpa，过滤后的固体少量纯水洗晶，压滤至晶体含水量为8.8％，进入真空干燥箱，真空度-0.098Mpa，温度为80℃。

(6)酸水分离：取步骤(5)得到洗晶水和母液的混合液，进入多级减压分馏系统，一级分馏系统加热温度调至80℃，冷却温度调至10℃；二级分馏系统加热温度调至60℃，冷却温度调至4℃；三级分馏系统加热温度调至40℃，冷却温度调至-5℃。分别将各级回收液收集起来，一级回收液和二级回收液调PH至中性进入污水处理系统，三级回收液返至酸溶一步，各级浓液收集进入苯酚吸附，脱除苯酚。

(7)苯酚吸附：取(6)中各级减压分馏浓液测定苯酚浓度为0.14g/L、L-酪氨酸浓度为4.67g/L，以3BV/h的速度流入0.4L XDA8G大孔树脂柱中，流至柱平面，上柱结束，静置30min，20％浓度的乙醇进行洗脱3BV，洗脱液60℃浓缩除醇，除醇后的样液返至催化端作为水，二次发酵使用。

L-酪氨酸成品品质检测：精密称定L-酪氨酸1.0002g，外标法液相检测纯度为99.98％。精密称定L-酪氨酸0.5321g，溶解在10ml 1mol/L盐酸溶液中，紫外-可见光分光光度计测得其在430nm波长下的透光度T＝96.3％，收率＝96.2％。

对比例2结论：本对比例利用传统的加热蒸馏法来回收盐酸，进行酸水分离，设备投入成本大，分离不彻底，浓缩液残留盐酸严重影响后续苯酚吸附效率，且由于苯酚的挥发性，在三级回收液中检测出0.26g/L的苯酚，苯酚的引入势必造成盐酸回收使用后产品质量的下降。

对比例3

(1)酸溶：取发酵产物约56kg，将37％盐酸流加至发酵产物中，同时将温度加热至80℃，直至发酵产物溶解完全；其中，发酵产物(w/kg)：盐酸(V/L)＝1:1。

(2)蛋白变性：步骤(1)的加酸后的溶液在室温25℃下搅拌，持续1h，仅靠极高的酸浓度进行蛋白变性。

(3)脱色除蛋白：步骤(2)中样液以L-酪氨酸质量计，按活性炭(w)：L-酪氨酸(w)＝1:30的比例加入活性炭，80℃搅拌吸附60min后，脱炭机脱炭。

(4)结晶：步骤(3)脱除活性炭后的澄清液维持80℃，进入结晶釜，搅拌速度为45rpm，加入NaOH碱液调节pH＝1，流加速度为200ml/min，降温至10℃析晶结束，降温速率为20℃/h。

(5)固液分离：析晶后物质利用板框过滤，压力为1.0Mpa，过滤后的固体少量纯水洗晶，压滤至晶体含水量为8.8％，进入真空干燥箱，真空度-0.098Mpa，温度为80℃。

(6)酸水分离：取步骤(5)得到洗晶水和母液的混合液，进入分子量为50D的卷式纳滤膜中，通过纳滤膜的通过液串联至反渗膜，卷式纳滤膜压力为0.2Mpa，通量为450L/h，反渗膜压力为0.4Mpa，通量为250L/h，卷式纳滤膜浓液150L，反渗浓液60L。

(7)苯酚吸附：取步骤(6)的纳滤膜的截留液测定苯酚浓度为0.84g/L、L-酪氨酸浓度为4.58g/L，以3BV/h的速度流入1.5L XDA8G大孔树脂柱中，流至柱平面，上柱结束，静置30min，20％浓度的乙醇进行洗脱3BV，洗脱液60℃浓缩除醇，除醇后的样液返至催化端作为水，二次发酵使用。

L-酪氨酸成品品质检测：精密称定L-酪氨酸0.9426g，外标法液相检测纯度为88.6％。精密称定L-酪氨酸0.5001g，溶解在10ml 1mol/L盐酸溶液中，紫外-可见光分光光度计测得其在430nm波长下的透光度T＝13％，收率＝98.9％。

对比例4

(1)酸溶：取发酵产物约56kg，将37％盐酸流加至发酵产物中，同时维持室温25℃，并搅拌直至发酵产物溶解完全；其中，发酵产物(w/kg)：盐酸(V/L)＝1:1。

(2)蛋白变性：步骤(1)的加酸后的溶液在室温25℃下搅拌，持续1h，仅靠极高的酸浓度进行蛋白变性。

(3)脱色除蛋白：步骤(2)中样液以L-酪氨酸质量计，按活性炭(w)：L-酪氨酸(w)＝1:30的比例加入活性炭，室温25℃下搅拌吸附60min后，脱炭机脱炭。

(4)结晶：步骤(3)脱除活性炭后的澄清液维持室温25℃，进入结晶釜，搅拌速度为45rpm，加入NaOH碱液调节pH＝1，流加速度为200ml/min，降温至10℃析晶结束，降温速率为20℃/h。

(5)固液分离：析晶后物质利用板框过滤，压力为1.0Mpa，过滤后的固体少量纯水洗晶，压滤至晶体含水量为8.8％，进入真空干燥箱，真空度-0.098Mpa，温度为室温25℃。

(6)酸水分离：取步骤(5)得到洗晶水和母液的混合液，进入分子量为50D的卷式纳滤膜中，通过纳滤膜的通过液串联至反渗膜，卷式纳滤膜压力为0.2Mpa，通量为450L/h，反渗膜压力为0.4Mpa，通量为250L/h，卷式纳滤膜浓液150L，反渗浓液60L。

(7)苯酚吸附：取步骤(6)的纳滤膜的截留液测定苯酚浓度为0.78g/L、L-酪氨酸浓度为4.66g/L，以3BV/h的速度流入1.5L XDA8G大孔树脂柱中，流至柱平面，上柱结束，静置30min，20％浓度的乙醇进行洗脱3BV，洗脱液60℃浓缩除醇，除醇后的样液返至催化端作为水，二次发酵使用。

L-酪氨酸成品品质检测：精密称定L-酪氨酸0.9852g，外标法液相检测纯度为67.5％。精密称定L-酪氨酸0.5031g，溶解在10ml 1mol/L盐酸溶液中，紫外-可见光分光光度计测得其在430nm波长下的透光度T＝8.3％，收率＝106.7％。

对比例5

(1)酸溶：取发酵产物约56kg，将37％盐酸流加至发酵产物中，同时将温度加热至80℃，直至发酵产物溶解完全；其中，发酵产物(w/kg)：盐酸(V/L)＝1:1。

(2)脱色：以步骤(1)中样液以L-酪氨酸质量计，按活性炭(w)：L-酪氨酸(w)＝1:30的比例加入活性炭，80℃搅拌吸附60min后，脱炭机脱炭。

(3)结晶：步骤(2)脱炭后的澄清液维持80℃，进入结晶釜，搅拌速度为45rpm，加入NaOH碱液调节pH＝1，流加速度为200ml/min，降温至10℃析晶结束，降温速率为20℃/h。

(4)固液分离：析晶后物质利用板框过滤，压力为1.0Mpa，过滤后的固体少量纯水洗晶，压滤至晶体含水量为8.8％，进入真空干燥箱，真空度-0.098Mpa，温度为80℃。

(5)酸水分离：取步骤(4)中洗晶水和母液的混合液，进入分子量为50D的卷式纳滤膜中，通过纳滤膜的通过液串联至反渗膜，卷式纳滤膜压力为0.2Mpa，通量为450L/h，反渗膜压力为0.4Mpa，通量为250L/h，卷式纳滤膜浓液150L，反渗浓液60L。

(6)苯酚吸附：取步骤(5)中卷式膜的截留液测定苯酚浓度为0.66g/L、L-酪氨酸浓度为4.37g/L，以3BV/h的速度流入1.5L XDA8G大孔树脂柱中，流至柱平面，上柱结束，静置30min，20％浓度的乙醇进行洗脱3BV，洗脱液60℃浓缩除醇，除醇后的样液返至催化端作为水，二次发酵使用。

L-酪氨酸成品品质检测：精密称定L-酪氨酸0.9864g，外标法液相检测纯度为86.55％。精密称定L-酪氨酸0.5041g，溶解在10ml 1mol/L盐酸溶液中，紫外-可见光分光光度计测得其在430nm波长下的透光度T＝10.7％，收率＝99.2％。

对比例3、4和5结论：当去除了“蛋白变性”步骤或其中的高温操作步骤后，会使得一部分蛋白等杂质残留，因此，最终成品品质检测时，残留的蛋白等杂质含量偏高，从而导致L-酪氨酸纯度检测结果偏低及透光率极大降低；收率略高于实施例是因为引入的部分杂质提高了产物纯化后的重量，从而导致计算后的收率偏高。

对比例6

本对比例提供一种L-酪氨酸的分离纯化方法，包括：

(1)酸溶：取发酵产物约48kg，将37％盐酸流加至发酵产物中，同时将温度加热至60℃，直至发酵产物溶解完全；其中，发酵产物(w/kg)：盐酸(V/L)＝1:1.4。

(2)蛋白变性：步骤(1)的加酸后的溶液60℃加热，持续1h。

(3)脱色除蛋白：步骤(2)中样液以发酵产物的质量计，按活性炭(w)：发酵产物(w)＝1:10的比例加入活性炭，60℃搅拌吸附30min后，脱炭机脱炭。

(4)结晶：步骤(3)脱除活性炭后的澄清液维持60℃，进入结晶釜，搅拌速度为30rpm，加入NaOH碱液调节pH＝5.66，流加速度为200ml/min，降温至10℃析晶结束，降温速率为30℃/h。

(5)固液分离：析晶后物质利用板框过滤，压力为0.6Mpa，过滤后的固体少量纯水洗晶，压滤至晶体含水量为17％，进入真空干燥箱，真空度-0.098Mpa，温度为60℃。

(6)酸水分离：取步骤(5)得到洗晶水和母液的混合液，进入分子量为70D的卷式纳滤膜中，通过纳滤膜的通过液串联至反渗膜，反渗膜的清液返回至卷式纳滤膜中用作顶水液进行稀释顶水。卷式纳滤膜压力为0.15Mpa，通量为400L/h，反渗膜压力为0.25Mpa，通量为200L/h。

(7)苯酚吸附：取步骤(6)的纳滤膜的截留液测定苯酚浓度为0.97g/L、L-酪氨酸浓度为8.49g/L，以3BV/h的速度流入3.15L SD300大孔树脂柱中，流至柱平面，上柱结束，静置30min。20％浓度的乙醇进行洗脱5BV，洗脱液50℃浓缩除醇，除醇后的样液返至催化端作为水，二次发酵使用，而穿出液用于发酵制备L-酪氨酸的发酵装置的润洗。

L-酪氨酸成品品质检测：精密称定L-酪氨酸1.0003g，外标法液相检测纯度为98.9％。精密称定L-酪氨酸0.5201g，溶解在10ml 1mol/L盐酸溶液中，紫外-可见光分光光度计测得其在430nm波长下的透光度T＝85％，收率＝96.2％。

对比例6结论：本对比例更改了板框过滤的压力，继而导致晶体不仅仅含水量提升，同时，透明度也大幅度降低。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。