一种与功能微生物生理特性匹配的缓释碳源材料的制备方法及其应用

技术领域：

本发明涉及一种与功能微生物生理特性匹配的缓释碳源材料的制备方法及其应用。

背景技术：

生物修复刺激卤代烃的降解在美国已展开了将近40年的研究，有机卤化合物是环境中广泛分布的异源污染物。在这些污染物中，氯代有机物，包括氯代烃(CEs)、氯代烷烃(CAs)和多氯联苯(PCBs)，是典型的具有环境可持续性、生物累积性和毒性的环境污染物。有机卤化物呼吸细菌(OHRB)来自一个系统发育广泛的属，根据其代谢的灵活性可分为专性和非专性OHRB。在有机卤化物的地球化学循环和环境生物修复中发挥中心作用。目前针对脱卤生物刺激的研究主要集中在碳源种类和污染物的选择；考察污染场地环境影响因素；并关注污染物的去除效果；然而，近年来，随着生物信息技术的快速发展，研究人员把目光更多地放在了有机卤化物呼吸菌OHRB的生理特性；研究发现，OHRB具有独特的生理代谢特征，和灵活的电子传递过程。然而，由于该菌群的生理敏感性，和代谢的复杂性，以及与其他非脱卤功能菌群密切的协作性，具体的还原脱氯降解机制并没有得到充分的证实，尤其是在生物刺激的条件下OHRB如何将电子快速转移，如何利用电子传递机制应对环境变化高效传递电子仍然未知。然而，在实际的污染场地当中，可以富集脱氯菌群的碳源和电子供体来源有限，生物刺激材料的高成本和快速消耗，降低脱氯效率，限制了其在原位生物修复中的应用。因此基于转录组学的方法，分析氯代烃污染场地降解功能微生物的功能及活性对生物刺激碳源材料的影响机制具有重要意义。

选择合适的电子供体是能否成功实现还原脱氯的关键。目前常用的电子供体有能够持续释放电子的缓释碳源，如天然高分子聚合物材料木屑。木屑作为底物发酵可以缓慢产生电子和氢气作为微生物生长的电子供体。与玉米、秸秆、稻壳等其他天然高分子缓释碳源相比，硬木质材料木屑由于具有更多的含氧醌官能团，具备更高的电子接受能力，可以作为最具潜力的生物刺激缓释碳源。然而，仅仅依靠缓释碳源刺激微生物还原脱氯还存在一些瓶颈问题，比如微生物活性容易受到外界环境条件变化的影响，从而导致修复时间长，或大量电子供体导致生物膜过度生长。因此，研究人员常常采用纳米零价铁(nZVI)作为氯化有机化合物去除的辅助还原剂。由于nZVI具有较大的比表面积和较多的活性位点，可以显著加速氯代污染物的去除。然而，不幸的是，nZVI往往对微生物表现出明显的细胞毒性，会导致细胞膜破裂并干扰细菌的呼吸。此外，在修复过程中，nZVI颗粒倾向于快速聚集和钝化，这使得nZVI的反应性下降，限制了其进一步应用。

发明内容：

本发明的目的是为了解决现有外加碳源材料与脱氯功能菌群生理特性不匹配，导致释放电子缓慢，降解效果差的问题，提供了一种与功能微生物生理特性匹配的缓释碳源材料的制备方法及其应用。

本发明一种与功能微生物生理特性匹配的缓释碳源材料的制备方法按照以下步骤进行：

一、制备天然高分子聚合物粉末：

清洗天然高分子聚合物，然后置于NaOH溶液中浸泡4～8小时进行预处理，烘干，破碎成粉末，得到天然高分子聚合物粉末；

二、制备交联剂溶液：

将聚乙烯醇和海藻酸钠加热溶解于蒸馏水中，在95～100℃条件下水浴加热搅拌6～8小时至完全溶解，室温冷却，得到交联剂溶液；

三、制备与功能微生物生理特性相匹配的缓释碳源材料：

向交联剂溶液中加入硅藻土，加入天然高分子聚合物木屑粉末，加入纳米零价铁，最后加入腐殖酸粉末，混合挤压成球状颗粒，再放入CaCl

本发明与功能微生物生理特性匹配的缓释碳源材料作为生物刺激碳源材料在微生物降解卤代烃中的应用。

为了解决纳米零价铁的抑制，本发明采用天然有机缓释碳材料与nZVI结合的方式，增强nZVI的稳定性和分散性的同时，减少nZVI还原过程中产生的羟基自由基对细胞的破坏，从而为细菌的附着提供保护，以降低nZVI对细菌的毒性。希瓦氏菌Shewanellaoneidensis MR-1是一种非常重要的模式异化细菌细菌，源于它具有胞外电子传递的功能，能够将呼吸链产生的电子传递到环境中的固态铁等电子受体上介导环境中污染物的降解。腐殖酸(HA)作为广泛存在于天然环境中的大分子有机组分，可以作为电子穿梭体加快希瓦氏菌的胞外电子传递速率。因此本发明构建了“木屑+硅藻土-纳米零价铁-腐殖酸”体系，作为一种与希瓦氏菌生理功能相匹配的缓释复合碳源材料，加速污染场地中氯代污染物的高效去除，本发明将为构建生物-环境相互作用的高效修复方法提供新的见解。

本发明以天然高分子聚合物缓释碳源为基础，制备的与功能微生物生理特性相匹配的缓释碳源材料不仅保留了天然高分子聚合物缓释碳源的高效、吸附性强，释碳效果好等适用于净化水质等优点，同时又具备吸附氯代烯烃污染物效率高，速率快稳定性强等优点。本发明以50μmol/L四氯乙烯(PCE)作为氯代烯烃的模式目标污染物，进行了为期60天的氯代烯烃污染物去除效能测试。实验组设置为木屑+硅藻土(SD)、木屑+硅藻土-纳米零价铁(SD-nZVI)、木屑+硅藻土-纳米零价铁-腐殖酸(SD-nZVI-HA)。结果表明三种缓释碳源材料的释碳效果都比较稳定，60天TOC释放量可达到30.55mg/d(SD)、29.86mg/d(SD-nZVI)、28.03mg/d(SD-nZVI-HA)，TOC浓度增加表明该缓释碳源可以作为碳底物维持微生物活性，使得氯代烯烃污染物能够快速高效的降解，同时避免二次污染。并且pH在60天内能够维持稳定，说明该缓释碳源材料不会引起地下水酸化，具有很好的缓冲效果。此外，氯代烯烃的去除率也随着反应时间的延长而持续上升，在第60天，木屑+硅藻土-纳米零价铁-腐殖酸(SD-nZVI-HA)对氯代烯烃的去除率甚至能达到99.8％，分别是SD-nZVI和SD条件下的3.4倍和2.1倍，说明以木屑为原材料的缓释碳源材料在添加腐殖酸HA后，能够显著提升氯代烯烃污染物的转化效率，增强缓释碳源材料的应用效果。

值得指出的是，与生物炭制备方法不同的是，该缓释碳源材料通过化学交联法制备，不需要高温煅烧，避免了生物炭因受到热解温度影响造成的性能差异，显著节约了经济成本的同时减少了温室气体的排放。并且化学交联能够改善材料的性能，提高了碳源材料的强度和耐热性。此外，纳米零价铁是一种强还原剂，从而具有优越的吸附性能和很高的还原活性，可以在非生物作用条件下通过还原作用对氯代烯烃污染物起到去除作用；但是在生物刺激的条件下纳米零价铁会产生大量的强还原性自由基破坏细胞的生理结构，引起细胞内容物流出，影响微生物的生理功能。此外，腐殖酸是常见的天然化合物，含有大量的醌类、羟基、羧基等官能团，可以作为胞外电子传递穿梭体，起到加速电子传递的作用。因此，腐殖酸的加入可以在一定程度上缓解纳米零价铁对微生物生理抑制作用，在减少氯代烯烃污染物毒性抑制的同时快速提供电子加速污染物的还原，并显著降低碳源材料的经济成本。该缓释碳源制备过程中使用到了聚乙烯醇(PVA)和海藻酸钠(SA)作为交联载体，是结构稳定的胶体碳水化合物，在交联剂的作用下，大分子链通过化学键联结起来，形成三维网状结构高分子聚合物的过程，这种结构使得材料结构紧密且不易水解。并且这种三维网状结构可以对污染水体中的功能菌群起到一定的保护作用。同时，饱和的硼酸溶液中含有4％的氯化钙溶液，Ca

具体的，缓释碳源材料处理废水时，缓释碳源材料在水力的作用下释放出有机碳，为生物吸附在多孔隙并且具有层叠状的缓释碳源表面，缓释碳源材料释放的有机碳能够维持水体中和缓释碳源表面生物膜的生长代谢和能量转换，并在缓释碳源表面发生吸附、氧化、还原等反应，使污染物得到有效去除。纳米零价铁可以通过非生物的还原作用去除氯代烯烃，腐殖酸的加入快速转移了由缓释碳源材料产生的电子供体，在加速电子转移的同时促进污染物的快速降解。此外，缓释碳源的硅藻土成分表面含有大量的羟基、Si-OH硅醇基，而且他的蜂窝网状结构能够为菌株提供足够的空间附着。本发明中的希瓦氏菌是一种典型的能够进行胞外电子传递的异化细菌，其细胞内膜及外膜上含有42个细胞色素功能基因，使其可以利用水体中的各种天然化合物，如腐殖酸HA作为电子传递的穿梭体，通过胞外电子传递的方式进行还原呼吸作用。本发明的缓释碳源材料中的腐殖酸HA作为胞外电子传递穿梭体快速将缓释碳源材料产生的电子转移至希瓦氏菌，通过希瓦氏菌的呼吸作用以污染物做为电子受体产生能量和电子，在腐殖酸HA存在的条件下，希瓦氏菌主要采用胞外电子传递方式去除氯代烯烃污染物，这个过程中希瓦氏菌将碳源材料提供的大量电子通过细胞外电子传递穿梭体腐殖酸HA快速转移至电子受体纳米零价铁或污染物氯代烯烃，通过胞外电子传递体系实现污染物高效降解的同时保存能量维持自身生长。在腐殖酸HA添加的条件下(SD-nZVI-HA)，可以显著促进希瓦氏菌中和细胞外电子传递相关的功能酶基因(MtrA、MtrB、MtrC、CymA、OmcA)的高表达。相比于SD-nZVI和SD条件，关键功能酶OmcA/MtrC基因的表达量甚至分别是增加了22％和14％；此外，与鞭毛活性相关的功能基因(FlgM、FlgH、FliD、FlgC、FlgB、FlgA)高表达(12.65倍)。腐殖酸的长效缓释性能碳源材料能够在长时间内持续、快速、高效地为希瓦氏菌提供能量和电子，增强希瓦氏菌的脱卤活性，从而提高对氯代烯烃的去除效果；同时，本研究制备的缓释碳源材料增加了希瓦氏菌与氯代烯烃接触的吸附位点，纳米零价铁的添加促进了细胞外污染物的持续高效降解，继而提高去除效率。相比现有的缓释碳源材料，本发明的制备与缓释碳源材料与希瓦氏菌的生理功能更加匹配，因此，可以实现更佳快速高效的污染物去除效果。

附图说明

图1为木屑+硅藻土-纳米零价铁-腐殖酸缓释碳源表面的扫描电镜SEM图；

图2为60天缓释碳源材料释碳规律图；

图3为60天缓释碳源材料对氯代烯烃的去除效果图；

图4为60天缓释碳源材料体系pH指标的变化图；

图5为缓释碳源材料刺激Shewanella oneidensis MR-1菌功能基因表达图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式一种与功能微生物生理特性匹配的缓释碳源材料的制备方法按照以下步骤进行：

一、制备天然高分子聚合物粉末：

清洗天然高分子聚合物，然后置于NaOH溶液中浸泡4～8小时进行预处理，烘干，破碎成粉末，得到天然高分子聚合物粉末；

二、制备交联剂溶液：

将聚乙烯醇和海藻酸钠加热溶解于蒸馏水中，在95～100℃条件下水浴加热搅拌6～8小时至完全溶解，室温冷却，得到交联剂溶液；

三、制备与功能微生物生理特性相匹配的缓释碳源材料：

向交联剂溶液中加入硅藻土，加入天然高分子聚合物木屑粉末，加入纳米零价铁，最后加入腐殖酸粉末，混合挤压成球状颗粒，再放入CaCl

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：天然高分子聚合物为木屑其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中NaOH溶液的质量浓度为1％～4％。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中的烘干是在80℃烘箱中烘干24h。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤一中木屑粉末的粒径为200-400目。其它与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二中聚乙烯醇、海藻酸钠和去离子水的质量体积比为8-16g：1-2g：300-600mL。其它与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤二中CaCl

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤二中在80℃烘箱干燥24h，紫外灭菌72h。其它与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与功能微生物生理特性匹配的缓释碳源材料作为生物刺激碳源材料在微生物降解卤代烃中的应用。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式九不同的是：微生物为奥奈达希瓦氏菌。其它与具体实施方式九相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式九或十不同的是：生理特性是指能够进行胞外电子传递。其它与具体实施方式九或十相同。

通过以下试验验证本发明的有益效果：

实施例1、一种缓释碳源材料去除水中氯代烯烃的方法：

清洗天然高分子聚合物材料，然后置于NaOH溶液中浸泡4小时进行预处理，放置在80℃烘箱中烘干24小时，取出冷却过后用永历牌破碎机，粉碎成粒径为200-400目的粉末备用，得到农业废弃物粉末；称取72g聚乙烯醇和9g海藻酸钠加热溶解于蒸馏水中，在95～100℃条件下水浴加热搅拌4-8小时至完全溶解，室温冷却,得到交联剂溶液(聚乙烯醇PVA-海藻酸钠SA载体骨架)；称取2.4g天然高分子聚合物木屑粉末置于100mL烧杯中，加入40mL聚乙烯醇PVA-海藻酸钠SA载体骨架，加入20g硅藻土，加入0.6g纳米零价铁，加入0.72g腐殖酸，进行混合搅拌。配制成混合均匀的含有天然高分子聚合物木屑的缓释碳源混合体系，挤压成粒径约为0.7mm的球状颗粒。然后，配制1000mL含有质量分数4％的CaCl

本实施例分别采用木屑+硅藻土，木屑+硅藻土-纳米零价铁，木屑+硅藻土-纳米零价铁-腐殖酸得到的缓释碳源材料依次命名为SD、SD-nZVI、SD-nZVI-HA。其中木屑+硅藻土-纳米零价铁-腐殖酸缓释碳源表面的扫描电镜SEM图如图1所示，由图1可知，在电镜条件下可以观察到木屑由许多层状结构组成，这种层状结构能够为卤代烃污染物提供大量吸附位点。同时，木屑作为农业废弃物的疏松孔隙结构具有较大的比表面积，能够为希瓦氏菌株提供足够的空间附着，使被吸附在硅藻土表面的氯代烯烃污染物发生吸附、氧化、还原等反应，此外球状的纳米零价铁可以增加希瓦氏菌的附着能力，通过还原作用加速污染物的去除，腐殖酸颗粒均匀的分布在木屑材料表面，为希瓦氏菌提供快速的电子转移途径。

本发明所制备的缓释碳源材料释碳规律如图2所示，其中a为SD-nZVI-HA、b为SD-nZVI、c为SD；从图2可以看出，随着反应时间的延长，所有的碳源材料释碳效果成梯度增加，在第60天时，TOC释放量可达到30.55mg/d(SD)、29.86mg/d(SD-nZVI)、28.03mg/d(SD-nZVI-HA)。这说明所制备的碳源材料均具有很好的释碳能力和缓释效果。如图3所示，其中a为SD-nZVI-HA、b为SD-nZVI、c为SD；以50μmol/L四氯乙烯(PCE)作为氯代烯烃的模式目标污染物，进行了为期60天的氯代烯烃污染物去除效能测试。从图3中可以看出，在第60天，所有缓释碳源材料(SD、SD-nZVI、SD-nZVI-HA)都能维持较好的污染物去除效果，同时，SD-nZVI-HA对氯代烯烃的去除率甚至能达到99.8％，分别是SD-nZVI和SD条件下的3.4倍和2.1倍，说明以木屑为原材料的缓释碳源材料在添加腐殖酸HA后，能够显著提升氯代烯烃污染物的转化效率，增强缓释碳源材料的应用效果。

二、所述奥奈达希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-1保藏编号(ATCC BAA-1096)

预培养奥奈达希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-1：配制固体LB培养基。用pH计将配置好的培养基pH调节至7.2～7.4，121℃高压蒸汽灭菌20-30min，冷却至60～65℃倒平板备用，放置在30-35℃恒温培养箱培养32-48小时。然后接种在液体LB培养基中进行扩大化培养，其中活化用培养基配方为：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和10g/L氯化钠，用1％的NaOH将溶液调节pH值为7.2-7.4。将培养36-48小时的奥奈达希瓦氏菌Shewanellaoneidensis MR-1进行菌液重悬。具体步骤为取10mL液体，在5500*g下离心5分钟，用无菌水洗涤三次。培养48小时，使OD

经实施例1中的处理条件：缓释碳源投加量为1-1.5g，加入到150mL的实验室配水中，将pH值调为7.2-7.4，静置放在棕色的且密闭无氧的厌氧瓶。三种缓释碳源(SD、SD-nZVI、SD-nZVI-HA)存在的条件下，溶解性有机碳TOC释放都趋于稳定，这说明释碳趋于平衡，说明木屑作为缓释碳源的基础材料可以释放电子供体和碳源共维生物的生长和能量代谢进行污染物的降解，此时水中的TOC大部分来源于木屑材料水解产生的大分子纤维素物质。且TOC随着时间延长持续上升，这说明添加该缓释碳源表现出较好的缓释性能。图4为不同缓释碳源体系pH指标的变化，其中1为0天，2为20天，3为40天，4为60天；由图4可知，不同的碳源材料组分可以显著影响体系中pH的变化，从而会对脱卤菌的活性产生直接影响(表1)。由表1可知，在含有nZVI且不添加HA的木屑+硅藻土-纳米铁(SD-nZVI)体系中，微生物活性显著降低，这是由于纳米零价铁nZVI对生物膜造成的损害，导致细胞解体。然而，木屑+硅藻土(SD)条件下，在反应结束的第60天可以观察到较高的活菌比例，说明缓释碳源材料木屑可以维持体系中MR-1菌株的生长，维持代谢活性。在添加了腐殖酸HA的体系当中(SD-nZVI-HA)，虽然此时存在可以导致生物毒性的纳米铁nZVI，但活菌比例却得到了进一步的提高(提高了7.8％)，这些结果说明木屑+硅藻土-纳米铁-腐殖酸(SD-nZVI-HA)体系是最适合MR-1菌生长的生理适应性碳源。此外，随着反应时间的延长，不加腐殖酸HA的体系(SD和SD-nZVI)pH显著降低，到第60天时SD和SD-nZVI体系的pH甚至可以降低至6.7-7.0，而加入腐殖酸的体系中(SD-nZVI-HA)pH较为稳定的维持在7.0-7.2之间，这可能是由于腐殖酸(HA)存在的大量羧基，带有负电荷可以中和一部分H

表1不同缓释碳源体系中Shewanella oneidensis MR-1的活死菌比例

缓释碳源材料刺激希瓦氏菌降解氯代烯烃污染物的能力如图2-5所示。实验结果表明，本发明所制备的缓释碳源材料SD-nZVI-HA对氯代烯烃的去除效果较好，相比于SD和SD-nZVI条件，SD-nZVI-HA由于腐殖酸HA的添加，其可以作为电子穿梭体加速具有胞外电子转移能力的希瓦氏菌的电子传输能力，在供给相同电子供体数量的同时，显著增加了电子的传递效率，促进污染物氯代烯烃的去除，节约了材料成本。此外，图5为在缓释碳源材料的刺激下，希瓦氏菌的功能基因表达图；其中a为SD-nZVI-HA、b为SD-nZVI、c为SD。从图中可以看出，在腐殖酸HA添加的条件下(SD-nZVI-HA)，可以显著促进希瓦氏菌中和细胞外电子传递相关的功能酶基因(MtrA、MtrB、MtrC、CymA、OmcA)的高表达。相比于SD-nZVI和SD条件，关键功能酶OmcA/MtrC基因的表达量甚至分别是增加了22％和14％；此外，与鞭毛活性相关的功能基因(FlgM、FlgH、FliD、FlgC、FlgB、FlgA)高表达(12.65倍)，也证明了在腐殖酸HA存在的条件下，希瓦氏菌主要采用胞外电子传递方式去除氯代烯烃污染物，这个过程中希瓦氏菌将碳源材料提供的大量电子通过细胞外电子传递穿梭体腐殖酸HA快速转移至电子受体纳米零价铁或污染物氯代烯烃，通过胞外电子传递体系实现污染物高效降解的同时保存能量维持自身生长。因此，本发明成功构建了一种与希瓦氏菌生理特性相匹配的缓释碳源材料，为氯代烯烃污染场地原位生物修复提供了新思路。