一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的地衣芽孢杆菌工程菌株

技术领域

本发明提供了一种高效生产2’-岩藻糖基乳糖的地衣芽孢杆菌工程菌株，属于合成生物学和微生物代谢工程技术领域。

背景技术

肠道微生物的组成会影响人类健康。母乳是婴儿最重要的食物，其含有的特殊成分，如寡糖、抗体和维生素，通过塑造婴儿肠道微生物组的组成而影响健康。母乳寡糖(HMO)是母乳中的主要可溶性固形物，其中2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)是最丰富的HMOs，占总量的30％。它由L-岩藻糖、D-半乳糖和D-葡萄糖组成。2’-FL的生物活性近年来备受关注，研究者普遍认为它是保障婴儿健康发育的重要因素。深入的研究发现，婴儿虽然难以消化2’-FL，但是它在发育中起着至关重要的作用免疫系统，如调节肠道和抑制病原体感染。目前，2’-FL已被美国、欧洲等批准为用于婴儿配方奶粉的益生元。

近年来，研究者已开始广泛地使用微生物发酵法生产2’-FL，主要使用大肠杆菌等模式微生物。大肠杆菌自身含有2’-FL合成途径的多个基因，如甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶等，易于构建完整的合成途径，因此研究最为广泛。然而大肠杆菌并非食品安全微生物，其所生产的产物应用于食品会存在问题。由于枯草芽孢杆菌是一种食品安全型菌株，研究者已利用这一宿主进行2’-FL合成途径的构建和发酵生产。目前存在的主要问题是，异源基因在枯草芽孢杆菌中表达量较低，造成途径的合成效率不高；另一方面，枯草芽孢杆菌在现有的2’-FL发酵中主要以葡萄糖、甘油等精细碳源为培养基，而使用来源更为广泛和廉价的玉米粉质原料时效果较差。此外，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在规模化生产中都面临着比较严重的噬菌体侵染风险。

地衣芽孢杆菌是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。在工业发酵中地衣芽孢杆菌可发酵的原料种类更广，对噬菌体的抵抗性能更强，在降低生产成本方面具有明显的优势。

发明内容

为了解决目前存在的技术问题，本发明通过代谢工程改造，使得地衣芽孢杆菌既可以利用蔗糖也可以利用玉米粉或水解糊精在胞内以GDP-甘露糖为前体合成GDP-岩藻糖，并通过异源表达岩藻糖基转移酶futC，得到了高产2’-FL的地衣芽孢杆菌工程菌株。地衣芽孢杆菌合成2’-FL的人工途径以玉米粉作为碳源，利用自身的玉米粉酶水解获得葡萄糖，经过磷酸转移系统磷酸化后，通过葡萄糖异构酶转化成六磷酸果糖。利用磷酸甘露糖变位酶manB(N1)得到六磷酸甘露糖。再分别经过异源表达的甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶manC(N2)、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶gmd(N3)和GDP-L-岩藻糖合成酶wcaG(N4)得到GDP-L-岩藻糖，再利用岩藻糖基转移酶futC(N5)得到2’-FL(图1)。

本发明提供了一株高产2’-FL的地衣芽孢杆菌工程菌株，所述地衣芽孢杆菌工程菌株过表达了磷酸甘露糖变位酶manB、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶manC、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶gmd、GDP-L-岩藻糖合成酶wcaG以及岩藻糖基转移酶futC。

在一种实施方式中，所述地衣芽孢杆菌工程菌株过表达了含有编码磷酸甘露糖变位酶manB基因的表达框、含有编码甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶manC基因的表达框、含有编码GDP-甘露糖-4,6-脱水酶gmd基因的表达框、含有编码GDP-L-岩藻糖合成酶wcaG基因的表达框以及含有编码岩藻糖基转移酶futC基因的表达框。

在一种实施方式中，利用启动子P

在一种实施方式中，所述磷酸甘露糖变位酶manB来源于蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)；所述甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶manC来源于蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus；所述GDP-甘露糖-4,6-脱水酶gmd来源于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)；所述GDP-L-岩藻糖合成酶wcaG来源于副地衣芽孢杆菌(Bacillusparalicheniformis)；所述岩藻糖基转移酶futC来源于幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)。

在一种实施方式中，启动子P

在一种实施方式中，所述磷酸甘露糖变位酶manB的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶manC的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述GDP-甘露糖-4,6-脱水酶gmd的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述GDP-L-岩藻糖合成酶wcaG的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述岩藻糖基转移酶futC的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

在一种实施方式中，编码磷酸甘露糖变位酶manB基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示，编码甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶manC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码GDP-甘露糖-4,6-脱水酶gmd基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，编码GDP-L-岩藻糖合成酶wcaG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码岩藻糖基转移酶futC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

在一种实施方式中，所述地衣芽孢杆菌工程菌株的出发菌株为地衣芽孢杆菌ATCC9945A。

在一种实施方式中，以质粒pHY和pHT43为表达载体。

在一种实施方式中，利用质粒pHY表达磷酸甘露糖变位酶manB、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶manC和GDP-甘露糖-4,6-脱水酶gmd，利用质粒pHT43表达GDP-L-岩藻糖合成酶wcaG和岩藻糖基转移酶futC。

本发明提供了含有上述地衣芽孢杆菌工程菌株的微生物制剂。

本发明提供了一种生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，所述方法为利用上述地衣芽孢杆菌工程菌株或上述微生物制剂，在以乳糖为底物，以蔗糖、玉米粉和/或糊精为碳源的发酵体系中，发酵生产2’-岩藻糖基乳糖。

在一种实施方式中，将上述地衣芽孢杆菌工程菌的种子液接种至发酵体系中，通气量控制在0.5vvm，将搅拌与DO偶联控制DO维持在25～35％，转速设置为200～900rpm，发酵6～14h后补加碳源。

在一种实施方式中，发酵6～8h后连续补加蔗糖或糊精，维持不被耗尽；或发酵10～14h一次性补加玉米粉至终浓度100～140g/L。

在一种实施方式中，种子液的制备方法是将上述地衣芽孢杆菌工程菌或上述微生物制剂于平板上划线，挑取单菌落接种于LB培养基，37℃、250rpm/min培养18～24h，取2ml菌液转接于100ml LB液体培养基中，37℃、250rpm培养18～24h。

本发明还提供了一种上述地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法，过表达磷酸甘露糖变位酶manB、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶manC、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶gmd、GDP-L-岩藻糖合成酶wcaG以及岩藻糖基转移酶futC。

在一种实施方式中，利用质粒pHY表达磷酸甘露糖变位酶manB、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶manC和GDP-甘露糖-4,6-脱水酶gmd，利用质粒pHT43表达GDP-L-岩藻糖合成酶wcaG和岩藻糖基转移酶futC。

在一种实施方式中，上述构建方法包括包括以下步骤：

(1)以pHY为出发质粒，利用启动子P

(2)以pHT43为出发质粒，利用启动子P

(3)首先将重组质粒pHY-H123转化入地衣芽孢杆菌ATCC9945A中，获得工程菌BLH1；再将重组质粒pHT-H45转化入BLH1，得到工程菌BLH2。

本发明还提供了上述地衣芽孢杆菌工程菌或上述微生物制剂在合成2’-岩藻糖基乳糖以及含有2’-岩藻糖基乳糖的产品中的应用。

与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：

本发明以地衣芽孢杆菌为出发菌株，采用具有群体感应效应的启动子表达磷酸甘露糖变位酶manB、甘露糖-1-磷酸-鸟苷酸转移酶manC、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶gmd、GDP-L-岩藻糖合成酶wcaG以及岩藻糖基转移酶futC，协调了细胞生长与产物合成，提高产物2’-FL生产产量和产率。地衣芽孢杆菌是既是食品安全型微生物，又是碳底物谱最广的工业微生物。所构建的工程菌可以在以乳糖为底物，以蔗糖、玉米粉和/或糊精为碳源的发酵体系中发酵生产2’-FL。同时，地衣芽孢杆菌染菌自身可以分泌抗菌肽，其在工业发酵中感染杂菌或噬菌体的风险远低于大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。综上，本发明的技术方案在工业生产成本和效率方面具有显著的优势。

附图说明

图1：地衣芽孢杆菌2’-FL合成途径的设计；

图2：重组质粒结构图；A，pHYH123表达载体，B，pHTH45表达载体；

图3：重组质粒物理图谱；

图4：发酵上清液中2’-FL的离子色谱定量分析；

图5：不同培养温度条件下摇瓶中2’-FL含量随时间的变化；

图6：地衣芽孢杆菌工程菌BLH2补料分批发酵生产2’-FL的过程曲线。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

(一)培养基

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。加入20g/L琼脂粉，以配制LB固体培养基。

摇瓶发酵培养基：蔗糖75g/L、乳糖40g/L、棉籽蛋白30g/L、K

发酵培养基1：棉籽蛋白30g/L、蔗糖75g/L、乳糖80g/L、K

发酵培养基2：棉籽蛋白30g/L、玉米粉75g/L、乳糖80g/L、K

发酵培养基3：棉籽蛋白30g/L、糊精75g/L、乳糖80g/L、K

(二)2’-FL的提取及检测

发酵液于12000r/min离心5min,取上清液经0.22μm膜过滤处理,利用HPLC进行检测。HPLC检测条件：示差折光检测器；色谱柱为Polyamino HILIC 5μm 250*4.6mm(迪马科技,中国),柱温为40℃；流动相为75％的乙腈水溶液,流速为0.8mL/min；进样量为10μL

(三)下述实施例中涉及的菌株和引物。

表1本发明中涉及的菌株

表2引物序列

实施例1构建重组地衣芽孢杆菌BLH6

通过重叠延伸PCR将P

分别使用引物对P1-P5扩增基因表达片段SEQ ID NO.8-12，从而在基因片段两端引入酶切位点。反应条件为：95℃预变性5min后进入下一循环94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s,30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。依次利用同源重组的方法将基因表达片段SEQ ID NO.8-10连接入pHY质粒，得到重组质粒pHY-H123(图2)。再依次利用同源重组的方法将基因表达片段SEQ ID NO.11和12连接入pHT43质粒，得到重组质粒pHT-H45(图2)。利用1％琼脂糖凝胶电泳进一步验证质粒的构建情况(图3)。

将成功构建的重组质粒pHYH123按照Li,Y.；Jin,K.；Zhang,L.；Ding,Z.；Gu,Z.；Shi,G.Development of an Inducible Secretory Expression System in Bacilluslicheniformis Based on an Engineered Xylose Operon.Journal of Agriculturaland Food Chemistry 2018,66,9456-9464.的方法转化地衣芽孢杆菌ATCC 9945A，获得地衣芽孢杆菌工程菌BLH1。

再将重组质粒pHT-H45以上述相同的方法转化地衣芽孢杆菌工程菌BLH1，获得重组地衣芽孢杆菌菌BLH2。

实施例2 2’-FL的摇瓶发酵

将实施例1中构建的地衣芽孢杆菌工程菌BLH2在LB平板上划线活化，37℃培养16h后挑取单菌落接种于15mL LB培养基中37℃、250r·min

实施例3碳源种类及浓度对重组菌表达的影响

将实施例1中构建的地衣芽孢杆菌工程菌BLH2在LB平板上划线活化，37℃培养16h后挑取单菌落接种于15mL LB培养基中37℃、250r·min

将摇瓶发酵培养基中的碳源(75g/L蔗糖)更换为不同浓度的糊精、玉米粉或蔗糖(浓度分别为30g/L、45g/L、60g/L、75g/L、90g/L)，以探究不同碳源种类及其浓度对工程菌BLH2发酵生产2’-FL的影响。结果如表3所示，不同碳源浓度对地衣芽孢杆菌工程菌BLH2发酵影响如表1，以75g/L蔗糖为碳源，可以获得2’-FL的最大产量为6.02g/L；而以75g/L玉米粉为碳源，可以获得5.5g/L 2’-FL。这表明地衣芽孢杆菌工程菌BLH2在玉米粉或蔗糖作为主要碳源的培养基中都可以较好地生长和合成产物，同样，也可以利用糊精作为碳源进行生长。

表3不同碳源种类及浓度对重组菌发酵的影响

实施例4以蔗糖和乳糖为碳源在20L发酵罐规模2’-FL的生产

将实施例1中构建的地衣芽孢杆菌工程菌BLH2在LB平板上划线活化，37℃培养16h后挑取单菌落接种于15mL LB培养基中37℃、250r·min

发酵温度42℃、初始pH7.5。当发酵过程中pH下降到7.0时通过补加50％氨水使得发酵过程中pH维持在7.0左右，发酵过程中通气量控制在0.5vvm，将搅拌与DO偶联控制DO维持在30％左右，转速上限设置为900rpm。发酵8h后连续补加蔗糖，维持其不被耗尽。

发酵罐规模的补料分批发酵结果如图6所示，在经过了46h的发酵后2’-FL的产量达到36g/L，最大OD

表4发酵罐过程参数

实施例5以玉米粉和乳糖为碳源在20L发酵罐规模2’-FL的生产

将实施例1中构建的地衣芽孢杆菌工程菌BLH2在LB平板上划线活化，37℃培养16h后挑取单菌落接种于15mL LB培养基中37℃、250r·min

发酵温度42℃、初始pH7.5。当发酵过程中pH下降到7.0时通过补加50％氨水使得发酵过程中pH维持在7.0左右，发酵过程中通气量控制在0.5vvm，将搅拌与DO偶联控制DO维持在30％左右，转速上限设置为900rpm。发酵12h后一次性补加玉米粉至终浓度为120g/L。

在经过了56h的发酵后2’-FL的产量达到29g/L，最大OD

实施例6以糊精和乳糖为碳源在20L发酵罐规模2’-FL的生产

将实施例1中构建的地衣芽孢杆菌工程菌BLH2在LB平板上划线活化，37℃培养16h后挑取单菌落接种于15mL LB培养基中37℃、250r·min

发酵温度42℃、初始pH7.5。当发酵过程中pH下降到7.0时通过补加50％氨水使得发酵过程中pH维持在7.0左右，发酵过程中通气量控制在0.5vvm，将搅拌与DO偶联控制DO维持在30％左右，转速上限设置为900rpm。发酵8h后连续补加糊精，维持其不被耗尽。

在经过了48h的发酵后2’-FL的产量达到28.1g/L，最大OD

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。