一种植物乳杆菌菌粉及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于益生菌菌粉技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌菌粉及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，益生菌的益生功效被不断证实，全球科技界与产业界对益生菌具有调节人体健康的作用已达成共识，益生菌当前备受关注。目前益生菌产业的下游产品横跨发酵乳品、乳饮料、休闲零食、膳食补充剂、日化用品及动物饲料等多个领域，产品品类丰富，其中主要可以分为益生菌功能性食品(85.9％)、保健食品与药品(8.6％)和益生菌原料(5.6％)三大类。据测算，全球益生菌市场规模约为500亿元，且随着COVID-19的爆发，益生菌对免疫健康的支持作用成为消费者购买益生菌产品的重要原因，预计2025年全球益生菌产业的产值将超770亿美元，益生菌市场存在着巨大的发展前景。

基于益生菌的益生功能，使其成为调节身体机能和促进人体健康的产品是益生菌领域研究的最终目标，将益生菌掺入货架上稳定的食品和饮料中是重要创新之一。益生菌发挥益生作用与每日摄入量有密切联系，研究报道当益生菌在肠道的活菌数大于10

如CN 11514112 A名称为“一种利用喷雾干燥技术制备肠溶复合微胶囊的方法”的发明专利，具体公开了适合于包埋益生菌或者双氯芬酸钠等固体药物粉末，采用天然高分子材料如酪蛋白，胶原蛋白为肠溶型微胶囊壁材，在常温下利用复凝聚法与喷雾干燥相结合的工艺，制备大小均匀的肠溶复合微胶囊。该方法要求微胶囊益生菌溶液体系的粒径尺寸≤500μm，而使用的黄原胶、果胶及明胶等壁材常温不易溶解或溶解度较低，与蛋白质溶液简单混合后难以保障。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌菌粉及其制备方法与应用，该方法利用抗性淀粉高糊化温度、稳定的晶体结构及其益生元属性的优势，联合乳清蛋白良好的凝胶成膜特性，辅以抗热保护剂，三者良好耦合为益生菌形成一个良好的耐热载体，实现植物乳杆菌菌体在喷雾干燥过程中保持良好生活能力，所获植物乳杆菌菌粉的活菌数较高、含水率较低，符合益生菌食品的相关标准；且具有良好的感官特征及良好的粉末特性，可作为粉剂直接温水冲泡饮用；同时该菌粉能够在酸性环境中具有较高的菌体存活率，可添加至酸奶等食品中消费；该菌粉具有良好的消化系统耐受性，能够以足够数量的活菌到达结肠。

为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

第一方面，提供一种植物乳杆菌菌粉，菌粉的壁材包括抗性淀粉与乳清蛋白以及抗热保护剂，菌粉的菌体为植物乳杆菌TH103，TH103菌株已在申请号为201510385613.6的中国发明专利(一种植物乳杆菌TH103及其用途)中公开，保藏编号为CGMCC10739。

抗性淀粉、乳清蛋白及抗热保护剂的质量百分比为7～23％，其中抗性淀粉与乳清蛋白的总质量百分比为3～15％、抗热保护剂的质量百分比为4～8％；菌粉的活菌数为(3.5-9.0)×10

进一步地，抗性淀粉为RS2、RS3或RS4，优选RS3；抗热保护剂为蔗糖或海藻糖，优选海藻糖；

进一步地，抗性淀粉与乳清蛋白的质量比为1:3-1:9。

第二方面，提供一种植物乳杆菌菌粉的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)按1％接种量培养活化的植物乳杆菌TH103，培养12h后低温离心菌液，用生理盐水洗涤菌体，得浓缩植物乳杆菌悬液，冷藏备用；

(2)将抗性淀粉水溶液进行沸水处理10min，冷却至室温得溶液A；

(3)将乳清蛋白水溶液与抗热保护剂混合，于60℃水浴中处理30min，冷却至室温得溶液B；

(4)将溶液A与溶液B充分混合后，将步骤(1)所得浓缩植物乳杆菌悬液加入其中，混合均匀后即得到植物乳杆菌菌液；

(5)将步骤(4)得到的植物乳杆菌菌液边搅拌边进行喷雾干燥，得到植物乳杆菌菌粉。喷雾干燥的进风温度为100-140℃、进气量为30％-70％、进料流速为5-10mL/min。

进一步地，步骤(1)中的活化的植物乳杆菌TH103是在37℃左右的环境条件下，将冻存的植物乳杆菌TH103缓慢融化，在MRS固体培养基中划线培养24h，然后在平板上挑取形状良好的菌落接种于MRS液体培养基，在37℃左右的温度下培养24h后获得种子液，按1％的比例将种子液接种于MRS液体培养基，12h后离心收集菌体，用无菌生理盐水进行洗涤、悬浮，获得浓缩植物乳杆菌悬液；浓缩浓度为10倍。

进一步地，步骤(2)中，先将抗性淀粉添加到灭菌后的离子水中，搅拌均匀后于沸水浴中处理10min后冷却至室温备用；抗性淀粉的浓度为0.3-3.75％。

进一步地，步骤(3)中，先将乳清蛋白添加到灭菌后的离子水中，4℃条件下过夜充分水合，然后将一定比例的抗热保护剂加入到水合好的乳清蛋白溶液中，搅拌均匀后于60℃水浴中处理30min，冷却至室温备用；乳清蛋白溶液的浓度为2.25-13.5％；抗热保护剂的添加量为4-8％。

进一步地，步骤(4)中，收集获得的植物乳杆菌菌粉，保存在4℃条件下备用。

第三方面，提供一种植物乳杆菌菌粉的应用，菌粉可作为粉剂直接冲泡，或用于酸奶等发酵食品中。

本发明的有益效果为：

(1)本发明以抗性淀粉和乳清蛋白为保护性载体、辅以抗热保护剂，实现了利用喷雾干燥法制备植物乳杆菌菌粉，所获得的植物乳杆菌菌粉活菌数、水分含量均符合益生菌食品相关要求，且具有良好的粉体性质，可直接以粉体形式进行冲泡或应用于酸奶等发酵食品中。推荐该菌粉冷藏或冷冻保存，其中4℃条件下的理论保质期为233天。

(2)抗性淀粉的高糊化温度与乳清蛋白良好的成膜性及凝胶特性，使两者在菌体周围共同形成了较为致密厚实的保护体，降低了喷雾干燥过程中高温气流对菌体的损伤；同时抗性淀粉的耐酶特性及其益生元属性使获得的植物乳杆菌菌粉可以顺利通过肠胃道消化系统而以较高活菌数到达结肠；再者蛋白变性后肽链的展开使其分子内部的活性基团暴漏后赋予了菌粉较好的冲泡特性。

附图说明

图1为本发明实施例提供的植物乳杆菌菌粉的表面结构示意图；

图2为本发明实施例提供的植物乳杆菌菌粉的截面结构示意图；

图3为本发明实施例提供的植物乳杆菌菌粉的冲泡特性及效果图；

图4为本发明实施例提供的植物乳杆菌菌粉在酸奶中的活菌数变化曲线图；

图5为本发明实施例提供的植物乳杆菌菌粉的消化系统释放特性示意图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

下述实施例中使用的MRS液体培养基可以从商业途径购得；原料均为食品级，无毒副作用，食用具有安全性和营养价值。

实施例1以抗性淀粉RS3、乳清蛋白和海藻糖为保护性载体

(1)浓缩植物乳杆菌菌液制备：37℃条件下将冻存的TH103缓慢融化，然后在超净工作台内将菌液接种到100mLMRS液体培养基中，在恒温恒湿箱中于37℃温度下培养12h；然后挑起单菌落接种于100mL液体培养基中于37℃、150r/min培养24h，得到活化的植物乳杆菌。将活化的植物乳杆菌按1％的体积比接种到MRS液体培养基中，置于恒温恒湿箱中，在37℃温度下培养12h，4000r/min离心15min收集菌体，并用生理盐水洗涤菌体1次，而后悬浮于10mL无菌生理盐水中。

(2)称取3.33g RS3抗性淀粉加入至50mL无菌水中摇匀，放置于沸水浴中处理10min后冷却至室温备用。

(3)称取16.67g乳清蛋白加入至150mL无菌水中，搅拌溶解后放置于4℃冰箱过夜，充分水合后向其中加入12g海藻糖，搅拌10min，随后将乳清蛋白-海藻糖混合溶液放置于60℃水浴中处理30min，然后冷却至室温。

(4)将冷却后的RS3抗性淀粉溶液与乳清蛋白-海藻糖溶液混合，搅拌均匀后，加入浓缩植物乳杆菌菌液并搅拌。

(5)将上述混合菌液进行喷雾干燥，设置进风温度120℃、30％进风量、7mL/min的物料流，得到乳白色植物乳杆菌菌粉，其活菌约为8.93×10

实施例2以抗性淀粉RS2、乳清蛋白和海藻糖为保护性载体

称取3.33g RS2抗性淀粉加入至50mL无菌水中摇匀，放置于沸水浴中处理10min后冷却至室温备用。

其他制备方法同上述实施例1。得到乳白色植物乳杆菌菌粉，其活菌约为8.46×10

实施例3以抗性淀粉RS4、乳清蛋白和海藻糖为保护性载体

称取3.33g RS4抗性淀粉加入至50mL无菌水中摇匀，放置于沸水浴中处理10min后冷却至室温备用。

其他制备方法同上述实施例1。得到乳白色植物乳杆菌菌粉，其活菌约为8.52×10

实施例4以抗性淀粉RS3、乳清蛋白和海藻糖为保护性载体

具体制备方法同实施例1，但改变抗性淀粉RS3与乳清蛋白保护载体的含量及两者之间的比例，其中抗性淀粉RS3与乳清蛋白的总质量百分比为3％、抗性淀粉与乳清蛋白的比例为1:9。得到的植物乳杆菌菌粉，其活菌约为6.74×10

实施例5以抗性淀粉RS3、乳清蛋白和海藻糖为保护性载体

具体制备方法同实施例1，但改变抗性淀粉RS3与乳清蛋白保护载体的含量及两者之间的比例，其中抗性淀粉RS3与乳清蛋白的总质量百分比为15％、抗性淀粉与乳清蛋白的比例为1:3。得到的植物乳杆菌菌粉，其活菌约为3.52×10

此外，在其他具体实施方式中，还包括抗性淀粉RS2、RS3、乳清蛋白与其他抗热干燥保护剂如蔗糖等的复配，不局限于上述实施例中的列举。

实施例6

将上述实施例制备得到的植物乳杆菌菌粉按照以下方法进行评价：

1.植物乳杆菌菌粉的粉体粒径、粉体性质及微观结构测定

1.1将上述实施1得到的植物乳杆菌菌粉采用动态光散射法Mastersizer2000对粉体粒径的粒度分布进行湿法分析；对菌粉的休止角进行测定。结果如下：

结果表明，本发明得到的植物乳杆菌菌粉粉体粒度较小、具有良好的粉体流动性(休止角＜40°)。

1.2将上述实施例得到的植物乳杆菌菌粉进行表面喷金、采用SU8020场发射扫描电子显微镜观察其表面形貌结构，如图1所示；其次对菌粉进行树脂包埋切片处理，然后对其截面进行观察，进一步了解菌粉的内部结构，如图2所示。

由图1可知，经喷雾干燥制得的植物乳杆菌TH103菌粉微观上为球形颗粒、整体结构完整、表面褶皱有凹痕但无裂缝且无益生菌残留；进一步结合菌粉内部结构，即图2可知，TH103菌体与壁材相互混合后共同被包裹在保护壁材内，从而形成完整的菌粉。

2.植物乳杆菌菌粉的最佳冲泡温度探究

将上述实施例1、2、3得到的植物乳杆菌菌粉进行最适冲泡温度研究。选择4℃冰水、常温水、40℃温水、75℃热水、沸水作为冲调温度，称取0.5g植物乳杆菌菌粉快速加入至不同温度的含有50mL无菌水的三角瓶中，于摇床中缓慢摇匀15min后，取1mL冲调溶液进行解囊处理，然后进行平板计数，以初始植物乳杆菌菌粉活菌数为对照。

经过测定，植物乳杆菌菌粉经过不同温度水冲泡后的活菌数如图3所示。由图3可知，三种植物乳杆菌菌粉经沸水冲泡后其活菌数都下降至10

3.植物乳杆菌菌粉在酸奶中的应用

将上述实施例1、2、3得到的植物乳杆菌菌粉加入酸奶中，具体操作为分别称取若干1g植物乳杆菌菌粉放置于100g酸奶中，储存21天，分别于0、2、5、10、15、21天进行平板活菌计数，并以等数量的植物乳杆菌裸菌液直接加入100g酸奶中作为对照。

经过测定，植物乳杆菌菌粉在酸奶保质期内的活菌数变化曲线如图4所示。由图4可知，直接添加植物乳杆菌菌体组(即裸菌组)其活菌数第7天之后数量已经降低至6.7个数量级，21天时已无活菌数检出；而三种植物乳杆菌菌粉在酸奶保质期(4℃，21天)中，活菌数虽均呈一定的下降趋势，但在贮存21天后的活菌数仍能保持在9个数量级；对比实施例1、2、3的植物乳杆菌菌粉在酸奶体系的存活情况，可发现实施1的植物乳杆菌菌粉在保质期内活菌数相对最高，但与其他两种植物乳杆菌菌粉无显著性差异。即本发明所获得的植物乳杆菌菌粉能够很好的提高益生菌菌体在酸奶等发酵食品中的存活能力。

4植物乳杆菌菌粉的消化体系释放特性

取实施例1、2、3中得到的植物乳杆菌菌粉进行消化体系连续释放特性研究，具体操作为分别称取0.5g植物乳杆菌菌粉加入至盛有20mL模拟胃液(pH 2.0,含胃蛋白酶)中，37℃、130r/min恒温水浴震荡处理2h，其中每隔0.5h进行取样检测0.5h、1h、2h，并分别进行解囊平板活菌计数。然后将经处理2h的消化胃液调pH至7.2，取10mL加入至含有10mL肠液(pH 7.4，含胰酶)中并在37℃、130r/min恒温水浴震荡处理4h，每隔1h取样进行活菌平板计数。最后取经处理4h的消化肠液10mL加入至含有10mL模拟结肠液(0.1)处理2h，每隔1h取样直接进行平板计数。并与植物乳杆菌菌体(裸菌组)进行比较。

经过测定，植物乳杆菌菌粉在模拟消化系统的中的存活情况如图5所示。由图5可知，裸菌组的菌体在进入模拟胃液后迅速失活，并在1h后无法检测活菌，说明该益生菌菌体无法在模拟胃液环境中生存；相对应的，本发明所获得的植物乳杆菌菌粉在整个模拟消化期间均能保证9个数量级的活菌数，具体而言，植物乳杆菌菌粉在模拟胃液处理间随着时间的延长活菌数逐渐下降，但在2h后数量级下降不足1个，说明植物乳杆菌菌粉具有较好的耐胃酸能力，即菌粉对植物乳杆菌起到了必要的保护性。此时，菌粉的微观结构表现出一定的破损，并暴露出一定量的益生菌菌体。随后，在模拟肠液和结肠液中，植物乳杆菌菌粉的活菌数量基本保持稳定，未发生明显的数量级下降，在结肠液处理2h后，3种植物乳杆菌菌粉的活菌数量级均在7.5个数量级以上，说明该植物乳杆菌菌粉具有良好的消化系统释放特性及稳定性，能在肠道及结肠部分保证大量的活菌。

5.植物乳杆菌益生菌菌粉储藏加速实验

以实施例1的植物乳杆菌菌粉为例进行储藏加速实验，分别取一定量的植物乳杆菌菌粉置于50℃、60℃、70℃、80℃环境环境条件下，并于2h、4h、6h、8h、10h、12h取样进行解囊平板计数，依据阿伦尼乌斯方程获得个温度条件下植物乳杆菌菌粉的失活速率常数，以此估算植物乳杆菌菌粉的理论保质期。

经过测定，植物乳杆菌菌粉的失活速率如下表所示：

据此，计算本发明所获植物乳杆菌菌粉在4℃的条件下其理论保质期为233天。

本发明以抗性淀粉和乳清蛋白为保护性载体、辅以抗热保护剂，实现了利用喷雾干燥法制备植物乳杆菌菌粉，所获得的植物乳杆菌菌粉活菌数、水分含量均符合益生菌食品相关要求，且具有良好的粉体性质，可直接以粉体形式进行冲泡或应用于酸奶等发酵食品中。推荐该菌粉冷藏或冷冻保存，其中4℃条件下的理论保质期为233天。

于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。