一种基于MPTP诱导的长爪沙鼠帕金森病模型的构建方法

技术领域

本发明涉及疾病模型构建技术领域，具体为一种基于MPTP诱导的长爪沙鼠帕金森病模型的构建方法。

背景技术

帕金森病是一种神经退行性疾病，其主要的病理变化是中脑黑质区多巴胺能神经元的变性缺失以及路易小体的形成。PD患者会出现静止性震颤、运动迟缓、肌肉僵直等典型的运动症状。除此之外，大多数患者也会出现非运动症状，包括失眠症、抑郁症和焦虑症等。目前没有治疗可以改变神经退行性的进程，但是对症治疗可以改变患者的生活质量。治疗方法和手段主要包括药物治疗、手术治疗和运动康复等方法。其中药物治疗为首选，且是整个治疗过程中的主要治疗手段。然而，治疗药物的筛选离不开动物模型。一个好的动物模型有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生发展规律，研究防治措施，是研究工作获得重要进展的关键之一。

非人灵长类如猴，在生理学、行为学和解剖学等方面虽然更接近于人类，然而高额的经济成本和较难的操作过程，以及大众对用猴做为实验对象的不理解等问题，注定了其很难被广泛应用。相比而言，大、小鼠由于饲养容易、操作简单、经济容易获得等优势，被广泛用于PD研究。其中，MPTP诱导的小鼠模型建模周期短(1-2周)，操作简单，可以直接采用腹腔注射或者皮下注射，已成为PD研究中应用最广泛的动物模型。然而，小鼠对MPTP较为敏感，容易导致多巴胺能神经元损伤的同时，也导致了此模型较高的死亡率。此外，在神经系统相关疾病研究过程中，对大小鼠进行行为学实验，发现在探索行为以及运动能力等方面大小鼠活动量较低且易受环境因素的干扰，容易导致造模差异不显著，影响后续实验进程。因此，寻找比小鼠更适合的实验动物具有重要意义。

长爪沙鼠是一种小型草原动物，大小介于大鼠和小鼠之间，目前已被驯化用于生命科学研究。由于其独特的解剖学、生理学和行为学特征，长爪沙鼠已成为在神经生物学等生物医学领域很有特色的实验动物。长爪沙鼠活跃喜动，具有较强的自主探索意识和能力，使其在许多行为学实验中表现出较好的表型。提示，长爪沙鼠可能适合用于建立帕金森病模型。综上所述，需要一种利用MPTP诱导长爪沙鼠建立帕金森病动物模型的方法。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于MPTP诱导的长爪沙鼠帕金森病模型的构建方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于MPTP诱导的长爪沙鼠帕金森病模型的构建方法，包括以下步骤：

S1、选择50只16周龄体重在70±5g的长爪沙鼠公鼠，随机分为5组，每组10只，分别为：saline、MPTP(20mg/kg)、MPTP(40mg/kg)、MPTP(60mg/kg)、MPTP(80mg/kg)，分别对其腹腔注射saline或不同浓度MPTP，统计动物的死亡率和体重变化；

S2、选择40只与S1中相同特征的长爪沙鼠公鼠，随机分为4组，每组10只，分别为：saline、MPTP(7d)、MPTP(14d)、MPTP(21d)，向长爪沙鼠腹腔内注射不同天数的saline或S1中确定的MPTP浓度，记录动物体重变化。

S3、使用S2中的长爪沙鼠，对其进行矿场试验和转棒实验等行为学检测，分析动物神经行为学变化；

S4、使用S2中的长爪沙鼠，获取脑组织进行石蜡切片和TH蛋白检测，分析动物神经元损伤情况；

S5、使用S2中的长爪沙鼠，获取脑组织进行凋亡相关蛋白检测，分析动物神经细胞凋亡情况。

优选的，步骤S1中使用的MPTP的浓度分别是20mg/kg、40mg/kg,、60mg/kg和80mg/kg四个浓度梯度，每天腹腔注射1次，连续7天，并且设置saline组进行对照。

优选的，步骤S1在注射完成之后，观察动物的状态，并统计死亡率和体重变化，初步确定MPTP注射浓度。

优选的，步骤S2在确定注射浓度之后，设置了三个造模时间分别是7天、14天、21天，并设置saline组进行对照。

优选的，根据步骤S2，在选择三个不同的注射时间的组，每天观察动物的状态，记录其体重，并通过开放性旷场实验和转棒实验对其进行神经行为学检测。

优选的，根据步骤S4，我们获取长爪沙鼠的中脑组织进行石蜡切片和提取总蛋白，通过免疫组织化学染色和western blot方法对其中脑多巴胺能神经元损伤情况进行检测。

优选的，根据步骤S5，我们获取长爪沙鼠的中脑组织进行提取总蛋白，通过western blot方法对其中脑凋亡相关蛋白(Bax、Bcl2和Caspase3)进行检测。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种基于MPTP诱导的长爪沙鼠帕金森病模型的构建方法，具备以下有益效果：

1、该MPTP诱导的长爪沙鼠帕金森病模型的实验方法，首先通过对于动物的体重以及状态的检测，初步确定出40mg/kg作为MPTP的使用浓度，在该浓度下长爪沙鼠的死亡率大大降低。

2、该MPTP诱导的长爪沙鼠帕金森病模型的实验方法，通过对动物体重监测和行为学评估，确定了14天作为诱导时间，在这一时间下长爪沙鼠表现出显著运动能力的下降。

3、该MPTP诱导的长爪沙鼠帕金森病模型的实验方法，通过对动物中脑黑质区多巴胺能神经元和凋亡相关蛋白的检测，评估了MPTP(40mg/kg)连续注射14天后，长爪沙鼠的神经损伤情况，显示出MPTP诱导长爪沙鼠出现了帕金森病相关病理损伤。

附图说明

图1为本发明的实验过程图；

图2为本发明中不同浓度的MPTP注射的长爪沙鼠的死亡率以及体重变化情况的示意图；

图3为本发明中使用MPTP注射不同天数长爪沙鼠的体重变化情况以及转棒实验的结果的示意图；

图4为本发明中使用MPTP注射不同天数长爪沙鼠在开放性旷场实验中行进的总距离和中心区域停留时间的示意图；

图5为本发明中使用MPTP注射不同天数长爪沙鼠中脑黑质区多巴胺能神经元损伤情况的示意图；

图6为本发明中使用MPTP注射不同天数长爪沙鼠中脑TH蛋白水平的示意图；

图7为本发明中使用MPTP注射不同天数长爪沙鼠中脑凋亡相关蛋白包括Bcl-2,Caspase 3,Bax的表达水平的示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-7，本发明提供了一种基于MPTP诱导的长爪沙鼠帕金森病模型的构建方法，主要包括以下步骤：

S1、选取16周龄，体重在70±5g的公鼠进行随机分组，包括A:空白对照组(salinetreatment),B:MPTP(20mg/kg),C:MPTP(40mg/kg),D:MPTP(60mg/kg),E:MPTP(80mg/kg)。

S2、提前将MPTP粉末使用生理盐水按照上述浓度进行溶解，通过腹腔注射每天一次，连续7天，观察动物的状态，并记录体重，确定MPTP的使用浓度。

S3、选择同样的的长爪沙鼠进行以下分组，包括：A:空白对照组(salinetreatment),B:MPTP(7d),C:MPTP(14d),D:MPTP(21d),按照上述筛选的浓度腹腔注射MPTP不同天数后，统计小鼠体重变化，并通过行为学实验检测其神经行为学变化。

S4、将步骤S3中的长爪沙鼠安乐死，获取中脑组织，进行石蜡切片，通过免疫组化检测长爪沙鼠中脑黑质区多巴胺能神经元损伤情况。

S5、将步骤S3中的长爪沙鼠安乐死，获取中脑组织，提取总蛋白，通过westernblot实验检测长爪沙鼠中脑中TH蛋白的表达情况。

S6、将步骤S3中的长爪沙鼠安乐死，获取中脑组织，提取总蛋白，通过westernblot实验检测长爪沙鼠中脑中神经细胞损伤情况。

S7开放性旷场实验：在测试开始前三天，长爪沙鼠每天被放置于开放性旷场盒子里(50厘米×50厘米×30厘米)10分钟，使其适应环境，实验过程中，长爪沙鼠在开放性旷场盒子里可以自由移动，位于该区域上方的摄像机不断收集长爪沙鼠的移动轨迹，并统计其在5分钟内移动的总距离以及在中心区域停留的总时间。

S8、转棒实验：在正式实验开展之前，长爪沙鼠被放置在转棒疲劳仪上(直径30厘米，长度60厘米)使其适应转棒环境，在实验过程中，当旋转杆在2分钟内从10转/分钟加速到50转/分钟时，长爪沙鼠被放置在旋转杆的中心，50转/分钟的速度持续了3分钟，在经历了一次适应性训练后，小鼠被允许连续进行三次测试，每次5分钟，中间休息30分钟，然后我们记录每只动物在杆上的停留时间并计算其平均值。

S9、长爪沙鼠在完成行为学实验的测试后，将其安乐死，收集的一部分中脑组织置于4％多聚甲醛中浸泡36小时，然后将其浸泡在不同浓度的酒精中(70％、80％、90％、95％和100％，各1小时)脱水，脱水后在二甲苯中浸泡15分钟以去除酒精，然后在液体蜡中浸泡1小时，然后进行石蜡包埋和切片(厚度为5μm)，随后，根据免疫组化试剂盒的说明书进行免疫组织化学染色。并用抗酪氨酸羟化酶(TH)抗体标记多巴胺能神经元。

S10、另一部分长爪沙鼠中脑组织使用组织研磨仪制成组织匀浆，接着进行蛋白的提取，然后使用Western Blot方法，测定中脑组织中TH和凋亡相关蛋白(Bcl-2,Caspase 3,Bax)的表达。

为配合上述实验方法，现提供如下数据统计：

根据图2(A)中长爪沙鼠的死亡率统计可以看出，与对照组相比，注射60mg/kg以上的MPTP后，长爪沙鼠出现明显的死亡情况；根据图2(B)中长爪沙鼠的体重统计，可以看出，与对照组相比，注射60mg/kg以上的MPTP后，长爪沙鼠体重出现明显的降低。

根据图3(A)中长爪沙鼠的体重统计可以看出，与对照组相比，MPTP连续注射14天，长爪沙鼠体重略有降低(*p<0.05)，MPTP连续注射21天，长爪沙鼠体重有极显著的降低(****p<0.0001)；根据图3(B)中长爪沙鼠在转棒疲劳仪上坚持的时间可以看出，MPTP连续注射14天及以上，长爪沙鼠在转棒疲劳仪上坚持的时间明显缩短(***p<0.001，****p<0.0001)。

根据图4(A)中长爪沙鼠在旷场中的移动轨迹，图4(B)长爪沙鼠在旷场中移动的总距离统计可以看出，MPTP连续注射7天后，长爪沙鼠在旷场中的运动距离减少(*p<0.05)，连续注射14天后，减少更为明显(****p<0.0001)。根据图4(C)中长爪沙鼠在旷场的中心区域停留的时间统计可以看出，MPTP连续注射14天后，长爪沙鼠在在旷场的中心区域停留的时间减少(***p<0.001)。

根据图5(A)中长爪沙鼠中脑黑质区TH-阳性细胞染色(比例尺代表50μm)和图5(B)中长爪沙鼠中脑黑质区TH-阳性细胞统计可以看出，MPTP连续注射7天后，长爪沙鼠中脑黑质区TH-阳性细胞略有减少(*p<0.05)，连续注射14天后，减少更为明显(**p<0.01)。

根据图6(A)中长爪沙鼠中脑中TH蛋白印迹和图6(B)长爪沙鼠中脑中TH蛋白统计可以看出，MPTP连续注射7天后，长爪沙鼠中脑中TH蛋白显著减少(**p<0.01)。

根据图7(A)中长爪沙鼠中脑中凋亡相关蛋白(Caspase3、Bcl2、Bax)印迹和图7(B)中长爪沙鼠中脑中Caspase3蛋白统计可以看出，MPTP连续注射7天后，长爪沙鼠中脑中Caspase3蛋白显著增加(**p<0.01)；根据图7(C)长爪沙鼠中脑中Bcl2蛋白统计，可以看出，MPTP连续注射14天后，长爪沙鼠中脑中Bcl2蛋白显著减少(**p<0.01)；根据图7(D)中长爪沙鼠中脑中Bax蛋白统计可以看出，MPTP连续注射7天后，长爪沙鼠中脑中Bax蛋白显著增加(**p<0.01)。

图1为本发明的实验过程，结合MPTP注射后长爪沙鼠死亡情况、体重变化，以及帕金森病相关病理，最终确定通过腹腔注射40mg/kg的MPTP连续14天，作为诱导长爪沙鼠帕金森病模型的一种方法。

综上所述，该发明提供了一种长爪沙鼠帕金森病模型的构建方法，一方面是通过注射不同浓度的MPTP，观测长爪沙鼠的状态、体重变化和死亡情况，初步确定MPTP的使用浓度；另一方面，通过使用筛选到的浓度注射不同天数，评估长爪沙鼠神经行为学变化和帕金森病相关病理损伤变化，以确定MPTP在合适浓度下的注射时间，综合本实验最终确定腹腔注射40mg/kg的MPTP连续14天，作为诱导长爪沙鼠帕金森病模型的一种方法；此种方法诱导的长爪沙鼠，表现出中脑多巴胺能能神经元损伤和运动功能下降等帕金森病相关病理，并且诱导过程中死亡率低，神经行为学差异明显；进一步丰富了帕金森病动物模型体系，有望为帕金森病相关研究提供一种有效的模型工具。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。