一种人类活性免疫细胞冻存液及其冻存方法

技术领域

本发明涉及细胞冻存技术领域，尤其涉及一种人类活性免疫细胞冻存液及其冻存方法。

背景技术

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，免疫细胞疗法是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，以激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。目前体细胞免疫治疗已成为肿瘤患者放疗、化疗后辅助治疗的重要手段之一，其对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及骨髓净化都具有良好效果。

目前，采集肿瘤病人体内的免疫细胞往往需要在化疗之前进行，于是就产生了病人放化疗的时间和免疫细胞回输时间的冲突。而细胞冻存技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已有深入广泛的应用，通过对供体的免疫细胞深低温保存保持其活力和功能，免疫细胞在-70℃～-80℃冻存，细胞活性会随着冷冻时间的延长迅速下降，细胞冷冻技术无论对临床还是基础研究均具有重要意义。

细胞冻存经常采用渗透性保护剂，例如甘油和二甲基亚砜两种，甘油作为冷冻保护剂冻存的免疫细胞存活率较低，而二甲基亚砜作为目前常用的细胞冷冻保存剂，但其具有一定的细胞毒性，复苏后的细胞必须进行洗脱，洗脱后的细胞应用于临床仍易引起病人诸多副作用。

因而，研制一种未添加二甲基亚砜并能够促进冷冻保存下免疫细胞存活率，并达到能够长期保存免疫细胞效果的冻存液，具有极好的研究前景。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种人类活性免疫细胞冻存液及其冻存方法。

一种人类活性免疫细胞冻存液，其组分包括：

聚乙二醇                                     1-2.5mg/ml，

1,3-丙二醇                                   1-3mg/ml，

所述聚乙二醇相对分子质量为800-1200。

优选地，聚乙二醇、1,3-丙二醇、壬基酚聚氧乙烯醚-10的质量比为1500-2000：1500-2500：0.2-0.3。

优选地，葡聚糖、海藻糖、苜蓿素的质量比为15-25：20-40：13-17。

优选地，海藻糖、半乳糖胺、唾液酸的质量比为0.2-0.4：0.02-0.04：0.02-0.04。

一种人类活性免疫细胞的冻存方法，包括如下步骤：

取外周血于离心管中，25℃离心25-35min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，加到Ficoll层上使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；

将外周血单核细胞与上述人类活性免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-80℃，冻存10h，然后转入液氮中冻存。

优选地，细胞悬浮液中细胞的浓度为2-4×10

优选地，程序降温至-80℃的具体操作如下：首先以1-2℃/min的速度降温至4℃，保温1-3min，以4-10℃/min的速度降温至-10～-20℃，保温5-15min，以2-6℃/min的速度降温至-80℃。

一种人类活性免疫细胞的冻存复苏方法，包括如下步骤：取出上述冻存方法所得冻存管快速置于37℃恒温水浴锅中1-3min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤2-4次。

本发明的技术效果如下所示：

(1)本发明不添加二甲基亚砜，采用聚乙二醇与1,3-丙二醇、壬基酚聚氧乙烯醚-10复配，改变细胞膜的通透性，使细胞内自由水排出细胞外，避免冻存对细胞产生损害；而海藻糖与葡聚糖、苜蓿素复配，在保证细胞快速恢复活性的基础上，其增殖能力极为优越；申请人发现，进一步向其中添加半乳糖胺、唾液酸，其增殖能力在原有基础上，可进一步增强至少20％，具有显著的差异性。

(2)而在聚乙二醇在水溶液中，由于其分子表面带有微弱的负电荷，通过添加草酸钙，可有效提高唾液酸、壳聚糖与聚乙二醇的亲和性，不仅可有效调节体系渗透压，而且可通过静电诱导与水牢固结合，显著抑制冰晶的生长，同时配合程序降温方式，可使冻存过程平稳度过相变点，避免冻存过程对细破坏，既对冻存细胞具有极好的保护作用，又使细胞复苏后细胞活力极有优秀，即使对于大规模免疫细胞的冻存，细胞回收率也可保持较高水平，冻存时间可达几年甚至更长，有效保证冻存液成本。

附图说明

图1为采用实施例5与对比例1-2所得冻存液将免疫细胞冻存复苏后细胞存活率对比图。

图2为采用实施例5与对比例1-2所得冻存液将免疫细胞冻存复苏后CD3+CD56表达率对比图。

图3为采用实施例5与对比例1-2所得冻存液将免疫细胞冻存复苏后增殖能力对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

实施例1

一种人类活性免疫细胞冻存液，其组分包括：

聚乙二醇相对分子质量为800-1200。

一种人类活性免疫细胞的冻存方法，包括如下步骤：

取外周血于离心管中，25℃离心25min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，加到Ficoll层上使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；

将外周血单核细胞与上述人类活性免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为2×10

一种人类活性免疫细胞的冻存复苏方法，包括如下步骤：取出上述冻存方法所得冻存管快速置于37℃恒温水浴锅中1min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤2次。

实施例2

一种人类活性免疫细胞冻存液，其组分包括：

聚乙二醇相对分子质量为800-1200。

一种人类活性免疫细胞的冻存方法，包括如下步骤：

取外周血于离心管中，25℃离心35min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，加到Ficoll层上使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；

将外周血单核细胞与上述人类活性免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为4×10

一种人类活性免疫细胞的冻存复苏方法，包括如下步骤：取出上述冻存方法所得冻存管快速置于37℃恒温水浴锅中3min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤4次。

实施例3

一种人类活性免疫细胞冻存液，其组分包括：

聚乙二醇相对分子质量为1000。

一种人类活性免疫细胞的冻存方法，包括如下步骤：

取外周血于离心管中，25℃离心29min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，加到Ficoll层上使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；

将外周血单核细胞与上述人类活性免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为2.8×10

一种人类活性免疫细胞的冻存复苏方法，包括如下步骤：取出上述冻存方法所得冻存管快速置于37℃恒温水浴锅中2min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤3次。

实施例4

一种人类活性免疫细胞冻存液，其组分包括：

聚乙二醇相对分子质量为800-1200。

一种人类活性免疫细胞的冻存方法，包括如下步骤：

取外周血于离心管中，25℃离心31min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，加到Ficoll层上使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；

将外周血单核细胞与上述人类活性免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为2.9×10

一种人类活性免疫细胞的冻存复苏方法，包括如下步骤：取出上述冻存方法所得冻存管快速置于37℃恒温水浴锅中2min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤3次。

实施例5

一种人类活性免疫细胞冻存液，其组分包括：

聚乙二醇相对分子质量为1000。

一种人类活性免疫细胞的冻存方法，包括如下步骤：

取外周血于离心管中，25℃离心30min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，加到Ficoll层上使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；

将外周血单核细胞与上述人类活性免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为3×10

一种人类活性免疫细胞的冻存复苏方法，包括如下步骤：取出上述冻存方法所得冻存管快速置于37℃恒温水浴锅中2min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤3次。

对比例1

一种人类活性免疫细胞冻存液，其组分包括：

聚乙二醇相对分子质量为1000。

一种人类活性免疫细胞的冻存方法，包括如下步骤：

取外周血于离心管中，25℃离心30min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，加到Ficoll层上使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；

将外周血单核细胞与上述人类活性免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为3×10

对比例2

一种人类活性免疫细胞冻存液，其组分包括：

聚乙二醇相对分子质量为1000。

一种人类活性免疫细胞的冻存方法，包括如下步骤：

取外周血于离心管中，25℃离心30min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，加到Ficoll层上使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；

将外周血单核细胞与上述人类活性免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为3×10

将实施例5和对比例1-2的冻存方法中所得细胞悬浮液加入冻存管中，每管1mL；各组试样分为四小组，每小组5个重复，即每组试样各有20管细胞；冻存盒中，程序降温至-60℃，冻存10h，然后转入液氮中冻存。

分别在液氮中保存到相应时间(15d、30d、45d、60d)，每组各取出1个小组免疫细胞，按实施例5中复苏方法执行，将解冻后细胞进行台盼蓝染色计算存活率；同时用流式仪检测CIK的表面标记物CD3与CD56；将复苏后的细胞存活率以及表面标记物取平均值与冻存前细胞的数值进行对比。

取部分上述复苏细胞，另外取未经冻存的外周血单核细胞，按10000个/孔接种到96板中，培养48h后加入10μl CCK-8，37℃共同孵育3h，每组设4个复孔，450nm酶标仪下读取吸光度OD值，实验重复3次。

如图1-图3所示，实施例5组复苏细胞的存活率、活性和增殖能力在各时间点均优于两个对比例组。本申请人认为这是由于本申请通过添加草酸钙，可有效提高唾液酸、壳聚糖与聚乙二醇的亲和性，不仅可有效调节体系渗透压，而且可通过静电诱导与水牢固结合，显著抑制冰晶的生长，同时配合程序降温方式，可使冻存过程平稳度过相变点，避免冻存过程对细破坏，既对冻存细胞具有极好的保护作用，又使细胞复苏后细胞活力极有优秀；同时采用聚乙二醇与1,3-丙二醇、壬基酚聚氧乙烯醚-10复配，改变细胞膜的通透性，使细胞内自由水排出细胞外，避免冻存对细胞产生损害；而海藻糖与葡聚糖、苜蓿素复配，在保证细胞快速恢复活性的基础上，其增殖能力极为优越；申请人发现，进一步向其中添加半乳糖胺、唾液酸，其增殖能力在原有基础上，可进一步增强至少20％，具有显著的差异性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。