一种分离检测三苯基溴化膦衍生物及其有关物质的方法

技术领域

本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种分离检测三苯基溴化膦衍生物及其有关物质的方法。

背景技术

三苯基溴化膦衍生物A是制备匹伐他汀钙的关键原料，也是制备其他药物活性成分的重要中间体。

在生产过程中，起始原料、中间体、聚合体、副反应产物、储藏过程中的降解产物等，都可能被带入终产品成为有关物质而影响产品质量。并且，三苯基溴化膦衍生物A及其有关物质的结构相近，很难实现有效分离。因此，开发科学合理的分离检测方法检测三苯基溴化膦及其有关物质，对于保障药品质量、保障药品的安全性和有效性，进而实现药品质量可控具有十分重要的意义。

CN113092597A公开了一种匹伐他汀钙中间体有关物质的分析方法，采用高效液相色谱法，采用具有较大的二异丁基(SB-C18)侧链基团键合硅胶为填充剂的色谱柱，检测波长为245nm，柱温20-40℃，进样器温度10-20℃，流动相为醋酸铵缓冲溶液和乙腈，等度洗脱。可以检测匹伐他汀钙中间体(即本发明所述三苯基溴化膦衍生物A) 中6种有关物质。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种高效液相色谱法分离检测三苯基溴化膦衍生物A和/或其有关物质的方法，所述方法中色谱柱以多孔石墨化碳为填充剂，流动相A为0.2-1.8％高氯酸水溶液，流动相 B为乙腈和异丙醇的组合，梯度洗脱。

本发明的优选技术方案中，所述三苯基溴化膦衍生物A为[[2- 环丙基-4-(4-氟苯基)-3-喹啉基]甲基]三苯基溴化膦。

本发明的优选技术方案中，所述有关物质选自有关物质B、有关物质 C、有关物质D、有关物质E、有关物质F、有关物质G中的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述色谱柱规格为100*2.1mm、 100*4.6mm、150*3mm、150*4.6mm、250*3mm、250*4.6mm中的任一种。

本发明的优选技术方案中，所述色谱柱填料粒径为3μm或5μm 中的任一种。

本发明的优选技术方案中，流动相A为0.2-1.5％高氯酸水溶液，优选0.2-1.2％高氯酸水溶液，更优选0.2-0.8％高氯酸水溶液。

本发明的优选技术方案中，流动相B中乙腈和异丙醇的体积比为1:0.5-1:1.5，优选为1:0.8-1:1.2，更优选为1:1。

本发明的优选技术方案中，流动相B中添加酸，所述酸的体积占流动相B总体积的0.5-1.5‰。

本发明的优选技术方案中，流动相B中添加酸，所述酸的体积占流动相B总体积的0.8-1.2‰。

本发明的优选技术方案中，所述酸选自高氯酸、磷酸、盐酸、硫酸、甲酸、乙酸、高氯酸钠、三氟乙酸中的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，流速为0.2-1.2ml/min，优选 0.2-0.8ml/min，更优选0.2-0.6ml/min。

本发明的优选技术方案中，进样量为10-20μl。

本发明的优选技术方案中，柱温为25-45℃，优选30-40℃。

本发明的优选技术方案中，检测波长为220-240nm，优选检测波长选自220nm、230nm、240nm中的任一种。

本发明的优选技术方案中，所述梯度洗脱，0-50min时，流动相A：流动相B的体积比为5:95-45:55，优选0-50min时，流动相 A：流动相B的体积比为10:90-30:70，更优选20-50min时，流动相A：流动相B的体积比为10:90-30:70。

本发明的优选技术方案中，所述梯度洗脱，0-20min时，流动相A：流动相B的体积比为30:70-60:40，优选0-20min时，流动相 A：流动相B的体积比为40:60-60:40，更优选0-5min时，流动相A：流动相B的体积比为40:60-55:45。

本发明的优选技术方案中，所述梯度洗脱，51min时，流动相A：流动相B的体积比为30:70-60:40，维持5-20min。

本发明的优选技术方案中，所述待测物质、供试品、对照品的任一种用溶解溶剂溶解或稀释，所述溶解溶剂选自乙腈-水溶液、乙腈-异丙醇、水、甲醇、乙腈、甲醇-水溶液中的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述溶解溶剂为40-60％乙腈-水溶液，优选50％乙腈-水溶液。

本发明的优选技术方案中，所述检测方法中待测物质的任一种之间的分离度不低于1.5，优选不低于2.0。

本发明的优选技术方案中，三苯基溴化膦衍生物A杂质与其有关物质的分离度大于2.0，优选大于4.0，更优选大于6.0。

本发明的优选技术方案中，三苯基溴化膦衍生物A高效液相色谱峰拖尾因子≤3，优选≤2.5。

本发明的优选技术方案中，三苯基溴化膦衍生物A、有关物质B、有关物质C、有关物质D、有关物质E、有关物质F的检测限不大于供试品浓度的0.05％，优选不大于供试品浓度的0.03％，更优选不大于供试品浓度的0.01％。

本发明的优选技术方案中，三苯基溴化膦衍生物A、有关物质B、有关物质C、有关物质D、有关物质E、有关物质F的定量限不大于供试品浓度的0.1％，优选不大于0.05％，更优选不大于0.02％。

本发明的另一目的在于提供本发明分析检测方法分离纯化制得的三苯基溴化膦衍生物A和/或其有关物质的任一种用作标准品或对照品的应用。

本发明的优选技术方案中，所述三苯基溴化膦衍生物A为[[2- 环丙基-4-(4-氟苯基)-3-喹啉基]甲基]三苯基溴化膦。

本发明的优选技术方案中，所述有关物质选自有关物质B、有关物质C、有关物质D、有关物质E、有关物质F或有关物质G中的任一种或其组合。

本发明的另一目的在于提供本发明高效液相色谱法分离检测三苯基溴化膦衍生物A和/或其有关物质的方法在匹伐他汀钙原料药和/或其制剂的质量控制中的应用。

本发明的优选技术方案中，所述匹伐他汀钙制剂选自匹伐他汀钙固体制剂或液体制剂。

本发明的优选技术方案中，所述匹伐他汀钙固体制剂选自片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、干混悬剂、微丸中的任一种。

本发明的优选技术方案中，所述匹伐他汀钙液体制剂选自口服液、糖浆剂、注射剂、喷雾剂、混悬剂中的任一种。

本发明中所述等量，除非另有说明，均按重量计。

除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：

1、本发明通过科学筛选并优化高效液相色谱法的检测条件，包括优化色谱条件和梯度洗脱条件，实现了三苯基溴化膦衍生物A和/ 或其有关物质、及匹伐他汀钙原料药、制剂在制备、存储中产生的多种结构相近、难以分离的有关物质之间的有效分离与检测。本发明的高效液相色谱法中三苯基溴化膦衍生物A与任一种待测有关物质之间的分离度不低于2.0，可用于三苯基溴化膦衍生物A或其衍生物、有关物质分离、含量测定、制备纯化或其有关物质的监控。

2、本发明的高效液相色谱法具有专属性好、灵敏度高等优点，实现了三苯基溴化膦衍生物A及其有关物质的有效分离，有关物质检测限极低。该方法利于三苯基溴化膦衍生物A、匹伐他汀钙原料药及制剂的质量控制，保障药品质量及其安全性，且简便易行，利于降低生产检测成本，适用于工业化、规模化生产的相关要求。

3、本发明用于制备、分离三苯基溴化膦衍生物A及其有关物质，并将其用作三苯基溴化膦衍生物A及其衍生物、匹伐他汀钙原料药或其制剂的对照品或标准品，用于控制原料药、中间体或制剂的质量，保障药品质量及安全性。

附图说明

附图1：实施例1高效液相色谱图；

附图2：对比例1高效液相色谱图。

具体实施方式

下面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以下具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

具体实施方式中,检测方法照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定。

(1)溶液配制(可等浓度或同比例配制)

流动相A：量取1000ml水，加高氯酸5ml，超声20min，即得；

流动相B：量取乙腈500ml，异丙醇500ml，高氯酸1ml，混匀，超声 20min，即得；

稀释剂：量取水500ml，加入乙腈500ml，混匀，即得；

有关物质贮备液(0.5mg/ml)：称取有关物质对照品约10mg，精密称定，置20ml量瓶，加稀释剂适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得；

混合有关物质贮备液：精密量取各有关物质贮备液各1ml，置同一 100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，即得；

分离度溶液(0.1％)：称取三苯基溴化膦衍生物A对照品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加混合杂质贮备液2.0ml，加稀释剂适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得；

供试品溶液(0.5mg/ml)：称取12.5mg待测三苯基溴化膦衍生物A，精密称定，置25ml量瓶中，加稀释剂适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得；

自身对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；

(2)色谱条件

色谱柱：Thermo Hypercarb 150*3mm，3μm

流动相A：0.5％高氯酸

流动相B：乙腈:异丙醇:高氯酸(50:50:0.1)

DAD检测器，检测波长230nm，流速0.5ml/min，柱温40℃，进样体积10μl，稀释剂为50％乙腈水溶液；

照下表进行梯度洗脱：

(3)照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定，计算方式为自身对照法，各物质分离度良好，保留时间、分离度见表 1，测得高效液相谱图见附图1。

表1

(4)进样精密度

精密量取对照溶液10μl，注入液相色谱仪检测，连续进样6次，进样精密度结果见表2。

表2

由表2结果可知，对照溶液连续进样6针，主峰保留时间RSD值为 0.48％，主峰峰面积RSD值为0.35％，说明进样精密度良好。

(1)溶液配制(可等浓度或同比例配制)

流动相A：量取1000ml水，加高氯酸17.5ml，超声20min，即得；流动相B、稀释剂、混合有关物质贮备液、分离度溶液(0.1％)、供试品溶液(0.5mg/ml)、自身对照溶液同实施例1；

(2)色谱条件

色谱柱：Thermo Hypercarb 150*3mm，3μm

流动相A：1.75％高氯酸

流动相B：乙腈:异丙醇:高氯酸(50:50:0.1)

DAD检测器，检测波长230nm，流速0.3ml/min，柱温40℃，进样体积10μl，稀释剂为50％乙腈水溶液；

照下表进行梯度洗脱：

(3)照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定，计算方式为自身对照法，各物质分离度良好，保留时间、分离度见表 3。

表3

三苯基溴化膦衍生物A贮备液：精密称取三苯基溴化膦衍生物A工作对照品10mg，置20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，即得；

各有关物质贮备液：精密称取有关物质B10mg，置20ml量瓶中，加稀释剂适量溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。同法配制有关物质C、有关物质D、有关物质E、有关物质G贮备液，可加适量乙腈助溶；定量限贮备液：分别精密量取上述各贮备液1ml，置同一100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；

检测限(LOD)：精密量取定量限贮备液1ml，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；

定量限(LOQ)：精密量取定量限贮备液2ml，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；

色谱条件同实施例1，精密量取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，试验结果见表4、表5。

表4检测限结果

表5定量限结果

由表4、表5可知，三苯基溴化膦衍生物A及各有关物质定量限S/N ＞10，定量限浓度约为供试品浓度的0.02％，且连续六针LOQ溶液峰面积RSD≤20.0％。三苯基溴化膦衍生物A及各有关物质检测限S/N ＞3，检测限浓度约为供试品浓度的0.01％。该方法灵敏度较好。

各有关物质贮备液：同实施例3配置方法；

有关物质混合贮备液：分别精密量取有关物质C 5ml、其他有关物质贮备液各1ml，置同一20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；

对照溶液：精密量取有关物质混合贮备液1ml，置50ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(自有关物质贮备液起平行配制2份)； 50％回收率溶液：取供试品约25mg，精密称定，置于50ml量瓶中，再精密加入杂质混合贮备液0.5ml，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(平行配制3份)；

100％回收率溶液：取三苯基溴化膦衍生物A供试品约25mg，精密称定，置于50ml量瓶中，再精密加入有关物质混合贮备液1.0ml，加稀释剂适量溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(平行配制3份)； 150％回收率溶液：取三苯基溴化膦衍生物A供试品约25mg，精密称定，置于50ml量瓶中，再精密加入杂质混合贮备液1.5ml，加稀释剂适量溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(平行配制3份)；

色谱条件同实施例1，精密量取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪检测，供试品本底有关物质含量数据采用重复性数据，以外标法计：有关物质B回收率在93.49％-103.10％之间，平均回收率为99.8％，RSD 为4.13％；有关物质C回收率在99.31％-101.60％之间，平均回收率为 100.0％，RSD为0.70％；有关物质D回收率在106.87％-115.40％之间，平均回收率为109.8％，RSD为2.82％；有关物质E回收率在90.07％-95.92％之间，平均回收率为93.7％，RSD为2.36％；有关物质 F回收率在93.55％-101.89％之间，平均回收率为98.9％，RSD为2.95％。该方法准确度良好。

(1)色谱条件：

色谱柱Agilent poroshell 120EC-C18 100mm×4.6mm，2.7μm；流动相A：20mm氯化铵和10mm磷酸盐混合溶液(pH2.5)，流动相B: 甲醇，梯度洗脱，DAD检测器，检测波长230nm；

(2)照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定计算方法为面积归一化法。

可检出峰包括三苯基溴化膦衍生物A、有关物质B、有关物质C、有关物质D、有关物质E可检出，有关物质F和有关物质G无法有效分离检测。主峰拖尾因子4.3，有关物质与主峰的分离度2.64，杂质有关物质间的分离度1.57。高效液相谱图见附图2.

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。