一种芝麻叶外泌体纳米颗粒及其制备方法和在活性成分递送中的应用

技术领域

本发明属于纳米材料及其制备技术领域，具体涉及一种芝麻叶外泌体纳米颗粒及其制备方法和在活性成分递送中的应用。

背景技术

植物来源的天然活性成分，如姜黄素、白藜芦醇、木犀草素等具有抗氧化、抗炎、抗肥胖等生物活性。但由于其强疏水性，化学稳定性差，代谢快，导致其生物利用度低，开发利用受到限制。纳米技术已被应用于提高活性成分的稳定性和生理活性。植物外泌体是具有脂质双层膜的直径约30～150nm的生物纳米结构，其天生富含具有生物活性的蛋白质、脂质、RNA和其他药理活性分子，可以调节受体细胞中的基因和蛋白质表达水平，从而介导多细胞生物的生理及病理功能。同时也可递送化学药物、蛋白质及多肽、基因药物、天然分子等多种活性成分，具有高生物相容性、高耐受性、可生物降解性等特性，被认为是一种理想的药食同源的天然递送载体。

芝麻属于胡麻科胡麻属的一年生草本植物，是世界上最重要的油料作物之一。世界芝麻的种植面积在700万～800万hm

现有植物外泌体制备方法主要包括超速离心法、密度梯度离心法、聚合物沉淀法、超滤法、尺寸排阻色谱、免疫亲和层析法。超速离心法一般耗时长，通常大于5h，且需要使用昂贵的分离设备(如CN110964694A)。聚合物沉淀法和超滤法获得的外泌体纯度较低，其中聚合物沉淀法还往往需要添加额外化学试剂(如CN112574940A，CN114015640A)。尺寸排阻色谱法具有操作简单、重现性好及纯度高等优点，但是获得的外泌体浓度较低，使得外泌体的应用受到限制(如CN114591892A)。免疫亲和层析法分离的外泌体虽然特异性及纯度高，外泌体形态完整，但亲和层析介质昂贵，纯度成本较高(如CN105934670B)。鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明结合超滤法与尺寸排阻色谱法，在提高外泌体纯度的基础上提高其物质含量，该方法简单，易于控制，可高质量、高得率地获得芝麻叶外泌体，具有良好的负载功能，可用于食品、日化用品和药品等领域。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种芝麻叶外泌体纳米颗粒及其高纯度制备方法和应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种负载活性成分的外泌体纳米颗粒及其制备方法和应用，将芝麻叶外泌体纳米颗粒作为具有抗炎作用的活性成分的递送载体，实现了副产物资源利用，提高活性成分的生理活性。

技术方案：为实现上述技术目的，本发明提供了一种芝麻叶外泌体纳米颗粒，所述芝麻叶外泌体纳米颗粒是通过将芝麻叶匀浆后差速离心，再超滤获得芝麻叶外泌体的上清浓缩液，然后将获得的上清浓缩液通过超纯色谱柱进行外泌体的纯化，随后采用超滤管对获得的外泌体进行进一步浓缩，即得。

其中，所述芝麻叶外泌体纳米颗粒粒径为50-60nm。

本发明内容还包括一种负载活性成分的外泌体纳米颗粒，所述负载活性成分的外泌体纳米颗粒是在所述的芝麻叶外泌体纳米颗粒中负载活性成分即得。

其中，所述活性成分为具有生理活性相关物质。

其中，作为优选地，所述活性成分为天然黄酮木犀草素(Lu)。

本发明内容还包括所述的芝麻叶外泌体纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)取芝麻叶，冲洗表面污渍，超纯水润洗后，加入PBS溶液浸泡匀浆，离心，收集上清液；

(2)取步骤(1)的上清液离心，收集上清液；

(3)取步骤(2)的上清液超滤取滤液，获得芝麻叶外泌体的浓缩液；

(4)用超纯色谱柱将浓缩液进行纯化处理，将浓缩液加入到超纯色谱柱中，待所有样品进入色谱柱后，每次加入柱床体积1/12的PBS溶液进行洗脱并收集馏分(即洗脱液)，待出口无液体流出时，该馏分收集完毕，第一次洗脱得到的馏分称为第1馏分，后续洗脱依次得到第2、3、4、5……馏分。合并第2-5馏分，再用超滤管浓缩，根据粒径和形貌分析，结合蛋白分子量和脂质组成判断，其即为外泌体，通过BCA蛋白定量，蛋白含量可达500μg/mL-3mg/mL。

其中，步骤(1)的所述PBS溶液的pH为7.0，浓度为0.01mol/L，所述芝麻叶与PBS溶液的质量体积比为1g：2mL。

其中，步骤(1)中的离心力为1000g，步骤(2)中的离心力为10000g。

本发明内容还包括所述的负载活性成分外泌体纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：将活性成分溶解于乙醇中得到活性成分溶液，将芝麻叶外泌体纳米颗粒与活性成分溶液混合，超声制备得到负载活性成分的外泌体纳米颗粒。

其中，所述活性成分与芝麻叶外泌体的蛋白的质量比为2：1。

本发明内容还包括所述的芝麻叶外泌体纳米颗粒、所述的负载活性成分的外泌体纳米颗粒在活性成分递送或制备治疗抗炎疾病的药物方面的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下：

本发明选用芝麻叶来源的外泌体作为载体，是对副产物的资源合理化利用，将天然活性成分Lu通过超声辅助装入其中，得到高负载量的外泌体。与脂质体等人工合成的纳米颗粒相比，本发明利用芝麻叶来源外泌体作为活性成分载体，具有材料易得、成本低廉，高生物相容性，高负载率、应用领域广泛、操作简便，易于应用的优势。同时，本发明确定了芝麻叶外泌体的负载潜力，研究了负载木犀草素外泌体纳米颗粒的稳定性，体外释放特性和生物利用度，以及体外抗炎活性，显示了用外泌体负载活性成分优势，为芝麻叶外泌体递送体系研究提供基础。

附图说明

图1为制备得到的芝麻叶外泌体(Exo)、负载Lu的外泌体(Exo@Lu)的电镜表征图与粒径分布图。其中a-b为芝麻叶Exo、Exo@Lu透射电镜图；c-d为芝麻叶Exo、Exo@Lu扫描电镜图；图e-f表示Exo、Exo@Lu的粒径分布，分别为156.4nm(PDI＝0.242)、134.2nm(PDI＝0.289)。

图2为得到的芝麻叶Exo、Exo@Lu的基本特征。a为考马斯亮蓝染色观察外泌体的蛋白分布；b为外泌体脂质组成；c为Lu在H

图3为稳定性测试。其中a为温度稳定性；b为光稳定性；c为粒径、电位稳定性其中，I、II分别为Exo、Exo-Lu的粒径稳定性，III、IV为Exo、Exo-Lu的电位稳定性。

图4为细胞毒性测试。其中a-b为Exo、Exo@Lu在0-40μg/mL的细胞毒性测试；c为Lu在0-10μg/mL的细胞毒性测试。

图5为氧化指标测试。其中a为细胞内活性氧(ROS)水平；b为细胞内谷胱甘肽(GSH)水平。

图6为NO释放水平和炎症因子水平测试。其中a为NO水平；b-d分别为肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)水平。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述负载活性成分外泌体生物活性评价进一步说明，以下实施案例只用于对发明进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护范围。

以下各实施例中：

所用芝麻叶为新鲜采摘的芝麻叶；

所用PBS溶液均为pH＝7.0、浓度为0.01mol/L。

实施例1：芝麻叶外泌体纳米颗粒(Exo)的制备

(1)取芝麻叶，冲洗表面污渍，超纯水润洗后，加入PBS溶液(芝麻叶和PBS溶液的质量体积比为1g:2mL)浸泡，匀浆，于4℃离心30min，收集上清液，离心力为1000g。

(2)取步骤(1)的上清液4℃离心30min，收集上清液，离心力为10000g。

(3)取步骤(2)的上清液超滤取滤液，滤膜截留分子量100kDa，获得植物来源外泌体的浓缩液。

(4)用柱床体积为60mL的SuperEV5.0超纯色谱柱将浓缩液进行纯化处理：将步骤(3)所得浓缩液(进样量为5.0mL)加入到超纯色谱柱中，每次用柱床体积1/12的(即5.0mL)PBS溶液进行洗脱，第几次洗脱收集得到的洗脱液为第几馏分，收集第2-5馏分的液体合并(根据粒径和形貌分析，结合蛋白分子量和脂质组成所做的判断)，再用100kDa超滤管浓缩，得到外泌体Exo，通过BCA蛋白定量，蛋白含量为500μg/mL。

实施例2：负载活性成分的外泌体纳米颗粒(Exo@Lu)制备

选取实施例1制备的外泌体Exo即芝麻叶外泌体纳米颗粒体进行活性成分的负载。

(1)取100μL Lu(2mg/mL Lu的乙醇溶液)，添加到200μL的外泌体(500μg/mL蛋白浓度)中，使用超声波细胞破碎仪对反应体系进行超声，on/off 2s，共10个循环，9W。

(2)将超声后的混合液置于37℃，1h，使外泌体膜恢复原状。然后将混合液以3500g的速度通过超滤管(100kDa)4℃下离心10min，得到负载Lu的外泌体，即负载有活性成分的外泌体。

(3)在348nm的吸收波长下测量吸光值，根据下列公式计算负载率(DLE％)。

载入外泌体中的Lu量为184μg，外泌体纳米颗粒的总量为900μg，由此公式可计算出活性成分负载率为20.44％。

实施例3：芝麻叶外泌体纳米颗粒(Exo)和负载有活性成分的外泌体纳米颗粒(Exo@Lu)表征及性能测试

对实施例1制备的芝麻叶外泌体纳米颗粒(Exo)、实施例2制备的负载有活性成分的外泌体进行表征和性能测定。

(1)芝麻叶外泌体纳米颗粒(Exo)和负载有活性成分的外泌体纳米颗粒(Exo@Lu)的表征

采用TEM和SEM分别对实施例1制备的Exo、实施例2制备的Exo@Lu进行电镜拍摄，如图1显示，Exo、Exo@Lu的粒径为50-60nm。采用马尔文激光粒度仪测定水合粒径(MalvernNano-ZS90)，图1e-f表示Exo、Exo@Lu的粒径分布，分别为156.4nm(PDI＝0.242)、134.2nm(PDI＝0.289)。图2a中SDS-PAGE凝胶蛋白电泳显示，Exo分子量为10-17kDa，图2b为芝麻叶外泌体脂质组成，成分为EtherDG(46.65％)、TG(13.75％)、DG(11.04％)、PE(7.76％)、Cer_AP(6.24％)、PC(1.71％)等。图2c表明Lu在Exo中的溶解性较在水中的溶解性好，图2d为FT-IR光谱图，表明Lu成功负载到外泌体中，图2e表示模拟胃肠道消化条件下的Lu释放行为，经过6h的胃肠道消化，Lu释放率为30±0.06％，Exo@Lu中Lu的释放率为12±0.09％，表明Exo@Lu具有缓慢释放活性成分的作用，同时显示生物利用度从70％提高至88％。

(2)负载有活性成分的外泌体稳定性测试

如图3a所示，将Exo@Lu分别置于在25℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃条件下1h，测试Lu的保留率，如图显示25℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃时，Lu的剩余率分别为100％、94±5.89％、92±7.01％、79±2.48％、71±5.23％、71±7.92％，说明负载Lu的外泌体具有良好的热稳定性。如图3b所示，将Lu与Exo@Lu暴露于紫外照射条件下，7h后游离的Lu剩余率为44.9％，而Exo@Lu中Lu剩余率为70.7％，说明负载Lu的外泌体具有良好的光稳定性。如图3c所示，采用马尔文激光粒度仪测得实施例1-2所制备的Exo与Exo@Lu 7天内的粒径和电位大小，Exo的粒径大小约为150nm，Exo@Lu的粒径大小约为130nm，电位为在-7mV上下波动，说明Exo与Exo@Lu具有良好的的粒径、电位稳定性。

(3)细胞毒性性测试

实施例1所制备的芝麻叶外泌体纳米颗粒(Exo)、实施例2制备的负载有活性成分的外泌体纳米颗粒、游离的Lu以小鼠单核巨噬细胞Raw264.7细胞为模型进行细胞学评价结果。将Raw264.7细胞制成5×10

(4)生物活性评价

4.1、抗氧化活性

将Raw264.7细胞制成5×10

4.2、抗炎活性

将Raw264.7细胞制成5×10