一种草菇纤维二糖水解酶及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种新型草菇纤维二糖水解酶，具体来说是一种草菇纤维二糖水解酶及其用途。

背景技术

秸秆是农业生产的常见副产品。根据食物和农业组织，全球谷物秸秆年产量达到大约20亿吨(Aquino et al.,Sustainable rice straw management,2020)。其中作为中国最重要的粮食产区，仅东北地区就每年生产秸秆超过2亿吨(Fu etal.,Remote Sens,2020)。因此，全面秸秆废弃物的资源化利用是环境保护和可持续农业的重大挑战。

青贮是一种基于厌氧乳酸发酵的草料保存策略，能够有效的规避季节性带来的稻草副产品利用问题(Cai et al.，J Clean Prod,2021)。适宜的温度和充足的碳氮原料是成功生产青贮饲料的先决条件。但这种生产需要利用乳杆菌和纤维素酶的外源添加才能高效生产青贮饲料。而大部分纤维素酶的优化温度是超过25℃，因此秸秆青贮在寒冷地区的应用是一项挑战。特别是在中国东北，那里的水稻收割是在冬季(10月)进行的，这不利于正常青贮加工。筛选在低温下保持高活性纤维素酶是一种很有前途的有效青贮策略。

草菇(Volvariella volvacea)被称为“中国菇”，是一种重要的食用菌。草菇菌丝的生长和结实要求比较高的温度(28–35℃)，尤其是其菌丝和子实体不耐低温，即使在常规低温4℃下，菌丝和子实体在短时间内便会软化、液化甚至腐烂，即通常所说的“低温自溶”。这种高温食用菌有一套在低温下保持高表达纤维素酶系统(Gong et al.,PostharvestBiology and Technology,2022)(Gong等人，2022)。然而，迄今为止，这组酶系统在菌丝生长或子实体期表现出非常低的表达水平，缺乏功能特征或应用的研究。这为进一步纤维素酶耐低温适应性功能验证及应用提供了大规模可供挖掘的新型的酶资源。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种草菇纤维二糖水解酶及其用途，所述的这种草菇纤维二糖水解酶及其用途要解决现有技术中的水稻秸秆低温青贮加工效率低的技术问题。

本发明提供了一种低温草菇纤维二糖水解酶，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述的草菇纤维二糖水解酶作为添加物在提高水稻秸秆低温青贮加工效率中的应用。

具体的，所述的低温是指温度指小于或等于10℃。

进一步的，所述的应用，是利用草菇纤维二糖水解酶进行遗传转化提取转化子的粗纤维素酶复合物，然后与植物乳杆菌混合添加到稻草秸秆进行低温青贮加工。

本发明还提供了一种提高水稻秸秆低温青贮加工效率的方法，利用上述的草菇纤维二糖水解酶进行遗传转化，提取转化子的粗纤维素酶复合物，然后与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)混合添加到稻草秸秆进行低温青贮加工。

具体的，所述的一种提高水稻秸秆低温青贮加工效率的方法包括如下步骤：

1)采用上述的草菇纤维二糖水解酶序列，然后通过农杆菌介导的里氏木霉遗传转化获得草菇纤维二糖水解酶转化菌株；

2)提取草菇纤维二糖水解酶转化菌株的粗纤维素酶复合物；

3)将草菇纤维二糖水解酶转化菌株的粗纤维素酶复合物和植物乳杆菌混合添加到稻草，进行水稻秸秆低温青贮加工。

本发明的方法解决了东北等寒冷地区低温不利于纤维素酶活力，进而影响高效生产青贮饲料的问题。

本发明的验证利用草菇纤维二糖水解酶作为添加物提高水稻秸秆低温青贮加工效率的方法的步骤如下：

1)基于草菇基因组数据库的注释信息，获取草菇纤维二糖水解酶VvCBHI-I序列，然后通过农杆菌介导的里氏木霉(Trichoderma reesei)遗传转化获得VvCBHI-I转化菌株；

2)提取转化菌株的粗纤维素酶复合物，使用滤纸做底物，然后进行不同温度下总纤维素酶活性的测定；

3)将草菇纤维二糖水解酶VvCBHI-I进行异源蛋白表达，提取粗纤维素酶复合物，使用PRS做底物，然后进行不同温度下糖化水解能力的测定；

4)将草菇纤维二糖水解酶VvCBHI-I进行异源蛋白表达，提取粗纤维素酶复合物，和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)混合添加到稻草，然后开展稻草低温青贮实验，评价VvCBHI-I粗纤维素酶复合物作为添加物在提高水稻秸秆低温青贮加工的效率。

本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明利用草菇VvCBHI-I的低温糖化水解能力提高稻草秸秆低温青贮加工效率的方法，本发明具有以下优点：

(1)从草菇VvCBHI-I异源表达的转化菌株提取的粗纤维素酶复合物，在10-30℃保持较高的纤维素酶活性。

(2)利用草菇VvCBHI-I的低温糖化水解能力，显著提高稻草秸秆低温青贮加工效率。

(3)证实了草菇具有一个冷适应性纤维素酶的新型资源库。

附图说明

图1VvCBHII的里氏木霉(Trichoderma reesei)转化子和野生型T.reesei提取的粗纤维素酶复合物的滤纸酶活的最优温度。T1：VvCBHI-I的T.reesei转化子；Rut-C30为野生型T.reesei。

图2不同温度下野生型Rut-C30及其转化子T1提取的粗酶制剂水解PRS形成还原糖的产量。

图3加入纯化蛋白的野生型Rut-C30的粗酶制剂水解PRS形成还原糖的产量。Rut-C30:Rut-C30的粗纤维素酶复合物。0.3-vv和0.6-vv:Rut-C30粗纤维素酶复合物加上0.3或0.6mg纯化的VvCBHI-I蛋白。0.3-Tr和0.6-Tr:Rut-C30粗纤维素酶复合物加上0.3或0.6mg纯化的野生型Rut-C30内源TrCBHI蛋白。每个误差条表示三次重复的标准差。

图4转化子T1提取的粗纤维素酶复合物与植物乳杆菌混合添加对低温水稻秸秆青贮的纤维素含量的影响。CK，无菌水；L，植物乳杆菌悬液；LC，植物乳杆菌和Rut-C30粗纤维素酶复合物悬浮液；LT，植物乳杆菌与转化子T1的粗纤维素酶复合物的悬浮液。

图5转化子T1提取的粗纤维素酶复合物与植物乳杆菌混合添加对水稻秸秆低温青贮的半纤维素含量的影响。

图6转化子T1提取的粗纤维素酶复合物与植物乳杆菌混合添加对水稻秸秆低温青贮的还原糖含量的影响。

图7转化子T1提取的粗纤维素酶复合物与植物乳杆菌混合添加对水稻秸秆低温青贮的可溶性蛋白含量的影响。

图8转化子T1提取的粗纤维素酶复合物与植物乳杆菌混合添加对水稻秸秆低温青贮的乳酸含量的影响。

图9转化子T1提取的粗纤维素酶复合物与植物乳杆菌混合添加对水稻秸秆低温青贮的pH的影响。

具体实施方式

实施例1

(1)VvCBHII序列来源和里氏木霉遗传转化

基于草菇基因组数据库的注释信息(Protein ID:Volvo1|114242；https://mycocosm.jgi.doe.gov/Volvo1/Volvo1.home.html)，获取了一个纤维二糖水解酶VvCBHII序列。

具体序列和注释信息如下所示：

>jgi|Volvo1|114242|cellobiohydrolase I-I

ATGTTCCCCAAGTCATCTCTTCTATTTCTTTCTTTCCTCGCCACGGCTTAC

GCCCAACAAGTTGGCACTCAAACAGCCGAGGTCCACCCGTCGCTCAACTG

GGCCAGATGTACCTCCAGCGGATGCACAAACGTCGCTGGCTCCGTCACCCT

TGACGCCAACTGGCGCTGGTTGCACACCACCTCCGGCTACACCAACTGCTA

CACCGGGAACACCTGGAATACCACATTGTGCCCAGATGGTGCCACCTGTGC

TCAGAACTGCGCCCTTGACGGTGCCAGCTACCAATCCACCTACGGAATCAC

CACCAGCGGTAACGCCCTCACCCTCAAATTCGTCACTCAGAGCGCACAGA

AGAACATCGGATCTCGCGTGTACTTGATGGCTAGCGACACTCAATATGAGAT

GTTCCAGCTCCTTAACAAGGAGTTCACCTTTGATGTCGATGTGTCCAACCT

CCCCTGCGGGTTGAACGGAGCATTGTACTTCTCCTCTATGGATGCGGATGG

CGGTATGGCCAAGTACCCGAGCAACAAGGCTGGTGCAAAATACGGCACTG

GTTACTGCGACTCTCAATGTCCACGAGACATCAAGTTCATCAATGGAGAGG

CTAACGTTGCAGGATGGGTCGGCTCTCCGAACGACACGAACGCAGGTACC

GGAAACTGGGGAGCGTGCTGCAATGAGATGGATATCTGGGAAGCCAACTC

AATCTCCGCTGCCTACACTcCCCACCCATGCACAGTTCAAGGTCTATCCCGC

TGCTCTGGTACTGCTTGCGGTACCAATGACCGCTACGGCACCGTCTGCGAT

CCCGACGGCTGCGATTTCAACTCGTACCGCATGGGCGACAAGACCTACTAC

GGCCCCGGCGGAACGGGCGTCGACACCCGCTCCAAGTTCACCGTCGTCAC

CCAATTCCTGACCAACAACAACAGCAGCTCCGGCACACTCTCCGAAATCC

GCCGTCTATACGTCCAGAACGGCCAGGTCGTGCAAAATTCCAAGGTCAACA

TCCCAGGAATGAGTGCGTACGACTCCATCACTGGTGCATTCTGTGATGCCC

AGAAGACTGCCTTTGGCGATACAAGGAGCTTCCAGAACAAGGGTGGCATG

TCGGCTATGGGTCAGGCTTTGGGTACAGGAATGGTCTTAGTCTTGTCCATTT

GGGACGACCACGCAGCCAACATGCTCTGGCTCGACAGCAACTACCCCGTC

GATGCGGACCCAAGCAAGCCTGGTATTGGTCGTGGTACCTGCCCAACCACA

TCCGGCAACCCATCTGATGTCGAGGTCTCTGCTGCCAATTCCTCGGTGACA

TTTTCCAACATCAAGTTCGGTGATATCGGTACTACATACACCGGTGGCTCAG

TCACCACCCCCGGTACTACCTCGGGCACTACGACTTCGACTGCTCCTGGTG

CCGTTCAGACCAAGTGGGGTCAATGTTGCCTTTTCTTCTCTGTCAGCGGTG

GTCAAGGCTGGTCTGGACCCACTCAATGCGAGAGTGGCTCTACATGCACTGTCGTCAACCAATGGTATAGTCAATGTATA(SEQ ID NO.1)。

采用Agrobacterium tumefaciens AGL1(Weili,Beijing,China)进行VvCBHII的T.reesei Rut-C30(ATCC 56765)的遗传转化。对所有选择的转化子进行单孢子培养分离后，采用Real-time PCR技术筛选单拷贝外源基因插入的转化株。将证实的转化株T1培养生长1周后收获，并转移到Sabouraud葡萄糖肉汤(SDB)用于种子培养。将种子培养转移到含有3％(w/v)微晶纤维素(Sangon,Shanghai,China)和2％微晶纤维素的诱导培养基(1:10,v:v)中培养7d。收获培养滤液提取粗纤维素酶配合物用于纤维素酶活性测定和重组蛋白纯化。

(2)里氏木霉转化子粗纤维素酶复合物的酶活性评价

与里氏木霉野生型Rut-C30显著变化的滤纸酶活(FPAs)相比较，在所有测试的温度下，转化子T1的波动较小。其中，与60℃的FPA活性相比，野生型Rut-C30 10℃的FPAs活性低于5％，转化子T1的FPAs仍然保留了其最高活性的一半(图1)。

为了评价VvCBHI-I对天然生物质的水解效率，采用了PRS用作糖化的底物。在10、15和25℃的糖化反应24小时后，与WT相比，来自转化子T1获得的粗纤维素酶复合物明显提升还原糖的释放(在10℃时增加332.24％，P＝0.0089；15℃时增加438.04％，P＝0.0004；25℃时增加172.41％，P＝0.00006)(图2)。(3)VvCBHI-I重组蛋白的制备及低温糖化效率验证

10℃处理24小时，在未添加VvCBHI-I的野生型Rut-C30粗纤维素酶复合物中PRS释放的还原糖的含量极低(即小于0.7mg/mL)。因此，添加内源性纤维素酶对糖化效率的影响较小(0.3或0.6mg纯化TrCBHI-I)(图3)。相比之下，添加了VvCBHI-I处理显著提高了还原糖产量(0.3或0.6mg纯化VvCBHI-I)。加入VvCBHI-I转化子与野生型Rut-C30的还原糖产量曲线明显分叉。这些结果表明低温处理下VvCBHI-I重组蛋白增加了粗纤维素酶复合物糖化效率。

(4)VvCBHI-I转化子的粗纤维素酶添加对提升水稻秸秆低温青贮效率的验证

嗜冷性植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC 1.557购自中国微生物综合培养收集中心。切碎的稻草(500克)用：(i)50mL无菌水(CK)；(ii)50mL L.plantarum(10

所述试验中使用的稻草纤维素和半纤维素含量分别占总干物质35.50％±0.90％和24.75％±0.50％(图4和5)。与此同时，可溶性蛋白质和还原糖分别为0.41％±0.01％和2.39％±0.07％(图6和7)。在15d后，纤维素和半纤维素含量的下降速度减缓，以及还原糖以及LT中的可溶性蛋白的释放速率减缓(图4-7)。而乳酸含量在不断上升(图8)，对应的pH值的变化则趋于平稳(图9)。

在青贮过程15d后，与LC、CK(无菌喷水)，L(植物乳杆菌喷雾悬浮液)相比，LT-喷施青贮显著提高了乳酸的含量(图8)。LT的pH值降低到<4.5，而其他处理组约为5.0或更高(图9)。青贮过程中乳杆菌产生的乳酸pKa＝3.86，乳酸通常是在青贮饲料中发现的浓度最高的酸。这说明植物乳杆菌在LT处理组中生长旺盛，而不是在其它处理中。青贮15d后，LT组的pH值和乳酸含量保持稳定，该组有酸香味，其他组没有。

以上结果表明使用VvCBHI-I纤维素粗酶复合物和L.plantarum的混合添加提高了低温青贮效率。

对比例1

在所有测试的温度下，Rut-C30的滤纸酶活显著变化。在10℃的滤纸酶活活性，与60℃时的活性相比，Rut-C30的滤纸酶活低于5％(图1)。

采用了PRS作糖化的底物，评价VvCBHI-I对天然生物质的水解效率。在10、15和25℃的糖化反应24小时后，WT(Rut-C30)的还原糖的含量明显低于VvCBHI-I异源表达的转化子T1的还原糖的含量(图2)。

对比例2

10℃处理24小时，在未添加VvCBHI-I的Rut-C30粗纤维素酶复合体中PRS释放的还原糖的数量，含量极低(即小于0.7mg/mL)。因此，添加内源性纤维生物水解酶对糖化效率的影响较小(0.3或0.6mg纯化TrCBHI-I)(图3)。

对比例3

在10℃青贮15d后，LC、CK(无菌喷水)，L(植物乳杆菌喷雾悬浮液)处理的乳酸含量明显低于LT-喷施的乳酸含量(图8)。CK组表现出不稳定的pH值和令人不快的气味(图8和9)，表明低温青贮质量较差。

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。