一种基于信号传递的紫外线防护生物控释农药及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物农药技术领域，尤其涉及一种基于信号传递的紫外线防护生物控释农药及其制备方法。

背景技术

目前，由于化学肥料的不合理使用以及工业污染的扩大，土壤问题成为制约农作物增产的关键，如何提高土壤质量、有效修复被污染的土壤成为亟待解决的问题。球孢白僵菌作为一种新型的生物农药，能够分解和降解污染物质，改善土壤结构和质量，增加土壤的通气性、保水性，促进植物生长。因此，球孢白僵菌被广泛应用于土壤的修复中。

然而，球孢白僵菌的使用在很大程度上受到外界环境的制约：过高或者过低的温度和pH以及强烈的紫外线照射都会影响球孢白僵菌的生长和修复能力。其中，紫外线的作用尤为明显。太阳辐射中的短波紫外线(UV-C)具有强烈的杀菌作用，能够抑制球孢白僵菌的代谢活动。为了保护球孢白僵菌在土壤中的活性和增殖能力，人们开发了紫外防护膜用于吸收外界强烈的紫外线。

传统的紫外防护膜仅仅只能起到保护的作用，不能根据外界环境的变化有效地实现控释的作用。因此，有学者利用天然高分子材料的缓释性能，实现″保护+控释″一体化。然而，该结构膜层较薄，很容易在土壤中破裂，无法有效保护球孢白僵菌，也达不到预期的控释效果。在此基础上，又有人试图构建多级紫外防护膜以增加其机械强度，但是膜层的厚度无法准确度量。在过厚的膜层中，仅仅只有表面的防护膜能起到吸收紫外线的作用，造成防护效率的低下和原料的浪费。除此之外，菌体在膜层内部也不能有效地交联附着，内源环境不稳定，生物相容性不高。

因此，目前亟需一种保护效果优良、紫外防护高效、内源环境稳定的紫外线防护生物控释农药来解决上述问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于现有的紫外线防护生物农药保护效果不佳、防护效率不高、菌体难以正常生长，针对现有技术中的缺陷，提供一种基于信号传递的紫外线防护生物控释农药及其制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于信号传递的紫外线防护生物控释农药的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将生物质去除游离水分后高温加热得到多孔生物炭；

(2)将步骤(1)得到的多孔生物炭使用过氧化氢浸渍，得到过氧化氢改性生物炭；

(3)将菌株进行培养后，利用吸附法固定在步骤(2)得到的过氧化氢改性生物炭中，得到负载菌株的过氧化氢改性生物炭；

(4)将步骤(3)得到的负载菌株的过氧化氢改性生物炭加入到框架材料中，得到全包络框架菌株负载的改性生物炭；

(5)将步骤(4)得到的全包络框架菌株负载的改性生物炭与改性纤维素基紫外防护膜进一步络合，得到所述基于信号传递的紫外线防护生物控释农药。

在本发明中，步骤(1)生物质一般经过粉碎，通过在105℃下烘干至重量变化率小于0.1％去除游离水分。高温加热在管式炉中进行。

在本发明中，生物质可以是水稻秸秆、木屑或者是谷壳等。

优选地，步骤(1)中所述高温加热的温度为400～800℃，例如可以是400℃、500℃、600℃、700℃或800℃等。

优选地，步骤(1)中所述高温加热的时间为1～2h，例如可以是1h、1.5h或2h等。

优选地，步骤(2)中所述过氧化氢的浓度为30wt％。

优选地，步骤(2)中所述浸渍结束后，还包括烘干的过程得到所述过氧化氢改性生物炭。在本发明中，浸渍过程中，可适用搅拌器进行搅拌，并且振荡。烘干过程一般设置的温度为105℃。

优选地，步骤(3)中所述培养菌株的培养液为牛肉膏蛋白胨培养液。

优选地，所述牛肉膏蛋白胨培养液的pH值为5.0。

优选地，步骤(3)中所述菌株为球孢白僵菌或枯草芽孢杆菌。

优选地，步骤(3)中所述培养为：在温度为27℃，转速180r/min的摇床上培养7天。

优选地，步骤(3)中所述吸附方法为：在温度为27℃，转速150r/min的摇床上吸附24h。

在本发明中，采用吸附的方法固定化菌体，具体吸附的方法如下：将生物炭加入到玻璃离心管中，然后在121℃灭菌20分钟。在玻璃离心管冷却后将细胞悬浮液添加到管中。随后将细胞悬浮液和生物炭的混合物置于150r/min的旋转摇床上，在27℃下培养24h，直至细胞吸附到生物炭的表面和孔隙上。分离后将生物炭用去离子水多次冲洗以去除未吸附的细胞，得到负载菌体的H

本发明的步骤(4)，是本发明关键的步骤。该步骤将框架材料包络到生物炭上，具体为：(1)将UiO-66-PNIPAM与生物炭以1∶1-1∶3的比例溶解在去离子水中，在磁力搅拌器中以150r/min的转速旋转6h，将框架材料初步覆盖在生物炭的表面。(2)UiO-66和明胶按1：4的比例混合均匀后，将混合物溶解在去离子水中，并用机械搅拌(200r/min)使其均匀分散，直至形成均一的胶体。(3)将步骤1所得到的初步覆盖框架材料的生物炭加入到步骤2所得的UiO-66-PNIPAM/明胶复合体系中，利用恒温振荡器以150-200r/min的转速振荡8-12h，使得框架材料和明胶充分包络生物炭的表面，并且呈现均一性的分布。(4)将制备好的UiO-66-PNIPAM/明胶覆盖的生物炭放置在通风干燥的环境中，将其干燥和固化，最终得到全包络框架菌株负载的改性生物炭。

优选地，步骤(4)中所述框架材料为Uio-66-PNIPAM。Uio-66-NH

优选地，所述Uio-66-PNIPAM的制备方法为：将2-氨基苯二甲酸和ZrCl

PNIPAM为聚(N-异丙基丙烯酰胺)。PNIPAM-NHS溶液为聚N-异丙基丙烯酰胺-N-羟基琥珀酰亚胺酯的溶液。

优选地，步骤(5)中所述改性纤维素基紫外防护膜的制备方法为：将4，4’-二羟基二苯甲酮与甲苯-2，4-二异氰酸酯反应得到紫外吸收交联体，然后将紫外吸收交联体加入到纤维素溶液中，反应得到改性纤维素基紫外防护膜。

在本发明中，紫外吸收交联体与纤维素溶液反应过程中，一般静置6h以上，同时烘干后，在丙酮中浸泡2h，得到改性纤维素基紫外防护膜。

优选地，所述纤维素溶液的制备方法为：将微晶纤维素进行二次活化后，加入氯化锂得到所述纤维素溶液。

优选地，所述二次活化的溶剂为N，N-二甲基乙酰胺。

优选地，所述二次活化的为经过加热反应和降温反应的过程。

优选地，所述加热反应的温度为100～200℃，例如可以是100℃、150℃、180℃或200℃等。

优选地，所述加热反应的时间为30～40min，例如可以是30min、34min、38min或40min等。

优选地，所述降温反应为降温至温度为100～120℃，例如可以是100℃、110℃、115℃或120℃等。

优选地，所述降温反应的时间为20～30min，例如可以是20min、25min或30min等。

本发明还提供了一种如上所述的制备方法制备得到的基于信号传递的紫外线防护生物控释农药。

本发明提供的基于信号传递的紫外线防护生物控释农药，在结构上分为外、中、内三层。其中，外层为改性纤维素基紫外防护膜，用于接受外源性紫外线刺激，将光信号转变为热信号；中间层为Uio-66-PNIPAM，即经过聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)修饰的金属有机框架Uio-66-NH

相比于现有的控释农药，本发明通过三层结构，既实现了紫外线的高效防护，同时又能保证内部菌体生长环境的稳定，达到控释效果。

外层为改性纤维素基紫外防护膜，该膜层可有效的保护生物农药在释放过程中不受紫外线的影响。纤维素膜材料是一种生物可降解的天然高分子材料，不会对环境造成污染，具有良好的生物相容性和机械强度。苯甲酮及其衍生物是常用的紫外线吸收剂，通过苯甲酮基团修饰纤维素材料，可为生物农药设计出一种兼具有缓释和紫外防护能力的膜层。同时该紫外防护膜还能充当外界信号源，将紫外线的光信号转化为热信号并向内传递，使得生物农药达到了精准控释。

生物农药的中层为Uio-66-PNIPAM。其中Uio-66-NH

最内层为负载生物菌的H

基于信号传递的紫外线防护生物控释农药，其信号传递机理如下：

由于外层的改性纤维素基防紫外线膜中存在苯甲酮基团，在紫外光的刺激下，羰基受到激发生成自由基。此时如果环境中存在伯胺类物质，该自由基会发生夺氢反应，伯胺类物质的氢被剥夺，而原有的自由基则会转变为新自由基；如果此时没有氢供体，苯甲酮自由基会在氧气的作用下消除自由基。经过苯甲酮的这一系列转变，紫外线能量被转变为热能释放出来并向内传递，由此实现光信号向热信号的转变。当Uio-66-PNIPAM接收到热信号后便产生温度响应：如果外界的紫外辐射强度较低，即在接受冷应激的情况下，Uio-66-PNIPAM表面的温度响应聚合物会由三维的球网结构向二维的线网结构坍塌，由此生物菌的通道打开，释放速率增加；如果外界的紫外辐射强度较高，即在热应激的情况下，温度响应聚合物则会由二维的线网结构纠缠成三维的球网结构，生物菌无法通过致密的球网，因此释放速率降低。即由Uio-66-PNIPAM实现热信号向生物信号的转变。

实施本发明，具有以下有益效果：

本发明提供的基于信号传递的紫外线防护生物控释农药相比于现有的控释农药，本发明通过三层结构，既实现了紫外线防护效果，同时又能保证内部菌体生长环境，不会对环境造成污染，具有良好的生物相容性和机械强度，同时本发明的紫外防护膜还能充当外界信号源，将紫外线的光信号转化为热信号并向内传递，使得生物农药达到了精准控释的效果。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的基于信号传递的紫外线防护生物控释农药信号传递机理图。

图2是本发明实施例1提供的基于信号传递的紫外线防护生物控释农药紫外防护体系示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)将生物质粉碎后筛分，在105℃烘箱中干燥2h，直至重量变化率小于0.1％，以完全去除游离水分。将上述生物质样品放在管式炉中，以100mL/min的速率通入氮气，以15℃/min的速率加热至750℃并保温2h，得到多孔生物炭。

(2)将多孔生物炭放入烧杯中，并加入30wt％的H

(3)将牛肉膏蛋白胨液体培养液的pH调节为5.0，封口放入灭菌锅，设置灭菌温度121℃灭菌30min，在灭菌后的牛肉膏蛋白胨液体培养基中接种球孢白僵菌。随后将培养基放入恒温摇床，设置温度27℃，转速为180r/min，培养7天。将生物炭加入到玻璃离心管中，随后在121℃灭菌20min。待玻璃离心管冷却后将球孢白僵菌悬浮液添加到管中，将其与生物炭的混合物置于150r/min的旋转摇床上，在27℃培养24h，直至球孢白僵菌吸附到生物炭的表面和孔隙上。分离后将生物炭用去离子水多次冲洗以去除未吸附的菌体，得到负载球孢白僵菌的H

(4)在反应器中添加2-氨基苯二甲酸和ZrCl

(5)在氮气保护下将N，N-二甲基乙酰胺加热到160℃，以除去其中的水分。随后在高温下对已经预干燥的微晶纤维素粉进行活化处理：第一次活化温度为180℃，活化时间为35min，然后降温至120℃进行第二次活化，活化时间为25min。随后在120℃的温度下加入无水氯化锂并保持50min。在室温下冷却后得到纤维素溶液。

(6)称取4，4’-二羟基二苯甲酮加入到烧杯中并用N，N-二甲基乙酰胺进行溶解。随后加入甲苯-2，4-二异氰酸酯，在常温下反应2h，得到紫外吸收交联体。取一定纤维素溶液加入到烧杯中，加入紫外吸收交联体并在室温下静置反应8h，得到改性纤维素基紫外防护膜溶液。

(7)将金属有机框架包络的负载球孢白僵菌生物炭加入到改性纤维素基紫外防护膜溶液中，在磁力搅拌器中以200r/min的速率交联6h，使得紫外防护基团充分嫁接到金属有机框架的空间结构中。在常温下风干后造粒，即得到基于信号传递的紫外线防护生物控释农药。得到的生物控释农药信号传递机理图如图1所示，紫外防护体系示意图如图2所示。

实施例2

(1)将生物质粉碎后筛分，在105℃烘箱中干燥2h，直至重量变化率小于0.1％，以完全去除游离水分。将上述生物质样品放在管式炉中，以100mL/min的速率通入氮气，以20℃/min的速率加热至750℃并保温2h，得到多孔生物炭。

(2)将多孔生物炭放入烧杯中，并加入30wt％的H

(3)将牛肉膏蛋白胨液体培养液的pH调节为5.0，封口放入灭菌锅，设置灭菌温度121℃灭菌30min，在灭菌后的牛肉膏蛋白胨液体培养基中接种枯草芽孢杆菌。随后将培养基放入恒温摇床，设置温度27℃，转速为180r/min，培养7天。将生物炭加入到玻璃离心管中，随后在121℃灭菌20min。待玻璃离心管冷却后将枯草芽孢杆菌悬浮液添加到管中，将其与生物炭的混合物置于150r/min的旋转摇床上，在27℃培养24h，直至枯草芽孢杆菌吸附到生物炭的表面和孔隙上。分离后将生物炭用去离子水多次冲洗以去除未吸附的菌体，得到负载枯草芽孢杆菌的H

(4)在反应器中添加2-氨基苯二甲酸和ZrCl

(5)在氮气保护下将N，N-二甲基乙酰胺加热到150℃，以除去其中的水分。随后在150℃下对已经预干燥的微晶纤维素粉进行活化处理，第一次活化时间为30min，然后降温至100℃进行第二次活化，活化时间为20min。随后在100℃的温度下加入无水氯化锂并保持40min。在室温下冷却后得到纤维素溶液。

(6)称取4，4’-二羟基二苯甲酮加入到烧杯中并用二甲基乙酰胺进行溶解。随后加入甲苯-2，4-二异氰酸酯，在常温下反应2h，得到紫外吸收交联体。取一定纤维素溶液加入到烧杯中，加入紫外吸收交联体并在室温下静置反应6h。烘干后用去离子水多次清洗后，在丙酮中浸泡2h，得到改性纤维素基紫外防护膜。

(7)将改性纤维素基紫外防护膜与金属有机框架包络的负载枯草芽孢杆菌生物炭在室温下充分络合，得到基于信号传递的紫外线防护生物控释农药。

对比例1

本对比例与实施例1的区别仅在于，本对比例不包含步骤(5)和步骤(6)，制备得到生物控释农药。

对比例2

本对比例与实施例1的区别仅在于，本对比例不包含步骤(4)，其余制备过程均与实施例1相同，制备得到生物控释农药。

对比例3

本对比例与实施例1的区别仅在于，本对比例中将步骤(4)中金属有机框架材料Uio-66-PNIPAM替换为介孔二氧化硅，制备得到生物控释农药。

将上述实施例1-2，对比例1-3提供的生物控释农药进行试验，进行田间防治试验，具体过程如下：

在试验田内随机划分等面积的7块土地，除空白组土地不设置任何控释药外，其余每块土地施用各防治方案例，对照组土地施用等量的球孢白僵菌防治药。在实验前、用药后的7、10、14、21天分别采用″五点取样法”测量玉米螟虫数并进行归一化处理，计算害虫衰减率和防治效果。

具体计算公式如下：

害虫衰减率σ(％)＝100％*(N

N

N

防治效率η(％)＝100％*(σ

σ

σ

σ

其中设置对照组，对照组土地施用与试验组等量的球孢白僵菌防治药，空白组不添加任何防治药。得到的具体实验结果如表1所示。

表1

通过表1中数据可以看出：

(1)实施例1和实施例2在田间试验中具有相似的效果，其药后防治效率可达90％以上，表现出最优异的紫外防护性能和控释性能。

(2)用药后7天内以及用药后14-21天内出现了短暂的强紫外天气，由于对比例1缺少改性纤维素基紫外防护膜，外源性光信号无法传入控释体系转变为热信号，因此用药后7天、21天的防治效率相比实施例1和2显著下降。在用药后7-14天遇到弱紫外天气，由于金属有机框架和生物炭的控释作用，在此期间防治效率有所提升并维持在85％附近，与对比例1与实施例1和2的差距并不明显。

(3)对比例2设置了改性纤维素基紫外防护膜，能够将光信号转变为热信号并向内传递，在前期菌体还没有释放出来时具有很好的紫外防护效果，其防治效率与实施例1和实施例2相当。然而由于缺乏PNIPAM修饰的框架材料，无法将热信号转变为生物信号，线网结构与球网结构不能实现应激性转变，因此信号传递过程中断，大量的球孢白僵菌释放，此时遇到药后14-21天的强紫外天气，紫外防护膜无法对控释药体外的球孢白僵菌实现紫外保护，因此这一阶段对比例2的防治效率急剧下降。

(4)对比例3全过程的防治效率均优于对比例1和对比例2，展现出较为良好的紫外防护性能和控释性能，说明完整的信号传递过程对于提高防治效率具有重要作用。然而，介孔二氧化硅的生物相容性较框架材料有所下降，与生物炭的耦合效果同样不如框架材料，因此防治效率仅能维持在85％附近。

(5)实施例1和实施例2与对比例1-3相比可以发现，由于缺乏紫外防护膜或框架材料导致信号传递中断引起的防治效率差异可达20％，而框架材料的替换引起的防治效率差异约为5％，说明在控释体系中起主导作用的是信号传递的过程而非框架材料的选择。

(6)对照组既缺少紫外防护膜又缺少框架材料和生物炭构建的菌体生长环境，因此控释性能和紫外防护性能均远不如实施例1和实施例2。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。