一种大鼠树鼩异种原位肝移植模型建立方法

技术领域

本发明涉及动物肝移植模型制作技术领域，尤其涉及一种大鼠树鼩异种原位肝移植模型建立方法。

背景技术

器官移植是治疗器官衰竭的有效手段，但供体器官的缺乏是器官移植面临的巨大挑战，近年来随着异种移植研究的兴起，为供体来源提供了新的可能。目前异种移植模型多在猪与猴子间展开，但受到猴子资源紧缺、价格昂贵等影响，严重滞缓了异种移植的研究进展。

大鼠原位肝移植是研究肝脏免疫排斥反应、免疫耐受、缺血-再灌注损伤极为重要的动物模型；大鼠原位肝移植方法与人类临床肝移植方法相类似，但是由于手术复杂、死亡率高，并没有得到推广；从首例大鼠肝移植建模成功至今，大鼠原位肝移植术一直再被不断的研究，其也在不断改进和优化；尤其是袖套技术的应用，更是使得大鼠原位肝移植术手术难度降低，成功率上升。

在采用大鼠与树鼩作为异种移植模型的动物，在资源、价格及伦理上切实解决问题，降低了异种移植研究的门槛，能够大大的促进异种移植研究的发展，而在进行肝胆移植的过程中发现，不能快速实现用于连接供受体胆总管的连接管，导致无肝期的时间增加；且在大鼠进行肝胆移植后容易出现移动，使胆总管连接管插入到胆总管支管内，容易导致肝内胆汁积累，不能实现肝内的胆汁运输，甚至流入到大鼠的腹腔内。

发明内容

本发明的目的是提供一种大鼠树鼩异种原位肝移植模型建立方法，胆管穿刺器作为胆总管连接管的辅助工具，可以提高胆总管连接管插入胆总管内的效率和准确度，缩短无肝期时间；限位结构可以避免大鼠在移植后的活动过程中出现胆总管连接管的移动，避免出现胆总管连接管延伸到胆总管支管内容易导致肝内胆汁积累，不能实现肝内的胆汁运输，甚至流入到大鼠腹腔内的现象。

本发明的技术方案是这样实现的：一种大鼠树鼩异种原位肝移植模型建立方法，所述包括以下步骤：

一、动物准备：供受体术前适应性喂养一周，自由饮水、进食；术前禁食12h，不禁水；

二、供肝处理：

S2.1：供体用动物麻醉机麻醉，全身肝素化后游离供肝，备皮开腹，湿棉签纱布覆盖，腔静脉全身肝素化，缝扎左膈下静脉不断，游离隔下肝周韧带；

S2.2：游离肝下下腔静脉，处理到右肾静脉，剥离右肾动脉，结扎右肾静脉；

S2.3：游离肝右后叶韧带，结扎右肾上腺静脉；

S2.4：利用静脉头皮针于腹主动脉近心端扎入，推注20ml灌注液；沿肋骨边缘的膈肌上迅速打开胸腔，夹闭胸主动脉；剪断胸段肝上下腔静脉让灌注液流出，随后可见肝脏由鲜红色逐渐变为土黄色；

S2.5：通过胆管穿刺器对胆总管的管壁进行穿刺；再将胆总管连接管通过胆管穿刺器内部插到穿刺孔内并抽出胆管穿刺器，并通过胆总管连接管上预先设置的第一限位螺母调节其插入胆总管内的深度；

S2.6：游离肝脏，将供肝从供体上取下，置于4℃保存液中；

三、修肝处理

S3.1：分别在门静脉和肝下下腔采用袖套法先行固定有PV管；

S3.2：在肝上下腔两端分别固定8-0针线；

四、受体处理

S4.1：供体用动物麻醉机麻醉，备皮开腹，湿棉签纱布覆盖，缝扎左膈下静脉不断，游离隔下肝周韧带；

S4.2：缝扎食管静脉丛、肝固有动脉；

S4.3：游离并剪断胆总管；

S4.4：游离肝下下腔静脉，结扎右肾上腺静脉；

S4.5：动脉夹阻断肝下下腔静脉，阻断门静脉开始无肝期；

S4.6：从门静脉将肝内血冲入体循环2ml抗生素生理盐水；

S4.7：动脉夹阻断肝上下腔静脉，断离肝上下腔静脉，肝下下腔静脉，门静脉；

S4.8：将受体肝取出，供体肝放在对应位置；

S4.9：8-0线缝合肝上下腔，袖套法连接门静脉和肝下下腔，开放门静脉，结束无肝期；

S4.10：通过胆管穿刺器对受体胆总管的管壁进行穿刺；再将胆总管连接管的另一端通过胆管穿刺器内部插到受体胆总管内，并通过胆总管连接管上预先设置的第二限位螺母调节其在受体胆总管内插入的深度；

S4.11：温生理盐水反复冲洗肝脏和腹腔，使受体复温，吸尽体液；

S4.12：检查出血，缝合肌层及皮肤，观察实验动物一般情况。

进一步的，所述胆管穿刺器包括两端呈开口结构的鞘管，所述鞘管内壁通过若干弹簧连接有三根平行布置的穿刺杆；

三根穿刺杆的右端延伸至鞘管外部并分别连接有穿刺针，左端通过鞘管开口延伸至其外部。

进一步的，三根穿刺杆在鞘管内能够沿着弹簧伸缩的方向相互外切，且三根穿刺杆外壁之间形成胆总管连接管的插接通道。

进一步的，所述穿刺杆与穿刺针的直径大小相同。

进一步的，两个相邻弹簧之间的夹角为60°。

进一步的，还包括用于卡紧三根穿刺杆相切的塑料卡环。

进一步的，所述塑料卡环包括卡环本体，所述卡环本体上一体成型有两个卡合头，两个卡合头之间形成一个V形槽；

所述卡环本体内开设有条形槽，所述条形槽与V形槽位于同一轴线，所述V型槽与条形槽之间形成有卡紧槽。

进一步的，所述第一限位螺母和第二限位螺母螺纹连接在胆总管连接管上，所述胆总管连接管两端开设有螺纹结构。

进一步的，所述第一限位螺母与第二限位螺母之间设有限制胆总管连接管移动的限位结构。

进一步的，所述限位结构包括卡接在第一限位螺母和第二限位螺母侧端的弹性卡环，所述弹性卡环上设有可分离式卡接配合的卡槽和卡齿，所述弹性卡环之间设有伸缩杆。

本发明的有益效果是：

（1）通过弹簧在鞘管内设有三根穿刺杆及其上对应连接的穿刺杆，每根穿刺针与穿刺杆的直径相同，可以减小每根穿刺针之间的距离。且每根穿刺针位于另外两根穿刺杆中心连线的垂直平分线上，使三根穿刺针之间形成正三角形，在通过穿刺针对胆总管壁进行穿刺时相当于一根穿刺针，避免造成对胆总管壁的穿刺孔过大，在通过三根穿刺针对胆总管壁进行穿刺后，可以通过解除塑料卡环对穿刺杆的限制，在弹簧收缩力的作用下通过三根穿刺针对胆总管壁的穿刺孔进行逐渐扩孔，再将胆总管连接管通过插接通道插入扩孔后的胆总管内，提高胆总管连接管插入胆总管内的效率，缩短无肝期的时间。

（2）在进行供受体处理的过程中，通过胆总管连接管实现供受体胆总管的连接，并通过限位螺母调节胆总管连接管的两端在供受体胆总管内的深度，提高肝胆移植的精度。胆总管连接管可以快速实现供受体胆总管的连接，缩短无肝期的时间，限位螺母可以设定要插入到胆总管内的深度，避免移植过程中出现意外。

（3）限位结构可以避免大鼠在移植后的活动过程中，出现胆总管连接管的移动，避免出现胆总管连接管延伸到胆总管支管内容易导致肝内胆汁积累，不能实现肝内的胆汁运输，甚至流入到大鼠腹腔内的现象。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为大鼠树鼩异种原位肝移植模型建立方法的关键步骤；其中A：树鼩供体肝的获取；B：预先将胆总管连接管固定在供体胆总管上；C：供体肝胆移植到受体肝处，并通过胆总管连接管连接供受体胆总管；

图2为预先将胆总管连接管固定在供体胆总管上的示意图；

图3为胆管穿刺器的结构示意图；

图4为胆管穿刺器的右视图；

图5为塑料卡环卡接在三根穿刺杆上的示意图；

图6为塑料卡环的示意图；

图7位胆总管连接管的示意图；

图8为胆总管连接管上设有限位结构的示意图；

图9为弹性卡环的结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

根据本发明的实施例，提供了一种大鼠树鼩异种原位肝移植模型建立方法。

参照图1-9，根据本发明实施例的大鼠树鼩异种原位肝移植模型建立方法，包括一种大鼠树鼩异种原位肝移植模型建立方法，所述包括以下步骤：

一、动物准备：供受体术前适应性喂养一周，自由饮水、进食；术前禁食12h，不禁水；

二、供肝处理：

S2.1：供体用动物麻醉机麻醉，全身肝素化后游离供肝，备皮开腹，湿棉签纱布覆盖，腔静脉全身肝素化，缝扎左膈下静脉不断，游离隔下肝周韧带；

S2.2：游离肝下下腔静脉，处理到右肾静脉，剥离右肾动脉，结扎右肾静脉；

S2.3：游离肝右后叶韧带，结扎右肾上腺静脉；

S2.4：利用静脉头皮针于腹主动脉近心端扎入，推注20ml灌注液；沿肋骨边缘的膈肌上迅速打开胸腔，夹闭胸主动脉；剪断胸段肝上下腔静脉让灌注液流出，随后可见肝脏由鲜红色逐渐变为土黄色；

S2.5：通过胆管穿刺器对胆总管的管壁进行穿刺；再将胆总管连接管通过胆管穿刺器内部插到穿刺孔内并抽出胆管穿刺器，并通过胆总管连接管上预先设置的第一限位螺母调节其插入胆总管内的深度；

S2.6：游离肝脏，将供肝从供体上取下，置于4℃保存液中；

三、修肝处理

S3.1：分别在门静脉和肝下下腔采用袖套法先行固定有PV管；

S3.2：在肝上下腔两端分别固定8-0针线；

四、受体处理

S4.1：供体用动物麻醉机麻醉，备皮开腹，湿棉签纱布覆盖，缝扎左膈下静脉不断，游离隔下肝周韧带；

S4.2：缝扎食管静脉丛、肝固有动脉；

S4.3：游离并剪断胆总管；

S4.4：游离肝下下腔静脉，结扎右肾上腺静脉；

S4.5：动脉夹阻断肝下下腔静脉，阻断门静脉开始无肝期；

S4.6：从门静脉将肝内血冲入体循环2ml抗生素生理盐水；

S4.7：动脉夹阻断肝上下腔静脉，断离肝上下腔静脉，肝下下腔静脉，门静脉；

S4.8：将受体肝取出，供体肝放在对应位置；

S4.9：8-0线缝合肝上下腔，袖套法连接门静脉和肝下下腔，开放门静脉，结束无肝期；

S4.10：通过胆管穿刺器对受体胆总管的管壁进行穿刺；再将胆总管连接管的另一端通过胆管穿刺器内部插到受体胆总管内，并通过胆总管连接管上预先设置的第二限位螺母调节其在受体胆总管内插入的深度；

S4.11：温生理盐水反复冲洗肝脏和腹腔，使受体复温，吸尽体液；

S4.12：检查出血，缝合肌层及皮肤，观察实验动物一般情况。

如图3所示，胆管穿刺器1包括两端呈开口结构的鞘管11，鞘管11内通过若干弹簧12连接有能够相互外切的三根穿刺杆13，每根穿刺杆13的右端延伸至鞘管11外部并分别连接有穿刺针14，使得三根穿刺针14通过弹簧12悬挂在鞘管11的内部。优选地，相邻两根弹簧12之间的夹角为60°，使得能够沿着弹簧12布置的方向拉动三根穿刺杆13时，使三根穿刺杆13的外壁相互外切。

如图4所示，三根穿刺杆13通过弹簧12悬挂在鞘管11的内部时，三根穿刺杆13外壁间形成胆总管连接管2的插接通道3，方便胆总管连接管2能够通过插接通道3插入胆总管内。

如图5所示，每根穿刺针14与对应穿刺杆13的直径相同，可以减小每根穿刺针14之间的距离。且每根穿刺针14位于另外两根穿刺杆13中心连线的垂直平分线上，使三根穿刺针14之间形成正三角形，在通过穿刺针14对胆总管壁进行穿刺时相当于一根穿刺针，避免造成对胆总管壁的穿刺孔过大。

另外，在通过三根穿刺针14对胆总管壁进行穿刺后，需要对胆总管壁的穿刺孔进行扩孔，方便将胆总管连接管2通过插接通道3插入扩孔后的胆总管内，提高胆总管连接管2插入胆总管内的效率，缩短无肝期的时间。

如图5和如6所示，在三根穿刺杆13上设有用于将其卡紧的塑料卡环4，在塑料卡环4的作用下，能够将位于鞘管11内的三根穿刺杆13卡紧成外壁相互外切的状态。在解除塑料卡环4对穿刺杆13的限制作用下，能够在弹簧12的作用下，逐渐对胆总管壁进行扩孔。

具体地，该塑料卡环4包括卡环本体41，卡环本体41上一体成型有两个卡合头42，两个卡合头42之间形成一个V形槽43，卡环本体41内开设有条形槽44，条形槽44与V形槽43位于同一轴线，且V型槽43与条形槽44之间形成有卡紧槽45。操作时，手动捏住卡环本体41的顶端，使两个卡合头42逐渐分离，让三根穿刺杆13通过V形槽43进入到卡紧槽45内，且每根穿刺杆13与卡紧槽45的内壁抵接。此时，弹簧12处于拉伸状态。

具体操作时：首先通过塑料卡环4卡主鞘管11外部前端的三根穿刺杆13，三根穿刺杆13处于被拉伸状态，三根穿刺针14外壁相切形成一根穿刺针；通过鞘管11使三根穿刺针14对胆总管进行穿刺并形成穿刺孔；解除塑料卡环4，使三根穿刺针14在弹簧12的作用下相互逐渐分离，并对穿刺孔进行扩孔；再将胆总管连接管2通过插接通道3插到胆总管内，并拔出鞘管11；通过胆总管连接管2上预先设置的第一限位螺母5对胆总管连接管2的一端进行限位固定，完成胆总管连接管2在供体胆总管上的连接；接着，采用同样的方法，将胆总管连接管2的另一端通过第二限位螺母6固定在受体胆总管上，实现大鼠树鼩异种原位肝移植。

需要说明的是，在解除塑料卡环4时，捏住卡环本体41顶端，使两个卡合头42分离，可以手动控制两个卡合头42分离的速度，即可控制穿刺杆13在弹簧12拉力作用下的速度，保证穿刺针14在扩孔过程中的稳定性，避免由于两个卡合头42分离速度过快，造成对胆总管壁的过度扩孔或损伤。

另外，将胆总管连接管2插入到胆总管内前，将第一限位螺母5和第二限位螺母6预设在胆总管连接管2插接端的远端。插入到胆总管后，将第一限位螺母5旋转至胆总管连接管2的插入位置，可以使胆总管连接管2快速、准确的插到供体的胆总管内。同理，在将胆总管连接管2的另一端插入到受体胆总管内时，将第二限位螺母6旋至靠近第一限位螺母5处。优选地，胆总管连接管2的中间段为光滑结构，提高第一限位螺母5和第二限位螺母6在胆总管连接管2上的调节速度。第一限位螺母5和第二限位螺母6能够限制胆总管连接管2插入胆总管内的深度，进一步提高移植过程中的速度，缩短无肝期的时间。

此外，在第一限位螺母5和第二限位螺母6之间设有限位结构7，通过限位结构7可以避免大鼠在移植后的活动中出现胆总管连接管2的移动，避免出现胆总管连接管2延伸到胆总管支管内而导致肝内胆汁积累，不能实现肝内的胆汁运输，甚至流入到大鼠腹腔内的现象。

如图8和图9所示，该限位结构7包括卡接在第一限位螺母5和第二限位螺母6侧端的弹性卡环71，弹性卡环71上设有可分离式卡接配合的卡槽72和卡齿73，两个弹性卡环71之间通过伸缩杆74相互连接，用来固定两者之间的相对位置，以保证胆总管连接管2和胆管之间不会发生相对位置的移动，也不会脱落或者扎入更深。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。在进行肝移植的过程中，需要通过胆总管连接管2快速实现供体和受体之间胆总管的连接，可以缩短无肝期的时间。