一种美登素-多肽偶联物、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及一种美登素-多肽偶联物、其制备方法及应用。

背景技术

肿瘤的治疗包括手术切除、放疗、药物治疗，其中药物治疗包括化疗和靶向治疗。临床用于化疗的药物由于缺乏靶向性，在杀伤肿瘤细胞的同时也会杀伤正常组织细胞，毒副作用明显，给患者造成了极大的痛苦，使得化疗药物的临床应用受到很大限制。靶向治疗包括小分子靶向药物、抗体靶向药物、靶向配体药物偶联物等。其中，小分子靶向药物主要包括伊马替尼、埃罗替尼等，但这类药物的半衰期较短，并且容易引起耐药性。抗体药物主要靶向肿瘤细胞表面的膜受体，如EGFR、HER2/neu、VEGFR等，但单独使用时疗效常常不尽人意，也容易引起肿瘤的抗药性等。为了有效的清除肿瘤细胞，并克服耐药性，靶向配体与抗肿瘤药物的偶联物的研发备受关注。其中，靶向配体包括抗体、多肽、小分子化合物、核酸寡核苷酸适配子等。偶联药物进入体内后，靶头可以特异性的识别受体过表达的肿瘤细胞，利用细胞内吞作用使抗肿瘤药物进入肿瘤细胞内发生作用，从而杀死肿瘤细胞，弥补了抗体药物疗效偏低、抗肿瘤药物毒副作用大的缺陷。

目前，抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugate，ADC)是偶联药物的研发热点。全球已有14款ADC药物上市，国内也有70余款ADC药物处于不同的研发阶段。但ADC药物的研发存在一些难点，包括(1)抗体分子量大，组织穿透能力差，免疫原性强，用药量大；(2)通过肝脏代谢，体内滞留时间长，毒副作用大，治疗窗较窄；(3)仅偶联高毒化合物；(4)药物/抗体比率(DAR)不一，混合组分，制备工艺复杂，成本较高。因此，寻找一种既保留受体亲和力，又具有较低分子量的配体作为偶联药物的靶头，对于降低偶联药物的免疫原性、提高偶联药物的肿瘤穿透能力，并降低生产成本，具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明针对现有技术的上述缺陷，提供一种美登素-多肽偶联物、其制备方法及应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种美登素-亲合体多肽偶联物，具有式I所示的分子结构式：

其中，R代表美登素，L代表链接体。

结构式I中的各符号分别代表如下氨基酸：

Asn天冬酰胺，Arg精氨酸，lle异亮氨酸，Glu谷氨酸，Trp色氨酸，Ala丙氨酸，Met甲硫氨酸，Lys赖氨酸，Asn天冬酰胺，Phe苯丙氨酸，Asp天冬氨酸，Val缬氨酸，Gly甘氨酸，Cys半胱氨酸，Leu亮氨酸，Pro脯氨酸，Leu亮氨酸，Gln谷氨酰胺，Ser丝氨酸。

采用上述技术方案具有如下技术效果：该美登素-多肽偶联物结构以亲合体多肽作为靶头，既保留了受体亲和力，又采用较低分子量的配体作为偶联药物的靶头，可降低偶联药物的免疫原性、提高偶联药物的肿瘤穿透能力。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以作出如下的改进：

进一步，所述链接体包含结构-S-S-。

进一步，所述美登素-亲合体多肽偶联物具有式II所示的分子结构式：

其中，美登素具有式III所示结构式：

美登素结构中的巯基(-SH)与2,2'-二硫二吡啶结构中的S键合形成-S-S-。

本发明还涉及上述美登素-多肽偶联物的制备方法，包括如下步骤：

(1)合成亲合体多肽；

(2)合成L-亲合体多肽偶联物：以2,2'-二硫二吡啶与亲合体多肽为原料，在DMSO溶剂存在条件下，室温条件下搅拌反应24～48h，其中2,2'-二硫二吡啶与亲合体多肽的摩尔比为(1～4)：1，反应结束后通过制备液相纯化，浓缩后冻干得到L-亲合体多肽偶联物；

(3)合成美登素-亲合体多肽偶联物：将美登素与所述L-亲合体多肽偶联物按照摩尔比(1～4)：1溶于有机溶剂中，于室温下搅拌反应24～36小时得反应液，将反应液通过制备液相纯化，将纯化后含有产物的液体合并，经浓缩、冻干得到美登素-亲合体多肽偶联物。

采用上述技术方案具有如下技术效果：采用化学方法合成美登素-亲合体多肽偶联物，制备工艺简单，成本较低。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以作出如下的改进：

进一步，步骤(1)中，具体包括步骤：

S1、采用固相多肽合成法，在N,N’-二异丙基乙胺(DIEA)存在的条件下由9-芴甲氧羰基保护氨基的赖氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)和Rink Amide-MBHA树脂反应得到Fmoc-Lys-Rink Amide-MBHA树脂；

S2、将所述Fmoc-Lys-Rink Amide-MBHA树脂经体积浓度为20％～40％的哌啶与N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶液除去Fmoc保护基团后，以O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)为缩合试剂，按照肽序列从C端向N端逐步偶联9-芴甲氧羰基保护氨基的氨基酸(Fmoc-氨基酸)得到全保护肽树脂；

S3、向所述全保护肽树脂中添加裂解液，室温裂解30～60min后过滤得滤液，采用50mL乙醚沉降，沉降后于8000rpm下离心分离10min，弃去上层清液后加50mL乙醚混匀下层沉降物进行洗涤，重复进行离心分离操作(8000rpm离心10min)，离心结束后弃去上清液，置于真空干燥箱内干燥，得到亲合体粗肽；

S4、粗肽通过制备液相纯化、冷冻干燥后得到亲合体多肽纯品。

其中，C端指多肽肽链的羧基基团(-COOH)末端，N端指多肽肽链的氨基基团(-NH

进一步，S1中，所述Rink Amide-MBHA树脂的取代度为0.337mmol/g；

按摩尔比计，所述Rink Amide-MBHA树脂：DIEA：Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩尔比为1：2～6：4～8。

进一步，S2中，所述Fmoc-Lys-Rink Amide-MBHA、HBTU、Fmoc-氨基酸的摩尔比为1：2～6：4～8，偶联时间为30min～3h。

进一步，S3中，按照质量体积比计，所述全保护肽树脂：裂解液为1g:5～10mL；

所述裂解液包括三氟乙酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDI)、三异丙基硅烷(TIS)与纯化水(H

本发明还涉及上述美登素-亲合体多肽偶联物在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用，其中，所述肿瘤是肺癌。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

本发明所提供的的美登素-亲合体多肽偶联物分子量较低，组织穿透能力强，免疫原性较低，并且可通过化学方法合成，制备工艺相对简单，成本较低。

附图说明

图1示出本发明实施例美登素-亲合体多肽偶联物的质谱图；

图2示出本发明的人肺癌H460裸鼠皮下移植瘤的体积变化趋势图(TV图，**P＜0.01，vs Control)：Control为对照组，PTX为紫杉醇溶液组，BX-105为美登素-亲合体多肽偶联物组；

图3示出本发明的人肺癌H460裸鼠皮下移植瘤的相对肿瘤体积变化趋势图(RTV图，**P＜0.01，vs Control)；

图4示出本发明的人肺癌H460裸鼠皮下移植瘤的相对肿瘤增殖率变化趋势图(T/C图)；

图5示出本发明的人肺癌H460裸鼠皮下移植瘤的大小示意图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。虽然本发明的描述将结合较佳实施例一起介绍，但这并不代表此发明的特征仅限于该实施方式。恰恰相反，结合实施方式作发明介绍的目的是为了覆盖基于本发明的权利要求而有可能延伸出的其它选择或改造。为了提供对本发明的深度了解，以下描述中将包含许多具体的细节。本发明也可以不使用这些细节实施。此外，为了避免混乱或模糊本发明的重点，有些具体细节将在描述中被省略。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1：美登素-亲合体多肽偶联物的制备方法

美登素-亲合体多肽偶联物的制备方法如下：

(1)亲合体多肽的合成：

使用Fmoc策略的固相多肽合成方法，依次进行氨基酸序列合成，得到多肽片段。以2.225g Rink Amide-MBHA Resin起始反应，经裂解后得到多肽粗品3.41g。粗品溶于乙腈：水(1:1)中，以C18制备柱进行纯化，检测波长：214nm，流动相A：乙腈(含0.1％三氟乙酸)，流动相B：水(含0.1％三氟乙酸)。MS确定所得纯品分子量，经冷冻干燥得到目标多肽中间体1.26g。

采用固相多肽合成法，在N,N’-二异丙基乙胺(DIEA)存在的条件下由9-芴甲氧羰基保护氨基的赖氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)和取代度为0.337mmol/g的Rink Amide-MBHA树脂进行反应得到，Rink Amide-MBHA Resin树脂的添加量为2.225g，DIEA和Fmoc-Lys(Boc)-OH的添加量分别为77.55g和1.406g；所得Fmoc-Lys-Rink Amide-MBHA树脂经过体积浓度为20％的哌啶/N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)溶液(体积比为哌啶：DMF＝1:4)除去Fmoc保护基团后，以O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)为缩合试剂，按照肽序列从C端向N端逐步偶联氨基酸得到全保护肽树脂，其中Fmoc-Lys-Rink Amide-MBHA树脂、缩合试剂HBTU和Fmoc-氨基酸的摩尔比为1：4：4，偶联时间为40min；按照质量体积比为1g:10mL的比例向所述全保护肽树脂中添加裂解液切肽，裂解液组成为三氟乙酸(TFA):1,2-乙二硫醇(EDI):三异丙基硅烷(TIS):纯化水(H

(2)L-亲合体多肽偶联物的合成：

将2,2'-二硫二吡啶(42mg,0.192mmol,1.02eq)，与步骤(1)所得的1.26g亲合体多肽溶于30mL DMSO中，在室温条件下反应26小时，反应结束后，将反应液用乙腈进行稀释处理，以C18制备柱进行纯化，检测波长：214nm，流动相A：乙腈(含0.1％三氟乙酸)，流动相B：水(含0.1％三氟乙酸)。MS确定所得纯品分子量，HPLC确定样品纯度，经冷冻干燥得到L-亲合体多肽偶联物718mg，收率56％。

(3)美登素-亲合体多肽偶联物的合成：

将美登素(27.1mg，0.037mmol，1.25eq)、L-亲合体多肽偶联物(200mg，0.029mmol)溶于10mL DMSO中，室温搅拌反应，HPLC显示反应约8小时完成。将反应液直接进行制备液相纯化，将含有产物的馏分合并，浓缩后冻干得到112mg固体，收率52％。

MS测试，表明得到目标偶联物(美登素-亲合体多肽偶联物)。

实施例2：美登素-亲合体多肽偶联物的抗肿瘤细胞增殖检测

人肺癌H460细胞以1640+10％FBS+1％双抗扩增培养，接种前细胞密度调整为1.5×107cells/mL，在无菌条件下于裸鼠右侧腋下靠背部接种200μL细胞悬液。用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至平均体积为200mm

整个实验过程中，每周3次测量移植瘤直径，同时称量小鼠体重。肿瘤体积(Tumorvolume,TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b

抗肿瘤活性的评价指标为：

1)相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：T/C(％)＝(TRTV/CRTV)×100％，TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV；

2)瘤重抑制率IR(％)，计算公式如下：IR(％)＝(Wc-WT)/Wc×100％，Wc：对照组瘤重，WT：治疗组瘤重。

各组肿瘤体积(TV)变化趋势如图2所示，各组相对肿瘤体积(RTV)变化趋势如图3所示，各组相对肿瘤增值率(T/C)变化趋势如图4所示，各组人肺癌H460裸鼠皮下移植瘤的动物瘤重和瘤重抑制率(瘤重和IR，**P＜0.01，vs Control)数据如表1所示，其中，附图及表格中的各组分别代表如下含义：Control为对照组，PTX为紫杉醇溶液组，BX-105为美登素-亲合体多肽偶联物组。

表1各组动物瘤重和IR比较

抗肿瘤活性的评价指标标准为：T/C(％)>40％为无效；T/C(％)≤40％，并经统计学t检验处理P≤0.05为有效。IR％>60％为有效的辅助性指标。

统计学：采用SPSS17.0统计软件对实验结果进行分析处理。数据以均数±标准差表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析,两两多重比较采用LSD-t检验。P＜0.01表示差异具有统计学意义。

经实验证实，本发明的美登素-亲合体多肽偶联药物对人肺癌H460裸鼠皮下移植瘤具有较强的增殖抑制作用，抗肿瘤作用明显，作为靶头的亲合体多肽分子量远小于抗体，不易引起免疫反应，完全由化学方法合成，效率更高，降低了制备成本。因此，该亲合体多肽偶联药物可提高偶联药物对肿瘤细胞的靶向性，并降低对正常组织的毒副作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。