棉花皱叶控制基因GhZY、连锁SNP位点及其应用

技术领域

本发明涉及一种棉花叶型品种选育技术领域，特别涉及一种棉花皱叶控制基因GhZY、连锁SNP位点及其应用。

背景技术

棉花是重要的经济作物之一，不仅是纺织工业原料，更是重要的战略物资，在国民经济发展中占有重要地位。棉花全基因组序列的发布，极大促进了棉花分子生物学研究，为分子设计辅助育种提供了坚实的基础。进一步明确基因功能，寻找控制棉花重要性状的关键基因，是目前棉花分子生物学的首要内容。

国内外学者对陆地棉栽培品种遗传多样性的鉴定，发现现今主要陆地棉栽培品种的遗传背景狭窄，这对新栽培品种的培育带来了巨大的挑战。在一定程度上，棉花种质的遗传多样性的高低决定着新品种培育的难易，因此提高陆地棉栽培种的遗传多样性是培育棉花新品种的首要任务。突变体库的构建则是创造棉花新的种质资源的有利途径。突变体是发现新基因、揭示基因功能的理想材料。功能基因组学是以鉴定基因功能为目标，目的是揭示基因与性状之间关系。随着基因组测序工作的大规模发展，大量核酸序列信息的获取，仅通过对自然突变获得的突变体进行基因功能的研究远远不能满足分子生物学的研究需求。

棉花的皱叶性状为叶脉之间紧密连结，导致呈现皱叶状态，并在背部皱叶区域长出叶片，表型和棉花曲叶病性状相近。皱叶棉花的品质和产量都不如正常叶棉花，其属于非优质棉花种质资源。正常叶参见图1A和皱叶参见图1B。

克隆基因是寻找与目标性状连锁的分子标记最重要的应用之一。图位克隆(Mapbased cloning)是利用分子遗传图谱，把目标性状和分子标记通过遗传连锁作图联系起来，把目标基因定位在与之连锁非常紧密的侧翼标记之间；也可以用群体分离分析法(BSA法)或近等基因系法得到与目标基因连锁的分子标记，然后利用作图群体把该分子标记定位到图谱上。然后由这些标记去筛选大片段DNA文库，鉴定出与标记有关的克隆，继之以亚克隆和染色体步移(Chromosome walking)形式获得含有目的基因的克隆片段，最终再辅之以转化和互补测验加以验证。目前，运用基于图位克隆技术已分离到了大量的植物基因，但未见有关控制棉花皱叶的基因被成功克隆的报道。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种棉花皱叶控制基因GhZY、控制棉花皱叶性状的蛋白质以及相关材料和应用。

本发明第二个目的在于提供一种棉花皱叶控制基因GhZY连锁SNP位点。

根据该SNP位点，本发明的目的之三在于提供用于检测上述SNP位点的多态性或基因型的引物对。

本发明的目的之四在于提供用于检测棉花皱叶控制基因GhZY连锁SNP位点的多态性或基因型的物质。

本发明的目的之五在于提供上述SNP位点、引物对和物质的用途。

本发明的目的之六在于提供一种鉴定或辅助鉴定棉花皱叶或正常叶的方法。

本发明所述棉花皱叶控制基因GhZY连锁SNP位点位于棉花参考基因组D亚组第12号染色体上的第61394027位核苷酸（或者说是，SNP位点位于序列表序列6中第1734位），所述棉花皱叶控制基因GhZY连锁SNP位点的碱基为G或A。针对该SNP位点，本发明提供了如下几个技术方案：

第一方面，本发明提供用于检测棉花皱叶控制基因GhZY连锁SNP位点的多态性或基因型的引物对，所述棉花皱叶控制基因GhZY连锁SNP位点位于棉花参考基因组Ghir.ZJU（https://cottonfgd.net/about/download/assembly/ genome.Ghir.ZJU. fa.gz）的D亚组第12条染色体的第61394027位核苷酸，所述棉花皱叶控制基因GhZY连锁SNP位点的碱基为G或A。

进一步地，所述引物对包括：

上游引物ZY-F，其核苷酸序列为如下（1）或（2）：

（1）如序列表中序列1所示（即AGCCTTTGGGTGAGGGTCTA），

（2）序列1中的一个或几个核苷酸经取代、缺失或增加后获得的与序列1具有相同功能的序列；

下游引物TM-1-R，其核苷酸序列为如下（3）或（4）：

（3）如序列表中序列2所示（即ACCTTCACACGATCAGCATCAG），

（4）序列2中的一个或几个核苷酸经取代、缺失或增加后获得的与序列2具有相同功能的序列。

上游引物ZY-F中的（2）所要表达的是，序列1的核苷酸序列中有1、2或3个被其它核苷酸取代或者缺失，或者序列1中增加了1、2或3个核苷酸后得到的新的序列仍然可以用于扩增上述SNP位点。

下游引物TM-1-R中的（2）所要表达的是，序列2的核苷酸序列中有1、2或3个被其它核苷酸取代或者缺失，或者序列1中增加了1、2或3个核苷酸后得到的新的序列仍然可以用于扩增上述SNP位点。

第二方面，本发明提供一种用于检测棉花皱叶控制基因GhZY连锁SNP位点的多态性或基因型的物质，所述物质包括：

上述引物对，以及XbaI限制性内切酶；

所述棉花皱叶控制基因GhZY连锁SNP位点位于棉花参考基因组Ghir.ZJU的D亚组第12号染色体上的第61394027位核苷酸，所述棉花皱叶控制基因GhZY连锁SNP位点的碱基为G或A。

第三方面，本发明提供了上述引物对或者上述物质在如下方面之一中的应用：

（a）鉴定或辅助鉴定棉花皱叶或正常叶中的应用；

（b）制备用于鉴定或辅助鉴定棉花皱叶与否的产品中的应用；

（c）在棉花育种中去除皱叶品种的应用。

在第三方面的应用中，所述产品典型非限定性地可以为含有引物对或物质的试剂或试剂盒，还可以含有其它PCR或酶切的常用试剂。

在第三方面的应用中，用第一方面的引物对或者第二方面的物质检测棉花皱叶控制基因GhZY连锁SNP位点的基因型来鉴定或辅助鉴定棉花皱叶或正常叶，当SNP位点的基因型为G:G时，棉花是皱叶，当SNP位点的基因型为A:A时，棉花是正常叶，当SNP位点的基因型为A:G时，棉花是正常叶。

第四方面，本发明提供一种鉴定或辅助鉴定棉花皱叶或正常叶的方法，包括如下步骤：

检测待测棉花基因组中SNP位点的基因型，当SNP位点的基因型为G:G时，棉花是皱叶，当SNP位点的基因型为A:A时，棉花是正常叶，当SNP位点的基因型为A:G时，棉花是正常叶，其中SNP位点位于棉花参考基因组Ghir.ZJU的D亚组第12号染色体上的第61394027位核苷酸。

在第四方面的方法中，进一步地，所述检测待测棉花基因组中SNP位点的基因型的方法包括如下（1）或（2）：

（1）直接测序，

（2）以待测棉花基因组为模板、用能扩增SNP位点的引物对进行PCR扩增，得到的扩增产物，然后采用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，分析酶切产物的大小，根据酶切产物的大小来确定待测棉花基因组中SNP位点的基因型。

更进一步地，所述能扩增SNP位点的引物对为第一方面的所述引物对，所述限制性内切酶为XbaI限制性内切酶。

更进一步地，当酶切产物大小为316bp时，待测棉花基因组中SNP位点的基因型为G:G，棉花为皱叶；当酶切产物大小为344bp时，待测棉花基因组中SNP位点的基因型为A:A，棉花为正常叶；当酶切产物大小为344bp和316bp时，待测棉花基因组中SNP位点的基因型为A:G，棉花是正常叶。

优选地，所述PCR扩增的条件依次为：94℃预变性15分钟；在 94℃下变性 30 s，57℃下退火 30 s，72℃下延伸 1min，重复35次；72℃保持4min，使产物延伸完整。

第五方面，本发明提供一种控制棉花皱叶性状的蛋白质，其氨基酸序列为如下的（P1）或（P2）：

（P1）如序列表中的序列3所示；

（P2）与序列3的氨基酸序列具有85%以上同一性且与序列3具有相同功能的序列。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

这里使用的术语 “同一性”包括与本发明的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述85％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。

第六方面，本发明提供与上述蛋白质相关的材料，所述材料为如下(A1)至（A6）中的任一种：

(A1)编码上述蛋白质的核酸分子；

(A2)含有(A1)所述核酸分子的表达盒；

(A3)含有(A1)所述核酸分子的重组载体；

(A4)含有(A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

(A5)含有(A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

(A6)含有(A3)所述重组载体的转基因植物细胞系。

进一步地，所述核酸分子为序列表中序列4所示的编码上述蛋白质的cDNA分子或者序列表中序列5所示的基因组DNA分子。

第七方面，本发明提供上述蛋白质或上述材料在鉴定或辅助鉴定棉花皱叶或正常叶中的应用、或者在棉花育种中去除皱叶品种的应用。

本发明的待测棉花可以是任意品种的棉花，特别是陆地棉突变体材料ZY和与其他品种的杂交种，更特别是陆地棉突变体材料ZY和陆地棉对照材料TM-1的杂交后代。

本发明所述正常叶比如可以为陆地棉对照材料TM-1的叶子性状，即叶面平整。

本发明的有益效果：

本发明以陆地棉突变体材料ZY和陆地棉对照材料TM-1为亲本，构建F2分离群体，发现皱叶与正常叶植株的分离比符合3：1，表明正常叶和皱叶为一对相对性状，受单基因调控，皱叶为隐性性状。通过BSA测序，筛选定位到8个候选基因，根据基因功能注释及F2群体材料测序验证，确定

附图说明

图1是棉花正常叶和皱叶的对比图，其中A为正常叶，B为皱叶。

图2是棉花皱叶控制基因GhZY的筛选定位过程图，其中：A为陆地棉D亚组第12号染色体的ΔSNP-index值；B：候选基因功能注释。

图3是部分待测棉花的PCR产物经酶切后的电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进或应用的基础，并不以任何方式构成对本发明的具体限制。

下述实施例中的实验方法中，如无特殊说明，均为常规方法，可按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。

本发明中所使用的棉花品种的来源：

陆地棉突变体材料ZY：为本实验室通过2%浓度的EMS处理TM-1种子，时间为2小时，将处理后的种子按照常规方法种植于田间，通过观察筛选出皱叶性状的陆地棉突变体材料ZY。

陆地棉材料对照材料TM-1：来源于中国农业科学院棉花研究所种质资源库申请获得。

以下实施例中涉及的DNA提取均采用天根植物基因组DNA提取试剂盒进行提取。

通过肉眼观测待测棉花品种为皱叶还是正常叶。

实施例1 棉花皱叶控制基因GhZY以及连锁SNP分子标记的获得

一、棉花皱叶控制基因GhZY的筛选定位方法

本发明以陆地棉突变体材料ZY和陆地棉对照材料TM-1为亲本，构建F2分离群体，共计153株，发现皱叶与正常叶植株的分离比符合3：1，表明正常叶和皱叶为一对相对性状，受单基因调控，皱叶为隐性性状。通过BSA测序，发现D亚组第12号染色体的候选区域Δ（SNP-index）≥0.6，参见图2A。筛选定位到8个候选基因，根据基因功能注释（参见图2B）及F2群体材料测序验证，确定

二、棉花皱叶控制基因GhZY全长DNA以及连锁SNP分子标记的获取

棉花基因组DNA的提取采用CTAB法，以供试皱叶材料（ZY）/正常材料 (TM-1)棉花材料基因组DNA为模板，利用

用于PCR扩增皱叶材料（ZY）的

F1: ATGGGTAGGAAGAAGAGAAG （序列表中序列6）

R1:ACTATCCTGGACTTGCCGAGAA（序列表中序列7）；

PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃3min，共35个循环。

用于PCR扩增正常材料 (TM-1) 的

F2: TGGTGGGACTGTAAACAACTGG（序列表中序列8）

R2:TTAACAGTAGAACATAACACGCTT（序列表中序列9）

PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃3min，共35个循环。

采用上述两组引物对进行PCR扩增反应的反应体系(20μL)中含有：25ng模板DNA，0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，0.2mM的dNTP mix；0.5U Taq DNA聚合酶，1×PCR Buffer(Fermentas)2μL，ddH

三、棉花多皱叶控制基因GhZY的cDNA和蛋白质序列鉴定分析

利用皱叶材料（ZY）/正常材料 (TM-1)棉花材料，分别选取幼嫩叶片组织提取总RNA，进行反转录合成mRNA的第一链(cDNA)，以该mRNA第一链为模板利用GhZY基因的全长扩增上下游引物进行PCR扩增，分别获取皱叶材料（ZY）/正常材料 (TM-1)棉花材料中的cDNA(mRNA)序列全长，均为3180bp，其中皱叶材料（ZY）的基因GhZY的cDNA序列如序列表中序列4所示，皱叶材料（ZY）控制皱叶的蛋白GhZY的氨基酸序列如序列表中序列3所示；正常材料(TM-1) 的基因GhZY的cDNA序列仅是将序列4的第1087bp位碱基由A变为G。利用DNAMAN软件对皱叶/正常材料的GhZY基因全长进行比对分析，发现该基因在皱叶材料（ZY）/正常材料(TM-1)棉花材料中均有21个外显子，20个内含子，但是在cDNA序列的1087bp的位置正常材料的碱基为G，皱叶材料的碱基为A，正是由于皱叶材料（ZY）/正常材料 (TM-1)棉花材料中这一处碱基的差别，从而导致氨基酸编码的差异，由正常材料 (TM-1)的谷氨酸变为皱叶材料（ZY）的赖氨酸，进而导致叶型性状发生变化。

用于PCR扩增的引物对为：

F3: ATGGGTAGGAAGAAGAGA （序列表中序列10）

R3:TTAACAGTAGAACATAACAC（序列表中序列11）

PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃3min，共35个循环。

实施例2棉花皱叶控制基因GhZY的功能验证

待测材料：以在皱叶材料（ZY）/正常材料 (TM-1)棉花材料为亲本，构建F2遗传群体，从中随机选取153个单株进行棉花皱叶和正常叶的鉴定。将上述待测材料的种子种植于河北廊坊农科院基地，待出现第一片真叶后采用CTAB法从幼苗中提取各待测材料的基因组DNA，并以各基因组DNA为模板，利用上下游引物F:TGCCTTCTGACTGGTAATGGGT（序列表中序列12）/R:ACCTTCACACGATCAGCATCAG（序列表中序列2）进行GhZY基因PCR扩增，然后将PCR产物测序，最终确认上述153份待测材料中有40株幼苗具有ZY材料所示的GhZY基因，且该40株材料叶型田间表现为皱叶。因此，基因水平的鉴定和田间表型一致，证明序列3所示的GhZY蛋白控制棉花的皱叶性状。本实施例的PCR扩增体系参见实施例1第二部分，扩增条件依次为：先于94℃保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度57°，保持30秒钟，使引物与模板充分退火；在72℃保持1分钟（扩增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环35次，使扩增的DNA片段大量累积。最后，在72℃保持4min，使产物延伸完整，4℃保存。

实施例3 SNP位点和dCAPS标记在鉴定棉花是否为皱叶上的应用

对实施例1开发的分子标记，进行进一步的群体验证。

依据dCAPs引物在线设计网站http://helix .wustl .edu/dcaps/dcaps .html，开发设计与GhZY基因紧密连锁的 d C A P s 分子标记，其中正向和反向扩增引物分别如序列表中序列1和序列2所示。

选取实施例1中的F2群体中153份棉花及20份由正常叶回交转育的棉花材料为验证材料，应用上述特异性引物（序列1和序列2）进行PCR扩增，并对扩增产物进行XbaI限制性内切酶酶切，酶切产物电泳后根据电泳结果确定待测棉花品种的SNP位点的基因分型，从而对棉花皱叶控制基因GhZY连锁的SNP分子标记应用于鉴定棉花皱叶品种或者辅助育种的准确性进行验证。

PCR反应在Hydrocycler水浴PCR仪上进行。

PCR扩增的体系为：25ng模板DNA，0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，0.2mM的dNTPmix；0.5U Taq DNA聚合酶，1×PCR Buffer(Fermentas)2μL，ddH

扩增条件依次为：先于94℃保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度57°，保持30秒钟，使引物与模板充分退火；在72℃保持1分钟（扩增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环35次，使扩增的DNA片段大量累积。最后，在72℃保持4min，使产物延伸完整，4℃保存。

PCR扩增产物的酶切方法：酶切体系(30μl)中含有：PCR扩增产物10μl，10×Buffer R(购自Thermo公司)2μl，XbaI（购自Thermo公司)1.0μl，灭菌双蒸水补足到30μl。所述的酶切反应程序为：阶段1：65℃温育10h；阶段2：80℃ 20min失活；阶段3：4℃保存。

将得到的各材料的基因分型结果与实际观察到的棉花叶型进行对比，当酶切产物大小为316bp时，待测棉花基因组中SNP位点的基因型为G:G，如果棉花为皱叶，则表示检测结果准确，否则认为鉴定结果不准确；当酶切产物大小为344bp时，待测棉花基因组中SNP位点的基因型为A:A，如果棉花为正常叶，则表示检测结果准确，否则认为鉴定结果不准确；当酶切产物大小为344bp和316bp时，待测棉花基因组中SNP位点的基因型为A:G，如果棉花为正常叶，则表示检测结果准确，否则认为鉴定结果不准确。

酶切后进行凝胶电泳，部分电泳结果参见图3，部分材料的酶切产物大小见表1，基因分型结果见表1。

将得到的各材料的基因分型结果与实际观察到的棉花叶型进行对比，二者一致率为100%，表明本发明的SNP分子标记检测的准确率为100%，可以应用于棉花分子标记辅助选择育种。

表1 其中20份测试材料的基因分型结果和实际观察到的棉花叶型

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