一种取代烟酰基哌嗪类化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种衍生物及其制备方法，具体涉及取代烟酰基哌嗪类化合物、包含所述化合物的组合物、所述化合物的制备及其在抗冠状病毒药物领域的应用，属于有机合成与医药应用技术领域。

背景技术

SARS-CoV-2变异迅速且具有显著的免疫逃逸能力，能够突破人体由疫苗或感染形成的免疫屏障，造成新的感染高峰，因此进一步开发高活性、低毒性、疗效确切的抗新冠药物成为保障人民生命健康的重要手段。因此卫健委近日发布的《关于对新型冠状病毒感染实施“乙类乙管”的总体方案》强调，要做好治疗新型冠状病毒感染相关对症治疗药物、抗新冠病毒小分子药物的准备，因此口服小分子新冠治疗药物的研发仍需持续推进。主蛋白酶(M

目前报道的SARS-CoV-2M

吡啶酰基哌嗪类化合物GC-14(IC

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种抑制主蛋白酶的取代烟酰基哌嗪类化合物、包含所述化合物的组合物及其制备方法，本发明还提供上述化合物作为SARS-CoV-2M

本发明的技术方案如下：

1.取代烟酰基哌嗪类化合物

取代烟酰基哌嗪类化合物，或其药学上可接受的盐，具有如下通式I所示的结构：

其中，

R

R

式I所示化合物为S构型。

药学上可接受的盐型包括常用的盐酸盐、硫酸盐或磷酸盐等无机酸盐以及甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、富马酸盐、枸橼酸盐或乙酸盐等有机酸盐。

根据本发明优选的，R

R

R

根据本发明进一步优选的，取代烟酰基哌嗪类化合物是下列化合物之一：

本发明中所述的“药学上可接受的盐”是指在可靠的医药评价范围内，化合物的盐类适于与人或较低等动物的组织相接触而无不适当的毒性、刺激及过敏反应等，具有相当合理的收益与风险比例，通常是水或油可溶的或可分散的，并可有效地用于其预期的用途。包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐，在这里是可做预期的用途并与式I、II化合物的化学性质相容的。适宜的盐的列表参见S.M.Birge等，J.Pharm.Sci.,1977,66,1-19页。进一步优选的盐型为盐酸盐、硫酸盐或磷酸盐等无机酸盐以及甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、富马酸盐、枸橼酸盐或乙酸盐等有机酸盐。

2.取代烟酰基哌嗪类化合物的制备方法

取代烟酰基哌嗪类化合物的制备方法，步骤如下：以3,4-二氯苯硼酸1和(S)-Boc-哌嗪甲酸酯2为起始原料，二氯甲烷作为反应溶剂，在醋酸铜催化下通过Chan-Lam偶联反应得中间体3；然后经氢氧化锂水解甲酯得到中间体4；随后将中间体4溶解在适量的二氯甲烷中，在缩合剂HATU的作用下与各类R

合成路线如下：

试剂及条件：(i)醋酸酮，氧气，吡啶，二氯甲烷，室温；(ii)氢氧化锂，甲醇，四氢呋喃，水，室温；(iii)各类胺基化合物，HATU，N,N,-二异丙基乙胺，二氯甲烷，室温；(iv)三氟乙酸，二氯甲烷，室温；(v)各类烟酸化合物，HATU，N,N,-二异丙基乙胺，二氯甲烷，室温。

其中，R

根据本发明优选的，含有取代烟酰基哌嗪类化合物的制备方法，具体步骤如下：

(1)将(S)-1-叔丁基-3-甲基哌嗪-1,3二羧酸(1)与3,4-二氯苯硼酸(2)加入二氯甲烷，搅拌中溶解近澄清；在溶液中一次性加入无水醋酸铜与2当量吡啶；混悬均匀后在氧气氛围下反应24h，TLC检测反应乙酸乙酯/石油醚＝1:2，v/v；反应完全后，在体系中加水淬灭反应；分液，以蒸馏水反复洗至有机相无蓝色；有机相经饱和氯化钠溶液洗涤，分出有机相，依次经无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩，所得粗品经硅胶柱层析分离纯化得中间体3，为无色油状液体；

(2)中间体3溶于甲醇与四氢呋喃混合液中，冰浴下滴加氢氧化锂的水溶液，室温反应，搅拌4h后减压浓缩部分有机溶剂；在冰浴下向剩余的水溶液中滴加1M稀盐酸溶液，将pH调至3以下，有大量乳白色固体析出。过滤、洗涤、干燥得中间体4，为微黄色粉末状固体；

(3)冰浴下，将中间体4与2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)加入到二氯甲烷中，活化30min后加入N,N,-二异丙基乙胺和各种R

(4)在冰水浴下将中间体5溶于二氯甲烷中，逐滴加入三氟乙酸与二氯甲烷的混合溶液；滴加结束后，转至室温反应；约6h后反应液减压浓缩，得到紫红色油状物；加入乙酸乙酯后，析出大量白色固体；过滤，固体用乙酸乙酯/石油醚洗涤，干燥得各目标产物中间体6的三氟乙酸盐；

(5)将各类烟酸化合物与2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)加入到二氯甲烷中，活化20min后加入N,N,-二异丙基乙胺和中间体6的三氟乙酸盐，室温反应12h，TLC监测；反应结束后加水，冰水浴下滴加1M的稀盐酸水溶液，分液，二氯甲烷相依次经饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后硅胶柱色谱分离得到目标化合物。

3.取代烟酰基哌嗪类化合物的生物活性及应用

本发明公开了含取代烟酰基哌嗪类化合物的活性筛选结果及其作为主蛋白酶抑制剂的首次应用。通过实验证明本发明的取代烟酰基哌嗪类化合物可作为主蛋白酶抑制剂用于制备抗冠状病毒药物。本发明还提供上述化合物在制备抗冠状病毒药物中的应用。

目标化合物的抗SARS-CoV-2主蛋白酶活性实验

对按照上述方法合成的一类取代烟酰基哌嗪类化合物进行了SARS-CoV-2主蛋白酶靶标活性测试，它们的抗主蛋白酶活性数据列于附图2中，以先导化合物GC-14及上市药物奈玛特韦为阳性对照。

本发明新合成的取代烟酰基哌嗪类化合物绝大部分呈现出显著的主蛋白酶抑制活性，例如化合物GC-55、GC-67、GC-78。其中GC-67的活性尤为突出(IC

本发明的一类取代烟酰基哌嗪类化合物可作为SARS-CoV-2主蛋白酶抑制剂应用，具体地说，作为SARS-CoV-2抑制剂用于制备抗新冠病毒药物。

一种抗新冠病毒药物组合物，包括本发明的取代烟酰基哌嗪类化合物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。

本发明提供了结构全新的取代烟酰基哌嗪类化合物及其制备方法，本发明还提供了化合物抗SARS-CoV-2主蛋白酶活性筛选结果及其在抗病毒领域中的首次应用。本发明的取代烟酰基哌嗪类化合物可作为SARS-CoV-2主蛋白酶抑制剂应用并具有很高的应用价值。具体地说，本发明通过结构优化发现了活性更高、结构新颖的主蛋白酶抑制剂，可作为SARS-CoV-2主蛋白酶抑制剂用于制备抗新冠病毒药物。

附图说明

图1是M

图2是以SARS-CoV-2M

图3是在10μM浓度下化合物对主蛋白酶的抑制率。

具体实施方式

通过下述实施例有助于理解本发明，但是不能限制本发明的内容，所述百分比数均为质量百分比。

实施例1：GC-55至GC-84的制备

(1)将(S)-1-叔丁基-3-甲基哌嗪-1,3二羧酸(1，5.0g，20.5mmol，1.0eq.)与3,4-二氯苯硼酸(2，7.8g，41mmol，2.0eq.)加入100mL二氯甲烷，搅拌中溶解近澄清。向溶液中一次性加入无水醋酸铜(3.71g，20.5mmol，1.0eq.)与吡啶(3.20g，41mmol，2.0eq.)。混悬均匀后在氧气氛下反应24h，TLC检测反应EA/PE＝1:2，v/v。16h反应完全后，在体系中加水淬灭反应。分液，以蒸馏水反复洗至水相无蓝色。有机相经饱和氯化钠溶液洗涤，分出有机相，依次经无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩，所得粗品经硅胶柱层析(EA/PE梯度洗脱)分离纯化得中间体3，为无色油状液体4.5g，收率59％。ESI-MS:m/z 389.2[M+H]

(2)中间体3(4.0g，7.5mmol，1.0eq.)溶于50mL甲醇与50mL四氢呋喃混合液中，冰浴下滴加氢氧化锂(1.57g，37.5mmol，5.0eq.)的水溶液，室温反应，搅拌12h后减压浓缩部分有机溶剂。在冰浴下向剩余的水溶液中滴加1M稀盐酸溶液，将pH调至2-3，有大量乳白色固体析出。过滤、100mL水洗多次、真空干燥得中间体4约2.5g，收率89.3％，为微黄色粉末状固体，ESI-MS:m/z 373.2[M-H]

(3)冰水浴下，将中间体4(2.4g，6.4mmol，1.0eq.)与2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，3.65g，9.6mmol，1.5eq.)加入到100mL二氯甲烷中，活化30min后加入二异丙基乙胺(DIPEA，2.5g，19.2mmol，3.0eq.)和噻吩-2-甲胺(3.9g，9.7mmol，1.0eq.)，转至室温反应20小时，溶液变为深黄色，有固体析出，TLC监测反应完成；抽滤反应液中固体，用二氯甲烷洗涤所得固体，真空干燥，得乳白色中间体52.4g，收率80.0％。ESI-MS:m/z470.2[M+H]

(4)在冰水浴下将中间体5(2.4g，5.1mmol，1.0eq.)溶于100mL二氯甲烷中，逐滴加入6mL三氟乙酸与30mL二氯甲烷的混合溶液。滴加结束后，转至室温反应。约5h后TLC检测反应完后减压浓缩反应液，得到紫红色油状物。加入50mL乙酸乙酯后，析出大量白色固体。过滤，固体用30mL乙酸乙酯洗涤2次，真空干燥。得目标产物中间体6的三氟乙酸盐2.1g，收率86.4％。ESI-MS:m/z 370.3[M+H]

(5)将吡啶并吡咯羧酸(0.027g，0.24mmol，1.2eq.)与HATU(0.114g，0.3mmol，1.5eq.)加入到10mL二氯甲烷中，活化30min后加入二异丙基乙胺(DIPEA，0.103g，0.8mmol，4.0eq.)和关键中间体6的三氟乙酸盐(0.1g，0.2mmol，1.0eq.)，室温反应12h，TLC监测；反应结束后加水淬灭，冰水浴下滴加1M的稀盐酸水溶液，分液，二氯甲烷相依次经饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后硅胶柱色谱分离得到目标化合物GC-55。

产物为白色固体，收率51％，熔点146-150℃。

1

操作同上，所不同的是使用4-氯烟酸。

产物为淡黄色油状物，收率：45％。

1

操作同上，所不同的是使用5-氟烟酸。

产物为白色固体，收率：58％，熔点165-168℃。

1

操作同上，所不同的是使用5-三氟甲基烟酸。

产物为白色固体，收率：60％，熔点140-142℃。

1

操作同上，所不同的是使用6-甲氧基烟酸。

产物为淡黄色固体，收率：63％，熔点117-119℃。

1

操作同上，所不同的是使用4-甲氧基烟酸。

产物为白色固体，收率：66％，熔点106-109℃。

1

操作同上，所不同的是使用6-羟基烟酸。

产物为淡黄色固体，收率：55％，熔点>206℃。

1

操作同上，所不同的是使用5-羟基烟酸。

产物为淡黄色固体，收率：58％，熔点90-93℃。

1

/>

操作同上，所不同的是使用6-氨基烟酸。

产物为白色固体，收率：58％，熔点112-114℃。

1

操作同上，所不同的是使用5-甲氧基烟酸。

产物为淡黄色油状物，收率：54％。

1

操作同上，所不同的是使用6-硝基烟酸。

产物为白色固体，收率：61％，熔点97-100℃。

1

操作同上，所不同的是使用6-羟胺烟酸。

产物为白色固体，收率：55％，熔点144-146℃。

1

产物为白色固体，收率：55％，熔点98-100℃。

1

产物为白色固体，收率：58％，熔点86-89℃。

1

产物为白色固体，收率：58％，熔点133-135℃。

1

产物为白色固体，收率：61％，熔点97-98℃。

1

产物为白色固体，收率：65％，熔点108-110℃。

1

实施例2:目标化合物的对主蛋白酶(M

实验原理：

采用的荧光共振能量转移法(fluorescence resonance energy transfer，FRET)，底物结构为：MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH

实验方法：

使用荧光共振能量转移法，测试了目标化合物的对主蛋白酶的抑制活性。使用MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH

复筛：选取1.5μM的SARS-CoV-2M

表2.取代烟酰基哌嗪类化合物抑制SARS-CoV-2主蛋白酶的复筛结果

a

实验结论分析：

本发明新合成的取代烟酰基哌嗪类化合物绝大部分呈现出显著的主蛋白酶抑制活性。化合物GC-55、GC-67、GC-14d、GC-14f、GC-78和GC-78-HCl活性均优于先导化合物GC-14和奈玛特韦，其中GC-78的活性尤为突出(IC

实施例3优选化合物细胞水平抗SARS-CoV-2活性评价

实验原理

细胞水平测定抗SARS-CoV-2活性的主要方法为酶联免疫吸附测定(EnzymeLinked ImmunosorbentAssay，ELISA)，指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。

实验材料

SARS-CoV-2病毒株；Vero E6细胞；待测化合物；PBS缓冲液；Dulbecco’s MEM 5％胎牛血清；豚鼠抗SARS-CoV-2抗体；甲基纤维素；山羊抗豚鼠lgG；阳性对照：奈玛特韦实验方法

在感染前约24小时将Vero E6细胞种植于96孔板中，密度为1.7×10

携带固定化Vero E6细胞的平板用焦点形成测定缓冲液冲洗，与针对病毒粒子产生的豚鼠抗SARS-CoV-2抗体孵育。第二抗体是山羊抗豚鼠IgG(辣根过氧化物酶结合物)。基质为TrueBlue，感染细胞/病灶表现为单个或蓝色细胞簇。染色后，在EliSpot阅读器上读取平板。染色的相对表面积用于计算药物的特定浓度梯度的抑制活性，并生成EC

活性结果与讨论

表2.取代烟酰基哌嗪类化合物细胞内抗SARS-CoV-2活性结果

a

实验结论分析：

选取本发明中酶抑制活性较好的代表性化合物在Vero E6细胞中进行抗SARS-CoV-2活性测试。其中化合物GC-55、GC-67、GC-14d、GC-14f、GC-78和GC-78-HCl活性均优于先导化合物GC-14和奈玛特韦，其中GC-78的活性尤为突出，其抗SARS-CoV-2活性较先导化合物GC-14提高了3倍，与上市药物奈玛特韦的活性相当；因此，取代烟酰基哌嗪类化合物具有进一步研发的价值。