一种猫疱疹病毒检测引物组及其等温检测试剂盒和应用

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种猫疱疹病毒检测引物组及其等温检测试剂盒和应用。

背景技术

猫疱疹病毒(Felineherpesvirus，FHV)又叫猫鼻气管炎病毒(FelineRhinotracheitisvirus)，属疱疹病毒科，是有囊膜的双链DNA病毒。病毒直径约为128nm～168nm，能在猫胚肾、肺以及睾丸细胞培养物内良好增值和传代。该病毒能致发猫鼻气管炎病，猫是本病唯一的自然宿主，病猫是主要传染源，通过直接接触传播。主要侵害仔猫，感染猫症状严重时，出现体温升高，明显的上呼吸道感染。猫鼻气管炎发病率可达100％，死亡率可达50％。病毒在病猫的鼻、咽喉、气管和支气管以及舌、结膜等的部位增殖。该病发病范围广，因此建立一种快速、准确、特异和灵敏的检测方法势在必行。

猫可较好的耐受麻醉和一般手术，手术时能保持正常血压。在药品的降压物质检查中，猫作为中国药典规定的实验动物，越来越多的被用于形觉波剥夺性弱视、食管病等研究。猫作为实验动物，虽然应用越来越广泛，但国内目前尚未见有开展猫的检测。虽然早在1999年，蒋虹等就建立过猫鼻气管炎病毒血清学检测方法，2011年前刘宝山、林颖、屈哲先后建立了FHV-1PCR检测方法，但都没有推广开来，实验用猫到目前为止也没有标准化规定。目前，实验用猫也多是从商贩或收购型饲养场购买，其来源混杂，遗传、年龄、微生物和寄生虫等携带情况不清，实验重现性差，结果隐存着未知因素的影响。FHV-1是目前已知最重要的猫呼吸道疾病之一，其发病率和死亡率均较高，严重危害猫的健康。目前国内还没有开展猫疱疹病毒等猫易感病毒临床检测的机构，仍未见有开展实验用猫FHV-1检测的报道，国内也没有相关检测试剂盒的出售。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速、准确的猫疱疹病毒检测引物组及其等温检测试剂盒和应用。

本发明提供了一种猫疱疹病毒检测引物组，包括引物对FHV-1-F3/FHV-1-B3、引物对FHV-1-FIP/FHV-1-BIP和引物对FHV-1-LF/FHV-1-LB；

所述FHV-1-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述FHV-1-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述FHV-1-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述FHV-1-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述FHV-1-LF的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述FHV-1-LB的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

本发明提供了一种猫疱疹病毒检测试剂盒，包括所述猫疱疹病毒检测引物组。

优选的，还包括反应预混液；

所述反应预混液包括含0.67μLBst2.0WarmStartDNA聚合酶，8.33μL缓冲液；所述反应预混液中还包括酸碱指示剂；

优选的，所述酸碱指示剂包括酚红。

优选的，还包括样品裂解液。

本发明提供了所述猫疱疹病毒检测引物组在制备猫疱疹病毒检测试剂或试剂盒中的应用。

本发明提供了所述猫疱疹病毒检测引物组或所述试剂盒在非诊断目的的猫疱疹病毒检测中的应用。

本发明提供了一种非诊断目的的猫疱疹病毒环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤：

1)将待测样品进行裂解后，得到裂解后的样品液；

2)将步骤1)中所述裂解后的样品液在所述引物组和所述试剂盒中反应预混液的作用下进行环介导等温扩增反应，得到扩增产物；

3)根据步骤2)中所述扩增产物的颜色判断待测样品中是否含有猫疱疹病毒。

优选的，步骤1)中所述裂解时，所用溶液为样品裂解液；所述待测样品和样品裂解液的体积比为2:5；

所述裂解的条件为95℃处理5min。

优选的，步骤2)中环介导等温扩增反应的反应体系为20μL：反应预混液10μL、引物组8μl和裂解后的样品液2μL；

当反应预混液中酸碱指示剂为酚红时，扩增产物显示黄色，说明待测样品中检测到猫疱疹病毒，为阳性样本；扩增产物显示紫红色或粉红色，说明待测样品中未检测到猫疱疹病毒或样品中猫疱疹病毒的浓度未达到检测限。

本发明提供的猫疱疹病毒检测引物组，包括引物对FHV-1-F3/FHV-1-B3、引物对FHV-1-FIP/FHV-1-BIP和引物对FHV-1-LF/FHV-1-LB。本发明首先从猫疱疹病毒基因序列中确定保守区域，再排除保守区域中高级结构复杂的区域，最终确定适合引物设计的区域。经过引物对筛选，筛选得到的所述引物组能够准确快速检测猫疱疹病毒，具有较高的检测重复性、特异性和检测灵敏度。

本发明提供一种非诊断目的的猫疱疹病毒检测方法，用所述引物组进行环介导等温扩增反应，其与利用普通PCR检测试剂盒的检测方法相比，在恒温下即可反应，不需变温，不需复杂仪器，且反应时间短，而且结果可视化，适用于现场快速检测。

附图说明

图1为猫疱疹病毒检测引物筛选结果，其中1、3、5分别为第一引物组、第二引物组和第三引物组；2、4、5分别为阴性对照；

图2为猫疱疹病毒第一引物组检测灵敏度结果；其中管壁上标注的考虑数为阳性质控品在反应体系中的终浓度拷贝数；

图3为猫疱疹病毒第一引物组重复性检测结果；

图4为猫疱疹病毒第一引物组特异性检测结果，其中1-5为猫细小病毒核酸样品、猫冠状病毒核酸样品、猫杯状病毒核酸样品、猫杯状病毒核酸样品和猫白血核酸样品。

具体实施方式

本发明提供了一种猫疱疹病毒检测引物组，包括引物对FHV-1-F3/FHV-1-B3、引物对FHV-1-FIP/FHV-1-BIP和引物对FHV-1-LF/FHV-1-LB。

在本发明中，为了筛选适合猫疱疹病毒检测的引物组，以猫疱疹病毒的保守序列为模板设计了多组引物对，具体见表1。

表1猫疱疹病毒检测引物组信息

在本发明中，利用三组引物组检测猫疱疹病毒，筛选结果显示第一引物组最适合检测猫疱疹病毒，而第二引物组和第三引物组不能成功扩增猫疱疹病毒。因此，本发明提供了所述猫疱疹病毒检测引物组在制备猫疱疹病毒检测试剂或试剂盒中的应用。

本发明提供了一种猫疱疹病毒检测试剂盒，包括所述猫疱疹病毒检测引物组。所述试剂盒优选还包括反应预混液。所述反应预混液包括含0.67μLBst2.0WarmStartDNA聚合酶(不含RT酶)，8.33μL缓冲液；所述反应预混液中还包括酸碱指示剂；所述酸碱指示剂优选包括酚红。在本发明实施例中，所述反应预混液购自NEB公司。所述试剂盒优选还包括样品裂解液。所述样品裂解液用于裂解样品中病毒，使核酸释放。所述样品裂解液购自杭州百裕生物科技有限公司。

本发明提供了所述猫疱疹病毒检测引物组或所述试剂盒在非诊断目的的猫疱疹病毒检测中的应用。

本发明提供了一种非诊断目的的猫疱疹病毒环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤：

1)将待测样品进行裂解后，得到裂解后的样品液；

2)将步骤1)中所述裂解后的样品液在所述引物组和所述试剂盒中反应预混液的作用下进行环介导等温扩增反应，得到扩增产物；

3)根据步骤2)中所述扩增产物的颜色判断待测样品中是否含有猫疱疹病毒。

在本发明中，所述裂解时，所用溶液优选为样品裂解液；所述待测样品和样品裂解液的体积比优选为2:5。所述裂解的条件为95℃处理5min。所述待测样品包括猫科动物的体液，具体包括尿液、血液、唾液等。

得到裂解后的样品液后，本发明将所述裂解后的样品液在所述引物组和所述试剂盒中反应预混液的作用下进行环介导等温扩增反应，得到扩增产物。

在本发明中，环介导等温扩增反应的反应体系优选为20μL：反应预混液10μL、引物组8μL和裂解后的样品液2μL。环介导等温扩增反应的反应程序优选为65℃50min，10℃2min。

得到扩增产物后，根据所述扩增产物的颜色判断待测样品中是否含有猫疱疹病毒。

在本发明中，根据扩增产物的颜色变化判断样品是否感染猫疱疹病毒的原理是：DNA聚合酶在LAMP扩增反应中产生大量质子，引发pH值的下降，当反应体系中存在酚红指示剂时，使反应液颜色从粉红色变为黄色。其中，阳性样品反应后显示黄色，无扩增样品及阴性样品反应后显示紫红色/粉红色。当反应预混液中酸碱指示剂为酚红时，扩增产物显示黄色，说明待测样品中检测到猫疱疹病毒，为阳性样本；扩增产物显示紫红色或粉红色，说明待测样品中未检测到猫疱疹病毒或样品中猫疱疹病毒的浓度未达到检测限。

下面结合实施例对本发明提供的一种猫疱疹病毒检测引物组及其等温检测试剂盒和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种猫疱疹病毒检测引物组的设计和筛选方法

在GenBank数据库中通过关键词(FelinePanleukopeniaVirus[Title])ANDCompletegenome[Title]检索猫疱疹病毒毒株序列并下载。通过序列比对找出病毒基因组的保守区域，并排除序列中高级结构复杂的区域，挑选出用于设计“猫疱疹病毒可视化快速恒温检测试剂盒”的引物设计区，设计出3组各参数指标优良的引物。根据保守靶序列，利用工具进行等温扩增引物的设计。所设计引物进一步通过BLASTn和Primer-BLAST检索验证。引物序列见表1。

表1猫疱疹病毒检测引物组信息

筛选引物，筛选出检测猫疱疹病毒的最佳引物

将设计合成的三组引物组配制LAMP扩增反应体系，反应体系共20μL:反应预混液10μL，引物组总体积8μL(包括0.5μLFHV-1-F3(浓度为10μM)、0.5μLFHV-1-B3(浓度为10μM)、2μLFHV-1-FIP(浓度为20μM)、2μLFHV-1-BIP(浓度为20μM)、1μLFHV-1-LF(浓度为20μM)、1μLFHV-1-LB(浓度为20μM)、1μLddH

表2猫疱疹病毒引物筛选结果

由上述结果可知，在相同阳性样本和阴性样品的基础上，仅第一引物检测到阳性样本，第二引物组和第三引物组并未检测到阳性样本(见图1)，因此选择第一引物组进行后续实验。

实施例2

第一引物组的检测灵敏度实验

以人工合成的猫疱疹病毒无感染性基因片段(质粒)作为阳性质控品(由苏州金唯智生物科技有限公司合成)，阳性质控品浓度为9×10

表3猫疱疹病毒灵敏度实验结果小结

实施例3

第一引物组的检测重复性

设计3批次试剂盒，每批次取5个试剂盒，分别对核酸阳性样本3份、弱阳性样本3份、阴性样本3份按照如下方法进行检验，每个试剂盒对每份样品进行3次批间检验，每一批批内重复3次。

结果见图3。阳性对照三个重复扩增产物显示黄色，弱阳性对照三个重复显示偏橙色，而阴性对照显示粉色，且三个重复检测结果较为一致，说明所述第一引物组具有较理想的重复性。

实施例4

第一引物组的特异性检测实验

利用猫细小病毒核酸样品、猫杯状病毒核酸样品、猫冠状病毒核酸样品、猫疱疹病毒核酸样品、猫艾滋病病毒样品、猫白血核酸样品进行检验。用样品裂解液按5：2(体积比)对待检样品进行裂解，95℃作用5分钟。反应母液配置和反应过程同实施例2。

结果可见，第一引物组对样品猫杯状病毒核酸样品、猫冠状病毒核酸样品、猫细小病毒核酸样品和猫白血核酸样本检测结果均为阴性，仅能对猫疱疹病毒核酸样品检测得到阳性结果(见图4)，说明该试剂具有良好的特异性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。