一种双加氧酶基因簇及其编码蛋白质的应用

技术领域

本发明涉及微生物基因工程领域，具体涉及一种双加氧酶基因簇及其编码蛋白质的应用。

背景技术

随着化学工业的高速发展，Phenoxyalkanoic(PAAs)苯氧乙酸类除草剂如4-氯苯氧乙酸钠(4-CPA)被广泛应用于工农业生产过程中，减少虫害与杂草的侵害，能有效提高农作物产量。但它们具有一定的毒性毒性，对生物具有致癌、致畸、致突变作用，不可避免的会进入环境造成污染。微生物对外来化合物的降解或转化具有巨大的应用潜力，而由于氯代芳香族化合物多为人工合成，自然界中的微生物缺乏降解相关的酶。

为此，现通过生物处理将有毒物质转化为无毒物质，投资少、成本低、且无二次污染是近年来污染修复相关研究的热点。例如，有研究发现，可以以4-氯苯氧乙酸钠为碳源来得到一种降解4-氯苯氧乙酸钠的菌株。

虽然，不断有新的能够降解氯代芳香族化合物的微生物被分离与鉴定。但面对复杂多样的生物修复需求，可供选择的降解微生物仍十分有限。故为了进一步对4-氯苯氧乙酸钠(4-CPA)的降解进行探索，现需要一种优化的技术，来有目的的改造合适的微生物，使它们获得相应的生物修复能力，从而高效降解氯代芳香族化合物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双加氧酶基因簇及其编码蛋白质的应用，以解决现有技术中氯代芳香族化合物的降解效率低的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明具体提供下述技术方案：

本发明提供了一种双加氧酶基因簇，来自于菌株DL-D2，至少包括gene5958基因编码与gene 5959基因编码：

所述gene 5958基因编码包含334个氨基酸，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述gene 5959基因编码包含430个氨基酸，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

其中，所述gene 5958基因编码与所述gene 5959基因编码在一个载体里面共同表达。

作为本发明的一种优选方案，所述gene 5958与所述gene 5959共同插入表达载体，所述表达载体具有gene 5958+5959；

所述表达载体5958+5959转化大肠杆菌后，阳性菌株能够将4-氯苯氧乙酸钠转化为4-氯邻苯二酚，所述gene 5958与所述gene 5959在同一个细胞内表达。

作为本发明的一种优选方案，所述双加氧酶基因簇还包括gene 5962，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

其中，具有gene 5962的表达载体或基因工程菌能够将4-氯邻苯二酚转化为β-氯粘酸盐。

作为本发明的一种优选方案，所述gene 5962插入至表达菌株中，进行纯化，得到融合蛋白；

所述融合蛋白能够体外降解4-氯邻苯二酚。

本发明提供了双加氧酶基因簇在降解4-氯苯氧乙酸钠(4-CPA)上的应用，并提供了一种4-氯苯氧乙酸钠(4-CPA)的降解途径，通过用过双加氧生成了4-氯邻苯二酚，4-氯邻苯二酚在氯邻苯二酚双加氧酶5962的作用下氧化开环生成了β-氯粘酸盐，5964将β-氯粘酸盐转化为γ-羧甲基-丁烯内酯，5965将γ-羧甲基-丁烯内酯转化为马来酰乙酸酯，5966将马来酰乙酸酯转化为富马酸盐，并将其引入三羧酸循环。

本发明提供了具有双加氧酶基因簇的表达载体或基因工程菌，如表达菌株PET-28a(+)-5958+5959、表达载体(pET-28a(+)-5962)、融合蛋白His

本发明与现有技术相比较具有如下有益效果：

本发明提供了5959基因编码与5958编码基因，在5959基因编码与5958编码基因在同一个表达载体中表达时，即氧化酶5959和还原酶5958同时存在于一个细胞内的情况下，用过双加氧反应将4-氯苯氧乙酸钠降解为中间产物4-氯邻苯二酚，使得4-氯邻苯二酚在环境中更容易降解，加快了降解速度，提高了对4-氯苯氧乙酸钠类有机农药的降解效率。

发明提供了5958+5959基因簇，在同时将基因簇导入至编码蛋白质后，得到的表达载体具有快速降解4-氯苯氧乙酸钠的能力，并能够为高效降解氯代芳香族化合物提供了新的合成思路；将gene 5958+5959编码两个蛋白同时导入基因工程菌或植物后，使得基因工程菌与植物获得降解4-氯苯氧乙酸钠的能力，从而高效降解氯代芳香族化合物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明提供实施例1中4-氯苯氧乙酸钠经DL-D2降解12h后紫外扫描图和和HPLC图谱；

图2为本发明提供实施例1中葡糖糖和4-氯苯氧乙酸钠导诱导DL-D212h后菌体PAGE-SDS图；

图3为本发明提供实施例2中诱导菌4-氯苯氧乙酸钠降解液上清HPLC图谱；

图4为本发明提供实施例3中表达载体构建技术路线示意图；

图5为本发明提供实施例3中5962表达菌株诱导后解降解4-氯邻苯二酚的HPLC图谱；

图6为本发明提供实施例4中融合蛋白His

图7为本发明提供实施例4中蛋白浓度标准曲线；

图8为本发明提供实施例4中粗酶/纯酶降解4-氯邻苯二酚的HPLC图谱；

图9为本发明提供实施例4中菌株DL-D2降解4-氯苯氧乙酸钠的代谢途径。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

菌株DL-D2是一种以4-氯苯氧乙酸钠唯一碳源的菌株，此种菌株能够对4-氯苯氧乙酸钠，其保藏编号为CCTCC M 2023677。但在菌株无法实现对4-氯苯氧乙酸钠的大量降解，为了进一步提高对4-氯苯氧乙酸钠降解效率，本发明旨在提供一种能够降解4-氯苯氧乙酸钠的基因编码以及能够降解4-氯苯氧乙酸钠的表达载体或基因工程菌，实现对农药的高速降解，减少农药的残留。

以下提供多个实施例。

本发明实施中所用试剂如下：

4-氯苯氧乙酸钠(纯度为98％)购自四川国光农化股份有限公司，甲醇(色谱纯)、醋酸、甘油、4-氯苯酚(纯度为98％)，2,4-二氯苯氧乙酸(纯度为97％))，4-氯邻苯二酚(纯度为98％)购自安耐吉化学；

细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)、快速质粒小提试剂盒(DP105)由天根生化科技(北京)有限公司提供，

SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)、BL713A彩色预染蛋白Marker(15-130kDa)、SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒考马斯亮蓝R-250购自Biosharp、琼脂糖、TAE、溴化乙锭、磷酸盐缓冲液(PBS)、葡萄糖、IPTG，NaH2PO4，NaCl，咪唑、Tris，EDTA，0.9％ TritonX-100，Urea，GSH，GSSG，抗生素(工作浓度)：卡那霉素，50mg/L；博来霉素，25ug/mL。

实施例1：4-氯苯氧乙酸钠降解相关基因簇鉴定

实验组：挑取过夜培养的DL-D2单菌落接种至100mL LB液体培养，30℃，150rpm培养过夜，取10mL菌液，5000rpm离心5min收集菌体，用基础盐培养基洗涤三次，MSM重悬后加入含有4-氯苯氧乙酸钠终浓度为250mg/L的100mL无菌MSM中。

对照组：对照加入含有葡萄糖终浓度为250mg/L的100mL无菌MSM中，30℃，150rpm培养12h后停止培养。

实验分析：

用紫外分光光度计扫描200-350nm的结果及HPLC检测结果(图1)，图中表明：4-氯苯氧乙酸钠已降解50％以上。

将剩余培养液于12000rpm离心1min后，弃上清。沉淀重悬于25μL1X蛋白上样buffer，混匀后煮沸10min，离心5min后，做聚丙烯酰胺凝胶电泳(如图2所示)，根据胶图显示，实验组与对照组相比，在28Kda左右有一条比较明显的蛋白条带。将此蛋白条带切下后，寄送至北京华大蛋白质研发中心有限公司做蛋白质谱鉴定，以DL-D2基因作为数据库比对，鉴定结果见表1。

表1

根据表1可知，gene5962比对率最高为96％，同时gene5963，gene5965比对率也非常高，分别为92％和57％。由于Scaffold63上有3个关键基因，得到gene5962、gene5963、gene5965参与了4-氯苯氧乙酸钠降解的过程，同时得到Scaffold63有其它基因也参与了4-氯苯氧乙酸钠降解的过程。

gene5958的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

gene5959的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

gene5962的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在图1中，27KDA左右有很明显的差异蛋白，与菌株DL-D2的所有基因中进行比对，发现gene5962比对率最高为96％，该基因位于Scaffold63上。在Scaffold63上成功克隆了一个双组分的4-氯苯氧乙酸钠双加氧酶基因gene5958+5959。

据此，在Scaffold63上发现了一个氧化酶基因5959和一个还原酶基因5958，氧化酶组分gene5959长度是1293bp，编码一个包含430个氨基酸，分子量为48.8Kda的蛋白。gene5959在NR数据库注释为Rieske2Fe-2Sdomain-containing protein，在Swiss-Prot数据库注释为3-chlorobenzoate-3,4-dioxygenase oxygenase subunit。

还原酶组分gene5958长度是1005bp，编码一个包含334个氨基酸，分子量为37.5Kda的蛋白。gene5958在NR数据库注释为2Fe-2S iron-sulfur cluster bindingdomain-containing protein，Swiss-Prot数据库注释为Carnitine monooxygenasereductase subunit。

根据实施例1可知，gene5958+5959主要参与4-氯苯氧乙酸钠下的降解，为编码降解4-氯苯氧乙酸钠关键酶的基因；gene5962、gene5963、gene5965、gene 5966主要参与4-氯苯氧乙酸钠下游产物的降解，为此，以下通过多个实施例对每个基因功能进行验证。

实施例2：5958+5959基因的功能验证

1、构建表达菌株

实验例1：以PET-28a(+)质粒DNA作为模板扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，以菌株DL-D2基因组DNA为模板，扩增基因片段gene5958+5959，导入pET-28a(+)构建重组质粒pET-28a(+)-5958+5959，并成功转化E.coli BL21(DE3)构建E.coliBL21(DE3)表达菌株E.coliBL21(pET-28a(+)-5958+5959)；

对比例1：与实验例1不同的是，扩增基因片段gene5958，构建E.coliBL21(DE3)表达菌株E.coli BL21(pET-28a(+)-5958)；

对比例2：与实验例1不同的是，扩增基因片段gene 5959，构建E.coliBL21(DE3)表达菌株E.coli BL21(pET-28a(+)-5959)。

2、构建表达菌株的诱导与功能验证

使用终浓度为1mM的IPTG对实验例1、对比例1以及对比例2进行低温诱导，取50mL诱导后的表达菌株，5000rpm离心3min，弃上清，菌体重悬于10mL灭菌的MSM中，加入4-氯苯氧乙酸钠至终浓度为50mg/L,30℃，150rpm培养过夜。取1mL培养液12000rpm离心1min后取500μL上清，加入500μL甲醇充分混匀后测HPLC，以pET-28a(+)空载的E.coli BL21(DE3)菌株作为对照组。

检测结果见图3。

由图3可以看出，表达菌株E.coli BL21(pET-28a(+)-5958+5959)，即实验例1诱导后可以将4-氯苯氧乙酸钠完全降解，并生成保留时间为6.7min左右的新物质。单一的对比例1、单一的对比例2以及对比例1与对比例2的混合表达菌株均无法降解4-氯苯氧乙酸钠。

因此，5958和5959两个基因在一个细胞里面共同表达才能表现出降解4-氯苯氧乙酸钠和活性，即需要将gene 5958+5959编码两个蛋白质同时导入至基因工程菌或者植物中，基因工程菌或者植物才能具有降解4-氯苯氧乙酸钠的功能。

综上可知，5958+5959基因在诱导后能够参与对4-氯苯氧乙酸钠的降解，对4-氯苯氧乙酸钠的降解具有关键的作用。

同时，由基因5958和5959组成的双加氧酶，在将两个基因同时导入编码蛋白质中，再将蛋白质导入至基因工程菌与植物中，可以用于修复豆芽4氯苯氧乙酸钠残留，也可以用于构建抗4氯苯氧乙酸钠的转基因植物

由实施例2的图3可知，将4-氯邻苯二酚在在同等液相检测条件下检测，4-氯邻苯二酚出峰保留时间也在6.7min左右，因此得到：表达菌株E.coli BL21(pET-28a(+)-5958+5959)诱导后将4-氯苯氧乙酸钠降解产生的代谢产物为4-氯邻苯二酚。

由于4-氯邻苯二酚具有毒性，而菌株DL-D2能够完成对4-氯苯氧乙酸钠完全的降解，故菌株DL-D2的基因中存在能够快速降解4-氯邻苯二酚的基因，为此，发明还提供了实施例3，以验证gene 5962能够对4-氯苯氧乙酸钠的下游产物4-氯邻苯二酚进行降解。

实施例3：gene 5962的功能验证

1、克隆：对菌株DL-D2基因组注释结果进行分析和预测，并结合差异蛋白鉴定结果，对疑似基因进行表达，纯化和功能验证，克隆到一个氯邻苯二酚双加氧酶基因5962，5962全长747bp，编码由编码一个包含248个氨基酸，分子量为27.8Kda的蛋白。

2、以菌株DL-D2的基因组DNA为模板，特异性扩增基因5962，构建基因5962表达载体pET-28a(+)-5962，技术路线如图4所示；

3、构表达菌株E.coli BL21(pET-28a(+)-5962)

对表达菌株E.coli BL21(pET-28a(+)-5962)以终浓度为1mM的IPTG，20℃，130rpm诱导16h；

4、功能验证

将诱导后的表达菌株E.coli BL21(pET-28a(+)-5962)在5000rpm离心3min后，弃上清，菌体重悬于10mL含有50mg/L4-氯邻苯二酚的无菌MSM培养基于30℃恒温摇床中，150rpm振荡培养24h后取上清检测4-氯邻苯二酚的降解情况。

5、结果

如图5所示，添加有表达菌株E.coli BL21(pET-28a(+)-5962)的培养液中4-氯邻苯二酚全部降解，且生成了保留时间在4.6min左右的产物。表明5962基因有非常强的降解4-氯邻苯二酚的活性。

由实施例3可知，含有5962基因的表达菌株具有快速降解4-氯邻苯二酚的能力，即本发明从菌株DL-D2中得到了降解4-氯邻苯二酚的基因，且降解活性强。

为此，发明还提供了一个实施例，得到一种能够体外降解4-氯邻苯二酚的酶。

实施例4：融合蛋白His

1、对表达菌株E.coli BL21(pET-28a(+)-5962)以终浓度为1mM的IPTG，20℃，130rpm诱导16h后，超声波破碎并去除细胞碎片后，利用融合表达蛋白C端所携带的6个组氨酸标签，使用Ni

2、根据改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒制作标准曲线的方法，得到50-300μg/mL浓度范围内的蛋白浓度标准曲线(图7)，拟合后得到一次方程：

y＝69.319x-4.4961，R

纯化gene 5962稀释50倍后测得A595平均值为0.344，根据蛋白浓度方程计算得到5962浓度约为967.482μg/mL。

3、gene 5962的体外功能验证

通过建立酶反应体系，30℃催化12h后粗酶5962和纯酶5962降解4-氯邻苯二酚的结果如图8所示。

结果表明5962粗酶和纯化酶均有很强的降解4-氯邻苯二酚的活性。

融合蛋白His

对4-氯邻苯二酚双加氧酶5962酶学特性的研究表明，5962最适反应温度为30℃，最适反应pH为7.5。1mM的Zn

实施例5：4-氯邻苯二酚的降解机理

通过合理的推测，得到DL-D2对4-氯苯氧乙酸钠的降解途径(图9所示)：4-氯苯氧乙酸钠通过氧化酶5959和还原酶5958同时存在于一个细胞内的情况下，用过双加氧生成了4-氯邻苯二酚，4-氯邻苯二酚在氯邻苯二酚双加氧酶5962的作用下氧化开环生成了β-氯粘酸盐，5964将β-氯粘酸盐转化为γ-羧甲基-丁烯内酯，5965将γ-羧甲基-丁烯内酯转化为马来酰乙酸酯，5966将马来酰乙酸酯转化为富马酸盐，并将其引入三羧酸循环。

gene 5964的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

gene 5965的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

gene 5966的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明通过对菌株DL-D2的DNA进行蛋白质检测，4-氯苯氧乙酸钠通过氧化酶5959和还原酶5958同时存在于一个细胞内的情况下，用过双加氧生成了4-氯邻苯二酚，4-氯邻苯二酚在氯邻苯二酚双加氧酶5962的作用下氧化开环生成了β-氯粘酸盐，且得到了5962蛋白酶在体外环境下能够实现对4-氯邻苯二酚的快速降解，提高了对4-氯苯氧乙酸钠类有机农药的降解效率，并通过合理的推断，得到了4-氯邻苯二酚的降解机理。

以上实施例仅为本申请的示例性实施例，不用于限制本申请，本申请的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本申请的实质和保护范围内，对本申请做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本申请的保护范围内。