朊病毒蛋白(PRNP)IRNA组合物和其使用方法

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背景技术

朊病毒病或传播性海绵状脑病(TSE)是一组影响人类和动物两者的神经退行性病症。朊病毒病通常进展迅速，认知能力迅速下降，并且在症状发作后的几个月内具有致命性。朊病毒病是由在神经元细胞和神经胶质细胞中高度表达的细胞朊病毒蛋白PrP

根据疾病的感染方式，朊病毒病被分为三种不同的亚型：散发性、遗传性和后天性。朊病毒蛋白基因(PRNP)中的固有突变产生朊病毒病的遗传亚型，如克雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease，CJD)、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克病(Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease，GSS)和致命性家族性失眠症(FFI)。已经鉴定出超过60种PRNP变体。

在患有遗传性朊病毒病的患者中，PRNP基因中的突变使细胞产生PrP

先前研究已经表明，PrP的纯合性缺失预防小鼠和山羊的朊病毒感染(Büeler H.,Aguzzi A.等人《细胞(Cell)》1993；73:1339–1347；

目前还没有针对PRNP相关疾病(如朊病毒病)的有效治疗，并且任何可用的治疗都是姑息性的。因此，仍然需要可以利用细胞自身的RNAi机制选择性地且有效地沉默PRNP基因的药剂，所述药剂具有高生物活性和体内稳定性两者，并且可以有效地抑制靶PRNP基因的表达。

发明内容

本公开提供了RNAi药剂组合物，所述组合物影响对朊病毒蛋白(PRNP)基因的RNA转录物的RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的切割。所述PRNP基因可以在细胞内，例如，受试者(如人)体内的细胞。本公开还提供了使用本公开的所述RNAi药剂组合物用于抑制PRNP基因的表达或用于治疗将受益于抑制或减少PRNP基因表达的受试者的方法，例如，患有或易于患有PRNP相关疾病的受试者，例如，朊病毒病，如遗传性朊病毒病，例如，家族性克雅二氏病(familial Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克综合征(Gerstmann-

因此，一方面，本公开提供了一种用于抑制PRNP基因的表达的双链核糖核酸(RNAi)药剂，其中所述dsRNA药剂包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有义链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸序列相差不超过0个、1个、2个或3个核苷酸的至少15个，例如，15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个连续核苷酸，并且所述反义链包括与SEQ ID NO:5的核苷酸序列相差不超过1个、2个或3个核苷酸的至少15个，例如，15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个连续核苷酸，并且其中所述有义链、所述反义链或所述有义链和所述反义链两者与一个或多个亲脂性部分缀合。

在某些实施例中，所述有义链包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。在某些实施例中，所述有义链包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸，并且所述反义链包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸。在某些实施例中，所述有义链包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列的至少19个连续核苷酸，并且所述反义链包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列的至少19个连续核苷酸。

在一些实施例中，所述有义链的所述核苷酸序列包括表2至表3中的任一个中的任一个有义链核苷酸序列。

在另一方面，本公开提供了一种用于抑制PRNP基因的表达的双链核糖核酸(RNAi)药剂，其中所述双链RNAi药剂包含形成双链区的有义链和反义链，其中所述反义链包括与编码PRNP的mRNA互补的区，并且其中所述互补区包括与表2至表3中的任一个中所列的反义序列中的任一个相差不超过3个核苷酸(即，相差3个、2个、1个或0个核苷酸)的至少15个，例如，15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个连续核苷酸，并且其中所述有义链、所述反义链或所述有义链和所述反义链两者与一个或多个亲脂性部分缀合。

在某些实施例中，所述反义链包含互补区，所述互补区包含表2至表3中的任一个中的所列的反义序列中的任一个的至少15个连续核苷酸。在某些实施例中，所述反义链包含互补区，所述互补区包含表2至表3中的任一个中的所列的反义序列中的任一个的至少17个连续核苷酸。在某些实施例中，所述反义链包含互补区，所述互补区包含表2至表3中的任一个中的所列的反义序列中的任一个的至少19个连续核苷酸。在某些实施例中，所述反义链包含互补区，所述互补区包含表2至表3中的任一个中的所列的反义序列中的任一个的至少20个连续核苷酸。在某些实施例中，所述反义链包含互补区，所述互补区包含表2至表3中的任一个中的所列的反义序列中的任一个的至少21个连续核苷酸。在某些实施例中，比对的(比较的)序列之间的胸腺嘧啶到尿嘧啶或尿嘧啶到胸腺嘧啶的差异不算作与比对的(比较的)序列之间有差异的核苷酸。

一方面，本发明提供了一种用于抑制细胞中的朊病毒蛋白(PRNP)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中所述dsRNA药剂包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有义链包括与SEQ ID NO:1的以下核苷酸的任一个核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个，例如，15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个连续核苷酸：502-524、507-529、502-529、540-562、566-588、575-597、576-598、589-611、575-611、593-615、594-616、600-622、593-622、650-672、858-880、976-998、1100-1122、1126-1148、1220-1242、1221-1243、1220-1243、1304-1326、1328-1350、1410-1432、1445-1467、1481-1503、1532-1554、1610-1632、1615-1637、1617-1639、1621-1643、1610-1643、1610-1639、1688-1710、1694-1714、1830-1852、1831-1853、1854-1876、1830-1853、1872-1894、1873-1895、1938-1960、2011-2033、2015-2037、2031-2053、2034-2056、2069-2091、2076-2098、2077-2099、1872-1895、2011-2037、2069-2099、2079-2101、2031-2056、2069-2098、2138-2160、2143-2165、2158-2180、2167-2189、2168-2190、2170-2192、2174-2196、2175-2197、2177-2199、2185-2207、2189-2211、2196-2218、2200-2222、2202-2224、2221-2243、2222-2244、2223-2245、2238-2260、2241-2263、2242-2264、2138-2264、2257-2358、2174-2245、2174-2224、2138-2196、2177-2224、2223-2245、2138-2189、2177-2211、2196-2224、2257-2279、2258-2280、2335-2537、2336-2358、2257-2358、2342-2364、2397-2419、2398-2420、2399-2421、2400-2422、2401-2423、2404-2426、2397-2426、2394-2423、2397-2421、2399-2426和2398-2421，并且所述反义链包括来自SEQ ID NO:5的对应核苷酸序列的至少15个，例如，15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个连续核苷酸，并且其中所述有义链、所述反义链或所述有义链和所述反义链两者与一个或多个亲脂性部分缀合。

一方面，本发明提供了一种用于抑制细胞中的朊病毒蛋白(PRNP)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中所述dsRNA药剂包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有义链包括与SEQ ID NO:1的以下核苷酸的任一个核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个，例如，15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个连续核苷酸：530-570、535-565、539-561、540-562、555-605、560-605、560-600、566-588、567-589、568-590、569-591、570-592、575-597、580-620、585-620、589-611、590-612、591-613、592-614、593-615、594-616、600-650、610-650、613-635、614-636、615-637、616-638、617-639、618-640、640-680、649-671、650-672、651-673、670-700、674-696、675-697、795-830、804-826、2325-2375、2325-2370、2330-2370、2335-2357、2336-2358、2337-2359、2338-2360、2339-2361或2340-2362，并且所述反义链包括来自SEQ ID NO:5的对应核苷酸序列的至少15个，例如，15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个连续核苷酸，并且其中所述有义链、所述反义链或所述有义链和所述反义链两者与一个或多个亲脂性部分缀合。

一方面，本发明提供了一种用于抑制细胞中的朊病毒蛋白(PRNP)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中所述dsRNA药剂包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有义链包括与SEQ ID NO:1的以下核苷酸的任一个核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个，例如，15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个连续核苷酸：502-524、540-562、589-611、594-616、650-672、1445-1467、1688-1710、2011-2033、2031-2053、2185-2207、2222-2244、2336-2358、2339-2361、2399-2421或2258-2280，并且所述反义链包括来自SEQ IDNO:5的对应核苷酸序列的至少15个连续核苷酸，并且其中所述有义链、所述反义链或所述有义链和所述反义链两者与一个或多个亲脂性部分缀合。

在一些实施例中，所述反义链包括与选自由以下组成的组的双链体的任一个反义链核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个，例如，15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个连续核苷酸：AD-1070511、AD-1070462、AD-1070553、AD-1072048、AD-1070516和AD-1072050、AD-1071769、AD-1071949、AD-1070444、AD-1071505、AD-1071912、AD-1071789、AD-1071265、AD-1072084和AD-1071985。

在一些实施例中，所述亲脂性部分通过接头或载体缀合。

所述有义链、所述反义链或所述有义链和所述反义链两者可以与一个或多个亲脂性部分缀合。在一些实施例中，所述亲脂性部分与所述dsRNA药剂的所述双链区中的一个或多个内部位置缀合，例如一个或多个亲脂性部分可以与所述反义链上的一个或多个内部位置缀合。在一些实施例中，所述一个或多个亲脂性部分通过接头或载体与至少一条链上的一个或多个内部位置缀合。

在一些实施例中，所述亲脂性部分的通过logKow测量的亲脂性超过0。

在一些实施例中，所述dsRNA药剂的通过所述dsRNA药剂的血浆蛋白结合测定中的未结合级分测量的疏水性超过0.2。在一些实施例中，所述血浆蛋白结合测定是使用人血清白蛋白的电泳迁移率偏移测定。

在一些实施例中，所述内部位置包含除了距所述有义链或所述反义链的每一端的末端两个位置以外的所有位置。在其它实施例中，所述内部位置包含除了距所述有义链或所述反义链的每一端的末端三个位置以外的所有位置。

在一些实施例中，所述内部位置不包括所述有义链的切割位点区，例如，所述内部位置包含从所述有义链的5'端开始计数的除位置9至12以外的所有位置，或所述内部位置包含从所述有义链的3'端开始计数的除位置11至13以外的所有位置。

在一些实施例中，所述内部位置不包括所述反义链的切割位点区。在其它实施例中，所述内部位置包含从所述反义链的5'端开始计数的除位置12至14以外的所有位置。在一些实施例中，所述内部位置包含从3'端开始计数的除所述有义链上的位置11至13以外和从5'端开始计数的除所述反义链上的位置12至14以外的所有位置。

在一些实施例中，所述一个或多个亲脂性部分与一个或多个所述内部位置缀合，所述一个或多个所述内部位置选自由以下组成的组：从每条链的5'端开始计数的所述有义链上的位置4至8和13至18，以及所述反义链上的位置6至10和15至18。

在一些实施例中，所述一个或多个亲脂性部分与一个或多个所述内部位置缀合，所述一个或多个所述内部位置选自由以下组成的组：从每条链的5'端开始计数的所述有义链上的位置5、6、7、15和17，以及所述反义链上的位置15和17。

在一些实施例中，所述双链区中的所述位置不包括所述有义链的切割位点区。

在一些实施例中，所述有义链的长度为21个核苷酸，所述反义链的长度为23个核苷酸，并且所述亲脂性部分与所述有义链的位置20、位置15、位置1、位置7、位置6或位置2或所述反义链的位置16缀合。

在其它实施例中，所述有义链的长度为21个核苷酸，所述反义链的长度为23个核苷酸，并且所述亲脂性部分与所述有义链的位置21、位置20、位置15、位置1、位置7、位置6或位置2或所述反义链的位置16缀合。

在一些实施例中，所述亲脂性部分是脂肪族、脂环族或聚脂环族化合物。

在一些实施例中，所述亲脂性部分选自由以下组成的组：脂质、胆固醇、视黄酸、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪。

在一些实施例中，所述亲脂性部分选自由以下组成的组：胆固醇、石胆酸(LCA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十二烷酸(DCA)、胆碱、维生素A、维生素B、维甲酸和α生育酚琥珀酸酯。在一些实施例中，所述亲脂性部分选自由以下组成的组：二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十二烷酸(DCA)。在一些实施例中，所述亲脂性部分不是胆固醇。

在一些实施例中，所述亲脂性部分含有饱和或不饱和C4-C30烃链，以及选自由以下组成的组的任选的官能团：羟基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、叠氮化物和炔烃。

在一些实施例中，所述亲脂性部分含有饱和或不饱和C6-C18烃链。

在一些实施例中，所述亲脂性部分含有饱和或不饱和C16烃链。在一些实施例中，所述饱和或不饱和C16烃链与从所述链的5'端开始计数的位置6缀合。

在一些实施例中，所述亲脂性部分通过置换所述内部位置或所述双链区中的一个或多个核苷酸的载体缀合。在一些实施例中，所述载体是选自由以下组成的组的环状基团：吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基和十氢萘基；或是基于丝氨醇主链或二乙醇胺主链的无环部分。

在一些实施例中，所述亲脂性部分通过含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、马来酰亚胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺键、点击反应的产物或氨基甲酸酯的接头与所述dsRNA药剂缀合。

在一些实施例中，所述亲脂性部分与核碱基、糖部分或核苷间键缀合。

在一些实施例中，所述dsRNA药剂包括至少一个经修饰的核苷酸。在一些实施例中，不超过五个有义链核苷酸和不超过五个所述反义链的核苷酸是未经修饰的核苷酸。在其它实施例中，所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸包括修饰。

在一些实施例中，所述经修饰的核苷酸中的至少一个选自以下的组：脱氧核苷酸、3'末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、解锁核苷酸、构象限制性核苷酸、约束乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-C-烷基修饰的核苷酸、2'-羟基修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包括核苷酸的非天然碱基、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包括5'-硫代磷酸酯基的核苷酸、包括5'-甲基膦酸酯基的核苷酸、包括5'磷酸酯或5'磷酸酯模拟物的核苷酸、包括乙烯基膦酸酯的核苷酸、乙二醇核酸(GNA)或乙二醇核酸S-异构体(S-GNA)(例如，包括腺苷-乙二醇核酸(GNA)的核苷酸或包括胸苷-乙二醇核酸(GNA)S-异构体的核苷酸)、包括2-羟甲基-四氢呋喃-5-磷酸酯的核苷酸、包括2'-脱氧胸苷-3'磷酸酯的核苷酸、包括2'-脱氧鸟苷-3'-磷酸酯的核苷酸和与胆甾醇基衍生物和十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸；以及其组合。

在其它实施例中，所述经修饰的核苷酸选自由以下组成的组：2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、3'末端脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dT)、锁定核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯和包括核苷酸的非天然碱基。

在一些实施例中，所述经修饰的核苷酸中的至少一个选自由以下组成的组：脱氧核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、乙二醇修饰的核苷酸(GNA)和膦酸乙烯酯核苷酸；以及其组合。

在一些实施例中，所述核苷酸上的至少一个所述修饰是热不稳定核苷酸修饰。在一些实施例中，所述热不稳定核苷酸修饰选自由以下组成的组：无碱基修饰；与所述双链体中的相对核苷酸的错配；以及不稳定糖修饰、2'-脱氧修饰、无环核苷酸、解锁核酸(UNA)和甘油核酸(GNA)

在一些实施例中，所述经修饰的核苷酸包括3'末端脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dT)的短序列。

在一些实施例中，所述核苷酸上的修饰是2'-O-甲基、GNA和2'氟修饰。

在一些实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施例中，所述dsRNA药剂包括6个至8个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施例中，所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷酸间键位于一条链的3'末端处。任选地，所述链是所述反义链。在另一个实施例中，所述链是所述有义链。在一个相关实施例中，所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的5'末端处。任选地，所述链是所述反义链。在另一个实施例中，所述链是所述有义链。在另一个实施例中，所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的5'和3'末端两者处。任选地，所述链是所述反义链。在另一个实施例中，所述链是所述有义链。

在一些实施例中，每条链的长度不超过30个核苷酸。

在一些实施例中，至少一条链包括至少1个核苷酸的3'突出端或至少2个核苷酸的3'突出端。

所述双链区可以是长度为15个至30个核苷酸对；长度为17个至23个核苷酸对；长度为17个至25个核苷酸对；长度为23个至27个核苷酸对；长度为19个至21个核苷酸对；或长度为21个至23个核苷酸对。

每条链可以是19个至30个核苷酸；19个至23个核苷酸；或21个至23个核苷酸。

在一些实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括靶向肝组织的靶向配体。在一些实施例中，所述靶向配体是GalNAc缀合物。

在某些实施例中，所述双链RNAi药剂进一步包含靶向介导向CNS组织的递送的受体的靶向配体，例如，亲水性配体。

在某些实施例中，所述靶向配体是C16配体。在一个实施例中，所述配体在所述有义链或反义链内的核苷酸或经修饰的核苷酸的2'位置缀合。例如,C16配体可以如下列结构所示缀合：

其中*表示邻近核苷酸的键，并且B是核碱基或核碱基类似物，任选地其中B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。

在一些实施例中，所述亲脂性分子或靶向配体通过选自由以下组成的组的生物可切割接头缀合：DNA、RNA、二硫化物、酰胺、半乳糖胺的官能化单糖或寡糖、葡糖胺、葡萄糖、半乳糖、甘露糖以及其组合。

在一些实施例中，所述有义链的3'端通过端盖保护，所述端盖是具有胺的环状基团，所述环状基团选自由以下组成的组：吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基和十氢萘基。

在一些实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括发生在所述反义链的3'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Sp构型的键磷原子的末端手性修饰；发生在所述反义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp构型的键磷原子的末端手性修饰；以及发生在所述有义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp构型或Sp构型的键磷原子的末端手性修饰。

在一些实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括发生在所述反义链的3'端处的第一核苷酸间键和第二核苷酸间键处，具有呈Sp构型的键磷原子的末端手性修饰；发生在所述反义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp构型的键磷原子的末端手性修饰；以及发生在所述有义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp或Sp构型的键磷原子的末端手性修饰。

在一些实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括发生在所述反义链的3'端处的第一核苷酸间键、第二核苷酸间键和第三核苷酸间键处，具有呈Sp构型的键磷原子的末端手性修饰；发生在所述反义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp构型的键磷原子的末端手性修饰；以及发生在所述有义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp或Sp构型的键磷原子的末端手性修饰。

在一些实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括发生在所述反义链的3'端处的第一核苷酸间键和第二核苷酸间键处，具有呈Sp构型的键磷原子的末端手性修饰；发生在所述反义链的3'端处的第三核苷酸间键处，具有呈Rp构型的键磷原子的末端手性修饰；发生在所述反义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp构型的键磷原子的末端手性修饰；以及发生在所述有义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp或Sp构型的键磷原子的末端手性修饰。

在一些实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括发生在所述反义链的3'端处的第一核苷酸间键和第二核苷酸间键处，具有呈Sp构型的键磷原子的末端手性修饰；发生在所述反义链的5'端处的第一核苷酸间键和第二核苷酸间键处，具有呈Rp构型的键磷原子的末端手性修饰；以及发生在所述有义链的5'端处的第一核苷酸间键处，具有呈Rp或Sp构型的键磷原子的末端手性修饰。

在一些实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括在所述反义链的5'端处磷酸酯或磷酸酯模拟物。在一些实施例中，所述磷酸酯模拟物是5'-乙烯基膦酸酯(VP)。当所述磷酸酯模拟物是5'-乙烯基膦酸酯(VP)时，所述5'末端核苷酸可以具有以下结构，

其中*指示键到邻近核苷酸的5'位置的位置；

R为氢、羟基、甲氧基、氟或本文所述的另一种2'-修饰(例如，羟基或甲氧基)；并且

B是核碱基或经修饰的核碱基，任选地其中B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。

在一些实施例中，在所述双链体的所述反义链的5端的1位置处的碱基对是AU碱基对。

在一些实施例中，所述有义链具有总计21个核苷酸，并且所述反义链具有总计23个核苷酸。

在一个实施例中，所述dsRNA药剂包括至少一种经修饰的核苷酸。

在一个实施例中，所述有义链的基本上所有核苷酸；所述反义链的基本上所有核苷酸都包括修饰；或所述有义链的基本上所有核苷酸和所述反义链的基本上所有核苷酸都包括修饰。

在一个实施例中，所述有义链的所有核苷酸都包括修饰；所述反义链的所有核苷酸都包括修饰；或所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸都包括修饰。

在一个实施例中，至少一个所述经修饰的核苷酸选自由以下组成的组：脱氧核苷酸、3'末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、解锁核苷酸、构象限制性核苷酸、约束乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-C-烷基修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包括核苷酸的非天然碱基、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包括硫代磷酸酯基的核苷酸、包括甲基膦酸酯基的核苷酸、包括5'-磷酸酯的核苷酸、包括5'-磷酸酯模拟物的核苷酸、热不稳定核苷酸、乙二醇修饰的核苷酸(GNA)和2-O-(N-甲基乙酰胺)修饰的核苷酸；以及其组合。

在一个实施例中，所述核苷酸上的所述修饰选自由以下组成的组：LNA、乙二醇核酸(GNA)、己糖醇核酸(HNA)、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-脱氧、2'-羟基和乙二醇；以及其组合。

在一个实施例中，至少一个所述经修饰的核苷酸选自由以下组成的组：脱氧核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、乙二醇修饰的核苷酸(GNA)，例如，Ggn、Cgn、Tgn或Agn以及膦酸乙烯酯核苷酸；以及其组合。

在另一个实施例中，所述核苷酸上的至少一个所述修饰是热不稳定核苷酸修饰。

在一个实施例中，所述热不稳定核苷酸修饰选自由以下组成的组：无碱基修饰；与所述双链体中的相对核苷酸的错配；以及不稳定糖修饰、2'-脱氧修饰、无环核苷酸、解锁核酸(UNA)和乙二醇核酸(GNA)。

双链区可以是长度为19个至30个核苷酸对；长度为19个至25个核苷酸对；长度为19个至23个核苷酸对；长度为23个至27个核苷酸对；或长度为21个至23个核苷酸对。

在一个实施例中，每条链的长度独立地不超过30个核苷酸。

在一个实施例中，所述有义链的长度为21个核苷酸，并且所述反义链的长度为23个核苷酸。

所述互补区可以是长度为至少17个核苷酸；长度为19个至23个核苷酸；或长度为19个核苷酸。

在一个实施例中，至少一条链包括至少1个核苷酸的3'突出端。在另一个实施例中，至少一条链包括至少2个核苷酸的3'突出端。

在一个实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括配体。

在一个实施例中，所述配体与所述dsRNA药剂的所述有义链的3'端缀合。

在一个实施例中，所述配体是N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。

在一个实施例中，所述配体是通过单价、二价或三价支链接头连接的一种或多种GalNAc衍生物。

在一个实施例中，所述配体是

在一个实施例中，所述dsRNA药剂与所述配体缀合，如以下示意图所示

并且其中X为O或S。

在一个实施例中，所述X为O。

在一个实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。

在一个实施例中，所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链，例如，所述反义链或所述有义链的3'末端处。

在另一个实施例中，所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链，例如，所述反义链或所述有义链的5'末端处。

在一个实施例中，所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的5'和3'末端两者处。在一个实施例中，所述链是反义链。

在一个实施例中，在所述双链体的所述反义链的5′-端的1位置处的碱基对是AU碱基对。

本发明还提供了含有本发明的任何dsRNA药剂的细胞和包括本发明任何dsRNA药剂的药物组合物。

本发明的药物组合物可以包含在未缓冲的溶液，例如，盐水或水中的dsRNA药剂，或本发明的药物组合物可以包含在缓冲溶液中的所述dsRNA药剂，例如，包括以下的缓冲溶液：乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合；或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

一方面，本发明提供了一种抑制细胞中的PRNP基因的表达的方法。所述方法包含使所述细胞与本发明的任何dsRNA或本发明的任何药物组合物接触，由此抑制所述细胞中所述PRNP基因的表达。

在一个实施例中，所述细胞在受试者体内，例如，人受试者，例如，患有PRNP相关疾病的受试者。

在某些实施例中，所述PRNP相关疾病是朊病毒病。在某些实施例中，所述朊病毒病是选自由以下组成的组的遗传性朊病毒病：家族性克雅二氏病(CJD)、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克综合征(GSS)和致命性家族性失眠症(FFI)。在一些实施例中，所述朊病毒病是选自由以下组成的组的散发性朊病毒病：散发性克雅二氏病、散发性致命性失眠症(sFI)和变异型蛋白酶敏感性朊蛋白病(VPSPr)。在另一实施例中，所述朊病毒病是选自由以下组成的组的后天性朊病毒病：医源性CJD(iCJD)、库鲁病和变体CJD(vCJD)。

在一些实施例中，使所述细胞与所述dsRNA药剂接触抑制PRNP的表达的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施例中，抑制PRNP的表达使所述受试者血清中的PRNP蛋白水平降低至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。

一方面，本发明提供了一种治疗患有将受益于PRNP表达减少的病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的所述dsRNA药剂的任一种或本发明的所述药物组合物的任一种，由此治疗患有所述将受益于PRNP表达减少的病症的所述受试者。

另一方面，本发明提供了一种预防患有将受益于PRNP表达减少的病症的受试者的至少一种症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用预防有效量的本发明的所述dsRNA药剂的任一种或本发明的所述药物组合物的任一种，由此预防患有所述将受益于PRNP表达减少的病症的所述受试者的至少一种症状。

在一些实施例中，所述病症是PRNP相关疾病。在一些实施例中，所述PRNP相关疾病是朊病毒病。在一些实施例中，所述朊病毒病是选自由以下组成的组的遗传性朊病毒病：家族性克雅二氏病(CJD)、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克综合征(GSS)和致命性家族性失眠症(FFI)。在一些实施例中，所述朊病毒病是选自由以下组成的组的散发性朊病毒病：散发性克雅二氏病、散发性致命性失眠症(sFI)和变异型蛋白酶敏感性朊蛋白病(VPSPr)。在另一实施例中，所述朊病毒病是选自由以下组成的组的后天性朊病毒病：医源性CJD(iCJD)、库鲁病和变体CJD(vCJD)。

本公开的另一方面提供了一种抑制受试者的PRNP的表达的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的本发明的所述dsRNA药剂的任一种或本发明的所述药物组合物的任一种，由此抑制所述受试者的PRNP的表达。

本公开的另一方面提供了一种用于治疗或预防受试者的PRNP相关病症的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的本发明的所述dsRNA药剂的任一种或本发明的所述药物组合物的任一种，由此治疗或预防所述受试者的PRNP相关病症。

在某些实施例中，所述PRNP相关病症是选自由以下组成的组：朊病毒病，如遗传性朊病毒病，例如，家族性克雅二氏病(CJD)、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克综合征(GSS)和致命性家族性失眠症(FFI)。在一些实施例中，所述朊病毒病是选自由以下组成的组的散发性朊病毒病：散发性克雅二氏病、散发性致命性失眠症(sFI)和变异型蛋白酶敏感性朊蛋白病(VPSPr)。在另一实施例中，所述朊病毒病是选自由以下组成的组的后天性朊病毒病：医源性CJD(iCJD)、库鲁病和变体CJD(vCJD)。

在一些实施例中，所述受试者是人。

在一些实施例中，所述dsRNA药剂以约0.01mg/kg至50mg/kg的剂量或以约5mg至1000mg的剂量施用于所述受试者。

在一些实施例中，向所述受试者鞘内施用所述dsRNA药剂。

在一些实施例中，向所述受试者皮下施用所述dsRNA药剂。

在一个实施例中，所述方法减少脑或脊柱组织，例如，纹状体、皮质、小脑、颈椎、腰椎或胸椎中PRNP基因的表达。

在一个实施例中，所述方法减少脑中PRNP基因的表达。

在一些实施例中，本发明的所述方法进一步包括向所述受试者施用用于治疗或预防PRNP相关病症的另外的药剂。示例性另外的治疗剂和治疗包含，例如，镇静剂、抗抑郁药、氯硝西泮(clonazepam)、丙戊酸钠(sodium valproate)、阿片类(opiates)、抗癫痫药、胆碱酯酶抑制剂、美金刚(memantine)、苯二氮卓类(benzodiazepines)、左旋多巴(levodopa)、COMT抑制剂(例如，托卡朋(tolcapone)和恩他卡朋(entacapone))、多巴胺激动剂(dopamine agonists)(例如，溴隐亭(bromocriptine)、培高利特(pergolide)、普拉克索(pramipexole)、罗匹尼罗(ropinirole)、吡贝地尔(piribedil)、卡麦角林(cabergoline)、阿朴吗啡(apomorphine)和麦角乙脲(lisuride))、MAO-B抑制剂(例如，沙非酰胺(safinamide)、司来吉兰(selegiline)和雷沙吉兰(rasagiline))、金刚烷胺(amantadine)、抗胆碱剂、莫达非尼(modafinil)、匹莫范色林(pimavanserin)、多虑平(doxepin)、雷沙林(rasagline)、抗精神病药、非典型抗精神病药(例如，氨磺必利(amisulpride)、奥氮平(olanzapine)、利培酮(risperidone)和氯氮平(clozapine))、利鲁唑(riluzole)、依达拉奉(edaravone)、深部脑刺激、无创通气(NIV)、有创通气物理疗法、职业疗法、言语疗法、饮食变化和吞咽技术、饲管、PEG管、益生菌和心理疗法。

本发明还提供了包括本发明的任一dsRNA或本发明的任一药物组合物的试剂盒，以及任选的使用说明书。

在另一个实施例中，所述RNAi药剂是其药学上可接受的盐。本文中RNAi药剂中的每一种的“药学上可接受的盐”包含但不限于钠盐、钙盐、锂盐、钾盐、铵盐、镁盐以及其混合物。本领域技术人员将理解，当所述RNAi药剂以聚阳离子盐的形式提供时，所述聚阳离子盐在任选地经修饰的磷酸二酯主链和/或任何其它酸性修饰(例如，5'末端膦酸酯基团)的每个游离酸基团具有一个阳离子。例如，长度为“n”个核苷酸的寡核苷酸含有n-1个任选地经修饰的二磷酸酯，因此长度为21nt的寡核苷酸可以作为具有至多20个阳离子(例如，20个钠阳离子)的盐提供。类似地，可以以具有至多42个阳离子(例如，42个钠阳离子)的盐的形式提供具有长度为21nt的有义链和长度为23nt的反义链的RNAi药剂。在前述实例中，其中所述RNAi药剂还包含5'末端磷酸酯或5'末端乙烯基膦酸酯基团，RNAi药剂可以以具有多达44个阳离子(例如，44个钠阳离子)的盐的形式提供。

通过以下具体实施方式进一步展示本发明。

附图说明

图1是描绘在第0天单次脑室内(ICV)注射50μg、150μg或300μg剂量的靶向PRNP的示例性dsRNA药剂、AD-1070516或对照、人工CSF(aCSF)后第28天野生型小鼠右半球中的PRNP mRNA水平的图。

具体实施方式

本公开提供了RNAi组合物，所述组合物影响对PRNP基因的RNA转录物的RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的切割。所述PRNP基因可以在细胞内，例如，受试者(如人)体内的细胞。这些iRNA的使用使得能够在哺乳动物中靶向降解对应基因(PRNP基因)的mRNA。

本发明的iRNA被设计为靶向PRNP基因，包含在其它哺乳动物物种的PRNP直系同源物中保守的基因部分。不旨在受理论的限制，据信上述特性和特定靶位点的组合或子组合或这些iRNA的特定修饰赋予本发明的iRNA改进的功效、稳定性、效力、耐久性和安全性。

因此，本公开还提供了使用本公开的RNAi组合物用于抑制PRNP基因的表达或用于治疗患有将受益于抑制或减少PRNP基因的表达的病症的受试者的方法，例如，PRNP相关疾病，例如，朊病毒病，如遗传性朊病毒病，如克雅二氏病(CJD)、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克病(GSS)和致命性家族性失眠症(FFI)；后天性朊病毒病，如疯牛病、医源性CJD(iCJD)、库鲁病和变体CJD(vCJD)；或散发性朊病毒病，如散发性克雅二氏病、散发性致命性失眠症(sFI)和变异型蛋白酶敏感性朊蛋白病(VPSPr)。

本公开的RNAi药剂包含RNA链(反义链)，其具有长度为约30个核苷酸或更少的区域，例如，15个至30个、15个至29个、15个至28个、15个至27个、15个至26个、15个至25个、15个至24个、15个至23个、15个至22个、15个至21个、15个至20个、15个至19个、15个至18个、15个至17个、18个至30个、18个至29个、18个至28个、18个至27个、18个至26个、18个至25个、18个至24个、18个至23个、18个至22个、18个至21个、18个至20个、19个至30个、19个至29个、19个至28个、19个至27个、19个至26个、19个至25个、19个至24个、19个至23个、19个至22个、19个至21个、19个至20个、20个至30个、20个至29个、20个至28个、20个至27个、20个至26个、20个至25个、20个至24个、20个至23个、20个至22个、20个至21个、21个至30个、21个至29个、21个至28个、21个至27个、21个至26个、21个至25个、21个至24个、21个至23个或21个至22个核苷酸，所述区域与PRNP基因的mRNA转录物的至少一部分基本互补。在某些实施例中，本公开的RNAi药剂包含具有长度为约21个至23个核苷酸的区域的RNA链(反义链)，所述区域与PRNP基因的mRNA转录物的至少一部分基本上互补。

在某些实施例中，本公开的RNAi药剂包含RNA链(反义链)，所述链可以包含较长的长度，例如至多，66个核苷酸，例如长度为36个至66个、26个至36个、25个至36个、31个至60个、22个至43个、27个至53个核苷酸，具有与PRNP基因的mRNA转录物的至少一部分基本上互补的至少19个连续核苷酸的区域。这些具有较长长度的反义链的RNAi药剂可以，例如，包含长度为20个至60个核苷酸的第二RNA链(有义链)，其中有义链和反义链形成18个至30个连续核苷酸的双链体。

这些RNAi药剂的使用使得能够在哺乳动物中靶向降解PRNP基因的mRNA。因此，包含这些RNAi药剂的方法和组合物可用于治疗将受益于PRNP蛋白的水平或活性降低的受试者，如患有PRNP相关疾病，例如，朊病毒病的受试者。

以下详细描述公开了如何制备和使用含有RNAi药剂的组合物以抑制PRNP基因的表达，以及用于治疗患有将受益于所述PRNP基因的表达的抑制或减少的疾病和病症的受试者的组合物和方法。

I.定义

为了更容易理解本公开，首先定义某些术语。另外，应该注意的是，每当引用参数的值或值的范围时，意图是所引用的值中间的值和范围也旨在是本公开的一部分。

冠词“一个/一种(a/an)”在本文中指代冠词的一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)语法宾语。举例来说，“要素”是指一个要素或多于一个要素，例如，多个要素。

术语“包含”在本文中用于意指短语“包含但不限于”，并且可与之互换使用。

除非上下文另外清楚地指出，否则术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”，并且可与之互换使用。

术语“约”在本文中用于意指在本领域的典型公差范围内。例如，“约”可以被理解为平均值的约2个标准偏差。在某些实施例中，约意指±10％。在某些实施例中、约意指±5％。当“约”出现在一系列数字或范围之前时，应当理解“约”可以修饰所述系列或范围中的数字中的每个数字。

一个数或一系列数之前的术语“至少”、“不少于”或“或更多”应理解为包含与术语“至少”相邻的数，以及逻辑上可以包含的所有后续数或整数，如从上下文中可以清楚地看出的。例如，核酸分子中的核苷酸数量必须是整数。例如，“21个核苷酸的核酸分子中的至少18个核苷酸”意指18个、19个、20个或21个核苷酸具有所指示的特性。当“至少”出现在一系列数字或范围之前时，应当理解，“至少”可以修饰所述系列或范围中的数字中的每个数字。

如本文所使用的，“不超过”或“或更少”被理解为与短语相邻的值和逻辑较低的值或整数，从上下文来看是逻辑的到零。例如，具有“不超过2个核苷酸”的突出端的双链体具有2个、1个或0个核苷酸突出端。当“不超过”出现在一系列数字或范围之前时，应当理解，“不超过”可以修饰所述系列或范围中的数字中的每个数字。如本文所使用的，范围包含上限和下限两者。

如本文所使用的，检测方法可以包含确定存在的分析物的量低于所述方法的检测水平。

在指示的靶位点与有义链或反义链的核苷酸序列之间发生冲突的情况下，指示的序列优先。

如果化学结构与化学名称之间发生冲突，则以化学结构为准。

如本文所使用的，与术语“朊病毒蛋白”可互换使用的术语“PRNP”是指众所周知的基因和多肽，在本领域中也称为AltPrP、ASCR、CD230抗原、CJD、GSS、库鲁病、朊病毒蛋白(p27-30)、PRIP、PrP、PrP27-30、PrP33-35C和PrPc。

朊病毒蛋白基因在哺乳动物中高度保守，并且已经参与了神经干细胞的神经发生和分化、神经突生成、信号转导途径的参与和相互作用、突触发生、通过抗凋亡功能或促凋亡功能的神经元存活、铜结合、氧化还原稳态、造血干细胞的长期更新、T细胞的活化和发育、白细胞吞噬作用的分化和调节以及改变白细胞向炎症部位的募集(Caughey B,BaronGS.《自然》.2006；443:803-810)。

朊病毒蛋白存在多种同种型，其中两种与朊病毒病最相关，即细胞朊病毒蛋白(PrP

术语“PRNP”包含人PRNP，其氨基酸和核苷酸序列可以在例如GenBank登录号NM_000311.5(GI:1653962152；SEQ ID NO:1)中找到；小鼠PRNP，其氨基酸和核苷酸序列可以在例如GenBank登录号NM_001278256.1(GI:506326230；SEQ ID NO:2)中找到；大鼠PRNP，其氨基酸和核苷酸序列可以在例如GenBank登录号XM_006235062.3(GI:1046878307；SEQ IDNO:3)中找到。术语“PRNP”还包含食蟹猴(Macaca fascicularis)PRNP，其氨基酸和核苷酸序列可以在例如GenBank登录号XM_005568413.2(GI:982273619；SEQ ID NO:4)中找到。

使用例如，GenBank、UniProt、OMIM和Macaca基因组计划网站可以很容易地获得PRNP mRNA序列的另外的实例。

示例性PRNP核苷酸序列也可以在SEQ ID NO:1-4中找到。SEQ ID NO:5-8分别是SEQ ID NO:1-4的反向补体序列。

在例如在NCBI基因数据库中(网址：www.NCBI.nlm.nih.gov/Gene/5621)提供了关于PRNP的另外的信息。

截至提交本申请之日，上述GenBank登录号和基因数据库号中的每一个的全部内容通过引用并入本文。

如本文所使用的，术语“朊病毒蛋白”和“PRNP”也指PRNP基因的天然存在的DNA序列变异。PRNP基因内的许多序列变型已经被鉴定，并且可以在例如NCBI dbSNP和UniProt中找到(参见，例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/snp？LinkName＝gene_snp&from_uid＝5621)，截至提交本申请之日，其全部内容通过引用并入本文。

如本文所使用的，“靶序列”是指在PRNP基因转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包含作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。在一个实施例中，序列的靶部分将至少足够长，以在PRNP基因转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的该部分处或附近用作RNAi定向切割的底物。在一个实施例中，靶序列位于PRNP基因的蛋白质编码区内。在另一实施例中，靶序列位于PRNP基因的3'UTR内。

靶序列的长度可以为约9个至36个核苷酸，例如，长度为约15个至30个核苷酸。例如，靶序列的长度可以为约15个至30个核苷酸，15个至29个、15个至28个、15个至27个、15个至26个、15个至25个、15个至24个、15个至23个、15个至22个、15个至21个、15个至20个、15个至19个、15个至18个、15个至17个、18个至30个、18个至29个、18个至28个、18个至27个、18个至26个、18个至25个、18个至24个、18个至23个、18个至22个、18个至21个、18个至20个、19个至30个、19个至29个、19个至28个、19个至27个、19个至26个、19个至25个、19个至24个、19个至23个、19个至22个、19个至21个、19个至20个、20个至30个、20个至29个、20个至28个、20个至27个、20个至26个、20个至25个、20个至24个、20个至23个、20个至22个、20个至21个、21个至30个、21个至29个、21个至28个、21个至27个、21个至26个、21个至25个、21个至24个、21个至23个或21个至22个核苷酸。在一些实施例中，靶序列的长度为约19个至约30个核苷酸。在其它实施例中，靶序列的长度为约19个至约25个核苷酸。在仍其它实施例中，靶序列的长度为约19个至约23个核苷酸。在一些实施例中，靶序列的长度为约21个至约23个核苷酸。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本发明的一部分。

如本文所使用的，术语“包括序列的链”是指包括核苷酸链的寡核苷酸，所述核苷酸链通过使用标准核苷酸命名法指代的序列描述。

在经修饰的或未经修饰的核苷酸的上下文中，“G”、“C”、“A”、“T”和“U”通常分别代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，可以理解的是，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可以指经修饰的核苷酸，如下文进一步详述的，或替代的替代部分(参见，例如，表1)。本领域技术人员清楚地知道，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷和尿嘧啶可以被其它部分取代，而不会实质性改变包括含有此类替代部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对特性。例如但不限于，包括肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，在本公开特征的dsRNA的核苷酸序列中，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以被含有例如肌苷的核苷酸取代。在另一个实例中，寡核苷酸中任何位置的腺嘌呤和胞嘧啶都可以分别被鸟嘌呤和尿嘧啶取代，以与靶mRNA形成G-U摆动碱基配对。含有此类取代部分的序列适用于公开内容特征的组合物和方法。

如本文可互换使用的术语“iRNA”、“RNAi药剂”、“iRNA药剂”和“RNA干扰剂”是指含有如本文所定义的RNA的药剂，并且其通过RNA诱导的沉默复合物(RISC)通路介导RNA转录物的靶向切割。RNA干扰(RNAi)是一种指导mRNA的序列特异性降解的过程。RNAi调节，例如，抑制细胞中PRNP的表达，例如，受试者(如哺乳动物受试者)体内的细胞。

在一个实施例中，本公开的RNAi药剂包含单链RNAi，其与靶RNA序列(例如，PRNP靶mRNA序列)相互作用以引导靶RNA的切割。不希望受理论束缚，据信引入细胞中的长双链RNA被称为Dicer的III型核酸内切酶分解为包括有义链和反义链的双链短干扰RNA(siRNA)(Sharp等人,(2001)《基因与发育(Genes Dev.)》15:485)。Dicer，即核糖核酸酶-III样酶使用特性两个碱基3'突出端将这些dsRNA加工成19个至23个碱基对短干扰RNA(Bernstein等人,(2001)《自然(Nature)》409:363)。然后将这些siRNA掺入到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中一种或多种解旋酶解开siRNA双链体，从而使互补的反义链能够指导靶识别(Nykanen等人,(2001)《细胞(Cell)》107:309)。在与适当的靶mRNA结合后，RISC内的一种或多种核酸内切酶切割靶以诱导沉默(Elbashir等人,(2001)《基因与发育》.15:188)。因此，一方面本公开涉及在细胞内产生的单链RNA(ssRNA)(siRNA双链体的反义链)，并且其促进RISC复合物的形成以影响靶基因，即，PRNP基因的沉默。因此，术语“siRNA”在本文中也用于指如上所述的RNAi。

在另一个实施例中，RNAi药剂可以是单链RNA，其被引入细胞或生物体中以抑制靶mRNA。单链RNAi药剂与RISC核酸内切酶Argonaute 2结合，然后所述核酸内切酶切割靶mRNA。单链siRNA通常为15个至30个核苷酸，并且经过化学修饰。单链RNA的设计和测试在美国专利第8,101,348号和Lima等人,(2012)《细胞》150:883-894中进行了描述，所述文献中每一个的全部内容通过引用并入本文。本文所描述的任何反义核苷酸序列可以作为本文所描述的单链siRNA使用，或通过Lima等人,(2012)《细胞》150:883-894中所描述的方法进行化学修饰。

在另一个实施例中，用于本公开的组合物、用途和方法的“RNAi药剂”是双链RNA，并且在本文中称为“双链RNAi药剂”、“双链RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA药剂”或“dsRNA”。术语“dsRNA”是指核糖核酸分子的复合物，具有双链体结构，所述双链体结构包括两条反平行且基本上互补的核酸链，相对于靶RNA(即，PRNP基因)具有“有义”和“反义”取向。在本公开的一些实施例中，双链RNA(dsRNA)通过本文中称为RNA干扰或RNAi的转录后基因沉默机制触发靶RNA(例如，mRNA)的降解。

通常，dsRNA分子可以包含核糖核苷酸，但如本文详细描述的，每条链或两条链也可以包含一种或多种非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸、经修饰的核苷酸。另外，如本说明中所使用的，“RNAi药剂”可以包含具有化学修饰的核糖核苷酸；RNAi药剂可以包含在多个核苷酸处的实质性修饰；RNAi药剂可以包含在多个核苷酸处的实质性修饰。

如本文所使用的，术语“经修饰的核苷酸”是指独立地具有经修饰的糖部分、经修饰的核苷酸间键或经修饰的核碱基的核苷酸。因此，术语经修饰的核苷酸涵盖对核苷间键、糖部分或核碱基的取代、添加或去除，例如，官能团或原子。适用于本公开的药剂的修饰包含本文所公开的或本领域已知的所有类型的修饰。出于本说明书和权利要求的目的，如在siRNA类型分子中使用的，任何此类修饰都被“RNAi药剂”涵盖。

在本公开的某些实施例中，如果存在于RNAi药剂内，则包含脱氧核苷酸(其被公认为核苷酸的天然存在形式)可以被认为构成经修饰的核苷酸。

双链体区可以是允许通过RISC通路特异性降解期望的靶RNA的任何长度，并且所述长度可以在约9个至36个碱基对的范围内，例如，长度为约15个至30个碱基对，例如，约9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个或36个碱基对，如长度为约15个至30个、15个至29个、15个至28个、15个至27个、15个至26个、15个至25个、15个至24个、15个至23个、15个至22个、15个至21个、15个至20个、15个至19个、15个至18个、15个至17个、18个至30个、18个至29个、18个至28个、18个至27个、18个至26个、18个至25个、18个至24个、18个至23个、18个至22个、18个至21个、18个至20个、19个至30个、19个至29个、19个至28个、19个至27个、19个至26个、19个至25个、19个至24个、19个至23个、19个至22个、19个至21个、19个至20个、20个至30个、20个至29个、20个至28个、20个至27个、20个至26个、20个至25个、20个至24个、20个至23个、20个至22个、20个至21个、21个至30个、21个至29个、21个至28个、21个至27个、21个至26个、21个至25个、21个至24个、21个至23个或21个至22个碱基对。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本发明的一部分。

形成双链体结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分，或其可以是单独的RNA分子。如果这两条链是一个较大分子的一部分，并且因此在一条链的3'端和形成双链体结构的相应的另一条链的5'端之间通过不间断的核苷酸链连接，则连接的RNA链被称为“发夹环”。发夹环可以包括至少一个未配对的核苷酸。在一些实施例中，发夹环可以包括至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个或更多个未配对的核苷酸或不指向dsRNA的靶位点的核苷酸。在一些实施例中，发夹环可以是10个或更少个核苷酸。在一些实施例中，发夹环可以是8个或更少个未配对的核苷酸。在一些实施例中，发夹环可以是4个至10个未配对的核苷酸。在一些实施例中，发夹环可以是4个至8个核苷酸。

在某些实施例中，双链寡聚化合物的两条链可以连接在一起。两条链可以在两端相互连接，或仅在一端连接。在一端连接意指第一条链的5'端与第二条链的3'端连接，或第一条链的3'端与第二条链的5'端连接。当两条链在两端相互连接时，第一条链的5'端与第二条链的3'端连接，并且第一条链的3'端与第二条链的5'端连接。两条链可以通过寡核苷酸接头连接在一起，所述寡核苷酸接头包含但不限于(N)n；其中N独立地是经修饰或未修饰的核苷酸，并且n是3至23。在一些实施例中，n是3-10，例如，3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施例中，寡核苷酸接头选自由以下组成的组：GNRA、(G)4、(U)4和(dT)4，其中N是经修饰的或未修饰的核苷酸，并且R是经修饰或未修饰的嘌呤核苷酸。接头中的一些核苷酸可以参与到与接头中的其它核苷酸的碱基对的相互作用中。两条链也可以通过非核苷接头连接在一起，例如本文所描述的接头。本领域技术人员将理解，本文所描述的任何寡核苷酸化学修饰或变异都可以用于寡核苷酸接头中。

发夹和哑铃型寡聚化合物将具有等于或至少为14个、15个、15个、16个、17个、18个、19个、29个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸对的双链体区。双链体区的长度可以等于或小于200、100或50。在一些实施例中，双链体区的长度范围为15个至30个、17个至23个、19个至23个和19个至21个核苷酸对。

发夹寡聚化合物可以具有单链突出端或末端未配对区，在一些实施例中在3'处，并且在一些实施例中在发夹的反义侧。在一些实施例中，突出端的长度为1个至4个，更通常地2个至3个核苷酸。可以诱导RNA干扰的发夹寡聚化合物在本文中也被称为“shRNA”。

在dsRNA的两条基本上互补的链包括单独的RNA分子的情况下，那些分子不必但可以共价连接。当两条链通过除一条链的3'端与形成双链体结构的相应的另一条链的5'端之间的不间断核苷酸链以外的其它方式共价连接时，连接结构被称为“接头”RNA链可以具有相同或不同数量的核苷酸。碱基对的最大数量是dsRNA的最短链中的核苷酸数量减去双链体中存在的任何突出端。除了双链体结构外，RNAi可以包括一个或多个核苷酸突出端。

在一个实施例中，本发明的RNAi药剂是dsRNA，其每条链的长度为24个至30个核苷酸，其与靶RNA序列(例如，PRNP靶mRNA序列)相互作用以引导靶RNA的切割。不希望受理论束缚，引入细胞中的长双链RNA被称为Dicer的III型核酸内切酶分解为siRNA(Sharp等人(2001)《基因与发育》.15:485)。Dicer，即核糖核酸酶-III样酶使用特性两个碱基3'突出端将dsRNA加工成19个至23个碱基对短干扰RNA(Bernstein等人,(2001)《自然》409:363)。然后将siRNA掺入到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中一种或多种解旋酶解开siRNA双链体，从而使互补的反义链能够指导靶识别(Nykanen等人,(2001)《细胞》107:309)。在与适当的靶mRNA结合后，RISC内的一种或多种核酸内切酶切割靶以诱导沉默(Elbashir等人,(2001)《基因与发育》.15:188)。

在一个实施例中，本发明的RNAi药剂是dsRNA药剂，其每条链包括19个至23个核苷酸，其与PRNP RNA序列相互作用以引导靶RNA的切割。不希望受理论束缚，引入细胞中的长双链RNA被称为Dicer的III型核酸内切酶分解为siRNA(Sharp等人(2001)《基因与发育》.15:485)。Dicer，即核糖核酸酶-III样酶使用特性两个碱基3'突出端将dsRNA加工成19个至23个碱基对短干扰RNA(Bernstein等人,(2001)《自然》409:363)。然后将siRNA掺入到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中一种或多种解旋酶解开siRNA双链体，从而使互补的反义链能够指导靶识别(Nykanen等人,(2001)《细胞》107:309)。在与适当的靶mRNA结合后，RISC内的一种或多种核酸内切酶切割靶以诱导沉默(Elbashir等人,(2001)《基因与发育》.15:188)。在一个实施例中，本发明的RNAi药剂是24个至30个核苷酸的dsRNA，其与PRNP RNA序列相互作用以引导靶RNA的切割。

如本文所使用的，术语“核苷酸突出端”是指从RNAi药剂(例如，dsRNA)的双链体结构突出的至少一个未配对的核苷酸。例如，当dsRNA的一条链的3'端延伸超过另一条链的5'端时，反之亦然，则存在核苷酸突出端。dsRNA可以包括至少一个核苷酸的突出端；可替代地，突出端可以包括至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多。核苷酸突出端可以包括以下或由以下组成：核苷酸/核苷类似物，包含脱氧核苷酸/核苷。突出端可以在有义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的核苷酸可以存在于dsRNA的反义链或有义链的5'端、3'端或两端上。

在一个实施例中，dsRNA的反义链在3'端或5'端处的突出端具有1个至10个核苷酸，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在一个实施例中，dsRNA的有义链在3'端或5'端处的突出端具有1个至10个核苷酸，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在另一个实施例中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸盐替代。

在某些实施例中，dsRNA的反义链在3'端或5'端处的突出端具有1个至10个核苷酸，例如，0个至3个、1个至3个、2个至4个、2个至5个、4个至10个、5个至10个，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在一个实施例中，dsRNA的有义链在3'端或5'端处的突出端具有1个至10个核苷酸，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在另一个实施例中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸盐替代。

在某些实施例中，有义链或反义链上的突出端可以包含长于10个核苷酸的延伸长度，例如，长度为1个至30个核苷酸，2个至30个核苷酸、10个至30个核苷酸或10个至15个核苷酸。在某些实施例中，延伸的突出端在双链体的有义链上。在某些实施例中，在双链体的有义链的3'端上存在延伸的突出端。在某些实施例中，在双链体的有义链的5'端上存在延伸的突出端。在某些实施例中，延伸的突出端在双链体的反义链上。在某些实施例中，在双链体的反义链的3'端上存在延伸的突出端。在某些实施例中，在双链体的反义链的5'端上存在延伸的突出端。在某些实施例中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸盐替代。在某些实施例中，突出端包含自互补部分，使得突出端能够形成在生理条件下稳定的发夹结构。

在某些实施例中，至少一条链的至少一端延伸超过双链体靶向区域，包含其中一条链包含热力学稳定四环结构的结构(参见，例如，美国专利第8,513,207号和第8,927,705号，以及W02010033225，所述文献中的每一个的全部内容通过引用并入本文)。此类结构可以包含单链延伸(在分子的一侧或两侧)以及双链延伸。

在某些实施例中，有义链的3'端和反义链的5'端由包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或两者的多核苷酸序列连接，任选地其中所述多核苷酸序列包含四环序列。在某些实施例中，有义链的长度为25个至35个核苷酸。

四环可以含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰的核苷酸以及其组合。通常，四环具有4个至5个核苷酸。在一些实施例中，环包括被阐述为GAAA的序列。在一些实施例中，环(GAAA)的核苷酸中的至少一个包括核苷酸修饰。在一些实施例中，经修饰的核苷酸包括2'-修饰。在一些实施例中，2'-修饰是选自由以下组成的组的修饰：2'-氨基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基、2'-氨基二乙氧基甲醇、2'-adem和2'-脱氧-2'-氟--d-阿拉伯壬酸。在一些实施例中，环的所有核苷酸都是经修饰的。在一些实施例中，GAAA序列中的G包括2'-OH。在一些实施例中，GAAA序列中的每个核苷酸包括2'-O-甲基修饰。在一些实施例中，GAAA序列中的每个A包括2'-OH，并且GAAA序列中的G包括2'-O-甲基修饰。在一些实施例中，GAAA序列中的每个A包括2'-O-甲氧基乙基(MOE)修饰，并且GAAA序列中的G包括2'-O-甲基修饰；或GAAA序列中的每个A包括2'-adem修饰，并且GAAA序列中的G包括2'-O-甲基修饰。参见，例如，PCT公开第WO 2020/206350号，所述文献的全部内容通过引用并入本文。

示例性2'adem修饰的核苷酸如下所示：

在dsRNA的一个实施例中，至少一条链包括至少1个核苷酸的3'突出端。在另一个实施例中，至少一条链包括至少2个核苷酸的3'突出端，例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个核苷酸。在其它实施例中，RNAi药剂的至少一条链包括至少1个核苷酸的5'突出端。在某些实施例中，至少一条链包括至少2个核苷酸的5'突出端，例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个核苷酸。在其它实施例中，RNAi药剂的一条链的3'端和5'端两者都包括至少1个核苷酸的突出端。

在一个实施例中，dsRNA的反义链在3'端或5'端处的突出端具有1个至10个核苷酸，例如，0个至3个、1个至3个、2个至4个、2个至5个、4个至10个、5个至10个，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在一个实施例中，dsRNA的有义链在3'端或5'端处的突出端具有1个至10个核苷酸，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在另一个实施例中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸盐替代。

在某些实施例中，有义链或反义链或两者上的突出端可以包含长于10个核苷酸的延伸长度，例如，长度为1个至30个核苷酸，2个至30个核苷酸、10个至30个核苷酸或10个至15个核苷酸。在某些实施例中，延伸的突出端在双链体的有义链上。在某些实施例中，在双链体的有义链的3'端上存在延伸的突出端。在某些实施例中，在双链体的有义链的5'端上存在延伸的突出端。在某些实施例中，延伸的突出端在双链体的反义链上。在某些实施例中，在双链体的反义链的3'端上存在延伸的突出端。在某些实施例中，在双链体的反义链的5'端上存在延伸的突出端。在某些实施例中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸盐替代。在某些实施例中，突出端包含自互补部分，使得突出端能够形成在生理条件下稳定的发夹结构。

如本文所使用的，关于dsRNA的术语“平端”或“平末端”是指在dsRNA的给定末端处没有未配对的核苷酸或核苷酸类似物，即，没有核苷酸突出端。dsRNA的一端或两端可以是平端的。当dsRNA的两端都是平端的时，所述dsRNA被称为“平末端”。为了清楚起见，“平末端”dsRNA是两端均为平端的dsRNA，即，在分子的任一端处都没有核苷酸突出端。最常见的此类分子将在其整个长度上是双链的。

术语“反义链”或“引导链”是指RNAi药剂的链，例如，dsRNA，其包含与靶序列(例如，PRNP mRNA)基本上互补的区域。

如本文所使用的，术语“互补区”是指反义链上与本文所定义的序列(例如，靶序列，例如PRNP核苷酸序列)基本上互补的区域。在互补区与靶序列不完全互补的情况下，错配可以处于分子的内部或末端区中。通常，最可容忍的错配在末端区域，例如，在RNAi药剂的5'或3'末端的5个、4个、3个或2个核苷酸内。

在一些实施例中，本发明的双链RNA药剂包含反义链中的核苷酸错配。在一些实施例中，本发明的双链RNA药剂的反义链包含与靶mRNA的不超过4个错配，例如，反义链包含与靶mRNA的4个、3个、2个、1个或0个错配。在一些实施例中，本发明的反义链双链RNA药剂包含与有义链的不超过4个错配，例如，反义链包含与有义链的4个、3个、2个、1个或0个错配。在一些实施例中，本发明的双链RNA药剂包含有义链中的核苷酸错配。在一些实施例中，本发明的双链RNA药剂的有义链包含与反义链的不超过4个错配，例如，有义链包含与反义链的4个、3个、2个、1个或0个错配。在一些实施例中，核苷酸错配在例如距离iRNA的3'端5个、4个、3个核苷酸内。在另一个实施例中，核苷酸错配在例如在iRNA药剂的3'末端核苷酸中。在一些实施例中，错配不在种子区中。

因此，如本文所描述的RNAi药剂可以含有与靶序列的一个或多个错配。在一个实施例中，如本文所描述的RNAi药剂含有不超过3个错配(即，3个、2个、1个或0个错配)。在一个实施例中，如本文所描述的RNAi药剂含有不超过2个错配。在一个实施例中，如本文所描述的RNAi药剂含有不超过1个错配。在一个实施例中，如本文所描述的RNAi药剂含有0个错配。在某些实施例中，如果RNAi药剂的反义链含有与靶序列的错配，则错配可以任选地被限制在距互补区的5'-或3'端的最后5个核苷酸内。例如，在此类实施例中，对于23个核苷酸的RNAi药剂，与PRNP基因的区域互补的链通常在中心13个核苷酸内不含有任何错配。本文所述的方法或本领域已知的方法可以用于确定包括与靶序列的错配的RNAi药剂是否有效抑制PRNP基因的表达。考虑具有错配的RNAi药剂在抑制PRNP基因表达方面的功效很重要，特别是如果已知PRNP基因中的特定互补区在群体内具有多态性序列变异。

如本文所使用的，术语“有义链”或“随从链”是指包含与如本文所定义的术语的反义链的区域基本上互补的区域的RNAi药剂的链。

如本文所使用的，“基本所有核苷酸都是经修饰的”在很大程度上但不是完全为经修饰的，并且可以包含不超过5个、4个、3个、2个或1个未经修饰的核苷酸。

如本文所使用的，术语“切割区”是指紧邻切割位点的区域。切割位点是靶上发生切割的位点。在一些实施例中，切割区在切割位点的任一端上并紧邻切割位点包括三个碱基。在一些实施例中，切割区在切割位点的任一端上并紧邻切割位点包括两个碱基。在一些实施例中，切割位点特异性地出现在反义链的核苷酸10和11结合的位点处，并且切割区包括核苷酸11、12和13。

如本文所使用的，并且除非另外指明，否则术语“互补”当用于相对于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列时是指包括第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包括第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并且形成双链体结构的能力，如技术人员将理解的。例如，此类条件可以是“严格条件”，其中严格条件可以包含：400mM NaCl，40mM PIPES，pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃，持续12小时至16小时，然后洗涤(参见，例如，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,Sambrook等人(1989)冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))。可以应用其它条件，如生物体内部可能遇到的生理学上相关的条件。技术人员将能够根据杂交核苷酸的最终应用确定最适合于两个序列的互补性测试的条件集。

RNAi药剂内(例如，如本文所描述的dsRNA内)的互补序列包含包括第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包括第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一个或两个核苷酸序列的全长上的碱基配对。此类序列在本文中可以被称为彼此“完全互补”。然而，当第一序列在本文中被称为相对于第二序列“基本上互补”时，这两个序列可以是完全互补的，或其可以形成一个或多个，但通常不超过5个、4个、3个或2个杂交后错配的碱基对用于至多30个碱基对的双链体，同时保留在与其最终应用最相关的条件下杂交的能力，例如，体外或体内抑制基因表达。然而，在两个寡核苷酸被设计以在杂交时形成一个或多个单链突出端的情况下，此类突出端不应视为相对于互补性的确定的错配。例如，包括一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸和另一个长度为23个核苷酸的寡核苷酸的dsRNA，其中较长的寡核苷酸包括与较短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，仍可以被称为出于本文所描述的目的“完全互补”。

如本文所使用的，“互补”序列还可以包含非沃森-克里克碱基对(non-Watson-Crick base pair)或由非天然和经修饰的核苷酸形成的碱基对，或完全由其形成，只要满足关于其杂交能力的以上要求即可。此类非沃森-克里克碱基对包含但不限于G:U摆动碱基配对或胡斯坦碱基配对(Hoogsteen base pairing)。

本文中的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可以相对于dsRNA的有义链和反义链之间的碱基匹配，或两个寡核苷酸或多核苷酸(如RNAi药剂的反义链和靶序列)之间的碱基匹配使用，如根据其使用的上下文所理解的。

如本文所使用的，与信使RNA(mRNA)的“至少部分基本上互补”的多核苷酸是指与所关注的mRNA(例如，编码PRNP的mRNA)的连续部分基本上互补的多核苷酸。例如，如果序列与编码PRNP的mRNA的不间断部分基本上互补，则多核苷酸与PRNP mRNA的至少一部分互补。

因此，在一些实施例中，本文所公开的反义链多核苷酸与靶PRNP序列完全互补。

在一些实施例中，本文公开的反义链多核苷酸与靶PRNP序列基本上互补，并且包括连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列在其完整长度上与SEQ ID NO:1-4的PRNP的核苷酸序列的等效区域或SEQ ID NO:1-4的片段至少约80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。

在其它实施例中，本文所公开的反义多核苷酸与靶PRNP序列基本上互补，并且包括连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列在其完整长度上与表2至表3中的任一个中的任一个有义链核苷酸序列，或表2至表3中的任一个中的任一个有义链核苷酸序列的片段至少约80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。

在一个实施例中，本公开的RNAi药剂包含与反义多核苷酸基本上互补的有义链，所述反义多核酸反过来与靶PRNP序列相同，并且其中所述有义链多核苷酸包括连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列在其完整长度上与SEQ ID NO:5-8的核苷酸序列的等效区域，或SEQ ID NO:5-8的任一项的片段至少约80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。

在一些实施例中，本文公开的反义多核苷酸与靶PRNP序列的片段基本上互补，并且包括连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列在其完整长度上与选自SEQ ID NO:1的以下核苷酸的组的SEQ ID NO:1的片段至少80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或99％互补：502-524、507-529、502-529、540-562、566-588、575-597、576-598、589-611、575-611、593-615、594-616、600-622、593-622、650-672、858-880、976-998、1100-1122、1126-1148、1220-1242、1221-1243、1220-1243、1304-1326、1328-1350、1410-1432、1445-1467、1481-1503、1532-1554、1610-1632、1615-1637、1617-1639、1621-1643、1610-1643、1610-1639、1688-1710、1694-1714、1830-1852、1831-1853、1854-1876、1830-1853、1872-1894、1873-1895、1938-1960、2011-2033、2015-2037、2031-2053、2034-2056、2069-2091、2076-2098、2077-2099、1872-1895、2011-2037、2069-2099、2079-2101、2031-2056、2069-2098、2138-2160、2143-2165、2158-2180、2167-2189、2168-2190、2170-2192、2174-2196、2175-2197、2177-2199、2185-2207、2189-2211、2196-2218、2200-2222、2202-2224、2221-2243、2222-2244、2223-2245、2238-2260、2241-2263、2242-2264、2138-2264、2257-2358、2174-2245、2174-2224、2138-2196、2177-2224、2223-2245、2138-2189、2177-2211、2196-2224、2257-2279、2258-2280、2335-2537、2336-2358、2257-2358、2342-2364、2397-2419、2398-2420、2399-2421、2400-2422、2401-2423、2404-2426、2397-2426、2394-2423、2397-2421、2399-2426和2398-2421。

在一些实施例中，本文公开的反义多核苷酸与靶PRNP序列的片段基本上互补，并且包括连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列在其完整长度上与选自SEQ ID NO:1的以下核苷酸的组的SEQ ID NO:1的片段至少80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或99％互补：530-570、535-565、539-561、540-562、555-605、560-605、560-600、566-588、567-589、568-590、569-591、570-592、575-597、580-620、585-620、589-611、590-612、591-613、592-614、593-615、594-616、600-650、610-650、613-635、614-636、615-637、616-638、617-639、618-640、640-680、649-671、650-672、651-673、670-700、674-696、675-697、795-830、804-826、2325-2375、2325-2370、2330-2370、2335-2357、2336-2358、2337-2359、2338-2360、2339-2361或2340-2362。

在其它实施例中，本文公开的反义多核苷酸与靶PRNP序列的片段基本上互补，并且包括连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列在其完整长度上与选自SEQ ID NO:1的以下核苷酸的组的SEQ ID NO:1的片段至少80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或99％互补：502-524、540-562、589-611、594-616、650-672、1445-1467、1688-1710、2011-2033、2031-2053、2185-2207、2222-2244、2336-2358、2339-2361、2399-2421或2258-2280。

在一些实施例中，本发明的iRNA包含与反义多核苷酸基本上互补的有义链，所述反义多核酸反过来与靶PRNP序列互补，并且其中所述有义链多核苷酸包括连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列在其完整长度上与表2至表3中的任一个的任一个中的任一个反义链核苷酸序列或表2至表3中的任一个中的任一个反义链核苷酸序列的片段至少约80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％，约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或99％互补。

在某些实施例中，有义链和反义链选自以下任何一种双链体的有义链或反义链：AD-1070511、AD-1070462、AD-1070553、AD-1072048、AD-1070516和AD-1072050、AD-1071769、AD-1071949、AD-1070444、AD-1071505、AD-1071912、AD-1071789、AD-1071265、AD-1072084和AD-1071985。

在一些实施例中，双链iRNA药剂的双链区的长度等于或至少为10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个核苷酸对。

在一些实施例中，双链iRNA药剂反义链的长度等于或至少为14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。

在一些实施例中，双链iRNA药剂的有义链的长度等于或至少为10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。

在一个实施例中，双链iRNA药剂的有义链和反义链的长度各自独立地为15个至30个核苷酸。

在一个实施例中，双链iRNA药剂的有义链和反义链的长度各自独立地为19个至25个核苷酸。

在一个实施例中，双链iRNA药剂的有义链和反义链的长度各自独立地为21个至23个核苷酸。

在一个实施例中，iRNA药剂的有义链的长度为21个核苷酸，并且反义链的长度为23个核苷酸，其中所述链形成21个连续碱基对的双链区，所述双链区在3'端处具有2个核苷酸长的单链突出端。

在本发明的一方面中，用于本发明的方法和组合物的药剂是通过反义抑制机制抑制靶mRNA的单链反义核酸分子。单链反义RNA分子与靶mRNA内的序列互补。单链反义寡核苷酸可以通过与mRNA的碱基配对和物理阻断翻译机制，以化学计量的方式抑制翻译，参见Dias,N.等人,(2002)《分子癌症治疗学(Mol Cancer Ther)》1:347-355。单链反义RNA分子的长度可以为约15个至约30个核苷酸，并且具有与靶序列互补的序列。例如，单链反义RNA分子可以包括来自本文描述的反义序列的任一者的至少约15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个连续核苷酸的序列。

在一个实施例中，PRNP基因的表达的至少部分抑制通过PRNP mRNA的量的减少来评估，所述PRNP mRNA可以从转录PRNP基因的第一细胞或细胞组中分离或检测，并且所述第一细胞或细胞组已经被处理以使PRNP基因的表达受抑制，如与基本上与第一细胞或细胞组相同但未被如此处理的第二细胞或细胞组(对照细胞)相比较的。抑制程度可以用以下方式表示：

在一个实施例中，通过实例1中的双荧光素酶方法测定表达的抑制，其中RNAi药剂以10nM的浓度存在。

如本文所使用的，短语“使细胞与RNAi药剂(如dsRNA)接触”包含通过任何可能的方式接触细胞。使细胞与RNAi药剂接触包含使细胞在体外与RNAi药剂接触或使细胞在体内与RNAi药剂接触。可以直接或间接地进行接触。因此，例如可以通过执行所述方法的个体使RNAi药剂与细胞物理接触，或可替代地，可以使RNAi药剂处于允许或使其随后与细胞接触的情况。

体外接触细胞可以通过例如将细胞与RNAi药剂一起温育来进行。体内接触细胞可以通过例如将RNAi药剂注射到细胞所在的组织中或其附近，或通过将RNAi药剂注射到另一个区域中，例如中枢神经系统(CNS)，任选地通过鞘内、玻璃体内或其它注射，或到血流或皮下空间，使得药剂随后到达待接触细胞所在的组织来进行。例如，RNAi药剂可以含有配体或与配体偶联，例如，一个或多个亲脂性部分，如下所述并进一步详细描述的，例如PCT公开第WO 2019/217459号中，所述文献通过引用并入本文，其在所关注的位点(例如，CNS)处引导或以其它方式稳定RNAi药剂。在一些实施例中，RNAi药剂可以含有配体或与配体偶联，例如，如下文描述的一个或多个GalNAc衍生物，其在所关注的位点(例如，肝脏)处引导或以其它方式稳定RNAi药剂。在其它实施例中，RNAi药剂可以含有或与一个或多个亲脂性部分和一种或多种GalNAc衍生物偶联。体外和体内接触方法的组合也是可能的。例如，细胞也可以与RNAi药剂体外接触，并且随后移植到受试者体内。

在一个实施例中，使细胞与RNAi药剂接触包含通过促进或影响细胞的摄取或吸收来“引入”或“将RNAi药剂递送到细胞中”。RNAi药剂的吸收或摄取可以通过无辅助的扩散或活性细胞过程发生，或通过辅助剂或装置发生。将RNAi药剂引入细胞中可以是体外的或体内的。例如，对于体内引入，可以将RNAi药剂注射到组织部位中或全身施用。体外引入细胞包含本领域已知的方法，如电穿孔和脂质转染。另外的方法在下文中描述或在本领域中是已知的。

术语“亲脂性”或“亲脂性部分”广义上是指对脂质具有亲和力的任何化合物或化学部分。用于表征亲脂性部分的亲脂性的一种方法是通过辛醇-水分配系数logK

分子的亲脂性可以根据其携带的官能团而改变。例如，将羟基或胺基添加到亲脂性部分的末端可以增加或降低亲脂性部分的分配系数(例如，logK

可替代地，与一个或多个亲脂性部分缀合的双链RNAi药剂的疏水性可以通过其蛋白质结合特征来测量。例如，在某些实施例中，双链RNAi药剂的血浆蛋白结合测定中的未结合级分可以被确定为与双链RNAi药剂的相对疏水性正相关，其然后可以与双链RNAi药剂的沉默活性正相关。

在一个实施例中，所确定的血浆蛋白结合测定是使用人血清白蛋白的电泳迁移率偏移测定(EMSA)。此结合测定的示例性方案在例如通过引用并入本文的PCT公开第WO2019/217459号中详细说明。通过结合测定中未结合的siRNA的级分测量的双链RNAi药剂的疏水性，对于siRNA的增强的体内递送而言超过0.15、超过0.2、超过0.25、超过0.3、超过0.35、超过0.4、超过0.45或超过0.5。

因此，将亲脂性部分与双链RNAi药剂的内部位置缀合为siRNA的增强的体内递送提供了最佳的疏水性。

术语“脂质纳米颗粒”或“LNP”是包括脂质层的囊泡，所述脂质层封装药物活性分子，如核酸分子，例如rNAi药剂或从其转录RNAi药剂的质粒。LNP在例如美国专利第6,858,225号、第6,815,432号、第8,158,601号和第8,058,069号中进行了描述，所述美国专利的全部内容特此通过引用并入本文。

如本文所使用的，“受试者”是动物，如哺乳动物，包含灵长类动物(如人、非人灵长类动物，例如猴子和黑猩猩)或非灵长类动物(如牛、绵羊、大鼠或小鼠)。在一个实施例中，受试者是人，如正在治疗或评估将受益于PRNP表达减少的疾病、病症或病状的人；处于将受益于PRNP表达减少的疾病、病症或病状的风险中的人；患有将受益于PRNP表达减少的疾病、病症或病状的人；或正在治疗将受益于PRNP表达减少的疾病、病症或病状的人，如本文所描述的。

如本文所使用的，术语“治疗(treating)”或“治疗(treating)”是指有益或期望的结果，包含但不限于减轻或改善与PRNP基因表达或PRNP蛋白产生相关的一种或多种体征或症状，例如，PRNP相关疾病，例如，朊病毒病，如患有此类疾病的受试者的遗传性朊病毒病、散发性朊病毒病或后天性朊病毒病。“治疗”也可以意指与没有治疗的预期存活期相比，延长存活期。

在受试者或疾病标志物或症状中PRNP水平的上下文中，术语“较低”是指此类水平在统计学上显著降低。降低可以是例如至少10％、15％、20％、25％、30％、％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在某些实施例中，降低为至少20％。在某些实施例中，疾病标志物，例如蛋白质或基因表达水平的降低为至少50％。受试者的PRNP水平的“较低”是降低到没有此类病症的个体的正常范围内的被接受的水平。在某些实施例中，“较低”是患有疾病的受试者的标志物或症状的水平与个体在正常范围内接受的水平之间的差异的降低，例如，肥胖个体与具有在正常范围内接受的体重的个体之间的体重降低的水平。

如本文所使用的，当用于提及将受益于PRNP基因表达或PRNP蛋白产生的减少的疾病、病症或其病状时，“预防”(“prevention”或“preventing”)是指受试者将出现与此类疾病、病症或病状相关的症状(例如，PRNP相关疾病的症状)的可能性的降低。未能发展出疾病、病症或病状，或与此类疾病、病症或病状相关的症状发展减少(例如，在该疾病或病症的临床接受的量表上至少减少约10％)，或延迟症状的表现(例如，几天、几周、几个月或几年)被认为是有效的预防。

如本文所使用的，术语“PRNP相关疾病”或“PRNP相关病症”被理解为将受益于PRNP的表达或活性减少的任何疾病或病症。此类PRNP相关疾病的特征在于在此类疾病中，异常折叠的瘙痒症PrP蛋白(PrP

在一个实施例中，PRNP相关疾病是朊病毒病。朊病毒病是一种慢性神经退行性疾病，并且由异常朊病毒引起，朊病毒是由蛋白质制成的微小传染源。朊病毒会导致多种哺乳动物的多种疾病，包含牛的牛海绵状脑病(BSE或疯牛病)和绵羊的瘙痒症。海绵状是指受感染的大脑的特征性外观，当在显微镜下检查时，所述受感染的大脑中充满了洞，直到其看起来像海绵。根据疾病的感染方式，朊病毒病被分为三种不同的亚型。就典型的体征、症状和疾病持续时间而言，所有亚型略有不同。亚型为散发性、遗传性和后天性。在一些实施例中，PRNP相关疾病是遗传性朊病毒病，例如，家族性克雅二氏病(CJD)、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克综合征(GSS)和致命性家族性失眠症(FFI)。在一些实施例中，PRNP相关疾病是散发性朊病毒病，例如，散发性克雅二氏病、散发性致命性失眠症。在其它实施例中，PRNP相关疾病是后天性朊病毒病，例如，医源性克雅二氏病、变体克雅二氏病或库鲁病。

朊病毒病通常开始得很慢，并且随着时间的推移逐渐恶化。朊病毒病的常见症状包含思维、记忆和判断困难、性格变化，如冷漠、激动和抑郁、困惑或定向障碍(包含容易迷路)、不自主肌肉痉挛(肌阵挛)、协调能力丧失(共济失调)、睡眠困难(失眠症)、言语困难或口齿不清以及视力受损或失明。随着一个人的病情恶化，他们往往会退出家庭和社会。身体机能逐渐丧失，最终导致死亡。

克雅二氏病(CJD)是已知的人类朊病毒病中最常见的一种。CJD是一种罕见的退行性致命性大脑病症。全世界每年大约每一百万人中就有一人受到影响；在美国，每年大约有350例病例。CJD通常出现在晚年，并且发展迅速。典型的症状发作出现在60岁左右，并且约70％的人在一年内死亡。在疾病的早期阶段，人们可能会出现记忆力减退、行为改变、缺乏协调和视觉障碍。随着病情发展，精神状况明显恶化，并且可能出现不自主运动、失明、四肢无力和昏迷。

CJD有三大类。在散发性CJD中，即使患者没有已知的疾病风险因素，也会出现这种疾病。这是迄今为止最常见的CJD类型，并且至少占85％的病例。在遗传性CJD中，患者可能有该疾病的家族史，并且与CJD相关的基因突变检测呈阳性。在美国，约10％到15％的CJD病例是遗传性的。在后天性CJD中，该疾病通过暴露于大脑或神经系统组织传播，通常通过某些医疗程序。没有证据表明CJD是通过与患有CJD的人的偶然接触而传染的。自从1920年首次描述CJD以来，只有不到百分之一的病例是后天性CJD。一种被称为变体CJD(或vCJD)的CJD可以通过食用受类似CJD疾病影响的牛的肉获得，这种疾病被称为牛海绵状脑病(BSE)，或者通常是“疯牛病”。

CJD的特征在于快速进行性痴呆。最初，个体会经历肌肉协调、性格变化(包含记忆力、判断力和思维受损)和视力受损的问题。患有这种疾病的人，尤其是患有FFI的人，也可能会经历失眠、抑郁或异常感觉。随着疾病的发展，人们的精神障碍变得严重。他们经常出现不自主的肌肉抽搐，称为肌阵挛，并且他们可能失明。他们最终失去了行动和说话的能力，并进入昏迷状态。肺炎和其它感染经常发生在这些人身上，并可能导致死亡。变体CJD主要始于精神症状，比其它类型的CJD影响更年轻的人，并且从症状发作到死亡的持续时间比平时更长。

CJD的一些症状可能与其它进行性神经系统疾病的症状相似，如阿尔茨海默氏病和亨廷顿氏病。然而，CJD会导致脑组织发生独特的变化，这可以在尸检中看到。与阿尔茨海默氏病或大多数其它类型的痴呆症相比，它往往会导致一个人的能力更快地恶化。

如本文所使用的，“治疗有效量”旨在包含当向患有PRNP相关疾病的受试者施用时足以影响疾病的治疗(例如，通过减少、改善或维持现有疾病或一种或多种疾病症状)的RNAi药剂的量。“治疗有效量”可能因RNAi药剂、药剂如何施用、疾病和其严重程度以及病史、年龄、体重、家族史、基因组成、先前或伴随治疗的类型(如果有的话)以及待治疗受试者的其它个体特征而异。

如本文所使用的，“预防有效量”旨在包含当向患有PRNP相关病症的受试者施用时足以预防或改善疾病或所述疾病的一种或多种症状的RNAi药剂的量。改善疾病包含减缓疾病的进程或降低后发疾病的严重程度。“预防有效量”可能因RNAi药剂、药剂如何施用、疾病的风险程度以及病史、年龄、体重、家族史、基因组成、先前或伴随治疗的类型(如果有的话)以及待治疗患者的其它个体特征而异。

“治疗有效量”或“预防有效量”还包含一定量的RNAi药剂，所述RNAi药剂以适用于任何治疗的合理收益/风险比产生一些期望的局部或全身性效果。本公开的方法中采用的RNAi药剂可以以足够的量施用，以产生适用于此类治疗的合理益处/风险比。

短语“药学上可接受的”在本文中用于指在正确医学判断的范围内适合于与人受试者和动物受试者的组织接触使用而不会产生过多毒性、刺激、过敏应答或其它问题或并发症的、与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料(包含盐)、组合物或剂型。

如本文所使用的，短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒剂，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)、或溶剂封装材料(涉及将主题化合物从身体的一个器官或部分携带或运送到身体的另一个器官或部分)。在与调配物的其它成分相容并且对被治疗的受试者无害的意义上来讲，每种载体必须是“可接受的”。可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包含：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素以及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡类；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯或聚酸酐；(22)填充剂，如多肽和氨基酸；(23)血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL；以及(22)药物调配物中所用的其它无毒可相容物质。

如本文所使用的，术语“样品”包含从受试者分离的类似流体、细胞或组织的集合，以及受试者体内存在的流体、细胞和组织。生物流体的实例包含血液、血清和浆膜流体、血浆、脑脊液、眼流体、淋巴、尿液、唾液等。组织样品可以包含来自组织、器官或局部区域的样品。例如，样品可以源自特定的器官、器官的一部分或这些器官内的液体或细胞。在某些实施例中，样品可以源自脑(例如，整个脑或脑的某些部分，例如纹状体，或脑中的某些类型的细胞，例如神经元和神经胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞))。在其它实施例中，“源自受试者的样品”是指源自受试者的肝组织(或其亚组分)。在一些实施例中，“源自受试者的样品”指的是从受试者抽取的血液或源自其的血浆或血清。在另外的实施例中，“源自受试者的样品”是指源自受试者的脑组织(或其亚组分)或视网膜组织(或其亚组分)。

II.本公开的RNAi药剂

本文描述了抑制PRNP基因的表达的RNAi药剂。在一个实施例中，RNAi药剂包含双链核糖核酸(dsRNA)分子，所述双链dsRNA分子用于抑制细胞，如受试者的细胞中的PRNP基因的表达，例如，哺乳动物，如患有PRNP相关疾病的人类，例如，朊病毒病，如遗传性朊病毒病，例如，家族性克雅二氏病(CJD)、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克综合征(GSS)和致命性家族性失眠症(FFI)；散发性朊病毒病，例如，散发性克雅二氏病、散发性致命性失眠症(sFI)和变异型蛋白酶敏感性朊蛋白病(VPSPr)；或后天性朊病毒病，例如，医源性CJD(iCJD)、库鲁病和变体CJD(vCJD)。

dsRNA包含具有互补区的反义链，所述互补区与在PRNP基因的表达中形成的mRNA的至少一部分互补。互补区的长度约为15个至30个核苷酸或更少。在与表达PRNP基因的细胞接触时，RNAi药剂抑制PRNP基因(例如，人基因、灵长类动物基因、非灵长类动物基因)的表达至少50％，如通过例如PCR或基于支链DNA(bDNA)的方法或通过基于蛋白质的方法(如通过免疫荧光分析，使用例如蛋白质印迹或流式细胞术技术)所测定的。在某些实施例中，如通过实例1中的双Glo萤光素酶测定所测定的，表达抑制为至少50％，其中siRNA的浓度为10nM。

dsRNA包含两条互补并且在将使用dsRNA的条件下杂交以形成双链体结构的RNA链。dsRNA的一条链(反义链)包含与靶序列基本上互补且通常完全互补的互补区。靶序列可以源自在PRNP基因表达期间形成的mRNA的序列。另一条链(有义链)包含与反义链互补的区，使得两条链在适当条件下组合时杂交并形成双链体结构。如本文中其它地方所描述且如本领域已知的，dsRNA的互补序列相对于位于单独寡核苷酸上还可以作为单一核酸分子的自身互补区被包含在内。

通常，双链体结构的长度为至少15个至30个碱基对，例如，长度为15个至29个、15个至28个、15个至27个、15个至26个、15个至25个、15个至24个、15个至23个、15个至22个、15个至21个、15个至20个、15个至19个、15个至18个、15个至17个、18个至30个、18个至29个、18个至28个、18个至27个、18个至26个、18个至25个、18个至24个、18个至23个、18个至22个、18个至21个、18个至20个、19个至30个、19个至29个、19个至28个、19个至27个、19个至26个、19个至25个、19个至24个、19个至23个、19个至22个、19个至21个、19个至20个、20个至30个、20个至29个、20个至28个、20个至27个、20个至26个、20个至25个、20个至24个、20个至23个、20个至22个、20个至21个、21个至30个、21个至29个、21个至28个、21个至27个、21个至26个、21个至25个、21个至24个、21个至23个或21个至22个碱基对。在某些实施例中，双链体结构的长度为18个至25个碱基对，例如，长度为18个至25个、18个至24个、18个至23个、18个至22个、18个至21个、18个至20个、19个至25个、19个至24个、19个至23个、19个至22个、19个至21个、19个至20个、20个至25个、20个至24,20个至23个、20个至22个、20个至21个、21个至25个、21个至24个、21个至23个、21个至22个、22个至25个、22个至24个、22个至23个、23个至25个、23个至24个或24个至25个碱基对，例如长度为19个至21个碱基对。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本公开的一部分。

类似地，与靶序列互补的区域的长度为15个至30个核苷酸，例如，长度为15个至29个、15个至28个、15个至27个、15个至26个、15个至25个、15个至24个、15个至23个、15个至22个、15个至21个、15个至20个、15个至19个、15个至18个、15个至17个、18个至30个、18个至29个、18个至28个、18个至27个、18个至26个、18个至25个、18个至24个、18个至23个、18个至22个、18个至21个、18个至20个、19个至30个、19个至29个、19个至28个、19个至27个、19个至26个、19个至25个、19个至24个、19个至23个、19个至22个、19个至21个、19个至20个、20个至30个、20个至29个、20个至28个、20个至27个、20个至26个、20个至25个、20个至24个、20个至23个、20个至22个、20个至21个、21个至30个、21个至29个、21个至28个、21个至27个、21个至26个、21个至25个、21个至24个、21个至23个或21个至22个核苷酸，例如长度为19个至23个核苷酸或长度为21个至23个核苷酸。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本公开的一部分。

在一些实施例中，双链体结构的长度为19个至30个碱基对。类似地，与靶序列互补的区域的长度为19个至30个核苷酸。

在一些实施例中，dsRNA的长度为15个至23个核苷酸或长度为25个至30个核苷酸。一般来说，dsRNA足够长以用作Dicer酶的底物。例如，本领域众所周知，长于约21个至23个核苷酸的dsRNA可以用作Dicer的底物。如普通技术人员还将认识到的，靶向切割的RNA的区域通常将是较大RNA分子的部分，通常是mRNA分子。在相关情况下，mRNA靶的一“部分”是mRNA靶的连续序列，其长度足以使其成为RNAi定向切割(即通过RISC通路切割)的底物。

本领域技术人员还将认识到，双链体区是dsRNA的主要功能部分，例如，约15个至36个碱基对的双链体区，例如，15个至36个、15个至35个、15个至34个、15个至33个、15个至32个、15个至31个、15个至30个、15个至29个、15个至28个、15个至27个、15个至26个、15个至25个、15个至24个、15个至23个、15个至22个、15个至21个、15个至20个、15个至19个、15个至18个、15个至17个、18个至30个、18个至29个、18个至28个、18个至27个、18个至26个、18个至25个、18个至24个、18个至23个、18个至22个、18个至21个、18个至20个、19个至30个、19个至29个、19个至28个、19个至27个、19个至26个、19个至25个、19个至24个、19个至23个、19个至22个、19个至21个、19个至20个、20个至30个、20个至29个、20个至28个、20个至27个、20个至26个、20个至25个、20个至24个、20个至23个、20个至22个、20个至21个、21个至30个、21个至29个、21个至28个、21个至27个、21个至26个、21个至25个、21个至24个、21个至23个或21个至22个碱基对，例如，19个至21个碱基对。因此，在一个实施例中，在其被加工成靶向所需RNA进行切割的例如15个至30个碱基对的功能性双链体的程度上，具有大于30个碱基对的双链体区的RNA分子或RNA分子复合物是dsRNA。因此，普通技术人员将认识到，在一个实施例中，miRNA是dsRNA。在另一个实施例中，dsRNA不是天然存在的miRNA。在另一个实施例中，可用于靶PRNP表达的RNAi药剂不是通过切割较大的dsRNA在靶细胞中产生的。

如本文所描述的dsRNA可以进一步包含一个或多个单链核苷酸突出端，例如，1个、2个、3个或4个核苷酸。核苷酸突出端可以包括以下或由以下组成：核苷酸/核苷类似物，包含脱氧核苷酸/核苷。突出端可以在有义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的核苷酸可以存在于dsRNA的反义链或有义链的5'端、3'端或两端上。在某些实施例中，更长的延伸的突出端是可能的。

dsRNA可以通过如下文进一步讨论的本领域已知的标准方法合成，例如，通过使用自动DNA合成仪，如可从例如应用生物系统公司的生物搜索(Biosearch,AppliedBiosystems,Inc.)商购获得。

本发明的iRNA化合物可以使用两步程序制备。首先，单独制备双链RNA分子的单个链。然后，对组分链进行退火。siRNA化合物的单个链可以使用溶液相或固相有机合成或两者制备。有机合成提供的优点是可以容易地制备包括非天然或经修饰的核苷酸的寡核苷酸链。本发明的单链寡核苷酸可以使用溶液相或固相有机合成或两者制备。

可以例如，通过多种方法大量产生siRNA。示例性方法包含：有机合成和RNA切割，例如，体外切割。

siRNA可以通过单独合成单链RNA分子或双链RNA分子的每条相应链来制备，然后可以对组分链进行退火。

大型生物反应器，例如，获得自法玛西亚生物技术AB公司(Pharmacia Biotec AB)(瑞典乌普萨拉(Uppsala Sweden))的OligoPilot II可以用于为给定siRNA产生大量特定RNA链。OligoPilotII反应器可以仅使用1.5摩尔过量的亚磷酸酰胺核苷酸有效地偶联核苷酸。为了制造RNA链，使用核糖核苷酸亚酰胺。单体添加的标准循环可用于合成siRNA的21至23核苷酸链。通常，这两条互补链是分开产生的，并且然后退火，例如，在从固体支撑物释放和脱保护之后。

有机合成可以用于产生离散siRNA物种。可以精准地指定与PRNP基因互补的物种。例如，物种可以与包含多态性，例如，单核苷酸多态性的区域互补。此外，可以精确地定义多态性的位置。在一些实施例中，多态性位于内部区域，例如，来自一个或两个末端的至少4个、5个、7个或9个核苷酸。

在一个实施例中，产生的RNA被仔细地纯化以去除末端。siRNA在体外被切割成siRNA，例如，使用Dicer或相当的基于RNA酶III的活性。例如，dsiRNA可以在果蝇的体外提取物中温育，或者使用纯化的组分，例如纯化的RNA酶或RISC复合物(RNA诱导的沉默复合物)。参见，例如，Ketting等人《基因与发育》2001年10月15日；15(20):2654-9和Hammond《科学》2001年8月10日；293(5532):1146-50。

dsiRNA切割通常产生多个siRNA物种，每个siRNA物种是源dsiRNA分子的特定21至23nt片段。例如，可以存在包含与源dsiRNA分子的重叠区域和相邻区域互补的序列的siRNA。

无论合成方法如何，siRNA制剂都可以在适合调配的溶液(例如，水溶液或有机溶液)中制备。例如，可以将siRNA制剂沉淀并在纯双蒸馏水中再溶解，并且冻干。然后可以将干燥的siRNA重悬在适合预期的调配过程的溶液中。

一方面，本公开的dsRNA包含至少两个核苷酸序列，有义序列和反义序列。PRNP的有义链序列可以选自表2至3中的任一个中提供的序列组，并且有义链的反义链的对应核苷酸序列可以选自表2至表3中任一个的序列组。在这方面，两个序列中的一个序列与两个序列中的另一个序列互补，其中所述序列中的一个序列与在PRNP基因表达中产生的mRNA序列基本上互补。因此，在这方面，dsRNA将包含两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸在表2至表3中的任一个中被描述为有义链(随从链)，并且第二个寡核苷酸被描述为表2至表3中的针对PRNP的任一个中的有义链的对应反义链(引导链)。

在一个实施例中，dsRNA的基本上互补的序列包含在分离的寡核苷酸上。在另一个实施例中，dsRNA的基本上互补的序列包含在单个寡核苷酸上。

应当理解、尽管条件是本文提供的序列被描述为经修饰的或缀合的序列，但本公开的RNAi药剂的RNA，例如，本公开的dsRNA可以包括表2至表3中的任一个中所述的未经修饰的、未缀合的或与其中所述的不同的经修饰的或缀合的序列中的任一个。一个或多个亲脂性配体或一个或更多个GalNAc配体可以包含在本申请中提供的RNAi药剂的位置中的任一处。

本领域技术人员充分了解，具有约20个至23个碱基对(例如，21个碱基对)的双链体结构的dsRNA已被誉为在诱导RNA干扰方面特别有效(Elbashir等人,(2001)《欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J.)》,20:6877-6888)。然而，其它人已经发现，较短或较长的RNA双链体结构也可以是有效的(Chu和Rana(2007)《RNA》14:1714-1719；Kim等人,(2005)《自然生物技术(Nat Biotech)》23:222-226)。在上述实施例中，由于本文所提供的寡核苷酸序列的性质，本文所描述的dsRNA可以包含至少一条长度为最少21个核苷酸的链。可以合理地预期，与上述dsRNA相比，在一端或两端仅减去很少核苷酸的较短的双链体可以类似地有效。因此，具有源自本文所提供的序列之一的至少15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个连续核苷酸的序列，并且其抑制PRNP基因的表达的能力与包括完整序列的dsRNA相差不超过10％、15％、20％、25％或30％的抑制(使用本文实例中提供的具有Cos7和10nM浓度的RNA药剂的体外测定和PCR测定)的dsRNA被认为在本公开的范围内。

另外，本文所描述的RNA鉴定了PRNP转录物中对RISC介导的切割敏感的位点。如此，本公开进一步以靶向此位点内的RNAi药剂为特征。如本文所使用的，如果RNAi药剂促进转录物在所述特定位点内任何位置的切割，则RNAi药剂被称为靶向RNA转录物的特定位点内。此类RNAi药剂将通常包含来自本文所提供的序列之一的至少约15个连续核苷酸，如至少19个核苷酸，所述序列与取自PRNP基因中与所选序列相邻的区域的另外的核苷酸序列偶联。

如本文所述的RNAi药剂可以包括与靶序列的一个或多个错配。在一个实施例中，如本文所描述的RNAi药剂含有不超过3个错配(即，3个、2个、1个或0个错配)。在一个实施例中，如本文所描述的RNAi药剂含有不超过2个错配。在一个实施例中，如本文所描述的RNAi药剂含有不超过1个错配。在一个实施例中，如本文所描述的RNAi药剂含有0个错配。在某些实施例中，如果RNAi药剂的反义链含有与靶序列的错配，则错配可以任选地被限制在距互补区的5'-或3'端的最后5个核苷酸内。例如，在此类实施例中，对于23个核苷酸的RNAi药剂，与PRNP基因的区域互补的链通常在中心13个核苷酸内不含有任何错配。本文所述的方法或本领域已知的方法可以用于确定包括与靶序列的错配的RNAi药剂是否有效抑制PRNP基因的表达。考虑具有错配的RNAi药剂在抑制PRNP基因表达方面的功效很重要，特别是如果已知PRNP基因中的特定互补区在群体内具有多态性序列变异。

III.本公开的经修饰的RNAi药剂

在一个实施例中，本公开的RNAi药剂的RNA，例如dsRNA，是未经修饰的，并且不包括例如本领域已知的和本文所描述的化学修饰或缀合。在某些实施例中，本公开的RNAi药剂的RNA，例如dsRNA被化学修饰以增强稳定性或其它有益特征。在本公开的某些实施例中，本公开的RNAi药剂的基本上所有核苷酸都是经修饰的。在本公开的其它实施例中，本公开的RNAi药剂的所有核苷酸都是经修饰的。其中“基本上所有核苷酸都是经修饰的”的本公开的RNAi药剂在很大程度上但不是完全为经修饰的，并且可以包含不超过5个、4个、3个、2个或1个未经修饰的核苷酸。在本公开的仍其它实施例中，本公开的RNAi药剂可以包含不超过5个、4个、3个、2个或1个经修饰的核苷酸。

本公开特征的核酸可以通过本领域公认的方法合成或修饰，例如“核酸化学中的当前实验方案(Current protocols in nucleic acid chemistry),”Beaucage,S.L等人(编辑),美国纽约州纽约的约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY,USA)中描述的那些方法，所述方法特此通过引用并入本文。修饰包含例如端修饰，例如5'端修饰(磷酸化、缀合、反向连接等)、3'端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)；碱基修饰，例如，用稳定碱基、去稳定碱基或与扩展的伙伴库碱基配对的碱基替换、去除碱基(无碱基核苷酸)或缀合的碱基；糖修饰(例如，在2'位置或4'位置处)或糖的置换；或主链修饰，包含磷酸二酯键的修饰或置换。可用于本文所描述的实施例的RNAi药剂的具体实例包含但不限于含有经修饰的主链或不含天然核苷间键的RNA。除此之外，具有经修饰的主链的RNA包含在主链中不具有磷原子的那些。出于本说明书的目的，并且如本领域中有时提及的，在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的RNA也可以被视为寡核苷。在一些实施例中，经修饰的RNAi药剂将在其核苷间主链中具有磷原子。

经修饰的RNA主链包含例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包含3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包含3'-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酸胺酯)、硫代羰基磷酰胺酯、硫代羰基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基磷酸三酯、以及具有正常3'-5'键的硼烷磷酸酯、这些酯的2'-5'连接类似物、以及具有反向极性的那些酯，其中相邻对的核苷单位以3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'连接。也包含了各种盐，例如，钠盐、混合盐和游离酸形式。

教导制备上述含磷键的代表性美国专利包含但不限于美国专利第3,687,808号；第4,469,863号；第4,476,301号；第5,023,243号；第5,177,195号；第5,188,897号；第5,264,423号；第5,276,019号；第5,278,302号；第5,286,717号；第5,321,131号；第5,399,676号；第5,405,939号；第5,453,496号；第5,455,233号；第5,466,677号；第5,476,925号；第5,519,126号；第5,536,821号；第5,541,316号；第5,550,111号；第5,563,253号；第5,571,799号；第5,587,361号；第5,625,050号；第6,028,188号；第6,124,445号；第6,160,109号；第6,169,170号；第6,172,209号；第6,239,265号；第6,277,603号；第6,326,199号；第6,346,614号；第6,444,423号；第6,531,590号；第6,534,639号；第6,608,035号；第6,683,167号；第6,858,715号；第6,867,294号；第6,878,805号；第7,015,315号；第7,041,816号；第7,273,933号；第7,321,029号；以及美国专利RE39464，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。

其中不包含磷原子的经修饰的RNA主链具有由以下形成的主链：短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键。这些包含具有吗啉代键的那些(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和其它具有混合的N、O、S和CH

教导制备上述寡核苷的代表性美国专利包含但不限于美国专利第5,034,506号；第5,166,315号；第5,185,444号；第5,214,134号；第5,216,141号；第5,235,033号；第5,64,562号；第5,264,564号；第5,405,938号；第5,434,257号；第5,466,677号；第5,470,967号；第5,489,677号；第5,541,307号；第5,561,225号；第5,596,086号；第5,602,240号；第5,608,046号；第5,610,289号；第5,618,704号；第5,623,070号；第5,663,312号；第5,633,360号；第5,677,437号；以及第5,677,439号，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。

在其它实施例中，合适的RNA模拟物被考虑用于RNAi药剂，其中核苷酸单元的糖和核苷间键，即主链被新基团替代。维持碱基单元以与适当的核酸靶化合物杂交。一种此类寡聚化合物(即已示出具有极佳杂交特性的RNA模拟物)被称作肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖主链被含酰胺的主链替代，尤其是氨基乙基甘氨酸主链。核碱基被保留并且直接或间接地与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导PNA化合物的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利第5,539,082号；第5,714,331号；以及第5,719,262号，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。适用于本公开的RNAi药剂的另外的PNA化合物在例如Nielsen等人,《科学(Science)》,1991,254,1497-1500中进行了描述。

本公开特征的一些实施例包含具有硫代磷酸酯主链的RNA和具有杂原子主链的寡核苷，特别是上文引用的美国专利第5,489,677号的--CH

经修饰的RNA还可以包括一个或多个经取代的糖部分。本文特征的RNAi药剂，例如dsRNA可以在2'位置处包含以下之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是经取代的或未经取代的C

其它修饰包含2'-甲氧基(2'-OCH

本公开的RNAi药剂还可以包含核碱基(在本领域中通常被简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所使用的，“未经修饰的”或“天然”核碱基包含嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包含其它合成和天然核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤基、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基，具体地5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。另外的核碱基包含美国专利第3,687,808号中公开的那些，在《生物化学、生物技术和医学中经修饰的核苷(Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology andMedicine)》,Herdewijn,P.编辑Wiley-VCH出版社(Wiley-VCH),2008年中公开的那些；在《聚合物科学与工程化简明百科全书(The Concise Encyclopedia Of Polymer ScienceAnd Engineering)》,第858-859页,Kroschwitz,J.L编辑约翰威利父子公司,1990中公开的那些，Englisch等人,(1991)《化学应用国际版(Angewandte Chemie,InternationalEdition)》,30:613中公开的那些，以及Sanghvi,Y S.,第15章,《dsRNA研究与应用(dsRNAResearch and Applications)》,第289-302页,Crooke，S.T.和Lebleu,B.编辑,CRC出版社(CRC Press),1993中公开的那些。这些核碱基中的某些核碱基对提高本公开特征的寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些包含5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包含2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经示出5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性提高0.6℃至1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑,《dsRNA研究与应用》,CRC出版社,波卡拉顿(Boca Raton),1993，第276-278页)，并且是示例性碱基取代，甚至更具体地在与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。

教导制备某些上述经修饰的核碱基以及其它经修饰的核碱基的代表性美国专利包含但不限于上述美国专利第3,687,808号、第4,845,205号；第5,130,30号；第5,134,066号；第5,175,273号；第5,367,066号；第5,432,272号；第5,457,187号；第5,459,255号；第5,484,908号；第5,502,177号；第5,525,711号；第5,552,540号；第5,587,469号；第5,594,121号、5,596,091号；第5,614,617号；第5,681,941号；第5,750,692号；第6,015,886号；第6,147,200号；第6,166,197号；第6,222,025号；第6,235,887号；第6,380,368号；第6,528,640号；第6,639,062号；第6,617,438号；第7,045,610号；第7,427,672号；以及第7,495,088号，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。

本公开的RNAi药剂也可以被修饰以包含一个或多个双环糖部分。“双环糖”是由两个碳(无论是相邻的或是非相邻的)桥接形成的环修饰的呋喃糖基环。“双环核苷”(“BNA”)是一种具有糖部分的核苷，搜书糖部分包括通过桥接糖环的两个碳(无论是相邻的或是非相邻的)而形成的环，由此形成双环系统。在某些实施例中，桥任选地通过2'-无环氧原子连接糖环的4'-碳和2'-碳。因此，在一些实施例中，本公开的药剂可以包含一种或多种锁定核酸(LNA)。锁定核酸是具有经修饰的核糖部分的核苷酸，其中核糖部分包括连接2'和4'碳的额外桥。换言之，LNA是包括双环糖部分的核苷酸，所述双环糖部分包括4'-CH2-O-2'桥。这种结构有效地将核糖“锁定”在3'-内结构构象中。向siRNA中添加锁定核酸已被证明可增加血清中的siRNA稳定性，并且减少脱靶效应(Elmen，J.等人,(2005)《核酸研究》33(1):439-447；Mook,OR.等人,(2007)《分子癌症治疗学》6(3):833-843；Grunweller,A.等人,(2003)《核酸研究》31(12):3185-3193)。用于本公开的多核苷酸的双环核苷的实例包含但不限于包括4'和2'核糖基环原子之间的桥的核苷。在某些实施例中，本公开的反义多核苷酸药剂包含一种或多种包括4'至2'桥的双环核苷。

锁核苷可以由以下结构表示(省略立体化学)，

其中B是核碱基或经修饰的核碱基，并且L是将核糖环的2'-碳与4'-碳连接的连接基团。此类4'至2'桥双环核苷的实例包含但不限于4′-(CH2)—O-2′(LNA)；4′-(CH

教导制备锁定核酸核苷酸的其它代表性美国专利和美国专利公开包含但不限于以下：美国专利第6,268,490号；第6,525,191号；第6,670,461号；第6,770,748号；第6,794,499号；第6,998,484号；第7,053,207号；第7,034,133；7,084,125号；第7,399,845号；第7,427,672号；第7,569,686号；第7,741,457号；第8,022,193号；第8,030,467号；第8,278,425号；第8,278,426号；第8,278,283号；US2008/0039618；以及US2009/0012281，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。

可以制备具有一种或多种立体化学糖构型的任何前述双环核苷，包含例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见WO 99/14226)。

本公开的RNAi药剂也可以被修饰以包含一个或多个约束乙基核苷酸。如本文所使用的，“约束乙基核苷酸”或“cEt”为包括包含4'-CH(CH

本公开的RNAi药剂还可以包含一个或多个“构象限制性核苷酸”(“CRN”)。CRN是具有连接核糖的C2'和C4'碳或核糖的PRNP和-C5'碳的接头的核苷酸类似物。CRN将核糖环锁定为稳定的构象，并且增加对mRNA的杂交亲和力。接头具有足够的长度以将氧放置在稳定性和亲和力的最佳位置，从而导致较少的核糖环褶皱。

教导上述某些CRN的制备的代表性出版物包含但不限于US 2013/0190383；以及WO2013/036868，所述文献中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。

在一些实施例中，本公开的RNAi药剂包括一种或多种为UNA(解锁核酸)核苷酸的单体。UNA是未锁定的无环核酸，其中糖的任何键都已被去除，形成未锁定的“糖”残基。在一个实例中，UNA还涵盖C1'-C4'之间的键已被去除的单体(即C1'与C4'碳之间的共价碳-氧-碳键)。在另一个实例中，糖的C2'-PRNP'键(即C2'与PRNP'碳之间的共价碳-碳键)已被去除(参见《核酸研讨会丛刊(Nuc.Acids Symp.Series)》,52,133-134(2008)和Fluiter等人,《分子生物系统(Mol.Biosyst.)》,2009,10,1039，特此通过引用并入)。

教导UNA的制备的代表性美国公开包含但不限于US8,314,227；以及美国专利公开第2013/0096289号；第2013/0011922号；和第2011/0313020号，所述文献中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。

对RNA分子末端的潜在稳定修饰可以包含N-(乙酰氨基己酰基)-4-羟脯氨醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己酰基-4-羟脯氨醇)(Hyp-C6)、N-(乙酰基-4-羟脯氨醇)(Hyp-NHAc)、胸苷-2'-O-脱氧胸苷(醚)、N-(氨基己酰基)-4-羟脯氨醇(Hyp-C6-氨基)、2-二十二烷酰基-尿苷-3'-磷酸酯、反向2'-脱氧修饰的核糖核苷酸，如反向dT(idT)、反向dA(idA)和反向无碱基2'-脱氧核糖核苷酸(iAb)等。此修饰的公开内容可以在WO 2011/005861中找到。

在一个实例中，寡核苷酸的3'或5'末端与反向2'-脱氧修饰的核糖核苷酸连接，如反向dT(idT)、反向dA(idA)或反向无碱基2'-脱氧核糖核苷酸(iAb)。在一个特定实例中，反向2'-脱氧修饰的核糖核苷酸与寡核苷酸的3'端连接，如本文所描述的有义链的3'端，其中连接是通过3'-3'磷酸二酯键或3'-3'-硫代磷酸酯键。

在另一个实例中，有义链的3'端通过3'-3'-硫代磷酸酯键与反向无碱基核糖核苷酸(iAb)连接。在另一个实例中，有义链的3'端通过3'-3'-硫代磷酸酯键与反向dA(idA)连接。

在一个特定实例中，反向2'-脱氧修饰的核糖核苷酸与寡核苷酸的3'端连接，如本文所描述的有义链的3'端，其中连接是通过3'-3'磷酸二酯键或3'-3'-硫代磷酸酯键。

在另一个实例中，有义链的3'末端核苷酸是反向dA(idA)，并且通过3'-3'-键(例如，3'-3'-硫代磷酸酯键)与前述核苷酸连接。

本公开的RNAi药剂的其它修饰包含5'磷酸酯或5'磷酸酯模拟物，例如，RNAi药剂的反义链上的5'末端磷酸酯或磷酸酯模拟物。合适的磷酸酯模拟物公开于例如US2012/0157511中，所述文献的全部内容通过引用并入本文。

A.包括本公开的基序的经修饰RNAi药剂

在本公开的某些方面，本公开的双链RNAi药剂包含具有化学修饰的药剂，如在例如WO 2013/075035中公开的，所述文献中的全部内容通过引用并入本文。如本文和WO2013/075035所示，将在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序引入RNAi药剂的有义链或反义链，特别是在切割位点处或附近。在一些实施例中，RNAi药剂的有义链和反义链可以以其它方式被完全修饰。这些基序的引入中断了有义或反义链的修饰模式(如果存在的话)。RNAi药剂可以任选地与亲脂性配体缀合，例如C16配体，例如在有义链上。RNAi药剂可以任选地用(S)-乙二醇核酸(GNA)修饰来修饰，例如在反义链的一个或多个残基上。

因此，本公开提供了能够在体内抑制靶基因(即PRNP基因)的表达的双链RNAi药剂。RNAi药剂包括有义链和反义链。RNAi药剂的每条链可以是长度为15个至30个核苷酸。例如，每条链可以是长度为16个至30个核苷酸、长度为17个至30个核苷酸、长度为25个至30个核苷酸、长度为27个至30个核苷酸、长度为17个至23个核苷酸、长度为17个至21个核苷酸、长度为17个至19个核苷酸、长度为19个至25个核苷酸、长度为19个至23个核苷酸、长度为19个至21个核苷酸、长度为21个至25个核苷酸或长度为21个至23个核苷酸。在某些实施例中，每条链的长度为19个至23个核苷酸。

有义链和反义链通常形成双链体双链RNA(“dsRNA”)，本文也称为“RNAi药剂”RNAi药剂的双链体区的长度可以是15个至30个核苷酸对。例如，双链体区可以是长度为16个至30个核苷酸对、长度为17个至30个核苷酸对、长度为27个至30个核苷酸对、长度为17个至23个核苷酸对、长度为17个至21个核苷酸对、长度为17个至19个核苷酸对、长度为19个25个核苷酸对、长度为19个至23个核苷酸对、长度为19个至21个核苷酸对、长度为21个至25个核苷酸对或长度为21个至23个核苷酸对。在另一个实例中，双链体区的长度选自15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个和27个核苷酸。在某些实施例中，双链体区的长度为19个至21个核苷酸对。

在一个实施例中，RNAi药剂可以在一条或两条链的3'端、5'端或两端含有一个或多个突出端区或封端基团。突出端的长度可以为1个至6个核苷酸，例如长度为2个至6个核苷酸、长度为1个至5个核苷酸、长度为2个至5个核苷酸、长度为1个至4个核苷酸、长度为2个至4个核苷酸、长度为1个至3个核苷酸、长度为2个至3个核苷酸或长度为1个至2个核苷酸。在某些实施例中，核苷酸突出端区的长度为2个核苷酸。突出端可以是一条链比另一条链长的结果，或是两条相同长度的链交错的结果。突出端可以与靶mRNA形成错配，或其可以与被靶向的基因序列互补，或可以是另一个序列。第一链和第二链也可以连接，例如通过另外的碱基形成发夹，或通过其它非碱基接头。

在一个实施例中，RNAi药剂的突出端区中的核苷酸可以各自独立地是经修饰的或未经修饰的核苷酸，包含但不限于2'-糖修饰的，如2-F、2'-O-甲基、胸苷(T)以及其任何组合。

例如，TT可以是任一条链上任一端的突出端序列。突出端可以与靶mRNA形成错配，或其可以与被靶向的基因序列互补，或可以是另一个序列。

RNAi药剂的有义链、反义链或两条链上的5'或3'突出端可以被磷酸化。在一些实施例中，突出端区含有在两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯的两个核苷酸，其中两个核苷酸可以是相同的或不同的。在一个实施例中，突出端存在于有义链、反义链或两条链的3'端处。在一个实施例中，这种3'突出端存在于反义链中。在一个实施例中，这种3'突出端存在于有义链中。

RNAi药剂可能只含有单个突出端，这可以增强RNAi的干扰活性，而不会影响其整体稳定性。例如，单链突出端可以位于有义链的3'末端处，或可替代地，位于反义链的3'末端处。RNAi也可能具有平端，位于反义链的5'端(即，有义链的3'端)处，或反之亦然。通常，RNAi的反义链在3'端处有核苷酸突出端，并且5'端是平的。虽然不希望受理论的束缚，但反义链5'端的不对称平端和反义链3'端突出端有利于引导链装载到RISC过程中。

在一个实施例中，RNAi药剂是长度为19个核苷酸的双平端，其中所述有义链在从5'端开始的位置7、8和9处的三个连续核苷酸上含有三个2'-F修饰的至少一个基序。反义链在从5'端开始的位置11、12和13处的三个连续核苷酸上含有三个2'-O-甲基修饰的至少一个基序。

在另一个实施例中，RNAi药剂是长度为20个核苷酸的双平端，其中所述有义链在从5'端开始的位置8、9和10的三个连续核苷酸上含有三个2'-F修饰的至少一个基序。反义链在从5'端开始的位置11、12和13处的三个连续核苷酸上含有三个2'-O-甲基修饰的至少一个基序。

在又另一个实施例中，RNAi药剂是长度为21个核苷酸的双平端，其中所述有义链在从5'端开始的位置9、10、11处的三个连续核苷酸上含有三个2'-F修饰的至少一个基序。反义链在从5'端开始的位置11、12和13处的三个连续核苷酸上含有三个2'-O-甲基修饰的至少一个基序。

在一个实施例中，RNAi药剂包括21个核苷酸的有义链和23个核苷酸的反义链，其中所述有义链在从5'端开始的位置9、10和11处的三个连续核苷酸上含有三个2'-F修饰的至少一个基序；所述反义链在从5'端开始的位置11、12和13处的三个连续核苷酸上含有三个2'-O-甲基修饰的至少一个基序，其中所述RNAi药剂的一端是平的，而另一端包括2个核苷酸的突出端。在一个实施例中，两个核苷酸的突出端位于反义链的3'端处。当两个核苷酸的突出端位于反义链的3'端处时，在末端三个核苷酸之间可能存在两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，并且第三个核苷酸是紧挨着突出端核苷酸的配对核苷酸。在一个实施例中，RNAi药剂在有义链的5'端和反义链的5'端两者的末端三个核苷酸之间另外具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施例中，RNAi药剂的有义链和反义链中的每个核苷酸，包含为基序一部分的核苷酸，都是经修饰的核苷酸。在一个实施例中，每个残基用2'-O-甲基或2'-氟独立地修饰，例如在交替基序中。任选地，RNAi药剂进一步包括配体(例如，亲脂性配体，任选地C16配体)。

在一个实施例中，RNAi药剂包括有义链和反义链，其中所述有义链的长度为25个至30个核苷酸残基，其中从第一链的5'末端核苷酸(位置1)位置1开始至位置23，包括至少8个核糖核苷酸；反义链的长度为36个至66个核苷酸残基，并且从3'末端核苷酸开始，在与有义链的位置1至23配对以形成双链体的位置中包括至少8个核糖核苷酸；其中至少反义链的3'末端核苷酸与有义链不配对，并且至多6个连续3'末端核苷酸与有义链不配对，由此形成1个至6个核苷酸的3'单链突出端；其中反义链的5'末端包括10个至30个与有义链不配对的连续核苷酸，由此形成10个至30个核苷酸单链5'突出端；其中当有义链和反义链比对以获得最大互补性时，至少有义链5'末端和3'末端核苷酸与反义链的核苷酸碱基配对，由此在有义链与反义链之间形成基本上双链的区域；并且反义链沿着反义链长度的至少19个核糖核苷酸与靶RNA充分互补，以在将双链核酸引入哺乳动物细胞时减少靶基因表达；并且其中所述有义链含有在三个连续核苷酸上的三个2'-F修饰的至少一个基序，其中至少一个所述基序出现在切割位点处或附近。反义链在切割位点处或其附近的三个连续核苷酸上含有三个2'-O-甲基修饰的至少一个基序。

在一个实施例中，RNAi药剂包括有义链和反义链，其中所述RNAi药剂包括长度为至少25个和最多29个核苷酸的第一链和长度为最多30个核苷酸的第二链，在从5'端起的位置11、12和13处的三个连续核苷酸上具有三个2'-O-甲基修饰的至少一个基序；其中所述第一链的3'端和所述第二链的5'端形成平端，并且所述第二链在其3'端处比所述第一链长1个至4个核苷酸，其中所述双链体区的长度为至少25个核苷酸，并且所述第二链沿着所述第二链长度的至少19个核苷酸与靶mRNA充分互补，以在将所述RNAi药剂引入哺乳动物细胞中时减少靶基因表达，并且其中所述RNAi药剂的dicer切割产生包括所述第二链的3'端的siRNA，由此减少所述靶基因在哺乳动物中的表达。任选地，RNAi药剂进一步包括配体。

在一个实施例中，RNAi药剂的有义链含有在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的至少一个基序，其中一个基序出现在有义链中的切割位点处。

在一个实施例中，RNAi药剂的反义链也可以含有在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的至少一个基序，其中一个基序出现在反义链中的切割位点处或附近。

对于具有长度为17个至23个核苷酸的双链体区的RNAi药剂，反义链的切割位点通常在距离5'端的10、11和12位置附近。因此，三个相同修饰的基序可以出现在反义链的9、10和11位置；10、11和12位置；11、12和13位置；12、13和14位置；或13、14和15位置，计数从反义链的5'端的第一个核苷酸开始，或计数从反义链的5'端双链体区内的第一个配对核苷酸开始。反义链中的切割位点也可以根据RNAi的双链体区从5'端开始的长度而改变。

RNAi药剂的有义链可以在链的切割位点处的三个连续核苷酸上含有三个相同修饰的至少一个基序；并且反义链可以在链的切割位点处或附近的三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的至少一个基序。当有义链和反义链形成dsRNA双链体时，有义链与反义链可以如此排列，使得有义链上的三个核苷酸的一个基序与反义链上的三个核苷酸的一个基序具有至少一个核苷酸重叠，即，有义链中的基序的三个核苷酸中的至少一个与反义链中基序的三个核苷酸中的至少一个形成碱基对。可替代地，至少两个核苷酸可以重叠，或所有三个核苷酸都可以重叠。

在一个实施例中，RNAi药剂的有义链可以含有在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的多于一个的基序。第一个基序可以出现在链的切割位点处或附近，并且其它基序可以是翼修饰。本文中的术语“翼修饰”是指出现在链的另一部分处的基序，所述部分在同一链的切割位点处或附近与基序分离。翼修饰要么与第一基序相邻，或被至少一个或多个核苷酸分开。当基序彼此紧邻时，则基序的化学性质彼此不同，并且当基序由一个或多个核苷酸分开时，化学性质可以相同或不同。可能存在两个或更多个翼修饰。例如，当存在两个翼修饰时，每个翼修饰可以出现在相对于第一基序的一端，所述第一基序位于切割位点处或附近，或在前导基序的任一侧。

与有义链一样，RNAi药剂的反义链可以含有在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的多于一个基序，其中至少一个基序出现在链的切割位点处或附近。此反义链还可以含有与可能存在于有义链上的翼修饰相似的排列的一个或多个翼修饰。

在一个实施例中，RNAi药剂的有义链或反义链上的翼修饰通常不包含链的3'端、5'端或两端处的第一个或前两个末端核苷酸。

在另一个实施例中，RNAi药剂的有义链或反义链上的翼修饰通常不包含链的3'端、5'端或两端处双链体区内的第一个或前两个配对核苷酸。

当RNAi药剂的有义链和反义链各自含有至少一个翼修饰时，翼修饰可以落在双链体区的同一端，并且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。

当RNAi药剂的有义链和反义链各自含有至少两个翼修饰时，有义链和反义链可以如此排列，使得各自来自一条链的两个修饰落在双链体区的一端，具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；各自来自一条链的两个修饰落在双链体区的另一端，具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；两个修饰一条链落在前导基序的每一侧，在双链体区中具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。

在一个实施例中，RNAi药剂包括与靶标、在双链体内或其组合的错配。所述错配可能发生在突出端区或双链体区中。碱基对可以基于其促进解离或熔化的倾向进行排序(例如，根据特定配对的缔合或离解的自由能，最简单的方法是在单个配对的基础上检查配对，尽管也可以使用下一个临近点或类似分析)。在促进解离方面：A:U优于G:C；G:U优于G:C；并且I:C优于G:C(I＝肌苷)。错配，例如非规范或规范外配对(如本文其它地方所述)优于规范(A:T、A:U、G:C)配对；并且包含通用碱基的配对优于规范配对。

在一个实施例中，RNAi药剂在从反义链的5'端开始的双链体区内包括前1个、2个、3个、4个或5个碱基对中的至少一个，所述双链体区独立地选自以下的组：A：U、G:U、I:C和错配对，例如非规范或规范外配对或包含通用碱基的配对，以促进双链体的5'端处反义链的解离。

在一个实施例中，反义链中从5'端开始的双链体区内1位置处的核苷酸选自由以下组成的组：A、dA、dU、U和dT。可替代地，从反义链的5'端开始的双链体区内的前1个、2个或3个碱基对中的至少一个是AU碱基对。例如，从反义链5'端起的双链体区内的第一个碱基对是AU碱基对。

在另一个实施例中，有义链的3'端处的核苷酸是脱氧胸腺嘧啶(dT)。在另一个实施例中，反义链的3'端处的核苷酸是脱氧胸腺嘧啶(dT)。在一个实施例中，存在脱氧胸腺嘧啶核苷酸的短序列，例如，在有义链或反义链的3'端上有两个dT核苷酸。

在一个实施例中，有义链序列可以由式(I)表示：

5'n

其中：

i和j各自独立地为0或1；

p和q各自独立地为0至6；

每个N

每个N

每个n

其中Nb和Y不具有相同的修饰；并且

XXX、YYY和ZZZ各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。在一个实施例中，YYY是所有2'-F修饰的核苷酸。

在一个实施例中，N

在一个实施例中，YYY基序出现在有义链的切割位点处或附近。例如，当RNAi药剂具有长度为17个至23个核苷酸的双链体区时，YYY基序可以出现在有义链的切割位点处或附近(例如，可以出现在位置6、7、8；7、8、9；8、9、10；9、10、11；10、11、12或11、12、13处)，计数从第1个核苷酸开始，从5'端开始；或任选地，计数从5'端开始，从双链体区内的第1配对核苷酸开始。

在一个实施例中，i是1并且j是0，或i是0并且j是1，或i和j两者都是1。因此，有义链可以由下式表示：

5'n

5'n

5'n

当有义链由式(Ib)表示时，N

每个N

当有义链表示为式(Ic)时，N

当有义链表示为式(Id)时每个N

X、Y和Z中的每一个可以彼此相同或不同。

在其它实施例中，i是0并且j是0，并且有义链可以由下式表示：

5'n

当有义链由式(Ia)表示时，每个N

在一个实施例中，RNAi的反义链序列可以由式(II)表示：

5'n

其中：

k和l各自独立地为0或1；

p'和q'各自独立地为0至6；

每个N

每个N

每个n

其中N

X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。

在一个实施例中，N

Y′Y′Y′基序出现在反义链的切割位点处或附近。例如，当RNAi药剂具有长度为17个至23个核苷酸的双链体区时，Y′Y′Y′基序可以出现在反义链的位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15处，计数从第1个核苷酸开始，从5'端开始；或任选地，计数从5'端开始，从双链体区内的第1配对核苷酸开始。在另一个实施例中，Y′Y′Y′基序出现在位置11、12、13处。

在一个实施例中，Y′Y′Y′基序全部是2'-OMe修饰的核苷酸。

在一个实施例中，k是1并且l是0，或k是0并且l是1，或k和l两者都是1。

因此，反义链可以由下式表示：

5'n

5'n

5'n

当反义链表示由式(IIb)表示时，N

当反义链表示为式(IIc)时，N

当反义链表示为式(IId)时，每个N

在其它实施例中，k是0并且l是0，并且反义链可以由下式表示：

5'n

当反义链表示为式(IIa)时，每个N

X′、Y′和Z′中的每一个可以彼此相同或不同。

有义链和反义链的每个核苷酸可以独立地用LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-羟基或2'-氟修饰。例如，有义链和反义链的每个核苷酸独立地用2'-O-甲基或2'-氟修饰。特别地，每个X、Y、Z、X′、Y′和Z′可以表示2'-O-甲基修饰或2'-氟修饰。

在一个实施例中，当双链体区为21nt时，RNAi药剂的有义链可以含有出现在链的9、10和11位置处的YYY基序，计数从5'端的第1个核苷酸开始，或任选地，计数从5'端的双链体区内的第1配对核苷酸开始；并且Y表示2'-F修饰。有义链可以另外含有XXX基序或ZZZ基序作为在双链体区的相对端处的翼修饰；并且XXX和ZZZ各自独立地表示2'-OMe修饰或2'-F修饰。

在一个实施例中，反义链可以含有出现在链的位置11、12、13处的Y′Y′Y′基序，计数从5'端的第1个核苷酸开始，或任选地，计数从5'端的双链体区内的第1配对核苷酸开始；并且Y′表示2'-O-甲基修饰。反义链可以另外含有X′X′X′基序或Z′Z′Z′基序作为在双链体区的相对端处的翼修饰；并且X′X′X′和Z′Z′Z′各自独立地表示2'-OMe修饰或2'-F修饰。

由上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的任一个表示的有义链与分别由式(IIa)、(IIb)、(IIc)和(IId)中的任一个表示的反义链形成双链体。

因此，用于本公开的方法中的RNAi药剂可以包括有义链和反义链，每条链具有14个至30个核苷酸，RNAi双链体由式(III)表示：

有义：5'n

反义：3'n

(III)

其中：

i、j、k和l各自独立地为0或1；

p、p′、q和q′各自独立地为0至6；

每个N

每个N

其中

每个可能存在或不存在的n

XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。

在一个实施例中，i是0并且j是0；或i是1并且j是0；或i是0并且j是1；或i和j两者都是0；或i和j两者都是1。在另一个实施例中，k是0并且l是0；或k是1并且l是0；k是0并且l是1；或k和l两者都是0；或k和l两者都是1。

形成RNAi双链体的有义链和反义链的示例性组合包含下式：

5'n

3'n

(IIIa)

5'n

3'n

(IIIb)

5'n

3'n

(IIIc)

5'n

3'n

(IIId)

当RNAi药剂由式(IIIa)表示时，每个N

当RNAi药剂由式(IIIb)表示时，每个N

当RNAi药剂表示为式(IIIc)时，每个N

当RNAi药剂表示为式(IIId)时，每个N

在一个实施例中，当RNAi药剂由式(IIId)表示时，N

在一个实施例中，当RNAi药剂由式(IIIa)表示时，N

在一个实施例中，RNAi药剂是含有至少两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体的多聚体，其中所述双链体通过接头连接。接头可以是可切割的或不可切割的。任选地，多聚体进一步包括配体。每个双链体可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或每个双链体可以靶向两个不同的靶位点处的相同的基因。

在一个实施例中，RNAi药剂是含有三个、四个、五个、六个或更多个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体的多聚体，其中所述双链体通过接头连接。接头可以是可切割的或不可切割的。任选地，多聚体进一步包括配体。每个双链体可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或每个双链体可以靶向两个不同的靶位点处的相同的基因。

在一个实施例中，由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的两种RNAi药剂在5'端处以及一个或两个3'处彼此连接，并且任选地与配体缀合。每种药剂可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或每种药剂可以靶向两个不同的靶位点处的相同的基因。

各种出版物描述了可以用于本公开的方法的多聚体RNAi药剂。此类出版物包含WO2007/091269、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887和WO2011/031520；以及US7858769，所述文献中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。

在某些实施例中，本公开的组合物和方法包含如本文所描述的RNAi药剂的乙烯基膦酸酯(VP)修饰。在示例性实施例中，本公开的膦酸5'-乙烯酯修饰的核苷酸具有以下结构：

其中X为O或S；

R是氢、羟基、氟或C

R

B是核碱基或经修饰的核碱基，任选地其中B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。

在一个实施例中，R

本公开的乙烯基膦酸酯可以与本公开的dsRNA的反义链或有义链连接。在某些实施例中，本公开的乙烯基膦酸酯与dsRNA的反义链连接，任选地在dsRNA反义链的5'端处。

乙烯基膦酸酯修饰也设想用于本公开的组合物和方法。示例性乙烯基膦酸酯前述结构，其中R

A.热不稳定修饰

在某些实施例中，dsRNA分子可以通过在反义链的种子区掺入热不稳定修饰来优化RNA干扰。如本文所使用的，“种子区”意指参考链5'端的位置2至9。例如，可以在反义链的种子区引入热不稳定修饰，以减少或抑制脱靶基因沉默。

术语“热不稳定修饰”包含将导致dsRNA的总熔融温度(T

已经发现，具有反义链的dsRNA具有降低脱靶基因沉默活性的作用，所述反义链包括前9个核苷酸位置内的双链体的至少一个热不稳定修饰，从所述反义链的5'端开始计数。因此，在一些实施例中，反义链在反义链的5'区的前9个核苷酸位置内包括至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或更多个)双链体的热不稳定修饰。在一些实施例中，双链体的一个或多个热不稳定修饰位于从反义链5'端起的位置2至9处，如位置4至8。在一些另外的实施例中，双链体的热不稳定修饰位于从反义链的5'端起的位置6、7或8处。在仍一些另外的实施例中，双链体的热不稳定修饰位于从反义链的5'端起的位置7处。在一些实施例中，双链体的热不稳定修饰位于从反义链的5'端起的位置2、3、4、5或9处。

热不稳定修饰可以包含但不限于无碱基修饰；与相对链中的相对核苷酸的错配；以及糖修饰，如2'-脱氧修饰、无环核苷酸，例如，解锁核酸(UNA)或乙二醇核酸(GNA)；以及2'-5'-连接的核糖核苷酸(“3'-RNA”)。

例示的无碱基修饰包含但不限于以下：

其中R＝H、Me、Et或OMe；R'＝H、Me、Et或OMe；R”＝H、Me、Et或OMe

其中B是经修饰的或未经修饰的核碱基。

例示的糖修饰包含但不限于以下：

/>

其中B是经修饰的或未经修饰的核碱基。

在一些实施例中，双链体的热不稳定修饰选自由以下组成的组：

以及/>

其中B是经修饰的或未经修饰的核碱基，并且每个结构上的星号表示R、S或外消旋。

在一些实施例中，双链体的热不稳定修饰选自由以下组成的组：

以及/>

其中B是经修饰的或未经修饰的核碱基，并且星号表示R、S或外消旋(例如S)。

术语“无环核苷酸”是指具有无环核糖糖的任何核苷酸，例如其中核糖碳之间的任何键(例如，C1'-C2'、C2'-PRNP'、PRNP'-C4'、C4'-O4'或C1'-O4')不存在或核糖碳或氧中的至少一个(例如，C1'、C2'、PRNP'、C4'或O4')独立地或组合地不存在于核苷酸中。在一些实施例中，无环核苷酸是

术语‘GNA’是指乙二醇核酸，所述乙二醇核酸是一种类似于DNA或RNA的聚合物，但其“主链”的组成不同，因为其由磷酸二酯键连接的重复甘油单元组成：

双链体的热不稳定修饰可以是热不稳定核苷酸与dsRNA双链体内相对链中的相对核苷酸之间的错配(即非互补碱基对)。示例性错配碱基对包含G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:T、U:T或其组合。本领域已知的其它错配碱基配对也适用于本发明。错配可以发生在核苷酸(天然存在的核苷酸或经修饰的核苷酸)之间，即，错配碱基配对可以发生在来自相应的核苷酸的核碱基之间，而与核苷酸的核糖糖上的修饰无关。在某些实施例中，dsRNA分子在错配配对中含有至少一个核碱基，所述核碱基为2'-脱氧核碱基；例如，2'-脱氧核碱基是在有义链中。

在一些实施例中，反义链的种子区中的双链体的热不稳定修饰包含与靶mRNA上的互补碱基具有受损沃森-克里克氢键合的核苷酸，如经修饰的核碱基：

/>

在WO 2011/133876中详细描述了无碱基核苷酸、无环核苷酸修饰(包含UNA和GNA)和错配修饰的更多实例，所述文献通过全文引用的方式并入本文。

热不稳定修饰还可以包含减少的或消除了与相对碱基形成氢键的能力的通用碱基和磷酸酯修饰。

在一些实施例中，双链体的热不稳定修饰包含具有非规范碱基的核苷酸，如但不限于具有受损的或完全消除了与相对链中的碱基形成氢键的能力的核碱基修饰。已经评估了这些核碱基修饰对dsRNA双链体的中心区域的不稳定，如WO 2010/0011895中所描述的，所述文献通过全文引用的方式并入本文。示例性核碱基修饰是：

在一些实施例中，反义链的种子区中的双链体的热不稳定修饰包含与靶mRNA上的碱基互补的一个或多个α-核苷酸，如：

其中R是H、OH、OCH

与天然磷酸二酯键相比，已知降低dsRNA双链体热稳定性的示例性磷酸酯修饰是：

R基团的烷基可以是C

如本领域技术人员将认识到的，鉴于核碱基的功能作用是定义本公开的RNAi药剂的特异性，而核碱基修饰可以以如本文所描述的各种方式进行，例如将不稳定修饰引入本公开的RNAi药剂中，例如为了相对于脱靶效应增强在靶效应，对于非核碱基修饰，例如对多核糖核苷酸的糖基或磷酸酯主链的修饰，本公开的RNAi药剂上可用的和通常存在的修饰的范围往往要大得多。此类修饰在本公开的其它部分中进行了更详细的描述，并且明确考虑用于本公开的RNAi药剂，其具有如上所述或本文其它地方所述的天然核碱基或经修饰的核碱基。

除了包括热不稳定修饰的反义链外，dsRNA还可以包括一个或多个稳定修饰。例如，dsRNA可以包括至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)稳定修饰。不受限制地，所有稳定修饰都可以存在于一条链中。在一些实施例中，有义链和反义链两者均包括至少两个稳定修饰。稳定修饰可以发生在有义链或反义链的任何核苷酸上。例如，稳定修饰可以发生在有义链或反义链上的每个核苷酸上；每个稳定修饰可以在有义链或反义链上以交替模式发生；或有义链或反义链两者包括交替模式的稳定修饰。有义链上的稳定修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，并且有义链上稳定修饰的交替模式可以相对于反义链上稳定修饰的交替模式具有偏移。

在一些实施例中，反义链包括至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)稳定修饰。不受限制地，反义链中的稳定修饰可以存在于任何位置处。在一些实施例中，反义包括从5'端起的位置2、6、8、9、14和16处的稳定修饰。在一些其它实施例中，反义包括从5'端起的位置2、6、14和16处的稳定修饰。在仍一些其它实施例中，反义包括从5'端起的位置2、14和16处的稳定修饰。

在一些实施例中，反义链包括与不稳定修饰相邻的至少一个稳定修饰。例如，稳定修饰可以是不稳定修饰的5'端或3'端处的核苷酸，即距离不稳定修饰的位置-1或+1的位置处。在一些实施例中，反义链包括不稳定修饰的5'端和3'端中的每一个处的稳定修饰，即从距离不稳定修饰的位置-1和+1的位置。

在一些实施例中，反义链包括不稳定修饰的3'端处的至少两个稳定修饰，即距离不稳定修饰的位置+1或+2的位置处。

在一些实施例中，有义链包括至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)稳定修饰。不受限制地，有义链中的稳定修饰可以存在于任何位置处。在一些实施例中，有义链包括从5'端起的位置7、10和11处的稳定修饰。在一些其它实施例中，有义链包括从5'端起的位置7、9、10和11处的稳定修饰。在一些实施例中，有义链包括从反义链的5'端开始计数，与反义链的位置11、12和15相对或互补的位置处的稳定修饰。在一些其它实施例中，有义链包括从反义链的5'端开始计数，与反义链的位置11、12、13和15相对或互补的位置处的稳定修饰。在一些实施例中，有义链包括两个、三个或四个稳定修饰的嵌段。

在一些实施例中，有义链不包括与反义链中的双链体的热不稳定修饰相对或互补的位置中的稳定修饰。

示例性的热稳定修饰包含但不限于2'-氟修饰。其它热稳定修饰包含但不限于LNA。

在一些实施例中，本公开的dsRNA包括至少四个(例如，四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)2'-氟核苷酸。不受限制地，所有2'-氟核苷酸都可以存在于一条链中。在一些实施例中，有义链和反义链两者均包括至少两个2'-氟核苷酸。2'-氟修饰可以发生在有义链或反义链的任何核苷酸上。例如，2'-氟修饰可以发生在有义链或反义链上的每个核苷酸上；每个2'-氟修饰可以在有义链或反义链上以交替模式发生；或有义链或反义链两者包括交替模式的2'-氟修饰。有义链上的2'-氟修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，并且有义链上2'-氟修饰的交替模式可以相对于反义链上2'-氟修饰的交替模式具有偏移。

在一些实施例中，反义链包括至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)2'-氟核苷酸。不受限制地，反义链中的2'-氟修饰可以存在于任何位置处。在一些实施例中，反义包括从5'端起的位置2、6、8、9、14和16处的2'-氟核苷酸。在一些其它实施例中，反义包括从5'端起的位置2、6、14和16处的2'-氟核苷酸。在仍一些其它实施例中，反义包括从5'端起的位置2、14和16处的2'-氟核苷酸。

在一些实施例中，反义链包括与不稳定修饰相邻的至少一个2'-氟核苷酸。例如，2'-氟核苷酸可以是不稳定修饰的5'端或3'端处的核苷酸，即距离不稳定修饰的位置-1或+1的位置处。在一些实施例中，反义链包括不稳定修饰的5'端和3'端中的每一个处的2'-氟核苷酸，即从距离不稳定修饰的位置-1和+1的位置。

在一些实施例中，反义链包括不稳定修饰的3'端处的至少两个2'-氟核苷酸，即距离不稳定修饰的位置+1或+2的位置处。

在一些实施例中，有义链包括至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)2'-氟核苷酸。不受限制地，有义链中的2'-氟修饰可以存在于任何位置处。在一些实施例中，反义包括从5'端起的位置7、10和11处的2'-氟核苷酸。在一些其它实施例中，有义链包括从5'端起的位置7、9、10和11处的2'-氟核苷酸。在一些实施例中，有义链包括从反义链的5'端开始计数，与反义链的位置11、12和15相对或互补的位置处的2'-氟核苷酸。在一些其它实施例中，有义链包括从反义链的5'端开始计数，与反义链的位置11、12、13和15相对或互补的位置处的2'-氟核苷酸。在一些实施例中，有义链包括两个、三个或四个2'-氟核苷酸的嵌段。

在一些实施例中，有义链不包括与反义链中的双链体的热不稳定修饰相对或互补的位置中的2'-氟核苷酸。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子包括21个核苷酸(nt)的有义链和23个核苷酸(nt)的反义链，其中所述反义链包括至少一个热不稳定核苷酸，其中所述至少一个热不稳定核苷酸出现在反义链的种子区(即反义链的5'端的位置2至9处)，其中所述dsRNA的一端是平端，而另一端包括2nt突出端，并且其中所述dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)所述反义包括2个、3个、4个、5个或6个2'-氟修饰；(ii)所述反义包括1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)所述有义链与配体缀合；(iv)所述有义链包括2个、3个、4个或5个2'-氟修饰；(v)所述有义链包括1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)所述dsRNA包括至少四个2'-氟修饰；以及(vii)所述dsRNA包括所述反义链的5'端处的平端。在另一个实施例中，两个核苷酸的突出端位于反义的3'端处。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子包括有义链和反义链，其中：所述有义链的长度为25个至30个核苷酸残基，其中从所述有义链的5'末端核苷酸(位置1)位置1开始至位置23，包括至少8个核糖核苷酸；反义链的长度为36个至66个核苷酸残基，并且从3'末端核苷酸开始，在与有义链的位置1至23配对以形成双链体的位置中的至少8个核糖核苷酸；其中至少反义链的3'末端核苷酸与有义链不配对，并且至多6个连续3'末端核苷酸与有义链不配对，由此形成1个至6个核苷酸的3'单链突出端；其中反义链的5'末端包括10个至30个与有义链不配对的连续核苷酸，由此形成10个至30个核苷酸单链5'突出端；其中当有义链和反义链比对以获得最大互补性时，至少有义链5'末端和3'末端核苷酸与反义链的核苷酸碱基配对，由此在有义链与反义链之间形成基本上双链的区域；并且反义链沿着反义链长度的至少19个核糖核苷酸与靶RNA充分互补，以在将所述双链核酸引入哺乳动物细胞时减少靶基因表达；并且其中所述反义链含有至少一个热不稳定核苷酸，其中至少一个热不稳定核苷酸在所述反义链的种子区(即在所述反义链的5'端的位置2至9处)中。例如，热不稳定核苷酸出现在与有义链的5'端的位置14至17相对或互补的位置之间，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)所述反义包括2个、3个、4个、5个或6个2'-氟修饰；(ii)所述反义包括1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)所述有义链与配体缀合；(iv)所述有义链包括2个、3个、4个或5个2'-氟修饰；(v)所述有义链包括1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；以及(vi)所述dsRNA包括至少四个2'-氟修饰；以及(vii)所述dsRNA包括长度为12个至30个核苷酸对的双链体区。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子包括有义链和反义链，其中所述dsRNA分子包括长度为至少25个且最多29个核苷酸的有义链以及长度为最多30个核苷酸的反义链，其中所述有义链包括在从5'端起的位置11处易受酶降解的经修饰的核苷酸，其中所述有义链的3'端和所述反义链的5'端形成平端，并且所述反义链在其3'端处比所述有义链长1个至4个核苷酸，其中长度为至少25个核苷酸的双链体区和所述反义链与靶mRNA沿着所述反义链长度的至少19个核苷酸充分互补以在将所述dsRNA分子引入哺乳动物细胞时降低靶基因表达，并且其中所述dsRNA的dicer切割产生包括所述反义链的所述3'端的siRNA，由此减少所述哺乳动物的所述靶基因的表达，其中所述反义链含有至少一个热不稳定核苷酸，其中所述至少一个热不稳定核苷酸在所述反义链的种子区(即在所述反义链的5'端的位置2至9处)中，并且其中所述dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)所述反义包括2个、3个、4个、5个或6个2'-氟修饰；(ii)所述反义包括1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)所述有义链与配体缀合；(iv)所述有义链包括2个、3个、4个或5个2'-氟修饰；(v)所述有义链包括1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；以及(vi)所述dsRNA包括至少四个2'-氟修饰；以及(vii)所述dsRNA具有长度为12个至29个核苷酸对的双链体区。

在一些实施例中，dsRNA分子的有义链和反义链中的每个核苷酸都可以是经修饰的。每个核苷酸可以用相同或不同的修饰进行修饰，所述修饰可以包含一个或两个非连接磷酸酯氧或一个或多个连接磷酸酯氧的一种或多种改变；核糖的成分的改变，例如，核糖上的2′羟基的改变；用“去磷酸”接头大规模取代磷酸酯部分；天然存在的碱基的修饰或替换；以及核糖-磷酸酯主链的替换或修饰。

由于核酸是亚基的聚合物，许多修饰发生在核酸内重复的位置，例如碱基或磷酸酯部分的修饰，或磷酸酯部分的非连接O。在一些情况下，修饰将发生在核酸中的所有主体位置，但在许多情况下不会。例如，修饰可以仅发生在3'或5'末端位置处，可以仅发生于末端区域中，例如，在末端核苷酸上的位置处或在链的最后2个、3个、4个、5个或10个核苷酸中。修饰可以发生在双链区、单链区或两者中。修饰可以只发生在RNA的双链区中，或可以只发生于RNA的单链区中。例如，非连接O位置处的硫代磷酸酯修饰可以仅发生在一个或两个末端处，可以仅发生于末端区中，例如，在末端核苷酸上的位置处或在链的最后2个、3个、4个、5个或10个核苷酸中，或可以发生在双链和单链区中，特别是在末端处。一个或多个5'端可以被磷酸化。

例如，为增强稳定性，可以在突出端中包含特定的碱基，或在单链突出端中，例如在5'或3'突出端中或在两者中包含经修饰的核苷酸或核苷酸替代物。例如，在突出端中包含嘌呤核苷酸可以是期望的。在一些实施例中，3'或5'突出端中的所有或一些碱基可以被修饰，例如，通过本文所描述的修饰。修饰可以包含，例如使用本领域已知的修饰在核糖糖的2'位置处的修饰，例如，用脱氧核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-氟(2'-F)或2'-O-甲基修饰代替核碱基的核糖，以及磷酸酯基团的修饰，例如硫代磷酸酯修饰。突出端不需要与靶序列同源。

在一些实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地用LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-脱氧或2'-氟修饰。链可以含有多于一种修饰。在一些实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地用2'-O-甲基或2'-氟修饰。应理解，这些修饰是对反义链中存在的双链体的至少一个热不稳定修饰的补充。

在有义链和反义链上通常存在至少两种不同的修饰。这两种修饰可以是2'-脱氧、2'-O-甲基或2'-氟修饰、无环核苷酸或其它修饰。在一些实施例中，有义链和反义链各自包括选自2'-O-甲基或2'-脱氧的两种不同修饰的核苷酸。在一些实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地用2'-O-甲基核苷酸、2'-O-脱氧核苷酸、2'-脱氧-2'-氟核苷酸、2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA、2'O-CH

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子包括交替模式的修饰。如本文所使用的，术语“交替基序”或“交替模式”是指具有一个或多个修饰的基序，每个修饰发生在一条链的交替核苷酸上。交替核苷酸可以指每隔一个核苷酸一个或每三个核苷酸一个，或类似的模式。例如，如果A、B和C各自表示核苷酸的一种修饰类型，则交替基序可以是“ABABABABABAB…”、“AABBAABBAABB…”、“AABAABAABAAB…”、“AAABAAABAAAB…”、“AAABBBAAABBB…”或“ABCABCABCABC…”等。

包含在交替基序中的修饰的类型可以是相同的或不同的。例如，如果A、B、C、D各自表示核苷酸上的一种修饰类型，则交替模式，即每隔一个核苷酸上的修饰可以是相同的，但每个有义链或反义链可以选自交替基序内的若干种修饰可能性，如“ABABAB…”、“ACACAC…”、“BDBDBD…”或“CDCDCD…”等。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子包括相对于反义链上的交替基序的修饰模式，有义链上交替基序的修饰模式发生了偏移。所述偏移可以使得有义链的核苷酸的经修饰的基团对应于反义链的核苷酸的不同经修饰的基团，并且反之亦然。例如，当有义链与dsRNA双链体中的反义链配对时，有义链中的交替基序可以从链的5'到3'以“ABABAB”开始，并且反义链中的交替基序可以在双链体区内从链的3'到5'以“BABABA”开始。作为另一个实例，有义链中的交替基序可以从链的5'到3'以“AABBAABB”开始，并且反义链中的交替基序在双链体区内可以从链的3'到5'以“BBAABBAA”开始，因此在有义链与反义链之间存在修饰模式的完全或部分转移。

在一个特定实例中，有义链中的交替基序是从链的5'到3'的“ABABAB”，其中每个A是未经修饰的核糖核苷酸，并且每个B是2'-O甲基修饰的核苷酸。

在一个特定实例中，有义链中的交替基序是从链的5'到3'的“ABABAB”，其中每个A是2'-脱氧-2'-氟修饰的核糖核苷酸，并且每个B是2'-O甲基修饰的核苷酸。

在另一个特定实例中，反义链中的交替基序是从链的3'到5'的“BABABA”，其中每个A是2'-脱氧-2'-氟修饰的核糖核苷酸，并且每个B是2'-O甲基修饰的核苷酸。

在一个特定实例中，有义链中的交替基序是从链的5'到3'的“ABABAB”，并且反义链中交替基序是从链的3'到5'的“BABABA”，其中每个A是未经修饰的核糖核苷酸，并且每个B是2'-O甲基修饰的核苷酸。

在一个特定实例中，有义链中的交替基序是从链的5'到3'的“ABABAB”，并且反义链中交替基序是从链的3'到5'的“BABABA”，其中每个A是2'-脱氧-2'-氟修饰的核糖核苷酸，并且每个B是2'-O甲基修饰的核苷酸。

本公开的dsRNA分子可以进一步包括至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰可以发生在链的任何位置中的有义链或反义链或两条链的任何核苷酸上。例如，核苷酸间键修饰可以发生在有义链或反义链上的每个核苷酸上；每个核苷酸间键修饰可以在有义链或反义链上以交替模式发生；或有义链或反义链以交替模式包括两种核苷酸间键修饰。有义链上的核苷酸间键修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，并且有义链上核苷酸间键修饰的交替模式可以相对于反义链上核苷酸间键修饰的交替模式具有偏移。

在一些实施例中，dsRNA分子包括突出端区中的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，突出端区包括两个核苷酸，所述两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。还可以进行核苷酸间键修饰，以将突出端核苷酸与双链体区内的末端配对核苷酸连接。例如，至少2个、3个、4个或所有突出端核苷酸可以通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键连接，并且任选地，可以存在另外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键，将突出端核苷酸与紧挨着突出端核苷酸的配对核苷酸连接。例如，在末端三个核苷酸之间可能存在至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，并且第三个是与突出端核苷酸相邻的配对核苷酸。在一个实施例中，这些末端三个核苷酸可以位于反义链的3'端处。

在一些实施例中，dsRNA分子的有义链包括由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个磷酸酯核苷酸间键分离的两个至十个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的1个至10个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述有义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的反义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。

在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个磷酸酯核苷酸间键分离的两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。

在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个磷酸酯核苷酸间键分离的三个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。

在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或14个磷酸酯核苷酸间键分离的四个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。

在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个磷酸酯核苷酸间键分离的五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。

在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个磷酸酯核苷酸间键分离的六个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。

在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个磷酸酯核苷酸间键分离的七个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。

在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括由1个、2个、3个、4个、5个或6个磷酸酯核苷酸间键分离的八个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。

在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括由1个、2个、3个或4个磷酸酯核苷酸间键分离的九个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义或反义链的末端位置的1个至10个核苷酸内的一个或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸可以通过有义或反义链的一端或两端处的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键连接。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括每个有义或反义链的双链体的内部区域的1个至10个核苷酸内的一个或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸可以通过从有义链的5'端开始计数的双链体区的位置8至16处的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键连接；dsRNA分子可以任选地进一步包括末端位置1至10内的一个或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的一个至五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个至两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的一个至五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个至五个(从5'端开始计数)。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1或2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及反义链的位置1和2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置20和21处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21处的一个(从5'端开始计数)。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置20和21处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21和22处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21盒22处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置22和23处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及反义链的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子进一步包括有义链的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)，以及位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置23和23处反义链的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端开始计数)。

在一些实施例中，本公开的化合物包括主链手性中心的模式。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少5个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少6个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少7个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少8个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少9个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少10个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少11个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少12个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少13个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少14个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少15个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少16个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少17个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少18个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少19个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Rp构型的不超过8个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Rp构型的不超过7个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Rp构型的不超过6个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Rp构型的不超过5个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Rp构型的不超过4个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Rp构型的不超过3个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Rp构型的不超过2个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Rp构型的不超过1个核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括不超过8个非手性的核苷酸间键(作为非限制性实例，磷酸二酯)。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括不超过7个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括不超过6个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括不超过5个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括不超过4个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括不超过3个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括不超过2个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括不超过1个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少10个核苷酸间键和不超过8个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少11个核苷酸间键和不超过7个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少12个核苷酸间键和不超过6个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少13个核苷酸间键和不超过6个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少14个核苷酸间键和不超过5个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，主链手性中心的常见模式包括呈Sp构型的至少15个核苷酸间键和不超过4个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，呈Sp构型的核苷酸间键任选地是连续的或不连续的。在一些实施例中，呈Rp构型的核苷酸间键任选地是连续的或不连续的。在一些实施例中，非手性的核苷酸间键任选地是连续的或不连续的。

在一些实施例中，本公开的化合物包括为立体化学嵌段的嵌段。在一些实施例中，嵌段是Rp嵌段，因为所述嵌段的每个核苷酸间键是Rp。在一些实施例中，5'-嵌段是Rp嵌段。在一些实施例中，3'-嵌段是Rp嵌段。在一些实施例中，嵌段是Sp嵌段，因为所述嵌段的每个核苷酸间键是Sp。在一些实施例中，5'-嵌段是Sp嵌段。在一些实施例中，3'-嵌段是Sp嵌段。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包括Rp和Sp嵌段两者。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包括一个或多个Rp嵌段但不包括Sp嵌段。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包括一个或多个Sp嵌段但不包括Rp嵌段。在一些实施例中，所提供的寡核苷酸包括一个或多个天然磷酸酯键(PO)嵌段，其中天然磷酸酯键中的每个核苷酸间键。

在一些实施例中，本公开的化合物包括为Sp嵌段的5'-嵌段，其中每个糖部分包括2'-F修饰。在一些实施例中，5'-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键是经修饰的核苷酸间键，并且每个糖部分包括2'-F修饰。在一些实施例中，5'-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键，并且每个糖部分包括2'-F修饰。在一些实施例中，5'-嵌段包括4个或更多个核苷单元。在一些实施例中，5'-嵌段包括5个或更多个核苷单元。在一些实施例中，5'-嵌段包括6个或更多个核苷单元。在一些实施例中，5'-嵌段包括7个或更多个核苷单元。在一些实施例中，3'-嵌段是Sp嵌段，其中每个糖部分包括2'-F修饰。在一些实施例中，3'-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键是经修饰的核苷酸间键，并且每个糖部分包括2'-F修饰。在一些实施例中，3'-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键，并且每个糖部分包括2'-F修饰。在一些实施例中，3'-嵌段包括4个或更多个核苷单元。在一些实施例中，3'-嵌段包括5个或更多个核苷单元。在一些实施例中，3'-嵌段包括6个或更多个核苷单元。在一些实施例中，3'-嵌段包括7个或更多个核苷单元。

在一些实施例中，本公开的化合物在一个区域中包括一种类型的核苷，或寡核苷酸之后是特定类型的核苷酸间键，例如天然磷酸酯键、经修饰的核苷酸间键、Rp手性核苷酸间键、Sp手性核苷酸间键等。在一些实施例中，A之后是Sp。在一些实施例中，A之后是Rp。在一些实施例中，A之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施例中，U之后是Sp。在一些实施例中，U之后是Rp。在一些实施例中，U之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施例中，C之后是Sp。在一些实施例中，C之后是Rp。在一些实施例中，C之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施例中，G之后是Sp。在一些实施例中，G之后是Rp。在一些实施例中，G之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施例中，C和U之后是Sp。在一些实施例中，C和U之后是Rp。在一些实施例中，C和U之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施例中，A和G之后是Sp。在一些实施例中，A和G之后是Rp。

在一些实施例中，反义链包括核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区(即反义链的5'端的位置2至9处)中的双链体的至少一个热不稳定修饰，并且其中所述dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)所述反义包括2个、3个、4个、5个或6个2'-氟修饰；(ii)所述反义包括3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)所述有义链与配体缀合；(iv)所述有义链包括2个、3个、4个或5个2'-氟修饰；(v)所述有义链包括1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)所述dsRNA包括至少四个2'-氟修饰；(vii)所述dsRNA包括长度为12个至40个核苷酸对的双链体区；以及(viii)所述dsRNA具有在所述反义链的5'端处的平端。

在一些实施例中，反义链包括核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区(即，反义链的5'端的位置2至9处)中的双链体的至少一个热不稳定修饰，并且其中所述dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)所述反义包括2个、3个、4个、5个或6个2'-氟修饰；(ii)所述有义链与配体缀合；(iii)所述有义链包括2个、3个、4个或5个2'-氟修饰；(iv)所述有义链包括1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(v)所述dsRNA包括至少四个2'-氟修饰；(vi)所述dsRNA包括长度为12个至40个核苷酸对的双链体区；(vii)所述dsRNA包括长度为12个至40个核苷酸对的双链体区；以及(viii)所述dsRNA具有在所述反义链的5'端处的平端。

在一些实施例中，有义链包括核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区(即反义链的5'端的位置2至9处)中的双链体的至少一个热不稳定修饰，并且其中所述dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)所述反义包括2个、3个、4个、5个或6个2'-氟修饰；(ii)所述反义包括1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)所述有义链与配体缀合；(iv)所述有义链包括2个、3个、4个或5个2'-氟修饰；(v)所述有义链包括3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)所述dsRNA包括至少四个2'-氟修饰；(vii)所述dsRNA包括长度为12个至40个核苷酸对的双链体区；以及(viii)所述dsRNA具有在所述反义链的5'端处的平端。

在一些实施例中，有义链包括核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，反义链包括核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区(即反义链的5'端的位置2至9处)中的双链体的至少一个热不稳定修饰，并且其中所述dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)所述反义包括2个、3个、4个、5个或6个2'-氟修饰；(ii)所述有义链与配体缀合；(iii)所述有义链包括2个、3个、4个或5个2'-氟修饰；(iv)所述有义链包括3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(v)所述dsRNA包括至少四个2'-氟修饰；(vi)所述dsRNA包括长度为12个至40个核苷酸对的双链体区；以及(vii)所述dsRNA具有在所述反义链的5'端处的平端。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子包括与靶标、在双链体内或其组合的错配。所述错配可以发生在突出端区或双链体区中。碱基对可以基于其促进解离或熔化的倾向进行排序(例如，根据特定配对的缔合或离解的自由能，最简单的方法是在单个配对的基础上检查配对，尽管也可以使用下一个临近点或类似分析)。在促进解离方面：A:U优于G:C；G:U优于G:C；并且I:C优于G:C(I＝肌苷)。错配，例如非规范或规范外配对(如本文其它地方所述)优于规范(A:T、A:U、G:C)配对；并且包含通用碱基的配对优于规范配对。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子在从反义链的5'端开始的双链体区内包括前1个、2个、3个、4个或5个碱基对中的至少一个，所述双链体区可以独立地选自以下的组：A：U、G:U、I:C和错配对，例如非规范或规范外配对或包含通用碱基的配对，以促进双链体的5'端处反义链的解离。

在一些实施例中，反义链中从5'端开始的双链体区内1位置处的核苷酸选自由以下组成的组：A、dA、dU、U和dT。可替代地，从反义链的5'端开始的双链体区内的前1个、2个或3个碱基对中的至少一个是AU碱基对。例如，从反义链5'端起的双链体区内的第一个碱基对是AU碱基对。

发现了在单链或双链寡核苷酸的任何位置，将4'-修饰的或5'-修饰的核苷酸引入核苷酸的磷酸二酯(PO)、硫代磷酸酯(PS)或二硫代磷酸酯(PS2)键的3'端可以对核苷酸间键施加空间效应，并且从而保护或稳定其免受核酸酶的作用。

在一些实施例中，在单链或双链siRNA的任何位置处的二核苷酸的3'端处引入5'-修饰的核苷酸。例如，可以在单链或双链siRNA的任何位置处的二核苷酸的3'端处引入5'-烷基化核苷酸。核糖糖的5'位置处的烷基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。示例性5'-烷基化核苷酸是5'-甲基核苷酸。5'-甲基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。

在一些实施例中，在单链或双链siRNA的任何位置处的二核苷酸的3'端处引入4'-修饰的核苷酸。例如，可以在单链或双链siRNA的任何位置处的二核苷酸的3'端处引入4'-烷基化核苷酸。核糖糖的4'位置处的烷基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。示例性4'-烷基化核苷酸是4'-甲基核苷酸。4'-甲基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。可替代地，可以在单链或双链siRNA的任何位置处的二核苷酸的3'端处引入4'-O-烷基化核苷酸。核糖糖的4'-O-烷基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。示例性4'-O-烷基化核苷酸是4'-O-甲基核苷酸。4'-O-甲基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。

在一些实施例中，在dsRNA的有义链或反义链上的任何位置处引入5'-烷基化核苷酸，并且此类修饰维持或提高dsRNA的效力。5'-烷基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。示例性5'-烷基化核苷酸是5'-甲基核苷酸。5'-甲基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。

在一些实施例中，在dsRNA的有义链或反义链上的任何位置处引入4'-烷基化核苷酸，并且此类修饰维持或提高dsRNA的效力。4'-烷基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。示例性4'-烷基化核苷酸是4'-甲基核苷酸。4'-甲基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。

在一些实施例中，在dsRNA的有义链或反义链上的任何位置处引入4'-O-烷基化核苷酸，并且此类修饰维持或提高dsRNA的效力。5'-烷基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。示例性4'-O-烷基化核苷酸是4'-O-甲基核苷酸。4'-O-甲基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。

在一些实施例中，本公开的dsRNA分子可以包括2'-5'键(具有2'-H、2'-OH和2'-OMe，并且具有P＝O或P＝S)。例如，2'-5'键修饰可以用于促进核酸酶抗性或抑制有义链与反义链的结合，或可以用于有义链的5'端以避免有义链被RISC激活。

在另一个实施例中，本公开的dsRNA分子可以包括L糖(例如，具有2'-H、2'-OH和2'-OMe的L核糖、L-阿拉伯糖)。例如，这些L糖修饰可以用于促进核酸酶抗性或抑制有义链与反义链的结合，或可以用于有义链的5'端以避免有义链被RISC激活。

各种出版物描述了多聚体siRNA，其都可以与本公开的dsRNA一起使用。此类出版物包含WO2007/091269、US 7858769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887和WO2011/031520，所述出版物特此通过全文引用的方式并入。

如下文更详细描述的，含有一个或多个碳水化合物部分与RNAi药剂的缀合的RNAi药剂可以优化RNAi药剂的一个或多个特性。在许多情况下，碳水化合物部分将与RNAi药剂的经修饰的亚基连接。例如，dsRNA药剂的一个或多个核糖核苷酸亚基的核糖糖可以被另一个部分替代，例如，与碳水化合物配体连接的非碳水化合物(如，环)载体。其中亚基的核糖糖已经被如此替代的核糖核苷酸亚基在本文中被称为核糖替代修饰亚基(RRMS)。环状载体可以是碳环系统，即所有环原子都是碳原子，或杂环系统，即一个或多个环原子可以是杂原子，例如氮、氧、硫。环状载体可以是单环系统，或可以含有两个或多个环，例如稠环。环状载体可以是完全饱和的环系统，或其可以含有一个或多个双键。

配体可以通过载体与多核苷酸连接。载体包含(i)至少一个“主链连接点”，如两个“骨干连接点”以及(ii)至少一个“系链连接点”。如本文所使用的，“主链连接点”是指官能团，例如羟基，或通常是可用于并适合将载体结合到主链中的键，例如核糖核酸的磷酸酯或经修饰的磷酸酯(例如，含硫)骨架。在一些实施例中，“系链连接点”(TAP)是指连接所选部分的环状载体的组成环原子，例如碳原子或杂原子(不同于提供主链连接点的原子)。所述部分可以是例如碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖和多糖。任选地，所选择的部分通过中间系链与环状载体连接。因此，环状载体将通常包含官能团，例如氨基，或通常提供适合于另一个化学实体(例如，组成环的配体)的结合或系留的键。

RNAi药剂可以通过载体与配体缀合，其中载体可以是环状基团或无环基团。例如，环状基团可以选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑啉基、异噻唑啉基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基和十氢萘基。无环基团选自，例如，丝氨醇主链或二乙醇胺主链。

在某些特定实施例中，用于本公开的方法中的RNAi药剂是选自表2至表3中的任一个所列出的药剂的组的药剂。这些药剂可以进一步包括配体，如一个或多个亲脂性部分、一个或多个GalNAc衍生物，或一个或多个亲脂性部分和一个或多个GalNAc衍生物两者。

IV.与配体缀合的iRNA

本发明的iRNA的RNA的另一种修饰涉及将一种或多种配体、部分或缀合物与iRNA化学连接，所述一种或多种配体、部分或缀合物增强iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取(例如，进入细胞)。此类部分包含但不限于脂质部分，如胆固醇部分(Letsinger等人,《美国国家科学院院刊》,1989,86:6553-6556)，胆酸(Manoharan等人,《生物有机与药物化学快报(Biorg.Med.Chem.Let.)》,1994,4:1053-1060)，硫醚，例如，绿柱石-S-三苯基甲硫醇(Manoharan等人,《纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)》,1992,660:306-309；Manoharan等人,《生物有机与药物化学》快报》,1993,3:2765-2770)，硫代胆固醇(Oberhauser等人,《核酸研究》,1992,20:533-538)，脂肪族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人,《欧洲分子生物学组织杂志》,1991,10:1111-1118；Kabanov等人,《FEBS快报(FEBS Lett.)》,1990,259:327-330；Svinarchuk等人,《生物化学(Biochimie)》,1993,75:49-54)，磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-膦酸酯(Manoharan等人,《四面体快报(Tetrahedron Lett.)》,1995,36:3651-3654；Shea等人,《核酸研究》,1990,18:3777-3783)，磷脂、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,《核苷与核苷酸(Nucleosides&Nucleotides)》,1995,14:969-973)或金刚烷乙酸(Manoharan等人,《四面体快报》,1995,36:3651-3654)，棕榈基部分(Mishra等人,《生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)》,1995,1264:229-237)，或十八胺或己基氨基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke等人,《药理和实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)》,1996,277:923-937)。

在某些实施例中，配体改变其掺入的iRNA药剂的分布、靶向或寿命。在一些实施例中，例如，与不存在此类配体的物种相比，配体为选定靶标(例如，分子、细胞或细胞类型)、区室(例如，细胞或器官区室、组织、器官或身体区)提供增强的亲和力。典型的配体将不参与双链体核酸中的双链体配对。

配体可以包含天然存在的物质，如蛋白质(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，右旋糖酐、支链淀粉、几丁质、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组分子或合成分子，如合成聚合物，例如合成聚氨基酸。聚氨基酸的实例包含聚氨基酸，即聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚膦嗪。多胺的实例包含：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、多胺、假肽-多胺、拟肽多胺、树枝状多胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、多胺的季盐或α螺旋肽。

配体还可以包含靶向基团，例如细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如与特定细胞类型(如肾细胞)结合的抗体。靶向基团可以是促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性剂蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化多氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸酯、聚谷氨酸酯、聚天冬氨酸酯、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、生物素或RGD肽或RGD肽模拟物。在某些实施例中，配体是多价半乳糖，例如，N-乙酰基-半乳糖胺。

配体的其它实例包含染料、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂烯、丝裂霉素C(mitomycin C))、卟啉(TPPC4、德克萨斯卟啉(texaphyrin)、扩环卟啉(Sapphyrin))、多环芳香族烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如，EDTA)、亲脂性分子(例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、肽缀合物(例如，触角足突变肽、Tat肽)、烷化剂、磷酸盐、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]

配体可以是蛋白质(例如，糖蛋白)或肽(例如，对共配体具有特异性亲和力的分子)或抗体(例如，与特定细胞类型，如癌细胞、内皮细胞或骨细胞结合的抗体)。配体还可以包含激素和激素受体。配体还可以包含非肽物质，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖或多价岩藻糖。配体可以是例如脂多糖、p38 MAP激酶的激活剂或NF-κB的激活剂。

配体可以是物质，例如药物，其可以例如通过破坏细胞的细胞骨架，例如通过破坏细胞的微管、微丝或中间丝来增加iRNA药剂摄取到细胞中。药物可以是例如分类单元(taxon)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、细胞松弛素(cytochalasin)、诺考达唑(nocodazole)、杰斯内酯(japlakinolide)、拉春库林A(latrunculin A)、毒伞素(phalloidin)、斯文赫利A(swinholide A)、印丹诺辛(indanocine)或麦司文(myoservin)。

在一些实施例中，与如本文所描述的iRNA连接的配体充当药代动力学调节剂(PK调节剂)。PK调节剂包含亲脂性物质、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包含但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、维生素E、生物素。还已知包括许多硫代磷酸酯键的与血清蛋白结合的寡核苷酸，因此在主链中包括多个硫代磷酸酯键的短寡核苷酸(例如，具有约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸)也适于本发明作为配体(例如，作为PK调节配体)。另外，与血清组分(例如，血清蛋白)结合的适体也适于用作本文所述的实施例中的PK调节配体。

本发明的配体缀合的iRNA可以通过使用具有侧反应功能的寡核苷酸来合成，如源自连接分子连接到寡核苷酸上的寡核苷酸(如下文所描述的)。这种反应性寡核苷酸可以直接与可商购获得的配体、合成的带有多种保护基团中的任一种的配体、或具有与其连接的连接部分的配体反应。

本发明的缀合物中使用的寡核苷酸可以通过众所周知的固相合成技术方便且常规地制备。用于此类合成的设备由若干个供应商销售，例如，包含Applied

在本发明的配体缀合的寡核苷酸和带有序列特异性连接的核苷的配体分子中，寡核苷酸和寡核苷可以利用标准核苷酸或核苷前体或已经带有连接部分的核苷酸或核苷缀合物前体、已经带有配体分子的配体-核苷酸或核苷缀合物前体或带有构建块的非核苷配体组装在合适的DNA合成器上。

当使用已经带有连接部分的核苷酸缀合物前体时，通常完成序列特异性连接核苷的合成，并且然后配体分子与连接部分反应以形成配体缀合的寡核苷酸。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸或连接的核苷通过自动合成器合成，使用源自配体-核苷缀合物的磷脒以及可商购获得的和常规用于寡核苷酸合成的标准磷脒和非标准磷酰胺。

A.脂质缀合物

在某些实施例中，配体或缀合物是脂质或基于脂质的分子。此类脂质或基于脂质的分子通常可以与血清蛋白，如人血清白蛋白(HSA)结合。HSA结合配体允许缀合物分布到靶组织，例如身体的非肾靶组织。例如，靶组织可以是肝，包含肝的实质细胞。可以与HSA结合的其它分子也可以用作配体。例如，可以使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加对缀合物降解的抗性，(b)增加靶向或转运到靶细胞或细胞膜中，或(c)可以用于调节与血清蛋白，例如HSA的结合HSA。

基于脂质的配体可以用于调节，例如控制(例如，抑制)缀合物与靶组织的结合。例如，更强地与HSA结合的脂质或基于脂质的配体将较不可能被靶向到肾脏，并且因此较不可能从身体清除。较不强烈地与HSA结合的脂质或基于脂质的配体可以用于将缀合物靶向到肾脏。

在某些实施例中，基于脂质的配体与HSA结合。例如，配体可以以足够的亲和力与HSA结合，从而增强缀合物在非肾组织中的分布。然而，亲和力通常不会强到HSA配体结合不能被逆转。

在某些实施例中，基于脂质的配体与HSA微弱地结合或根本不结合，使得缀合物在肾脏中的分布增强。靶向到肾细胞的其它部分也可以代替基于脂质的配体或除其之外使用。

另一方面，配体是被靶细胞(例如，增殖细胞)摄取的部分，例如维生素。这些对于治疗以不期望的细胞增殖为特征的疾病特别有用，例如恶性或非恶性类型的疾病，例如癌细胞。示例性维生素包含维生素A、E和K。包含的其它示例性维生素是B族维生素，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或被癌细胞摄取的其它维生素或营养素。还包含HSA和低密度脂蛋白(LDL)。

B.细胞渗透剂

另一方面，配体是细胞渗透剂，如螺旋细胞渗透剂。在某些实施例中，药剂为两亲性的。示例性药剂为肽，如tat或触角足突变肽。如果药剂为肽，那么其可以被修饰，包含肽基模拟物、反演体、非肽或假肽键和使用D-氨基酸。螺旋剂通常是α-螺旋剂，并且可以具有亲脂性和疏脂性相。

配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称为寡肽模拟物)是能够折叠成类似于天然肽的所定义三维结构的分子。肽和肽模拟物与iRNA药剂的连接可能影响iRNA的药代动力学分布，如通过增强细胞识别和吸收。肽或肽模拟物部分的长度可以为约5个至50个氨基酸，例如约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个氨基酸长。

肽或肽模拟物可以是例如细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽或疏水肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状体肽、约束肽或交联肽。在另一个替代方案中，肽部分可以包含疏水性膜易位序列(MTS)。示例性疏水性含MTS肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:9)的RFGF。含疏水性MTS的RFGF类似物(例如，氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO:10))也可以是靶向部分。肽部分可以是“递送”肽，所述肽可以携带包含肽、寡核苷酸和蛋白质在内的大极性分子穿过细胞膜。例如，来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:11))和果蝇触角足突变(Drosophila Antennapedia)蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:12))的序列已被发现能够起到递送肽的作用。肽或肽模拟物可以由DNA的随机序列编码，如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽(Lam等人,《自然》,354:82-84,1991)。通常，通过掺入的单体单元与dsRNA药剂连接的肽或肽模拟物的实例是细胞靶向肽，如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽或RGD模拟物。肽部分的长度可以在约5个氨基酸至约40个氨基酸的范围内。肽部分可以具有结构修饰，如增加稳定性或直接构象特性。可以使用下面描述的任何结构修饰。

用于本发明的组合物和方法的RGD肽可以是线性或环状的，并且可以被修饰，例如糖基化或甲基化，以促进靶向特定组织。含有RGD的肽和肽二聚体可以包含D-氨基酸以及合成的RGD模拟物。除了RGD，还可以使用靶向整合素配体的其它部分，如PECAM-1或VEGF。

RGD肽部分可以用于靶向特定细胞类型，例如肿瘤细胞，如内皮肿瘤细胞或乳腺癌肿瘤细胞(Zitzmann等人,《癌症研究(Cancer Res.)》,62:5139-43,2002)。RGD肽可以促进dsRNA药剂靶向多种其它组织的肿瘤，包含肺、肾、脾或肝的肿瘤(Aoki等人,《癌症基因疗法(Cancer Gene Therapy)》8:783-787,2001)。通常，RGD肽将促进iRNA药剂靶向肾。RGD肽可以是线性或环状的，并且可以被修饰，例如糖基化或甲基化，以促进靶向特定组织。例如，糖基化RGD肽可以将iRNA药剂递送到表达α

“细胞渗透肽”能够渗透细胞，例如微生物细胞(如细菌或真菌细胞)或哺乳动物细胞(如人细胞)。微生物细胞渗透肽可以是例如α-螺旋线性肽(例如，LL-37或Ceropin P1)、含二硫键的肽(例如，α-防御素、β-防御素或细菌素)或仅含有一个或两个主要氨基酸的肽(例如，PR-39或吲哚西丁(indolicidin))。细胞渗透肽还可以包含核定位信号(NLS)。例如，细胞渗透肽可以是二分两亲性肽，如MPG，其源自HIV-1gp41的融合肽结构域和SV40大T抗原的NLS(Simeoni等人,《核酸研究》31:2717-2724,2003)。

C.碳水化合物缀合物

在本发明的组合物和方法的一些实施例中，iRNA进一步包括碳水化合物。碳水化合物缀合的iRNA对于核酸的体内递送以及适于如本文所描述的体内治疗用途的组合物而言是有利的。如本文所使用的，“碳水化合物”是指化合物，所述化合物是碳水化合物，所述碳水化合物本身由一个或多个单糖单元构成，所述单糖单元具有至少6个碳原子(可以是直链、支链或环状)，其中氧、氮或硫原子与每个碳原子结合；或是具有碳水化合物部分作为其部分的化合物，所述碳水化合物部分由一个或多个单糖单元构成，每个单糖单元具有至少六个碳原子(可以是直链、支链或环状)，其中氧、氮或硫原子与每个碳原子结合。代表性碳水化合物包含糖(单糖、二糖、三糖和含有约4个、5个、6个、7个、8个或9个单糖单元的寡糖)和多糖如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。特定单糖包含C5及以上(例如，C5、C6、C7或C8)糖；二糖和三糖包含具有两个或三个单糖单元(例如，C5、C6、C7或C8)的糖。

在某些实施例中，碳水化合物缀合物包括单糖。

在某些实施例中，单糖是N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。包括一种或多种N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)衍生物的GalNAc缀合物在例如US 8,106,022中进行了描述，所述文献的完整内容特此通过引用的方式并入本文。在一些实施例中，GalNAc缀合物用作将iRNA靶向特定细胞的配体。在一些实施例中，GalNAc缀合物将iRNA靶向肝细胞，例如，通过充当肝细胞(例如，肝细胞(hepatocyte))的去唾液酸糖蛋白受体的配体。

在一些实施例中，碳水化合物缀合物包括一种或多种GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可以通过接头连接，例如，二价或三价支链接头。在一些实施例中，GalNAc缀合物与有义链的3'端缀合。在一些实施例中，GalNAc缀合物通过接头，例如本文所描述的接头与iRNA药剂缀合(例如，与有义链的3'端)。在一些实施例中，GalNAc缀合物与有义链的5'端缀合。在一些实施例中，GalNAc缀合物通过接头，例如本文所描述的接头与iRNA药剂缀合(例如，与有义链的5'端)。

在本发明的某些实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过单价接头与本发明的iRNA药剂连接。在一些实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过二价接头与本发明的iRNA药剂连接。在本发明的又其它实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过三价接头与本发明的iRNA药剂连接。在本发明的其它实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过四价接头与本发明的iRNA药剂连接。

在某些实施例中，本发明的双链RNAi药剂包括与iRNA药剂连接的一种GalNAc或GalNAc衍生物。在某些实施例中，本发明的双链RNAi药剂包括多个(例如，2个、3个、4个、5个或6个)GalNAc或GalNAc衍生物，每个所述衍生物通过多个单价接头独立地与双链RNAi药剂的多个核苷酸连接。

在一些实施例中，例如，当本发明的iRNA药剂的两条链是一个较大分子的一部分时，所述较大分子由一条链的3'端和相应的另一条链的5'端之间的不间断核苷酸链连接，形成包括多个未配对核苷酸的发夹环，发夹环内的每个未配对核苷酸可以独立地包括通过单价接头连接的GalNAc或GalNAc衍生物。发夹环也可以由双链体的一条链中的延伸突出端形成。

在一些实施例中，例如，当本发明的iRNA药剂的两条链是一个较大分子的一部分时，所述较大分子由一条链的3'端和相应的另一条链的5'端之间的不间断核苷酸链连接，形成包括多个未配对核苷酸的发夹环，发夹环内的每个未配对核苷酸可以独立地包括通过单价接头连接的GalNAc或GalNAc衍生物。发夹环也可以由双链体的一条链中的延伸突出端形成。

在一些实施例中，GalNAc缀合物是

在一些实施例中，RNAi药剂通过接头与碳水化合物缀合物连接，如以下示意图所示，其中X是O或S

在一些实施例中，RNAi药剂与如表1中定义的L96缀合，并且如下所示：

在某些实施例中，用于本发明的组合物和方法的碳水化合物缀合物选自由以下组成的组：

/>

/>

/>

/>

其中Y是O或S，并且n是3至6(式XXIV)；/>

其中Y是O或S，并且n是3至6(式XXV)；

其中X是O或S(式XXVII)；/>

/>

以及

/>

式XXXIV。

在某些实施例中，用于本发明的组合物和方法的碳水化合物缀合物是单糖。在某些实施例中，单糖是N-乙酰基半乳糖胺，如

用于本文所描述的实施例中的另一代表性碳水化合物缀合物包含但不限于：

(式XXXVI)，

当X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一个是氢。

在一些实施例中，合适的配体是WO 2019/055633中公开的配体，所述文献的全部内容通过引用并入本文。在一个实施例中，配体包括以下结构：

在某些实施例中，本公开的RNAi药剂可以包含GalNAc配体，即使此类GalNAc配体目前预计对于本公开的鞘内/CNS递送途径具有有限的价值。

在本发明的某些实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过单价接头与本发明的iRNA药剂连接。在一些实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过二价接头与本发明的iRNA药剂连接。在本发明的又其它实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过三价接头与本发明的iRNA药剂连接。在本发明的其它实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过四价接头与本发明的iRNA药剂连接。

在某些实施例中，本发明的双链RNAi药剂包括与iRNA药剂连接的一种GalNAc或GalNAc衍生物，例如，dsRNA药剂的有义链的5'端或如本文所描述的双靶向RNAi药剂的一个或两个有义链的5'端。在某些实施例中，本发明的双链RNAi药剂包括多个(例如，2个、3个、4个、5个或6个)GalNAc或GalNAc衍生物，每个所述衍生物通过多个单价接头独立地与双链RNAi药剂的多个核苷酸连接。

在一些实施例中，例如，当本发明的iRNA药剂的两条链是一个较大分子的一部分时，所述较大分子由一条链的3'端和相应的另一条链的5'端之间的不间断核苷酸链连接，形成包括多个未配对核苷酸的发夹环，发夹环内的每个未配对核苷酸可以独立地包括通过单价接头连接的GalNAc或GalNAc衍生物。

在一些实施例中，碳水化合物缀合物进一步包括一个或多个如上文所描述的另外的配体，如但不限于PK调节剂或细胞渗透肽。

适用于本发明的另外的碳水化合物缀合物和接头包含WO 2014/179620和WO2014/179627中所描述的那些，所述文献中的每一个的全部内容通过引用并入本文。

D.接头

在一些实施例中，本文所述的缀合物或配体可以通过各种接头与iRNA寡核苷酸连接，所述接头可以是可切割的或不可切割的。

术语“接头”或“连接基团”意指连接化合物两部分的有机部分，例如，共价连接化合物的两部分。接头通常包括直接键或原子，如氧或硫；单元，如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO

可切割连接基团是在细胞外部充分稳定的连接基团，但其在进入靶细胞之后切割以释放接头保持在一起的两个部分。在另一个实施例中，可切割连接基团在靶细胞中或在第一参考条件下(其可以例如被选择以模拟或代表细胞内条件)的切割是在受试者的血液中或在第二参考条件下(其可以例如被选择以模拟或代表在血液或血清中发现的条件)的切割速度的至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多，或至少约100倍。

可切割连接基团易受切割剂(例如pH、氧化还原电位或降解分子的存在)影响。一般来说，切割剂在细胞内部比在血清或血液中更普遍，或以更高的水平或活性找到。此类降解剂的实例包含：针对特定底物选择的或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括例如存在于细胞中的氧化或还原酶或还原剂，如硫醇，所述氧化或还原酶或还原剂可以通过还原降解氧化还原可切割连接基团；酯酶；可以产生酸性环境的核内体或药剂，例如，产生pH为五或更低的那些核内体或药剂；可以通过充当广义酸、肽酶(其可以是底物特异性的)和磷酸酶来水解或降解酸可切割连接基团的酶。

可切割键基团，如二硫键可能对pH敏感。人血清的pH为7.4，而细胞内pH的平均值略低，范围为约7.1-7.3。核内体具有更酸性的pH，范围为5.5-6.0，并且溶酶体具有甚至更酸性的pH，为约5.0。一些接头将具有可切割连接基团，所述连接基团在所选pH下切割，由此从细胞内的配体释放阳离子脂质，或释放到细胞的期望的区室中。

接头可以包含可由特定酶切割的可切割连接基团。并入到接头中的可切割连接基团的类型可以取决于所靶向的细胞。例如，肝脏靶向配体可以通过包含酯基的接头与阳离子脂质连接。肝细胞富含酯酶，并且因此接头在肝细胞中将比在非富含酯酶的细胞类型中更高效地切割。其它富含酯酶的细胞类型包含肺、肾皮质和睾丸中的细胞。

当靶向富含肽酶的细胞类型，如肝细胞和滑膜细胞时，可以使用含有肽键的接头。

一般来说，可以通过测试降解剂(或条件)切割候选连接基团的能力来评价候选可切割连接基团的适合性。还将期望测试候选可切割连接基团抵抗在血液中或当与其它非靶组织接触时切割的能力。因此，可以确定第一条件与第二条件之间对切割的相对易感性，其中选择第一条件以指示靶细胞中的切割，并且选择第二条件以指示其它组织或生物流体，例如血液或血清中的切割。评价可以在无细胞系统、在细胞、在细胞培养物、在器官或组织培养物或在整只动物中进行。在无细胞或培养条件下进行初始评价并且通过在整只动物中进一步评价来确认可以是有用的。在某些实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择以模拟细胞内条件的体外条件下)的切割是在血液或血清中(或在被选择以模拟细胞外条件的体外条件下)的切割速度的至少约2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或约100倍。

i.氧化还原可切割连接基团

在某些实施例中，可切割连接基团是在还原或氧化时切割的氧化还原可切割连接基团。还原性可切割连接基团的实例是二硫化物连接基团(-S-S-)。为了确定候选可切割连接基团是否是合适的“还原性可切割连接基团”，或例如是否适合与特定iRNA部分和特定靶向剂一起使用，可以参考本文所描述的方法。例如，可以通过使用本领域已知的试剂与二硫苏糖醇(DTT)或其它还原剂一起温育来评估候选物，这模拟将在细胞(例如，靶细胞)中观察到的切割速率。候选物还可以在被选择以模拟血液或血清条件的条件下评价。在一个中，候选化合物在血液中被切割至多约10％。在其它实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择以模拟细胞内条件的体外条件下)的降解是在血液中(或在被选择以模拟细胞外条件的体外条件下)的切割速度的至少约2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或约100倍。候选化合物的切割速率可以使用标准酶动力学测定在被选择以模拟细胞内介质的条件下确定并且与被选择以模拟细胞外介质的条件进行比较。

ii.基于磷酸酯的可切割连接基团

在某些实施例中，可切割接头包括基于磷酸酯的可切割连接基团。基于磷酸酯的可切割连接基团被降解或水解磷酸酯基团的药剂切割。细胞中使磷酸酯基团切割的药剂的实例为细胞中的酶，如磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例为-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-，其中Rk在每次出现时可以独立地为C1-C20烷基、C1-C20卤代烷基、C6-C10芳基或C7-C12芳烷基。示例性实施例包含-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-和-O-P(S)(H)-S-。在某些实施例中，基于磷酸酯的连接基团为-O-P(O)(OH)-O-。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评价这些候选物。

iii.酸可切割连接基团

在某些实施例中，可切割接头包括酸可切割连接基团。酸可切割连接基团是在酸性条件下被切割的连接基团。在其它实施例中，酸可切割连接基团在pH为约6.5或更低(例如，约6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的酸性环境中或通过可以充当广义酸的药剂(如酶)被切割。在细胞中，特定低pH细胞器，如核内体和溶酶体可以提供酸可切割连接基团的切割环境。酸可切割连接基团的实例包含但不限于腙、酯和氨基酸的酯。酸可切割基团可以具有通式-C＝NN-、C(O)O或-OC(O)。示例性实施例是与酯的氧连接的碳(烷氧基)为芳基、经取代的烷基或叔烷基，如二甲基戊基或叔丁基。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评价这些候选物。

iv.基于酯的可切割连接基团

在某些实施例中，可切割接头包括基于酯的可切割连接基团。基于酯的可切割连接基团通过细胞中的酶，如酯酶和酰胺酶切割。基于酯的可切割连接基团的实例包含但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可切割连接基团具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评价这些候选物。

v.基于肽的可切割连接基团

在又另一个实施例中，可切割接头包括基于肽的可切割连接基团。基于肽的可切割连接基团通过细胞中的酶，如肽酶和蛋白酶切割。基于肽的可切割连接基团是在氨基酸之间形成以产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽的肽键。基于肽的可切割基团不包含酰胺基(-C(O)NH-)。酰胺基可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以产生肽和蛋白质的特殊类型的酰胺键。基于肽的切割基团通常限于在产生肽和蛋白质的氨基酸之间形成的肽键(即酰胺键)并且不包含整个酰胺官能团。基于肽的可切割连接基团具有通式–NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB为两个相邻氨基酸的R基团。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评价这些候选物。

在一些实施例中，本发明的iRNA通过接头与碳水化合物缀合。iRNA碳水化合物缀合物与本发明的组合物和方法的接头的非限制性实例包含但不限于：

/>

(式XLIV)，当X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一个是氢。

在本发明的组合物和方法的某些实施例中，配体为通过二价或三价支链接头连接的一个或多个“GalNAc”(N-乙酰基半乳糖胺)衍生物。

在某些实施例中，本发明的dsRNA与二价或三价支链接头缀合，所述二价或三价支链接头选自由式(XLV)至(XLVI)中任一项所示的结构组成的组：

/>

其中：

q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B和q5C在每次出现时独立地表示0-20，并且其中重复单元可以相同或不同；

P

Q

R

L

式XLIX

/>

其中L

适合的缀合GalNAc衍生物的二价和三价支链接头基团的实例包含但不限于上文所提及的式II、式VII、式XI、式X和式XIII的结构。

教导RNA缀合物的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利第4,828,979号；第4,948,882号；第5,218,105号；第5,525,465号；第5,541,313号；第5,545,730号；第5,552,538号；第5,578,717号、第5,580,731号；第5,591,584号；第5,109,124号；第5,118,802号；第5,138,045号；第5,414,077号；第5,486,603号；第5,512,439号；第5,578,718号；第5,608,046号；第4,587,044号；第4,605,735号；第4,667,025号；第4,762,779号；第4,789,737号；第4,824,941号；第4,835,263号；第4,876,335号；第4,904,582号；第4,958,013号；第5,082,830号；第5,112,963号；第5,214,136号；第5,082,830号；第5,112,963号；第5,214,136号；第5,245,022号；第5,254,469号；第5,258,506号；第5,262,536号；第5,272,250号；第5,292,873号；第5,317,098号；第5,371,241号、第5,391,723号；第5,416,203号、第5,451,463号；第5,510,475号；第5,512,667号；第5,514,785号；第5,565,552号；第5,567,810号；第5,574,142号；第5,585,481号；第5,587,371号；第5,595,726号；第5,597,696号；第5,599,923号；第5,599,928号；第5,688,941号；第6,294,664号；第6,320,017号；第6,576,752号；第6,783,931号；第6,900,297号；第7,037,646号；以及第8,106,022号，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。

不需要均匀地修饰给定化合物中的所有位置，并且事实上，可以将上述修饰中的多于一个修饰并入单一化合物中或甚至iRNA内的单个核苷处。本发明还包含作为嵌合化合物的iRNA化合物。

在本发明的上下文中，“嵌合”iRNA化合物或“嵌合体”是iRNA化合物，如dsRNA药剂，其含有两个或更多个化学上不同的区，每个区由至少一个单体单元构成，即在dsRNA化合物的情况下的核苷酸。这些iRNA通常含有至少一个区，其中RNA被修饰以赋予iRNA增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄取或增加的对靶核酸的结合亲和力。iRNA的另外的区可以作为能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂交体的酶的底物。举例来说，RNase H是细胞核酸内切酶，所述细胞核酸内切酶切割RNA:DNA双链体的RNA链。因此，RNase H的激活使RNA靶标切割，由此大大增强iRNA抑制基因表达的效率。因此，与杂交到同一靶标区的硫代磷酸酯脱氧dsRNA相比，当使用嵌合dsRNA时，使用更短的iRNA通常可以获得相当的结果。可以通过凝胶电泳和必要时本领域已知的相关核酸杂交技术常规检测RNA靶标的切割。

在某些情况下，iRNA的RNA可以被非配体基团修饰。许多非配体分子已与iRNA缀合以增强iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取，并且进行此类缀合的程序可在科学文献中获得。此类非配体部分已经包含脂质部分，如胆固醇(Kubo，T.等人,《生物化学和生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)》,2007,365(1):54-61；Letsinger等人,《美国国家科学院院刊》,1989,86:6553)，胆酸(Manoharan等人,《生物有机与药物化学快报》,1994,4:1053)，硫醚，例如，己基-S-三苯基甲硫醇(Manoharan等人,《纽约科学院年鉴》,1992,660:306；Manoharan等人,《生物有机与药物化学快报》,1993,3:2765)，硫代胆固醇(Oberhauser等人,《核酸研究》,1992,20:533)，脂肪族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人,《欧洲分子生物学组织杂志》,1991,10:111；Kabanov等人,《FEBS快报》,1990,259:327；Svinarchuk等人,《生物化学》,1993,75:49)，磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等人,《四面体快报》,1995,36:3651；Shea等人,《核酸研究》,1990,18:3777)，磷脂、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,《核苷与核苷酸》,1995,14:969)或金刚烷乙酸(Manoharan等人,《四面体快报》,1995,36:3651)，棕榈基部分(Mishra等人,《生物化学与生物物理学报》,1995,1264:229)，或十八胺或己基氨基-羰基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke等人,《药理和实验治疗学杂志》,1996,277:923)。上面列出了教导制备此类RNA缀合物的代表性美国专利。典型的缀合方案涉及合成在序列的一个或多个位置处具有氨基接头的RNA。随后使用适当偶联试剂或激活试剂使氨基与所缀合的分子反应。缀合反应可以在RNA仍与固相载体结合的情况下或在RNA切割之后在溶液相中进行。通过HPLC纯化RNA缀合物通常产生纯缀合物。

V.本公开的RNAi药剂的递送

将本公开的RNAi药剂递送至细胞，例如，受试者的细胞，如人类受试者(例如，有需要的受试者，如患有PRNP相关病症的受试者，例如，朊病毒病，如遗传性朊病毒病，例如，家族性克雅二氏病(CJD)、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克综合征(GSS)和致命性家族性失眠症(FFI)，可以通过多种不同的方式来实现。例如，可以通过在体外或体内使细胞与本公开的RNAi药剂接触来进行递送。还可以通过向受试者施用包括RNAi药剂(例如，dsRNA)的组合物直接进行体内递送。可替代地，体内递送可以通过施用一种或多种编码和引导RNAi药剂的表达的载体间接进行。下文将进一步讨论这些替代方案。

通常，任何递送核酸分子的方法(体外或体内)都可以适于与本公开的RNAi药剂一起使用(参见例如，Akhtar S.和Julian RL.,(1992)《细胞生物学趋势(TrendsCell.Biol.)》2(5):139-144和WO94/02595，所述文献通过全文引用的方式并入本文)。对于体内递送，为递送RNAi药剂需要考虑的因素包含例如，递送的药剂的生物稳定性、非特异性效应的预防以及递送的药剂在靶组织中的积累。可以通过局部施用，例如通过直接注射或植入到组织中或局部施用制剂来最小化RNAi药剂的非特异性效应。对治疗位点的局部施用使药剂的局部浓度最大化，限制药剂暴露于全身组织，所述全身组织可能被药剂伤害或可能降解药剂，并允许施用较低的总剂量的RNAi药剂。若干研究表明，当局部施用RNAi药剂时，基因产物的成功敲低。例如，在食蟹猴中通过玻璃体内注射(Tolentino,MJ.等人,(2004)《视网膜(Retina)》24:132-138)和在小鼠中通过视网膜下注射(Reich,SJ.等人,(2003)《分子视觉(Mol.Vis.)》9:210-216)眼内递送VEGF dsRNA两者均表明在年龄相关性黄斑变性的实验模型中预防新生血管形成。另外，在小鼠中直接瘤内注射dsRNA减小了肿瘤体积(Pille,J.等人,(2005)《分子疗法(Mol.Ther.)》11:267-274)，并且可以延长荷瘤小鼠的存活期(Kim,WJ.等人,(2006)《分子疗法》14:343-350；Li,S.等人,(2007)《分子疗法》15:515-523)。RNA干扰也显示出通过直接注射局部递送到CNS的成功(Dorn,G.等人,(2004)《核酸(Nucleic Acids)》32:e49；Tan,PH.等人,(2005)《基因疗法》12:59-66；Makimura,H.等人,(2002)《BMC神经科学(BMC Neurosci.)》3:18；Shishkina,GT等人,(2004)《神经科学(Neuroscience)》129:521-528；Thakker,ER.等人,(2004)《美国国家科学院院刊》101:17270-17275；Akaneya,Y.等人,(2005)《神经生理学杂志(J.Neurophysiol.)》93:594-602)，并且通过鼻内施用到达肺部(Howard,KA.等人,(2006)《分子疗法》14:476-484；Zhang,X.等人,(2004)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》279:10677-10684；Bitko,V.等人,(2005)《自然医学(Nat.Med.)》11:50-55)。为了全身地施用RNAi药剂以治疗疾病，可以修饰RNA或可替代地使用药物递送系统递送；这两种方法都用于防止dsRNA在体内被内切和外切核酸酶快速降解。RNA或药物载体的修饰也可以允许RNAi药剂靶向靶组织，并且避免不期望的脱靶效应(例如，不希望受理论束缚，本文所描述的GNA的使用已被鉴定为使dsRNA的种子区不稳定，导致相对于脱靶效应，此类dsRNA对在靶有效性的偏好增强，因为此类脱靶效应因此类种子区不稳定而显著减弱)。RNAi药剂可以通过与亲脂性基团(如胆固醇)的化学缀合进行修饰，以增强细胞摄取并防止降解。例如，将针对与亲脂性胆固醇部分缀合的ApoB的RNAi药剂全身注射到小鼠体内，并且引起肝脏和空肠两者中apoB mRNA的敲低(Soutschek,J.等人,(2004)《自然》432:173-178)。在前列腺癌的小鼠模型中，RNAi药剂与适体的缀合已被证明可以抑制肿瘤生长并介导肿瘤消退(McNamara,JO.等人,(2006)《自然生物技术》24:1005-1015)。在替代性实施例中，可以使用药物递送系统(如纳米颗粒、树状物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统)递送RNAi药剂。带正电荷的阳离子递送系统促进(带负电荷的)分子RNAi药剂的结合，并且还在带负电荷的细胞膜处增强相互作用以允许细胞高效地摄取RNAi药剂。阳离子脂质、树状物或聚合物可以与RNAi药剂结合或被诱导以形成包裹RNAi药剂的囊泡或胶束(参见例如，Kim SH.等人,(2008)《控释杂志(Journal of ControlledRelease)》129(2):107-116)。当全身施用时，囊泡或胶束的形成进一步防止RNAi药剂的降解。用于制备和施用阳离子RNAi药剂复合物的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(参见例如，Sorensen,DR等人,(2003)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol)》327:761-766；Verma,UN.等人,(2003)《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》9:1291-1300；Arnold,AS等人,(2007)《高血压杂志(J.Hypertens.)》25:197-205，所述文献通过全文引用的方式并入本文)。可用于RNAi药剂的全身递送的药物递送系统的一些非限制性实例包含DOTAP(Sorensen,DR.等人(2003),同上；Verma,UN.等人,(2003),同上)，Oligofectamine,“固体核酸脂质颗粒(solid nucleic acid lipid particles)”(Zimmermann,TS.等人,(2006)《自然》441:111-114)，心磷脂(Chien,PY.等人,(2005)《癌症基因疗法》12:321-328；Pal,A.等人,(2005)《国际肿瘤学杂志(Int J.Oncol.)》26:1087-1091)，聚乙烯亚胺(Bonnet ME.等人,(2008)《药学研究(Pharm.Res.)》8月16日印刷前的电子出版物；Aigner,A.(2006)《生物医学与生物技术杂志(J.Biomed.Biotechnol.)》71659)，Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)《分子药物学(Mol.Pharm.)》3:472-487)以及聚酰胺型胺(Tomalia,DA.等人,(2007)《生化学会会刊(Biochem.Soc.Trans.)》35:61-67；Yoo,H.等人(1999)《药学研究》16:1799-1804)。在一些实施例中，RNAi药剂与环糊精形成用于全身施用的复合物。施用方法以及RNAi药剂和环糊精的药物组合物可以在美国专利第7,427,605号中找到，所述专利通过引用整体并入本文。

本公开的某些方面涉及减少细胞中PRNP靶基因表达的方法，包括使所述细胞与本公开的双链RNAi药剂接触。在一个实施例中，细胞是肝细胞，任选地肝细胞。在一个实施例中，细胞是肝外细胞，任选地CNS细胞，例如，神经元或神经胶质细胞。

本公开的另一方面涉及一种减少受试者的PRNP靶基因的表达的方法，包括向受试者施用本公开的双链RNAi药剂。

本公开的另一方面涉及治疗患有PRNP相关病症的受试者的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开的双链RNAi药剂，由此治疗所述受试者。可以通过本公开的方法治疗的示例性PRNP相关病症包含朊病毒病，如遗传性朊病毒病，例如，家族性克雅二氏病(CJD)、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克综合征(GSS)和致命性家族性失眠症(FFI)；散发性朊病毒病，例如，散发性克雅二氏病、散发性致命性失眠症(sFI)和变异型蛋白酶敏感性朊蛋白病(VPSPr)；或后天性朊病毒病，例如，医源性CJD(iCJD)、库鲁病和变体CJD(vCJD)。

在一个实施例中，皮下施用双链RNAi药剂。

在一个实施例中，通过心室内施用施用双链RNAi药剂。

在一个实施例中，鞘内施用双链RNAi药剂。通过鞘内施用双链RNAi药剂，所述方法可以减少脑或脊柱组织(例如皮质、小脑、纹状体、颈椎、腰椎和胸椎)中PRNP靶基因的表达。

为了便于说明，本部分中主要讨论了经修饰的siRNA化合物的调配物、组合物和方法。然而可以理解，这些调配物、组合物和方法可以与其它siRNA化合物，例如未经修饰的siRNA化合物一起实践，并且此类实践在本公开范围内。包含RNAi药剂的组合物可以通过多种途径向受试者递送。示例性途径包含：鞘内、静脉内、心室内、局部、直肠、肛门、阴道、鼻腔、肺部和眼部。

本公开的RNAi药剂可以掺入适合施用的药物组合物中。此类组合物通常包含一种或多种RNAi药剂和药学上可接受的载体。如本文所使用的，语言“药学上可接受的载体”旨在包含与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂以及吸附延迟剂等。将此类培养基和药剂用于药物活性物质是本领域公知的。除了任何常规介质或药剂与活性化合物不相容的情况之外，设想介质或药剂在组合物中的使用。补充的活性化合物也可以并入所述组合物中。

取决于期望局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域，可以以许多方式施用本公开的药物组合物。施用可以是局部(包含眼科、阴道、直肠、鼻内、透皮)、口服或肠胃外。肠胃外施用包含静脉滴注、皮下、腹膜内或肌内注射，或鞘内或心室内施用。

可以选择施用的通路和位点来增强靶向。例如，为了靶向肌肉细胞，肌内注射到所关注的肌肉中是合乎逻辑的选择。肺细胞可以通过施用气溶胶形式的RNAi药剂来被靶向。可以通过用RNAi药剂涂覆球囊导管并机械地引入RNA来靶向血管内皮细胞。

用于局部施用的调配物可以包含透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必要的或期望的。带涂层的避孕套、手套等也可能是有用的。

用于口服施用的组合物包含粉末或微粒、在水、糖浆、酏剂或非水性介质中的悬浮液或溶液、片剂、胶囊、含片或锭剂。在片剂的情况下，可以使用的载体包含乳糖、柠檬酸钠和磷酸盐。片剂中通常使用各种崩解剂，如淀粉，以及润滑剂，如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂是乳糖和高分子量聚乙二醇。当口服需要水性悬浮液时，核酸组合物可以与乳化剂和悬浮剂组合。如果期望，可以添加某些甜味剂或调味剂。

用于鞘内或心室内施用的组合物可以包含还可以含有缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂的无菌水溶液。

用于肠胃外施用的调配物可以包含还可以含有缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂的无菌水溶液。心室内注射可以通过心室内导管来促进，例如，与储器连接。对于静脉内使用，可以控制溶质的总浓度以使调配物具有等渗性。

在一个实施例中，siRNA化合物(例如，双链siRNA化合物或ssiRNA化合物)组合物的施用是肠胃外的，例如，静脉内(例如，作为团注或扩散输注)、皮内、腹膜内、肌内、鞘内、心室内、颅内、皮下、经粘膜、经颊、舌下、内窥镜、直肠、口腔、阴道、局部、肺部、鼻内、尿道或眼部。施用可以由受试者提供，也可以由另一个人提供，例如，医疗保健提供者。药物可以以测量剂量提供，或在递送计量的剂量的分配器中提供。下文将更详细地讨论选定的递送模式。

鞘内施用。

在一个实施例中，双链RNAi药剂通过鞘内注射(即，注射到沐浴脑和脊髓组织的脊髓液中)递送。将RNAi药剂鞘内注射到脊髓液中可以以团注的方式进行，也可以通过植入皮肤下的微型泵进行，从而向脊髓液中提供siRNA的定期和持续递送。脊髓液从产生其的脉络丛开始循环，向下绕过脊髓和背根神经节，向上经过小脑和皮质到达蛛网膜颗粒，在那里流体可以离开CNS，这取决于注射的化合物的大小、稳定性和溶解性，鞘内递送的分子可以命中整个CNS的靶点。

在一些实施例中，鞘内施用是通过泵进行的。所述泵可以是通过外科手术植入的渗透泵。在一个实施例中，将渗透泵植入椎管的蛛网膜下腔以促进鞘内施用。

在一些实施例中，鞘内施用是通过用于药物的鞘内递送系统进行的，所述鞘内递送系统包含含有一定体积药剂的储器和被配置成递送所述储器中含有的药剂的一部分的泵。关于这种鞘内递送系统的更多细节可以在WO 2015/116658中找到，所述文献通过全文引用的方式并入。

鞘内注射的RNAi药剂的量可能在一个靶基因与另一个靶基因之间有差异，并且必须针对每个靶基因单独确定必须应用的适当量。通常，此量的范围为10μg至2mg，或50μg至1500μg，或100μg至1000μg。

本公开的载体编码的RNAi药剂

靶向PRNP基因的RNAi药剂可以从插入DNA或RNA载体的转录单元表达(参见例如，Couture,A等人,《TIG.》(1996),12:5-10；WO 00/22113、WO 00/22114和US 6,054,299)。表达可以是持续的(数月或更长时间)，这取决于所使用的特定构建体和靶组织或细胞类型。这些转基因可以作为线性构建体、环状质粒或病毒载体引入，其可以是整合或非整合载体。还可以构建转基因以允许其作为染色体外质粒遗传(Gassmann等人,(1995)《美国国家科学院院刊》92:1292)。

RNAi药剂的一条或多条单独的链可以从表达载体上的启动子转录。在要表达两条单独的链以产生例如dsRNA的情况下，可以将两个单独的表达载体共同引入(例如，通过转染或感染)到靶细胞中。可替代地，dsRNA的每个单独的链都可以通过启动子转录，这两个启动子都位于同一表达质粒上。在一个实施例中，dsRNA被表达为通过接头多核苷酸序列连接的反向重复多核苷酸，使得dsRNA具有茎和环结构。

RNAi药剂表达载体通常是DNA质粒或病毒载体。与真核细胞相容的表达载体，如与脊椎动物细胞相容的那些表达载体可以用于产生用于表达如本文所描述的RNAi药剂的重组构建体。RNAi药剂表达载体的递送可以是全身的，如通过静脉内或肌内施用，通过施用从患者体内移植的靶细胞，然后重新引入患者体内，或通过允许引入期望的靶细胞的任何其它方式。

可以与本文所描述的方法和组合物一起使用的病毒载体系统包含但不限于(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包含但不限于慢病毒载体、莫罗尼鼠白血病病毒(moloneymurine leukemia virus)等；(c)腺相关病毒载体；(d)单纯性疱疹病毒载体；(e)SV 40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头瘤病毒载体；(h)小核糖核酸病毒载体；(i)痘病毒载体，如正痘(例如，牛痘病毒载体)或禽痘(例如，金丝雀痘或禽痘)；以及(j)辅助依赖性或无肠腺病毒。复制缺陷病毒也可能是有利的。不同的载体将或不会被并入到细胞的基因组中。如果期望，构建体可以包含用于转染的病毒序列。可替代地，构建体可以被并入能够附加型复制的载体中，例如EPV和EBV载体。用于重组表达RNAi药剂的构建体将通常需要调节元件，例如启动子、增强子等，以确保RNAi药剂在靶细胞中的表达。对于载体和构建体要考虑的其它方面是本领域已知的。

VI.本发明的药物组合物

本公开还包含药物组合物和调配物，所述药物组合物和调配物包含本公开的RNAi药剂。在一个实施例中，本文提供了药物组合物，所述药物组合物含有如本文所描述的RNAi药剂以及药学上可接受的载体。含有RNAi药剂的药物组合物可用于治疗与PRNP的表达或活性相关的疾病或病症，例如，PRNP相关疾病，如朊病毒病，例如，遗传性朊病毒病，例如，家族性克雅二氏病(CJD)、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克综合征(GSS)和致命性家族性失眠症(FFI)；散发性朊病毒病，例如，散发性克雅二氏病、散发性致命性失眠症(sFI)和变异型蛋白酶敏感性朊蛋白病(VPSPr)；或后天性朊病毒病，例如，医源性CJD(iCJD)、库鲁病和变体CJD(vCJD)。

此类药物组合物基于递送模式调配。一个实例是调配用于通过肠胃外递送进行全身施用的组合物，例如，通过静脉内(IV)、肌内(IM)或用于皮下(subQ)递送。另一个实例是调配用于直接递送到中枢神经系统中的组合物，例如，通过鞘内或心室内注射途径，任选地通过输注到脑(例如，纹状体)中，如通过连续泵输注。

在一些实施例中，本发明的药物组合物是不含热原或无热原的。

本公开的药物组合物可以以足以抑制PRNP基因的表达的剂量施用。通常，本公开的RNAi药剂的合适剂量的范围将为约0.001mg至约200.0mg约每月一次至约每年一次，通常为每季度一次(即，约每三个月一次)至约每年一次的固定剂量，通常为范围为约1mg至50mg约每月一次至约每年一次，通常为约每季度一次至每年一次的固定剂量。

在初始治疗方案(例如，负荷剂量)之后，可以在不太频繁的基础上施用治疗。

本领域技术人员将理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排，这些因素包含但不限于疾病或病症的严重性、之前的治疗、所述受试者的总体健康或年龄以及存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的组合物对受试者进行的治疗可以包含单次治疗或系列治疗。

小鼠遗传学的进步已经产生了许多用于研究将受益于PRNP表达减少的各种PRNP相关疾病的小鼠模型。此类模型可以用于RNAi药剂的体内测试，以及用于确定治疗有效剂量。合适的小鼠模型是本领域已知的，并且包含例如本文其它地方描述的小鼠模型。

取决于期望局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域，可以以许多方式施用本公开的药物组合物。施用可以是局部的(例如，通过透皮贴剂)、肺部的(例如，通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包含通过雾化器)；气管内的、鼻内的、表皮和透皮的、口服的或肠胃外的。肠胃外施用包含静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；皮下(例如，通过植入的装置)；或颅内(例如，通过实质内、鞘内或心室内施用)。

RNAi药剂可以以靶向特定组织的方式递送，如肝、CNS(例如，脑的神经元、神经胶质或血管组织)或肝和CNS两者。

用于局部施用的药物组合物和调配物可以包含透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体以及粉末。常规的药物载体、水性基质、粉末或油性基质、增稠剂等可以是必要的或期望的。带涂层的避孕套、手套等也可以是有用的。合适的局部调配物包含其中本公开特征的RNAi药剂与局部递送剂，如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些调配物。合适的脂质和脂质体包含中性的(例如，二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、负性的(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子的(例如，二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本公开特征的RNAi药剂可以被封装在脂质体中或可以与其形成复合物，具体地与阳离子脂质体。可替代地，RNAi药剂可以与脂质复合，具体地与阳离子脂质复合。合适的脂肪酸和酯包含但不限于花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C

A.包括膜分子组装体的RNAi药剂调配物

用于本公开的组合物和方法的RNAi药剂可以被调配成以膜分子组装体(例如，脂质体或胶束)形式递送。如本文所使用的，术语“脂质体”是指由排列在至少一个双层中(例如，一个双层或多个双层)的两亲性脂质组成的囊泡。脂质体包含具有由亲脂性材料形成的膜和水性内部的单层和多层囊泡。水性部分含有RNAi药剂组合物。亲脂性材料将水性内部与水性外部分离，所述水性外部通常不包含RNAi药剂组合物，尽管在一些实例中其可以。脂质体可用于将活性成分转移和递送到作用位点。由于脂质体膜在结构上与生物膜相似，当脂质体应用于组织时，脂质体双层与细胞膜的双层融合。随着脂质体和细胞融合的进展，包含RNAi药剂的内部水性内容物被递送到细胞中，其中RNAi药剂可以与靶RNA特异性结合并可以介导RNAi。在一些情况下，脂质体也被特异性靶向，例如将RNAi药剂引导到特定的细胞类型。

含有RNAi药剂的脂质体可以通过多种方法制备。在一个实例中，脂质体的脂质组分溶解在洗涤剂中，从而与脂质组分形成胶束。例如，脂质组分可以是两亲性阳离子脂质或脂质缀合物。洗涤剂可以具有高临界胶束浓度，并且可以是非离子的。示例性洗涤剂包含胆酸盐、CHAPS、辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐和肌氨酸月桂酰酯。然后将RNAi药剂制剂添加到包含脂质组分的胶束中。脂质上的阳离子基团与RNAi药剂相互作用，并且在RNAi药剂周围缩合以形成脂质体。缩合后，例如通过透析去除洗涤剂，以产生RNAi药剂的脂质体制剂。

如果需要，可以在缩合反应期间，例如通过控制添加来添加有助于缩合的载体化合物。例如，载体化合物可以是除核酸以外的聚合物(例如，精胺或亚精胺)。也可以调节pH以利于缩合。

在例如WO 96/37194中进一步描述了用于产生稳定的多核苷酸递送媒剂的方法，所述媒剂合并了多核苷酸/阳离子脂质复合物作为递送媒剂的结构组分，所述文献的全部内容通过引用并入本文。脂质体形成也可以包含以下中描述的示例性方法的一个或多个方面：Felgner,P.L.等人,(1987)《美国国家科学院院刊》8:7413-7417；美国专利第4,897,355号；美国专利第5,171,678号；Bangham等人,(1965)《分子生物学杂志(M.Mol.Biol.)》23:238；Olson等人,(1979)《生物化学与生物物理学报》557:9；Szoka等人,(1978)《美国国家科学院院刊》75:4194；Mayhew等人,(1984)《生物化学与生物物理学报》775:169；Kim等人,(1983)《生物化学与生物物理学报》728:339；以及Fukunaga等人,(1984)《内分泌学(Endocrinol.)》115:757.用于制备用作递送媒剂的合适大小的脂质聚集体的常用技术包含超声处理和冻融加挤压(参见，例如，Mayer等人,(1986)《生物化学与生物物理学报》858:161。当期望持续较小(50nm至200nm)且相对均匀的聚集体时，可以使用微流体化(Mayhew等人,(1984)《生物化学与生物物理学报》775:169。这些方法很容易适用于将RNAi药剂制剂包装到脂质体中。

脂质体分为两个广泛的类别。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其与带负电荷的核酸分子相互作用以形成稳定的复合物。带正电荷的核酸/脂质体复合物与带负电荷的细胞表面结合并且内化于核内体中。由于核内体中的酸性pH，脂质体破裂，从而将其内容物释放到细胞质中(Wang等人,(1987)《生物化学与生物物理学研究通讯》,147:980-985)。

对pH敏感的或带负电荷的脂质体截留核酸而不是与其复合。由于核酸和脂质两者均带有类似的电荷，所以会出现排斥而非复合物形成。然而，一些核酸包埋于这些脂质体的水性内部内。对pH敏感的脂质体已被用于将编码胸苷激酶基因的核酸递送到培养中的细胞单层。在靶细胞中检测到外源基因的表达(Zhou等人,(1992)《控释杂志》,19:269-274)。

一种主要类型的脂质体组合物包含除天然来源的磷脂酰胆碱之外的磷脂。中性脂质体组合物例如可以由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阴离子脂质体组合物通常由二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成，而阴离子融合脂质体主要由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一种类型的脂质体组合物由磷脂酰胆碱(PC)形成，例如大豆PC和鸡蛋PC。另一种类型由磷脂或磷脂酰胆碱或胆固醇的混合物形成。

在体外和体内将脂质体引入细胞中的其它方法的实例包含美国专利第5,283,185号；美国专利第5,171,678号；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；Felgner,(1994)《生物化学杂志》269:2550；Nabel,(1993)《美国国家科学院院刊》90:11307；Nabel,(1992)《人类基因疗法(Human Gene Ther.)》3:649；Gershon,(1993)《生物化学(Biochem)》32:7143；以及Strauss,(1992)《欧洲分子生物学组织杂志》11:417。

还对非离子脂质体系统进行了检查，以确定其在向皮肤递送药物中的效用，特别是包括非离子表面活性剂和胆固醇的系统。使用包括Novasome

脂质体还包含“空间稳定的”脂质体，如本文所使用的，所述术语是指包括一种或多种特殊脂质的脂质体，当掺入脂质体中时，相对于缺乏此类特殊脂质的脂质体，所述脂质体导致提高的循环寿命。空间稳定的脂质体的实例是其中脂质体(A)的囊泡形成脂质部分的一部分包括一种或多种糖脂，如单唾液酸神经节苷脂G

包括一种或多种糖脂的各种脂质体是本领域已知的。Papahadjopoulos等人(《纽约科学院年鉴》,(1987),507:64)报道了单唾液酸神经节苷脂G

在一个实施例中，使用阳离子脂质体。阳离子脂质体具有能够与细胞膜融合的优点。非阳离子脂质体尽管不能与质膜有效融合，但在体内被巨噬细胞吸收，并且可以用于向巨噬细胞递送RNAi药剂。

脂质体的另外的优点包含：从天然磷脂中获得的脂质体具有生物相容性且可生物降解；脂质体可以掺入多种水溶性和脂溶性药物；脂质体可以保护其内部区室中封装的RNAi药剂免受代谢和降解(Rosoff,《药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)》，Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,第1卷,第245页)。制备脂质体调配物的重要考虑因素是脂质表面电荷、囊泡大小和脂质体的水性体积。

带正电的合成阳离子脂质N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)可以用于形成小脂质体，所述小脂质体与核酸自发相互作用以形成脂质-核酸复合物，所述复合物能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电荷的脂质融合，导致RNAi药剂的递送(参见例如，Felgner,P.L.等人,(1987)《美国国家科学院院刊》8:7413-7417，以及美国专利第4,897,355号中关于DOTMA以及其与DNA的使用的描述)。

DOTMA类似物，1,2-双(油酰基氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)可以与磷脂组合使用，以形成DNA络合囊泡。Lipofectin

其它报道的阳离子脂质化合物包含与多种部分缀合的那些，包含例如与两种类型的脂质之一缀合的羧精胺，并且包含如5-羧基精胺基甘氨酸二十八烷基酰胺(“DOGS”)(Transfectamine

另一种阳离子脂质缀合物包含脂质与胆固醇的衍生化(“DC-Chol”)，其已与DOPE组合调配成脂质体(参见，Gao,X.和Huang,L.,(1991)《生物化学与生物物理学研究通讯》179:280)。据报道，通过将聚赖氨酸与DOPE缀合制备的脂聚赖氨酸在血清存在下对转染有效(Zhou,X.等人,(1991)《生物化学与生物物理学报》1065:8)。对于某些细胞系，这些含有缀合的阳离子脂质的脂质体据说表现出比所述含有DOTMA的组合物更低的毒性并提供更有效的转染。其它可商购获得的阳离子脂质产品包含DMRIE和DMRIE-HP(加利福尼亚州拉荷亚市的Vical公司(Vical,La Jolla,California))和Lipofectamine(DOSPA)(马里兰州盖瑟斯堡的生命技术有限公司(Life Technology,Inc.,Gaithersburg,Maryland))。WO 98/39359和WO 96/37194中描述了适用于递送寡核苷酸的其它阳离子脂质。

脂质体调配物特别适合局部施用，脂质体呈现出超过其它调配物的若干个优点。此类优点包含减少了与施用的药物的高全身吸收相关的副作用，增加了施用的药物在期望的靶标的积聚，以及将RNAi药剂施用到皮肤中的能力。在一些实施例中，脂质体用于将RNAi药剂递送到表皮细胞，并且还用于增强RNAi药剂向真皮组织中的渗透，例如到皮肤中。例如，脂质体可以局部应用。已经记录了将调配成脂质体的药物局部递送到皮肤(参见，例如，Weiner等人,(1992)《药物靶向杂志(Journal of Drug Targeting)》,第2卷,405-410和duPlessis等人,(1992)《抗病毒研究(Antiviral Research)》,18:259-265；Mannino,R.J.和Fould-Fogerite,S.,(1998)《生物技术(Biotechniques)》6:682-690；Itani,T.等人,(1987)《基因(Gene)》56:267-276；Nicolau,C.等人(1987)《酶学方法(Meth.Enzymol.)》149:157-176；Straubinger,R.M.和Papahadjopoulos,D.(1983)《酶学方法》101:512-527；Wang,C.Y.和Huang,L.,(1987)《美国国家科学院院刊》84:7851-7855)。

还对非离子脂质体系统进行了检查，以确定其在向皮肤递送药物中的效用，特别是包括非离子表面活性剂和胆固醇的系统。使用包括Novasome I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)和Novasome II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子脂质体调配物将药物递送到小鼠皮肤的真皮中。具有RNAi药剂的此类调配物可用于治疗皮肤病学病症。

包含RNAi药剂的脂质体可以被制成高度可变形的。此类可变形性可以使脂质体渗透穿过小于脂质体平均半径的孔。例如，传递体是一类可变形的脂质体。传递体可以通过在标准脂质体组合物中添加表面边缘激活剂(通常是表面活性剂)来制备。包含RNAi药剂的传递体可以例如通过感染皮下递送，以便将RNAi药剂递送到皮肤中的角质细胞。为了穿过完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在适当的透皮梯度的影响下穿过一系列直径小于50nm的细孔。另外，由于脂质特性，这些传递体可以自我优化(适应孔的形状，例如皮肤中的孔)、自我修复，并且可以经常在不碎裂的情况下达到其靶标，并且经常自我装载。

PCT公开第WO 2008/042973号中描述了适用于本公开的其它调配物。

传递体是又另一种类型的脂质体，是高度可变形的脂质聚集体，是药物递送媒剂的有吸引力的候选者。传递体可以被描述为脂滴，其可高度可变形，使得其很容易渗透穿过比液滴小的孔。传递体能够适应其使用的环境，例如其是自我优化的(适应皮肤中孔的形状)、自我修复的，经常在不碎裂的情况下达到其靶标，并且经常自我装载。为了制备传递体，可以向标准脂质体组合物添加表面边缘激活剂，通常是表面活性剂。传递体已被用于将血清白蛋白递送到皮肤。传递体介导的血清白蛋白的递送已被证明与皮下注射含有血清白蛋白的溶液一样有效。

表面活性剂广泛应用于本文所描述的调配物中，尤其是乳液(包含微乳液)和脂质体。对许多不同类型的表面活性剂(天然和合成两者)的特性进行分类和排序的最常见方式是通过使用亲水/亲脂平衡(HLB)。亲水基团(也称为“头”)的性质为调配物中使用的不同表面活性剂的分类提供了最有用的方法(Rieger,《药物剂型》,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.),1988,第285页)。

如果表面活性剂分子未离子化，则将其归类为非离子表面活性剂。非离子表面活性剂在药物和化妆品中有着广泛的应用，并且可用于多种pH值。通常，根据其结构，其HLB值的范围为2至约18。非离子表面活性剂包含非离子酯，如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨醇酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。非离子烷醇酰胺和醚，如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物也包含在此类别中。聚氧乙烯表面活性剂是非离子表面活性剂类别中最受欢迎的成员。

如果表面活性剂分子在溶解或分散在水中时带有负电荷，则表面活性剂被分类为阴离子。阴离子表面活性剂包含羧酸酯，如皂类、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸酯，如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯，磺酸酯，如烷基苯磺酸酯、酰基异硫辛酸酯、酰基牛磺酸酯和磺基琥珀酸酯，以及磷酸酯。阴离子表面活性剂类别中最重要的成员是烷基硫酸酯和皂类。

如果表面活性剂分子在溶解或分散在水中时带有正电荷，则表面活性剂被分类为阳离子。阳离子表面活性剂包含季铵盐和乙氧基化胺。季铵盐是此类别化合物中使用最多的成员。

如果表面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力，则表面活性剂被归类为两性。两性表面活性剂包含丙烯酸衍生物、经取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂。

对表面活性剂在药物产品、调配物和乳液中的应用进行了综述(Rieger,《药物剂型》,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,1988,第285页)。

用于本公开的方法中的RNAi药剂也可以作为胶束调配物提供。“胶束”在本文中被定义为特定类型的分子组装体，其中两亲性分子以球形结构排列，使得分子的所有疏水部分向内，使亲水部分与周围的水相接触。如果环境是疏水的，则存在相反的排列。

适合通过透皮膜递送的混合胶束调配物可以通过混合siRNA组合物的水溶液、碱金属C

在一种方法中，制备含有siRNA组合物和至少碱金属烷基硫酸酯的第一胶束组合物。然后将第一胶束组合物与至少三种胶束形成化合物混合以形成混合的胶束组合物。在另一种方法中，通过将siRNA组合物、碱金属烷基硫酸酯和至少一种胶束形成化合物混合，然后在剧烈混合的情况下添加剩余的胶束形成化合物来制备胶束组合物。

苯酚或间甲酚可以添加到混合的胶束组合物中，以稳定调配物并防止细菌生长。可替代地，苯酚或间甲酚可以与胶束形成成分一起添加。在形成混合的胶束组合物之后，也可以添加等渗剂，如甘油。

为了将胶束调配物作为喷雾递送，可以将所述调配物放入气溶胶分配器中，并且在分配器中装入推进剂。处于压力下的推进剂在分配器中呈液体形式。调节成分的比率，使水相和推进剂相成为一个相，即有一个相。如果有两个相，则有必要在分配一部分内容物之前摇动分配器，例如通过计量阀。分配的剂量的药剂以精细喷雾的形式从计量阀推进。

推进剂可以包含含氢氯氟烃、含氢氟碳化合物、二甲醚和二乙醚。在某些实施例中，可以使用HFA134a(1,1,1,2四氟乙烷)。

基本成分的具体浓度可以通过相对简单的实验来确定。为了通过口腔吸收，通常期望通过注射或通过胃肠道施用增加剂量，例如至少两倍或三倍。

脂质颗粒

RNAi药剂，例如本公开中的dsRNA可以完全封装在脂质调配物中，例如LNP或其它核酸脂质颗粒中。

如本文所使用的，术语“LNP”是指稳定的核酸-脂质颗粒。LNP通常含有阳离子脂质、非阳离子脂质和防止颗粒聚集的脂质(例如，PEG-脂质缀合物)。LNP对于全身应用非常有用，因为其在静脉内(i.v.)注射后表现出延长的循环寿命并在远隔位点(例如，与施用位点物理分离的位点)累积。LNP包含“pSPLP”，其包含WO00/03683中所述的封装的缩合剂-核酸复合物。本公开的颗粒的平均直径通常为约50nm至约150nm、更通常地为约60nm至约130nm、更通常地为约70nm至约110nm、最通常地为约70nm至约90nm，并且基本上无毒。另外，核酸当存在于本公开的核酸-脂质颗粒中时在水溶液中抵抗核酸酶的降解。核酸-脂质颗粒以及其制备方法在例如以下中公开：美国专利第5,976,567号；第5,981,501号；第6,534,484号；第6,586,410号；第6,815,432号；美国专利公开第2010/0324120号和WO 96/40964。

在一个实施例中，脂质与药物的比率(质量/质量比)(例如，脂质与dsRNA的比率)将在约1:1至约50:1、约1:1至约25:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1或约6:1至约9:1的范围内。上述范围中间的范围也被认为是本公开的一部分。

本领域已经描述了用于递送RNAi药剂的某些特定LNP调配物，包含例如“LNP01”调配物，如例如在WO 2008/042973中描述的，所述文献特此通过引用并入。

在下表中鉴定了另外的示例性脂质-dsRNA调配物。

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DSPC：二硬脂酰基磷脂酰胆碱

DPPC：二棕榈酰磷脂酰胆碱

PEG-DMG：PEG-二肉豆蔻酰基甘油(C14-PEG或PEG-C14)(平均摩尔重量为2000的PEG)

PEG-DSG：PEG-联苯乙烯基甘油(C18-PEG或PEG-C18)(平均摩尔重量为2000的PEG)

PEG-cDMA：PEG-氨基甲酰基-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙胺(平均摩尔重量为2000的PEG)

在WO 2009/127060中描述了包括SNALP(l,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA))的调配物，所述文献特此通过引用并入。

包括XTC的调配物在WO 2010/088537中进行了描述，所述文献的全部内容特此通过引用并入本文。

例如，在美国专利公开第2010/0324120号中描述了包括MPRNP的调配物，所述文献的全部内容特此通过引用并入。

包括ALNY-100的调配物在WO 2010/054406中进行了描述，所述文献的全部内容特此通过引用并入本文。

包括C12-200的调配物在WO 2010/129709中进行了描述，所述文献的全部内容特此通过引用并入本文。

用于口服施用的组合物和调配物包含粉末或颗粒、微粒、纳米颗粒、在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、囊剂、片剂或微型片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可以是期望的。在一些实施例中，口服调配物是其中本公开特征的dsRNA与一种或多种增渗剂表面活性剂和螯合剂一起施用的那些调配物。合适的表面活性剂包含脂肪酸或其酯或盐、胆汁酸或其盐。合适的胆汁酸/盐包含鹅脱氧胆酸(CDCA)和熊脱氧鹅脱氧胆酸(UDCA)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡胆酸、甘胆酸、甘脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺基-24,25-二氢-富西酸钠和甘二氢富西酸钠。合适的脂肪酸包含花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐(例如，钠)。在一些实施例中，使用增渗剂的组合，例如脂肪酸/盐与胆汁酸/盐的组合。示例性组合是月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。另外的增渗剂包含聚氧乙烯-9-十二烷基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡醚。本公开特征的dsRNA可以口服、以包含喷雾干燥颗粒的颗粒形式递送，或复合以形成微型或纳米颗粒。dsRNA络合剂包含聚氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚烷基丙烯酸酯、聚氧乙烷、聚氰基丙烯酸烷基酯；阳离子化明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚氰基丙烯酸烷基酯；DEAE衍生的聚胺、支链淀粉、纤维素和淀粉。合适的络合剂包含壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、聚-L-赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精蛋白、鱼精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫二乙基氨基甲基乙烯P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(例如，对氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异己基丙烯酸酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白和DEAE-右旋糖酐、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、藻酸酯和聚乙二醇(PEG)。dsRNA的口服调配物以及其制备在以下中详细描述：美国专利6,887,906、U.S.2003/0027780和美国专利第6,747,014号，所述文献中的每一个通过引用并入本文。

用于肠胃外、实质内(进入脑)、鞘内、心室内或肝内施用的组合物和调配物可以包含无菌水溶液，所述无菌水溶液也可以含有缓冲液、稀释剂和其它合适的添加剂，如但不限于增渗剂、载体化合物和其它药学上可接受的载体或赋形剂。

本公开的药物组合物包含但不限于溶液、乳液和含有脂质体的调配物。这些组合物可以由多种组分产生，所述组分包含但不限于预成型液体、自乳化固体和自乳化半固体。特别有用的调配物包含在治疗PRNP相关疾病或病症时靶向脑的那些调配物。

本公开的药物调配物可以方便地以单位剂型存在，可以根据制药工业中众所周知的常规技术制备。此类技术包含使活性成分与药物载体或赋形剂缔合的步骤。一般而言，通过使活性成分与液体载体或精细固体载体或两者均匀充分地缔合并且然后在必要时使产物成形来制备所述调配物。

本公开的组合物可以调配成许多可能的剂型中的任一种，如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本公开的组合物也可以被调配成在水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步含有增加悬浮液粘度的物质，包含例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。悬浮液也可以含有稳定剂。

另外的调配物

i.乳液

本公开的组合物可以制备并调配成乳液。乳液通常是一种液体以液滴的形式分散在另一种液体中的非均相系统，通常直径超过0.1μm(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统(Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins,New York,NY)(第8版)；Idson,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司(MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.),第1卷,第199页；Rosoff,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第245页；Block,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第2卷,第335页；Higuchi等人,《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.),1985,第301页)。乳液通常是两相系统，包括两个相互紧密混合和分散的不混溶液相。通常，乳液可以是油包水(w/w)或水包油(w/w)类型。当水相被精细地分成微小的液滴并分散到本体油相中时，所得到的组合物被称为油包水(w/o)乳液。可替代地，当油相被精细地分成微小的液滴并分散到本体水相中时，所得到的组合物被称为水包油(o/w)乳液。除了分散相和活性药物之外，乳液还可以含有另外的组分，所述活性药物可以以溶液的形式存在于水相、油相中或其本身作为单独的相。药物赋形剂，如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂也可以根据需要存在于乳液中。药物乳液也可以是包含多于两相的多种乳液，例如在油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳液的情况下。此类复杂的调配物通常提供简单的二元乳液所没有的某些优点。其中o/w乳液的单个油滴包围小水滴的多重乳液构成w/o/w乳液。类似地，包围在油状连续相中稳定的水滴中的油滴系统提供o/w/o乳液。

乳液的特征在于几乎没有或没有热力学稳定性。通常，乳液的分散或不连续相很好地分散到外部或连续相中，并且通过乳化剂或调配物的粘度维持这种形式。乳液的任何一个相都可以是半固体或固体，如同乳液型软膏基质和乳膏的情况一样。稳定乳液的其它方法需要使用可以并入乳液任一相中的乳化剂。乳化剂可以大致分为四类：合成表面活性剂、天然存在的乳化剂、吸收碱和精细分散的固体(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版)；Idson,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第199页)。

已发现合成表面活性剂(也称为表面活性药剂)在乳液调配物中具有广泛的适用性，并且已在文献中进行了综述(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版)；Rieger,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第285页；Idson,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第199页)。表面活性剂通常是两亲性的，并且包括亲水性和疏水性部分。表面活性剂的亲水性与疏水性的比率被称为亲水/亲脂平衡(HLB)，并且是在调配物的制备中对表面活性剂进行分类和选择的有价值的工具。表面活性剂可以基于亲水基团的性质分为不同的类别：非离子、阴离子、阳离子和两性(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版)；Rieger,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第285页)。

乳液调配物中使用的天然存在的乳化剂包含羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和阿拉伯胶。吸收碱具有亲水特性，使得其可以吸收水形成w/o乳液，但仍保持其半固体稠度，如无水羊毛脂和亲水性矿脂。精细分散的固体也被用作良好的乳化剂，特别是与表面活性剂和粘性制剂组合使用。这些包含极性无机固体，如重金属氢氧化物，非溶胀粘土，如膨润土、凹凸棒石、锂蒙脱石、高岭土、蒙脱石、胶体硅酸铝和胶体硅酸镁铝，颜料和非极性固体，如碳或三硬脂酸甘油酯。

乳液调配物中还包含多种非乳化材料，并且有助于乳液的特性。这些包含脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、保湿剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(Block,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第335页；Idson,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第199页)。

亲水胶体或水胶体包含天然存在的树胶和合成聚合物，如多糖(例如，阿拉伯胶、琼脂、藻酸、角叉菜胶、瓜尔豆胶、卡拉亚胶和黄芪胶)、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)以及合成聚合物(例如，碳聚合物、纤维素醚和羧乙烯基聚合物)。这些在水中分散或膨胀以形成胶体溶液，所述胶体溶液通过在分散相液滴周围形成强界面膜并通过增加外部相的粘度来稳定乳液。

由于乳液通常含有许多成分，如碳水化合物、蛋白质、甾醇和磷脂，所述成分可以很容易地支持微生物的生长，因此这些调配物通常掺入防腐剂。乳液调配物中包含的常用的防腐剂包含尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、季铵盐、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯和硼酸。抗氧化剂通常也被添加到乳液调配物中，以防止调配物变质。所使用的抗氧化剂可以是自由基清除剂，如生育酚、没食子酸烷基酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯，或还原剂，如抗坏血酸和焦亚硫酸钠，以及抗氧化剂增效剂，如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂。

乳液调配物通过皮肤、口服和肠胃外途径的应用以及其制造方法已经在文献中进行了综述(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版)；Idson,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第199页)。用于口服递送的乳液调配物由于易于调配以及从吸收和生物利用度的角度来看的功效而被非常广泛地使用(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版)；Rosoff,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第245页；Idson,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第199页)。矿物油基泻药、油溶性维生素和高脂肪营养制剂通常是作为o/w乳液口服施用的材料。

ii.微乳液

在本公开的一个实施例中，RNAi药剂和核酸的组合物被调配为微乳液。微乳液可以定义为水、油和两亲物的系统，其是单一的光学各向同性和热力学稳定的液体溶液(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版)；Rosoff,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第245页)。通常，微乳液是通过首先将油分散在表面活性剂水溶液中，并且然后添加足量的第四组分(通常是中链长醇)以形成透明系统而制备的系统。因此，微乳液也被描述为两种不混溶液体的热力学稳定、各向同性透明的分散体，所述两种不混溶液体通过表面活性分子的界面膜来稳定(Leung和Shah,《药物的控制释放：聚合物和聚集系统(Controlled Releaseof Drugs:Polymers and Aggregate Systems)》,Rosoff,M.编辑,1989,纽约的VCH出版社(VCH Publishers,New York),第185-215页)。微乳液通常通过三种至五种组分的组合制备，所述组分包含油、水、表面活性剂、助表面活性剂和电解质。微乳液是油包水(w/o)还是水包油(o/w)类型取决于所用的油和表面活性剂的特性，以及表面活性剂分子的极性头和烃尾的结构和几何堆积(Schott,《雷明顿药物科学》,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司,1985,第271页)。

利用相图的现象学方法已经得到了广泛的研究，并且为本领域技术人员提供了关于如何调配微乳液的全面知识(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版),纽约州纽约；Rieger,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第245页；Block,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第335页)。与传统乳液相比，微乳液提供了将水不溶性药物溶解在自发形成的热力学稳定液滴调配物中的优点。

用于制备微乳液的表面活性剂包含但不限于离子表面活性剂、非离子表面活化剂、Brij 96、聚氧乙烯油醚、聚甘油脂肪酸酯、单月桂酸四甘油酯(ML310)、单油酸四甘油酯(MO310)、单油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、单癸酸十甘油酯(MCA750)、单油酸十甘油酯(MO750)、连续油酸十甘油酯(SO750)、十油酸十甘油酯(DAO750)，单独或与助表面活性剂组合。助表面活性剂，通常是短链醇，如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，通过渗透到表面活性剂膜中，并且由于表面活性剂分子之间产生的空隙空间而产生无序膜，从而增加界面流动性。然而，可以在不使用助表面活性剂的情况下制备微乳液，并且本领域已知无醇自乳化微乳液系统。水相通常可以是但不限于水、药物的水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇和乙二醇的衍生物。油相可以包含但不限于材料，如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中链(C8-C12)单、二和三甘油酯、聚氧乙烯化甘油脂肪酸酯、脂肪醇、聚乙二醇化甘油酯、饱和聚乙二醇化C8-C10甘油酯、植物油和硅酮油。

从药物增溶和增强药物吸收的角度来看，微乳液尤其引人关注。已经提出了基于脂质的微乳液(o/w和w/o两者)来提高包含肽在内的药物的口服生物利用度(参见例如，美国专利第6,191,105号；第7,063,860号；第7,070,802号；第7,157,099号；Constantinides等人,《药物研究(Pharmaceutical Research)》,1994,11,1385-1390；Ritschel,《实验和临床药理学的方法和发现(Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.)》,1993,13,205)。微乳液具有改善药物增溶、保护药物免受酶水解、由于表面活性剂诱导的膜流动性和渗透性的改变而可能增强药物吸收、易于制备、相对于固体剂型易于口服施用、提高临床效力以及降低的毒性等优点(参见例如，美国专利第6,191,105号；第7,063,860号；第7,070,802号；第7,157,099号；Constantinides等人,《药物研究》,1994,11,1385；Ho等人,《药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)》,1996,85,138-143)。当微乳液的组分在环境温度下聚集在一起时，通常可以自发形成微乳液。这在调配不耐热药物、肽或RNAi药剂时尤其有利。微乳液在化妆品和药物应用两者中对活性组分的透皮递送也很有效。预期本公开的微乳液组合物和调配物将促进RNAi药剂和核酸从胃肠道的增加的全身吸收，以及改善RNAi药剂和核酸的局部细胞摄取。

本公开的微乳液还可以含有另外的组分和添加剂，如脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Grill 3)、Labrasol和增渗剂，以改善调配物的特性并增强本公开的RNAi药剂和核酸的吸收。本公开的微乳液中使用的增渗剂可以分类为五大类之一——表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(Lee等人,《治疗药物载体系统的关键综述(CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)》,1991,第92页)。这些类别中的每一个都已经在上文进行了讨论。

iii.微颗粒

本公开的RNAi药剂可以掺入到颗粒中，例如微颗粒中。微颗粒可以通过喷雾干燥生产，但也可以通过其它方法生产，包含冻干、蒸发、流化床干燥、真空干燥或这些技术的组合。

iv.增渗剂

在一个实施例中，本公开使用各种增渗剂来实现核酸，特别是RNAi药剂到动物皮肤的有效递送。大多数药物以电离和非电离两种形式存在于溶液中。然而，通常只有脂溶性或亲脂性药物容易穿过细胞膜。已经发现，如果用增渗剂处理待穿过的膜，即使是非亲脂性药物也可以穿过细胞膜。除了有助于非亲脂性药物穿过细胞膜的扩散外，增渗剂还可以增强亲脂性药物的渗透性。

增渗剂可以分为五大类之一，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(参见例如，Malmsten,M.《药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactantsand polymers in drug delivery)》,纽约州纽约的Informa医疗健康公司(InformaHealth Care,New York,NY),2002；Lee等人,《治疗药物载体系统的关键综述》,1991,第92页)。下面更详细地描述上述每一类增渗剂。

表面活性剂(surfactant)(或“表面活性剂(surface-active agent)”)是化学实体，当其溶解在水溶液中时，会降低溶液的表面张力或水溶液与另一种液体之间的界面张力，从而增强RNAi药剂通过粘膜的吸收。除了胆汁盐和脂肪酸之外，这些增渗剂还包含例如，十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-十二烷基醚和聚氧乙烯-20-鲸蜡醚)(参见例如，Malmsten,M.《药物递送中的表面活性剂和聚合物》,纽约州纽约的Informa医疗健康公司,2002；Lee等人,《治疗药物载体系统的关键综述》,1991,第92页)；以及全氟化学乳液，如FC-43。Takahashi等人,《药学和药理学杂志(J.Pharm.Pharmacol.)》,1988,40,252)。

作为增渗剂的各种脂肪酸以及其衍生物包含例如，油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、单油酸甘油酯(1-单油酰基-rac-甘油)、二月桂酸甘油酯、辛酸、花生四烯酸、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮，酰基肉碱、酰基胆碱、其C

胆汁的生理作用包含促进脂质和脂溶性维生素的分散和吸收(参见例如，Malmsten,M.《药物递送中的表面活性剂和聚合物》,纽约州纽约的Informa医疗健康公司,2002；Brunton,第38章:《古德曼和吉尔曼治疗学的药理学基础(Goodman&Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics)》,第9版,Hardman等人,编辑,纽约的麦格劳·希尔出版社(McGraw-Hill,New York),1996,第934-935页)。各种天然胆汁盐以及其合成衍生物作为增渗剂。因此，术语“胆汁盐”包含胆汁的任何天然存在的组分以及其任何合成衍生物。合适的胆汁盐包含例如，胆酸(或其药学上可接受的钠盐，胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、葡胆酸(葡胆酸钠)、甘胆酸(甘胆酸钠)、甘脱氧胆酸(甘脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)、熊脱氧胆酸(UDCA)、牛磺基-24,25-二氢-富西酸钠(STDHF)、甘二氢富西酸钠和聚氧乙烯-9-十二烷基醚(POE)(参见例如，Malmsten,M.《药物递送中的表面活性剂和聚合物》,纽约州纽约的Informa医疗健康公司,2002；Lee等人,《治疗药物载体系统的关键综述》,1991,第92页；Swinyard,第39章:《雷明顿药物科学》,第18版，Gennaro编辑,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司,1990,第782-783页；Muranishi,《治疗药物载体系统的关键综述》,1990,7,1-33；Yamamoto等人,《药理和实验治疗学杂志(J.Pharm.Exp.Ther.)》,1992,263,25；Yamashita等人,《药物科学杂志》,1990,79,579-583)。

如与本公开结合使用的螯合剂可以定义为通过与溶液形成复合物来从溶液中去除金属离子的化合物，其结果是增强了RNAi药剂通过粘膜的吸收。关于其本公开中作为增渗剂的用途，螯合剂还具有作为DNase抑制剂的另外的优点，因为大多数表征的DNA核酸酶需要二价金属离子进行催化，并且因此被螯合剂抑制(Jarrett,《色谱杂志(J.Chromatogr.)》,1993,618,315-339)。合适的螯合剂包含但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸酯(例如，水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸酯和高香草酸酯)、胶原蛋白的N-酰基衍生物、β-二酮(烯胺)的月桂醇聚醚-9和N-氨基酰基衍生物(参见例如，Katdare,A.等人,《用于药物、生物技术和药物递送的赋形剂开发(Excipient development forpharmaceutical,biotechnology,and drug delivery)》,马萨诸塞州丹弗斯的CRC出版社,2006；Lee等人,《治疗药物载体系统的关键综述》,1991,第92页；Muranishi,《治疗药物载体系统的关键综述》,1990,7,1-33；Buur等人,《控释杂志(J.Control Rel.)》,1990,14,43-51)。

如本文所使用的，非螯合非表面活性剂渗透增强化合物可以定义为作为螯合剂或表面活性剂表现出不显著的活性，但仍然增强RNAi药剂通过消化道粘膜的吸收的化合物(参见例如，Muranishi,《治疗药物载体系统的关键综述》,1990,7,1-33)。此类增渗剂包含例如，不饱和环脲、1-烷基-和1-烯基氮杂环-烷酮衍生物(Lee等人,《治疗药物载体系统的关键综述》,1991,第92页)；和非甾体抗炎剂，如双氯芬酸钠、吲哚美辛和苯基丁氮酮(Yamashita等人,《药学和药理学杂志》,1987,39,621-626)。

在细胞水平上增强RNAi药剂的摄取的药剂也可以添加到本公开的药物和其它组合物中。例如，阳离子脂质，如lipofectin(Junichi等人,美国专利第5,705,188号)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子，如聚赖氨酸(WO 97/30731)也已知可增强dsRNA的细胞摄取。

其它药剂可以用于增强施用的核酸的渗透，包含二醇，如乙二醇和丙二醇，吡咯，如2-吡咯、氮酮和萜烯，如柠檬烯和薄荷酮。

vi.赋形剂

与载体化合物相比，“药物载体”或“赋形剂”是药学上可接受的溶剂、悬浮剂或任何其它用于将一种或多种核酸递送到动物的药理学惰性媒剂。赋形剂可以是液体的或固体的并且在考虑计划的施用方式的情况下被选择，以便在与核酸和给定药物组合物的其它组分组合时提供期望的体积、一致性等。典型的药物载体包含但不限于结合剂(例如，预凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(例如，乳糖和其它糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯、磷酸氢钙等)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、硅石、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如，淀粉、羟乙酸淀粉钠等)；以及润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠等)。

适于非肠胃外施用的不与核酸发生有害反应的药学上可接受的有机或无机赋形剂也可以用于调配本公开的组合物。适合的药学上可接受的载体包含但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

用于局部施用核酸的调配物可以包含无菌和非无菌水溶液、普通溶剂(如醇)中的非水溶液或核酸在液体或固体油基中的溶液。所述溶液还可以含有缓冲液、稀释剂和其它合适的添加剂。可以使用适于非肠胃外施用的不与核酸发生有害反应的药学上可接受的有机或无机赋形剂。

适合的药学上可接受的赋形剂包含但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

vii.其它组分

本公开的组合物可以另外含有在药物组合物中常规存在的其它附属组分，处于其现有技术确定的使用水平。因此，例如，组合物可以含有另外的相容性药物活性材料，例如，止痒药、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可以含有可用于物理调配本公开的组合物的各种剂型的另外的材料，如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、不透明剂、增稠剂和稳定剂。然而，这种材料，在添加时，不应该不适当地干扰本公开的组合物的成分的生物活性。调配物可以进行灭菌，并且如果期望的话，可以与不与所述调配物的核酸有害地相互作用的助剂，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂、调味剂或芳香物质等混合。

含水悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质包含例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。悬浮液也可以含有稳定剂。

在一些实施例中，本公开特征的药物组合物包含(a)一种或多种RNAi药剂和(b)通过非RNAi机制发挥作用并且可用于治疗PRNP相关病症的一种或多种药剂。此类药剂的实例包含但不限于SSRI、文拉法辛(venlafaxine)、安非他酮(venlafaxine)和非典型抗精神病药物。

此类化合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养或实验动物中的标准制药程序来确定，例如用于确定LD

从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于调配用于在人中使用的剂量范围。本公开中本文特征的组合物的剂量通常在包含ED

除了其施用之外，如上所述，本公开中特征的RNAi药剂可以与其它已知药剂组合施用，所述其它已知药剂在治疗由核苷酸重复表达介导的病理过程中有效。在任何情况下，施用医师可以基于使用本领域已知或本文所描述的功效的标准测量观察到的结果来调节RNAi药剂施用的量和时间。

VII.用于抑制PRNP表达的方法

本公开还提供了抑制细胞中PRNP基因的表达的方法。所述方法包含将细胞与RNAi药剂，例如，双链RNAi药剂接触，所述药剂的量有效地抑制细胞中PRNP的表达，由此抑制细胞中的PRNP的表达。在本公开的某些实施例中，PRNP在CNS(例如，脑)细胞中被优先抑制。在本公开的一些实施例中，PRNP在肝细胞(例如，肝细胞)中被抑制。在本公开的某些实施例中，PRNP在CNS(例如，脑)细胞中和在肝(例如，肝细胞)细胞中被抑制。

细胞与RNAi药剂，例如双链RNAi药剂的接触可以在体外或体内进行。使细胞与RNAi药剂体内接触包含使受试者(例如，人受试者)体内的细胞或细胞组与RNAi药剂接触。体外和体内接触细胞方法的组合也是可能的。

如上文所讨论的，接触细胞可以是直接的或间接的。此外，接触细胞可以通过靶向配体实现，包含本文所描述的或本领域已知的任何配体。在一些实施例中，靶向配体是碳水化合物部分，例如GalNAc配体，或将RNAi药剂引导到所关注的位点的任何其它配体。

如本文所使用的，术语“抑制(inhibiting)”可以与“减少”、“沉默”、“下调”、“抑制(suppressing)”和其它类似术语互换使用，并且包含任何水平的抑制。在某些实施例中，可以在细胞培养条件下评估抑制水平，例如，对于本公开的RNAi药剂，例如，其中细胞培养中的细胞通过Lipofectamine

如本文所用的，短语“抑制PRNP基因的表达”或“抑制PRNP的表达”包含抑制任何PRNP基因(例如，小鼠PRNP基因、大鼠PRNP基因，猴PRNP基因或人PRNP基因)以及编码PRNP蛋白的PRNP基因变体或突变体的表达。因此，在基因操纵的细胞、细胞组或生物体的背景下，PRNP基因可以是野生型PRNP基因、突变体PRNP基因或转基因PRNP基因。

“抑制PRNP基因的表达”包含对PRNP基因的任何水平的抑制，例如至少部分抑制PRNP基因的表达，如抑制至少20％。在某些实施例中，抑制至少30％、至少40％、优选地至少50％、至少约60％、至少70％、至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％；或低于测定方法的检测水平。在优选的方法中，使用实例1中提供的荧光素酶测定法在10nM浓度的siRNA下测量抑制。

PRNP基因的表达可以基于与PRNP基因表达相关的任何变量的水平来评估，例如，PRNP mRNA水平或PRNP蛋白水平，或例如与神经元细胞死亡相关的大脑的区域的PRNP沉积的水平。

可以通过与对照水平相比这些变量中的一个或多个的绝对或相对水平的降低来评估抑制。对照水平可以是本领域中使用的任何类型的对照水平，例如，给药前基线水平，或从未经治疗或用对照(例如，仅缓冲液对照或无活性药剂对照)治疗的类似受试者、细胞或样品中确定的水平。

在本公开的方法的一些实施例中，PRNP基因的表达被抑制至少20％、30％、40％，优选地至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％，或低于测定的检测水平。在某些实施例中，所述方法包含对PRNP的表达的临床相关抑制，例如，如用减少PRNP的表达的药剂治疗受试者后的临床相关结果所证明的。

PRNP基因的表达的抑制可以通过第一细胞或细胞组(例如，此类细胞可以存在于源自受试者的样品中)表达的mRNA的量的减少来表现，在所述细胞或细胞组中，PRNP的基因被转录并且已经被处理(例如，通过使一个或多个细胞与本公开的RNAi药剂接触，或通过向存在或曾经存在所述细胞的受试者施用本公开的RNAi药剂)，从而与基本上与第一细胞或细胞组相同但尚未如此处理的第二细胞或细胞组(未用RNAi药剂处理或未用靶向所关注的基因的RNAi药剂处理的对照细胞)相比，PRNP基因的表达受到抑制。抑制程度可以用以下方式表示：

在其它实施例中，可以根据与PRNP基因表达(例如，PRNP蛋白表达)功能性相关的参数的减少来评估PRNP基因的表达的抑制。PRNP基因沉默可以在任何表达PRNP的细胞中确定，无论是内源性的还是来自表达构建体的异源性的，并且通过本领域已知的任何测定。

PRNP蛋白的表达的抑制可以通过细胞或细胞组(例如，源自受试者的样品中表达的蛋白质水平)表达的PRNP蛋白水平的降低来表现。如上文所解释的，为了评估mRNA抑制，处理的细胞或细胞组中蛋白质表达水平的抑制可以类似地表达为对照细胞或细胞组中蛋白质水平的百分比。

可以用于评估PRNP基因的表达抑制的对照细胞或细胞组包含尚未与本公开的RNAi药剂接触的细胞或细胞组。例如，在用RNAi药剂治疗受试者之前，对照细胞或细胞组可以源自个体受试者(例如，人或动物受试者)。

细胞或细胞组表达的PRNP mRNA的水平可以使用本领域已知的用于评估mRNA表达的任何方法来确定。在一个实施例中，通过检测转录的多核苷酸或其部分，例如PRNP基因的mRNA来确定样品中PRNP的表达水平。可以使用RNA提取技术从细胞中提取RNA，包含例如使用酸酚/异硫氰酸胍提取(RNAzol B；生物起源公司(Biogenesis))、RNeasy

在一些实施例中，使用核酸探针确定PRNP的表达水平。如本文所使用的，术语“探针”是指能够与特定PRNP核酸或蛋白质或其片段选择性地结合的任何分子。探针可以由本领域技术人员合成，或源自适当的生物制剂。探针可以专门设计成被标记。可以用作探针的分子的实例包含但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。

分离的mRNA可以用于杂交或扩增测定，包含但不限于Southern分析或northern分析、聚合酶链式反应(PCR)分析和探针阵列。一种用于确定mRNA水平的方法涉及将分离的mRNA与可以与PRNP mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。在一个实施例中，mRNA被固定在固体表面上并与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶上运行分离的mRNA并将mRNA从凝胶转移到膜，如硝酸纤维素。在替代性实施例中，探针固定在固体表面上，并且mRNA与探针接触，例如，在

用于确定样品中PRNP的表达水平的替代性方法涉及样品中例如mRNA的核酸扩增或逆转录酶(以制备cDNA)的过程，例如通过RT-PCR(Mullis,1987,美国专利第4,683,202号中所述的实验实施例)、连接酶链式反应(Barany(1991)《美国国家科学院院刊》88:189-193)、自持序列复制(Guatelli等人,(1990)《美国国家科学院院刊》87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等人(1989)《美国国家科学院院刊》86:1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等人,(1988)《生物/技术(Bio/Technology)》6:1197)、滚环复制(Lizardi等人,美国专利第5,854,033号)或任何其它核酸扩增方法，然后使用本领域技术人员众所周知的技术检测扩增的分子。如果此类核酸分子以非常低的数量存在，则这些检测方案对于检测核酸分子特别有用。在本公开的特定方面，PRNP的表达的水平通过定量荧光RT-PCR(即TaqMan

PRNP mRNA的表达水平可以使用膜印迹(如用于杂交分析，如northern、Southern、斑点等)或微孔、样品管、凝胶、珠或纤维(或任何包括结合核酸的固相载体)来监测。参见美国专利第5,770,722号、第5,874,219号、第5,744,305号、第5,677,195号和第5,445,934号，所述美国专利通过引用并入本文。PRNP表达水平的确定也可以包括在溶液中使用核酸探针。

在一些实施例中，使用支链DNA(bDNA)测定或实时PCR(qPCR)来评估mRNA表达的水平。此PCR方法的使用在本文给出的实例中进行了描述和例示。此类方法也可以用于检测PRNP核酸。

PRNP蛋白表达的水平可以使用本领域已知的任何用于测量蛋白质水平的方法来确定。此类方法包含，例如，电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、超扩散色谱法、流体或凝胶沉淀反应、吸收光谱法、比色测定、分光光度测定、流式细胞术、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、电化学发光测定等。此类测定也可以用于检测指示PRNP蛋白的存在或复制的蛋白质。

在一些实施例中，本公开的方法在治疗PRNP相关疾病中的功效通过PRNP mRNA水平的降低来评估(例如，通过评估CSF样品的PRNP水平，通过脑活检，或其它方式)。

在一些实施例中，本公开的方法在治疗PRNP相关疾病中的功效通过PRNP mRNA水平的降低来评估(例如，通过评估肝样品的PRNP水平，通过活检，或其它方式)。

在本公开的方法的一些实施例中，向受试者施用RNAi药剂，从而将RNAi药剂递送到受试者体内的特定位点。PRNP的表达的抑制可以使用源自受试者体内特定部位(例如，CNS细胞)的样品中PRNP mRNA或PRNP蛋白的水平或水平变化的测量来评估。在某些实施例中，所述方法包含对PRNP的表达的临床相关抑制，例如，如用减少PRNP的表达的药剂治疗受试者后的临床相关结果所证明的。

如本文所使用的，术语检测或确定分析物的水平被理解为执行步骤以确定是否存在材料(例如，蛋白质、RNA)。如本文所使用的，检测或确定的方法包含检测或确定低于所使用的方法的检测水平的分析物水平。

VIII.PRNP相关疾病的治疗或预防方法

本公开还提供了使用本公开的RNAi药剂或含有本公开的RNAi药剂的组合物来减少或抑制细胞中PRNP表达的方法。所述方法包含使细胞与本公开的dsRNA接触，并且将细胞维持足够的时间以获得PRNP基因的mRNA转录物的降解，由此抑制PRNP基因在细胞中的表达。基因表达的减少可以通过本领域已知的任何方法进行评估。例如，PRNP的表达的减少可以使用本领域普通技术人员常规的方法，通过确定PRNP的mRNA表达水平来确定，例如northern印迹、qRT-PCR；通过使用本领域普通技术人员常规的方法，如蛋白质印迹、免疫技术确定PRNP的蛋白质水平来确定。

在本公开的方法中，细胞可以在体外或体内接触，即细胞可以在受试者体内。

适用于使用本公开的方法进行处理的细胞可以是表达PRNP基因的任何细胞。适用于本公开的方法的细胞可以是哺乳动物细胞，例如灵长类细胞(如人细胞或非人灵长类动物细胞，例如猴细胞或黑猩猩细胞)、非灵长类动物细胞(如大鼠细胞或小鼠细胞。在一个实施例中，细胞是人细胞，例如人CNS细胞。在一个实施例中，细胞是人细胞，例如，人肝细胞。在一个实施例中，细胞是人细胞，例如，人CNS细胞或人肝细胞。

PRNP表达在细胞中被抑制至少约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％，即低于检测水平。在优选的实施例中，PRNP表达被抑制至少50％。

本公开的体内方法可包含向受试者施用含有RNAi药剂的组合物，其中所述RNAi药剂包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与待治疗的哺乳动物的PRNP基因的RNA转录物的至少一部分互补。当待治疗的生物体是如人等哺乳动物时，组合物可以通过本领域已知的任何方式施用，包含但不限于口服、腹膜内或肠胃外途径，包含颅内(例如，心室内、脑实质内和鞘内)、静脉内、肌内、皮下、透皮、气道(气溶胶)、鼻内、直肠和局部(包含经颊和舌下)施用。在某些实施例中，组合物通过静脉输注或注射施用。在某些实施例中，组合物通过皮下注射施用。在某些实施例中，组合物通过鞘内注射施用。

在一些实施例中，通过贮库注射进行施用。贮库注射可以在长时间段内以一致的方式释放RNAi药剂。因此，贮库注射可以减少获得期望的效果(例如，PRNP的期望的抑制，或治疗或预防效果)所需的给药频率。贮库注射也可以提供更一致的血清浓度。贮库注射可以包含皮下注射或肌内注射。在优选实施例中，贮库注射是皮下注射。

在一些实施例中，通过泵进行施用。泵可以是外部泵或外科植入的泵。在某些实施例中，泵是皮下植入的渗透泵。在其它实施例中，泵是输注泵。输注泵可以用于颅内、静脉内、皮下、动脉或硬膜外输注。在优选实施例中，输注泵是皮下输注泵。在其它实施例中，泵是外科手术植入的泵，所述外科手术植入的泵将RNAi药剂递送到CNS。

可以基于是否期望局部或全身治疗以及基于待治疗的区域来选择施用模式。可以选择施用的通路和位点来增强靶向。

一方面，本公开还提供了用于抑制哺乳动物的PRNP基因的表达的方法。所述方法包含向哺乳动物施用包括靶向哺乳动物的细胞中的PRNP基因的dsRNA的组合物，并且维持哺乳动物足够的时间以获得PRNP基因的mRNA转录物的降解，由此抑制细胞中PRNP基因的表达。基因表达的减少可以通过本领域已知的任何方法和通过本文所描述的方法(例如，qRT-PCR)来评估。蛋白质产生的减少可以通过本领域已知的任何方法和通过本文所描述的方法(例如，ELISA)来评估。在一个实施例中，CNS活检样品或脑脊液(CSF)样品用作组织材料，用于监测PRNP基因或蛋白质表达(或因此的替代物)的减少。

本公开进一步提供了治疗有需要的受试者的方法。本公开的治疗方法包含以治疗有效量的靶向PRNP基因的RNAi药剂或包括靶向PRNP基因的RNAi药剂的药物组合物向受试者(例如，将受益于PRNP表达抑制的受试者)施用本公开的RNAi药剂。

另外，本公开提供了预防、治疗或抑制PRNP相关疾病或病症，如朊病毒病的进展的方法，例如，遗传性朊病毒病，例如，家族性克雅二氏病(CJD)、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克综合征(GSS)和致命性家族性失眠症(FFI)；散发性朊病毒病，例如，散发性克雅二氏病、散发性致命性失眠症(sFI)和变异型蛋白酶敏感性朊蛋白病(VPSPr)；或后天性朊病毒病，例如，医源性CJD(iCJD)、库鲁病和变体CJD(vCJD)。所述方法包含向受试者施用治疗有效量的任何RNAi药剂，例如dsRNA药剂，或本文所提供的药物组合物，由此预防、治疗或抑制受试者的PRNP相关疾病或病症的进展。

本公开的RNAi药剂可以作为“游离RNAi药剂”施用。在不存在药物组合物的情况下施用游离RNAi药剂。裸露的RNAi药剂可以在合适的缓冲溶液中。缓冲溶液可以包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐，或其任何组合。在一个实施例中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。可以调节含有RNAi药剂的缓冲溶液的pH和渗透压，使得其适合向受试者施用。

可替代地，本公开的RNAi药剂可以作为药物组合物，如dsRNA脂质体调配物施用。

将从PRNP基因表达的减少或抑制中受益的受试者是那些患有PRNP相关疾病的受试者。

本公开进一步提供了RNAi药剂或其药物组合物用于例如治疗将受益于PRNP表达的减少或抑制的受试者(例如，患有PRNP相关病症的受试者)的方法和用途，其与其它药物或其它治疗方法组合，例如，与已知药物或已知治疗方法组合，例如目前用于治疗这些病症的那些药物或治疗方法。例如，在某些实施例中，靶向PRNP的RNAi药剂与例如本文其它地方描述的或本领域已知的用于治疗PRNP相关病症的药剂组合施用。例如，适用于治疗将受益于PRNP表达减少的受试者(例如，患有PRNP相关病症的受试者)的另外的药剂和治疗可以包含目前用于治疗PRNP的症状的药剂。RNAi药剂和另外的治疗剂可以同时或以相同的组合施用，例如鞘内，或另外的治疗剂可以作为单独的组合物的一部分或在单独的时间施用，或通过本领域已知或本文所描述的另一种方法施用。

示例性另外的治疗剂和治疗包含，例如，镇静剂、抗抑郁药、氯硝西泮、丙戊酸钠、阿片类、抗癫痫药、胆碱酯酶抑制剂、美金刚、苯二氮卓类、左旋多巴、COMT抑制剂(例如，托卡朋和恩他卡朋)、多巴胺激动剂(例如，溴隐亭、培高利特、普拉克索、罗匹尼罗、吡贝地尔、卡麦角林、阿朴吗啡和麦角乙脲)、MAO-B抑制剂(例如，沙非酰胺、司来吉兰和雷沙吉兰)、金刚烷胺、抗胆碱剂、莫达非尼、匹莫范色林、多虑平、雷沙林、抗精神病药、非典型抗精神病药(例如，氨磺必利、奥氮平、利培酮和氯氮平)、利鲁唑、依达拉奉(edaravone)、深部脑刺激、无创通气(NIV)、有创通气物理疗法、职业疗法、言语疗法、饮食变化和吞咽技术、饲管、PEG管、益生菌和心理疗法。

在一个实施例中，所述方法包含施用本文特征的组合物，使得靶PRNP基因的表达降低至少一个月。在一些实施例中，表达降低至少2个月或6个月。

优选地，可用于本文特征的方法和组合物的RNAi药剂特异性靶向靶PRNP基因的RNA(初级或加工的)。使用RNAi药剂抑制这些基因的表达的组合物和方法可以如本文所描述的制备和进行。

根据本公开的方法施用dsRNA可以导致患有PRNP相关病症的患者的此类疾病或病症的严重程度、体征、症状或标志物的降低。在此上下文中，“减少”意指此类水平在统计学上显著或临床上显著减少。减少可以是例如至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或约100％。

可以例如通过测量疾病进展、疾病缓解、症状严重程度、疼痛减轻、生活质量、维持治疗效果所需的药物剂量、疾病标志物水平或适用于正在治疗或以预防为目标的给定疾病的任何其它可测量参数来评估疾病的治疗或预防功效。通过测量此类参数中的任一个或参数的任何组合来监测治疗或预防的功效完全在本领域技术人员的能力范围内。例如，可以通过例如对受试者的认知、学习或记忆的定期监测来评估PRNP相关病症的治疗功效。后期读数与初始读数的比较为医师提供了治疗是否有效的指示。通过测量此类参数中的任一个或参数的任何组合来监测治疗或预防的功效完全在本领域技术人员的能力范围内。关于靶向PRNP的RNAi药剂或其药物组合物的施用，“有效对抗”PRNP相关病症表明，以临床适当的方式施用对至少一部分具有统计学意义的患者产生有益效果，如症状的改善、治愈、疾病的减少、寿命的延长，生活质量的改善或熟悉治疗PRNP相关病症和相关原因的医生通常认为是积极的其它效果。

当疾病状态的一个或多个参数有统计上显著的改善时，或由于没有恶化或出现预期的症状，治疗或预防效果是明显的。例如，疾病的可测量参数的至少10％的有利变化，并且优选地至少20％、30％、40％、50％或更多的有利变化可以指示有效的治疗。也可以使用本领域已知的给定疾病的实验动物模型来判断给定RNAi药剂药物或该药物的调配物的功效。当使用实验动物模型时，当观察到标志物或症状在统计学上显著减少时，就证明了治疗的功效。

可替代地，功效可以通过由诊断领域的技术人员基于临床上可接受的疾病严重程度分级量表确定的疾病严重度的降低来测量。任何导致例如使用适当量表测量的疾病严重程度减轻的积极变化表示使用本文所描述的RNAi药剂或RNAi药剂调配物的充分治疗。

可以向受试者施用治疗量的dsRNA，如约0.01mg/kg至约200mg/kg。

RNAi药剂可以定期鞘内、通过心室内或通过静脉内输注施用一段时间。在某些实施例中，在初始治疗方案之后，可以在不太频繁的基础上施用治疗。RNAi药剂的施用可以将例如患者的细胞、组织、血液、CSF样品或其它区室中的PRNP水平降低至少20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少约99％或更多。在优选实施例中，RNAi药剂的施用可以将例如患者的细胞、组织、血液、CSF样品或其它区室中的PRNP水平降低至少50％。

在施用全剂量的RNAi药剂之前，可以向患者施用较小的剂量，如5％的输注反应，并且监测不良反应，如过敏反应。在另一个实例中，可以监测患者不期望的免疫刺激作用，如增加的细胞因子(例如，TNF-α或INF-α)水平。

可替代地，RNAi药剂可以皮下施用，即通过皮下注射。一次或多次注射可以用于向受试者递送期望的，例如每月剂量的RNAi药剂。注射可以在一个时间段内重复进行。可以定期重复施用。在某些实施例中，在初始治疗方案之后，可以在不太频繁的基础上施用治疗。重复剂量方案可以包含定期施用治疗量的RNAi药剂，如每月或延长到每季度一次、每年两次、每年一次。在某些实施例中，RNAi药剂约每月施用一次至约每季度施用一次(即约每三个月施用一次)。

IX.试剂盒

在某些方面，本公开提供了试剂盒，所述试剂盒包含含有siRNA化合物(例如，双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如，前体，例如可以加工成ssiRNA化合物的较大siRNA化合物，或编码siRNA化合物的DNA，例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物，或其前体))的药物调配物的合适容器。

此类试剂盒包含一种或多种dsRNA药剂和使用说明书，例如，施用预防或治疗有效量的dsRNA药剂的说明书。dsRNA药剂可以在小瓶或预先填充的注射器中。试剂盒可以任选地进一步包括用于施用dsRNA药剂的装置(例如，注射装置，如预填充注射器)，或用于测量PRNP的抑制的装置(例如，用于测量PRNP mRNA、PRNP蛋白和/或PRNP活性的抑制的装置)。用于测量PRNP的抑制的此类装置可以包括用于从受试者获得样品(例如，CSF和/或血浆样品)的装置。本发明的试剂盒可以任选地进一步包括用于确定治疗有效量或预防有效量的装置。

在某些实施例中，药物调配物的各个组分可以提供在一个容器中，例如，小瓶或预填充的注射器。可替代地，可能期望在两个或更多个容器中单独提供药物调配物的组分，例如，一个容器用于siRNA化合物制剂，并且至少另一个用于载体化合物。试剂盒可以包装在许多不同的配置中，如单个盒子中的一个或多个容器。可以将不同的组分组合，例如，根据随试剂盒提供的说明书。这些组分可以根据本文所描述的方法进行组合，例如，以制备和施用药物组合物。试剂盒还可以包含递送装置。

除非另有定义，否则本文中所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管类似或等效于本文所描述的方法和材料的方法和材料可以用于实践或测试本发明特征的RNAi药剂和方法，但下文描述了合适的方法和材料。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，将以本说明书(包含定义)为准。另外，所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在进行限制。

非正式的序列标随此提交，并形成所提交的说明书的一部分。

实例

实例1：RNAi药剂设计、合成、选择和体外评估

此实例描述了用于PRNP RNAi药剂的设计、合成、选择和体外评估的方法。

试剂来源

在本文没有具体给出药剂来源的情况下，此类试剂可以从任何分子生物学试剂供应商处获得，其质量/纯度标准适用于分子生物学。

生物信息学

靶向人朊病毒蛋白(PRNP)基因(人：NCBI refseqID NM_000311.5；NCBI GeneID：5261)是使用定制R和Python脚本设计的。人NM_000311.5REFSEQ mRNA，具有2435个碱基的长度。

未经修饰的PRNP有义和反义链核苷酸序列的详细列表在表2中示出。经修饰的PRNP有义和反义链核苷酸序列的详细列表在表3中示出。

应理解，在整个应用程序中，没有小数的双链体名称等效于具有仅引用双链体的批号的具有小数的双链体名称。例如，AD-564727等效于AD-564727.1。

siRNA合成

使用本领域已知的常规方法合成并退火siRNA。简而言之，siRNA序列是使用Mermade 192合成器(生物自动化公司(BioAutomation))在1μmol的规模上合成的，所述合成器在固相载体上具有亚磷酰胺化学。固相载体是受控孔玻璃

固相合成完成后，用300μL的甲胺(40％水溶液)在室温下在96孔板中处理固相支持的寡核糖核苷酸约2小时，以从固相载体中切割，并且随后去除所有另外的碱不稳定保护基。对于含有用叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)基团保护的任何天然核糖核苷酸键(2'-OH)的序列，使用TEA.3HF(三乙基胺三氢氟酸盐)进行第二次脱保护步骤。向甲胺水溶液中的每个寡核苷酸溶液中添加200μL的二甲基亚砜(DMSO)和300μL TEA.3HF，并且将溶液在60℃下温育约30分钟。温育后，使板达到室温，并且通过添加1mL的9:1乙腈:乙醇或1:1乙醇:异丙醇沉淀粗寡核苷酸。然后将板在4℃下离心45分钟，并且在多通道移液管的帮助下小心倾析上清液。将寡核苷酸颗粒重悬于20mM NaOAc中，并且随后在配备有自动进样器、UV检测器、电导率计和级分收集器的Agilent LC系统上使用HiTrap尺寸排除柱(5mL，通用电气医疗集团(GE Healthcare))脱盐。在96孔板中收集脱盐样品，并且然后通过LC-MS和UV光谱法进行分析，以分别证实材料的同一性和定量。

在Tecan液体处理机器人上进行单链的双面折叠。在96孔板中，将有义和反义单链以等摩尔比组合到1x PBS中的最终浓度10μM，将板密封，在100℃下温育10分钟，并且随后允许其在2小时至3小时内缓慢恢复到室温。证实每个双链体的浓度和同一性，并且然后用于体外筛选测定。

体外筛选测定

细胞培养和转染

在具有EMEM:F12培养基(Gibco目录号11765054)的人神经母细胞瘤BE(2)C细胞(ATCC CRL-2268)和具有EMEM培养基的小鼠神经母细胞瘤Neuro2A细胞(ATCC CCL-131)中进行转染实验。通过将4.9μL Opti-MEM加0.1μL RNAiMAX每孔(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad CA.)，目录号13778-150)添加到5μL siRNA双链体每孔中，每个siRNA双链体重复4次，将细胞转染到384孔板中，并在室温下温育15分钟。然后将四十μL含有约5x10

使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒的总RNA分离

使用DYNABEADs(英杰公司，目录号61012)在BioTek-EL406平台上使用自动化方案分离RNA。简而言之，将70μL的裂解/结合缓冲液和10μL的含有3μL磁珠的裂解缓冲液添加到具有细胞的板中。在室温下将板在电磁振荡器上温育10分钟，并且然后捕获磁珠并去除上清液。然后用150μL洗涤缓冲液A洗涤珠结合RNA 2次，并且用洗涤缓冲液B洗涤一次。然后用150μL洗脱缓冲液洗涤珠，重新捕获并去除上清液。

使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(加利福尼亚州福斯特市的应用生物系统公司

向上述分离的RNA中添加十μL主混合物，所述主混合物每次反应含有1μL 10X缓冲液、0.4μL 25X dNTP、1μL 10x随机引物、0.5μL逆转录酶、0.5μL RNase抑制剂和6.6μL H

实时PCR

将二μL的cDNA添加到主混合物中，所述主混合物在384孔板(罗氏公司目录号04887301001)中每孔含有0.5μL的人或小鼠GAPDH TaqMan探针(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)目录4352934E或4351309)和0.5μL的适当的PRNP探针(可从例如赛默飞世尔公司商购获得)和5μL Lightcycler 480探针主混合物(罗氏公司(Roche)目录号04887301001)。实时PCR是在LightCycler480实时PCR系统(罗氏公司)中进行的。用N＝4测试每个双链体，并且将数据相对于用非靶向对照siRNA转染的细胞归一化。为了计算相对折叠变化，使用ΔΔCt方法分析实时数据，并且将其相对于使用非靶向对照siRNA转染的细胞进行的测定归一化。

表2和表3中所列的dsRNA药剂在BE2C细胞中的转染实验结果如表4所示，并且表2和3中所列的dsRNA药剂在Neuro2a中的转染实验结果如表5所示。

表1：用于核酸序列表示的核苷酸单体的缩略语。应理解，当这些单体存在于寡核苷酸中时，通过5'-3'-磷酸二酯键相互连接；并且应理解，当核苷酸含有2'-氟修饰时，则氟替换亲本核苷酸中该位置处的羟基(即，其为2'-脱氧-2'-氟核苷酸)。

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表2：PRNP dsRNA药剂的未经修饰的有义和反义链序列

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表3.PRNP dsRNA药剂的经修饰的有义和反义链序列

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表4.BE2C细胞的体外筛选

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表5：Neuro2a细胞的体外筛选

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实例2：体内PRNP的剂量依赖性敲除

为了确定鞘内施用的靶向PRNP的dsRNA药剂的适当剂量，在第0天通过脑室内(ICV)注射向野生型小鼠(n＝4)施用单次50μg、150μg或300μg剂量的靶向PRNP的示例性dsRNA药剂、AD-1070516或对照、人工CSF(aCSF)。dsRNA药剂的剂量以10μl的体积施用，并且aCSF的剂量以5μL的体积施用。施用后第28天，处死动物并收集组织样品。通过qPCR确定右半球样品中的PRNP mRNA的水平，并且通过ELISA确定左半球样品中的PRNP蛋白的水平。

如图1中所描绘的，数据显示了PRNP mRNA的剂量依赖性敲除，其中50μg组具有约15％的PRNP mRNA敲除，150μg组具有约40％的PRNP mRNA敲除，并且300μg具有约60％的PRNP mRNA敲除。