一种基于嫁接蒙导技术获得属间杂交马铃薯远缘新种质的方法

技术领域

本发明涉及马铃薯育种技术领域，特别涉及一种基于嫁接蒙导技术获得属间杂交马铃薯远缘新种质的方法。

背景技术

马铃薯原产南美洲安第斯山，世界范围内马铃薯栽培种遗传基础狭窄，近交退化现象严重，抗性育种受资源限制。枸杞同为茄科植物，不会发生晚疫病，且耐旱，耐盐碱，是盐碱地造林先锋树种。嫁接作为农林生产中常用的技术手段，在提高生产效率、改善品质、保存种质资源和新的突变基因等方面发挥着重要作用。目前马铃薯晚疫病是威胁马铃薯生产的重要病害之一，每年造成产业严重损失。有研究表明砧木接穗间基因组会在嫁接中发生交流，而维管束和胞间连丝可能会给基因水平转移提供条件。Stegemann和Rock使用2个转基因烟草品系进行相互嫁接，其核基因和质体基因分别带有不同的标记和报告基因，报告基因的检测表明，质体基因组会在嫁接界面发生短距离转移。若是能通过嫁接手段将枸杞抗病基因转移到马铃薯植株中，获得新的种质资源或者中间材料，那将对马铃薯抗晚疫病研究提供新的思路。日本Ohta(1991)多年从事辣椒的嫁接杂交试验，不仅获得了嫁接杂种，而且还进一步从基因水平上对嫁接杂种进行研究，总结了一些孟德尔性状在嫁接后的遗传变异特点，发现诱导这些变异的机制与高等生物的转化机制相似。德国Stegemann和Bock(2006)将两种转基因烟草品系进行嫁接，结果显示，标记基因可以频繁地在嫁接部位的细胞间交换，说明砧木和接穗之间存在着横向基因转移。

目前对于嫁接蒙导技术以马铃薯为母本，以枸杞为父本，克服马铃薯远缘间植物有性育种障碍，获得属间杂交后代国内外报道目前仍未见到。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于嫁接蒙导技术获得属间杂交马铃薯远缘新种质的方法，克服马铃薯远缘间植物有性育种障碍，获得属间杂交后代。

本发明所要解决的一个技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种基于嫁接蒙导技术获得属间杂交马铃薯远缘新种质的方法，包括以下步骤：

(1)砧木的培育与选择：选用生长健壮无病虫害的枸杞偏上部位未木质化嫩枝为砧木；

(2)接穗的培育与选择：二倍体原始栽培种马铃薯2～3片展开叶幼苗为接穗；

(3)嫁接：用刀片将马铃薯幼苗从基部切下，摘去全部叶片，然后用刀片将接穗削成一对称斜面的楔形，楔面大小与砧木切口大小一致，保持楔面干净整洁，以劈接的方式嫁接，将接穗插入砧木切口，使二者切口对齐，然后用保险膜将砧木与接穗固定；

(4)嫁接后管理：嫁接完成后进入嫁接后管理；

(5)远缘杂交种质的获得：选择嫁接苗马铃薯花蕾授粉，获得自交结实的马铃薯品种种子，再将自交种子催芽，生产实生小薯，实生小薯经嫁接、授粉并获得远缘杂交种子，远缘杂交种子组织扩繁后收获F

优选地，所述步骤(5)具体包括以下步骤：

(51)选择嫁接苗马铃薯花蕾肥大，开花前1～2天的花蕾，拨开花瓣后，去除雄蕊；

(52)授粉，套袋，挂牌：采集枸杞花粉，每天上午对马铃薯/枸杞嫁接株进行授粉；

(53)子房膨大：初代嫁接马铃薯受枸杞花粉后子房少见膨大，脱落时间较同等对照延后5～7d；采集远缘嫁接亲和性好，接穗生长旺盛，能够自交结实的马铃薯自交种子，备用；

(54)自交种子催芽，生产实生小薯：上年获得接穗杂交种子预处理后拌细沙，播种，秋季收获实生小薯；

(55)实生小薯再次嫁接：将步骤(54)获得的实生小薯播种，待出苗后同一亲本的后代，称为姐妹系，姐妹系与枸杞再次嫁接，方法同上步骤(3)；

(56)姐妹系接穗授粉：采集枸杞花粉，每天上午对马铃薯/枸杞嫁接株进行授粉；

(57)姐妹系接穗子房膨大：授粉后，7～10d子房能够膨大；

(58)远缘杂交种子无菌培养：将获得远缘杂交种子播种在组培室1/2MS培养基上，进行组织扩繁，将无性繁殖茎段栽种于温室蛭石中，收获F1代无性克隆系原原种。

优选地，步骤(52)和步骤(56)的授粉方法为：采集父本枸杞的花粉涂抹在去雄后的花朵柱头上，并套袋挂标签，注明杂交日期，父本母本品种名称。

优选地，步骤(54)具体为：

将上年获得接穗杂交种子，1000倍赤霉素液体，浸泡48小时；

种子拌细沙，均匀撒在穴盘上，轻轻覆一层土；

播种40d后移栽到10cm×10cm营养钵内，正常肥水管理，秋季收获实生小薯。

优选地，步骤(55)具体为：马铃薯与枸杞嫁接后，同一品种自交结实种子生产的一系列实生小薯，称为姐妹系，将该姐妹系均播种，待出苗后与枸杞再次嫁接，方法同上步骤(3)。

优选地，步骤(1)中选取的砧木进行如下处理：

去除枸杞的顶芽，从顶部第一片完全叶与第二片完全叶之间的茎节间采用劈接法，用双面刀片从砧木顶端垂直向下切，刀口深度约1.0～1.5cm。

优选地，步骤(3)中，嫁接前先用75％的酒精擦拭刀片和手，进行消毒，每完成一组嫁接后，均要用酒精来消毒刀片和手，待酒精完全挥发干后，方能进行下一步操作。

本发明上述技术方案，具有如下有益效果：

本申请的出发点是世界范围内马铃薯栽培种遗传基础狭窄，近交退化现象严重，抗性育种受资源限制，同时目前马铃薯晚疫病是威胁马铃薯生产的重要病害之一，在此基础上，本申请利用枸杞不会发生晚疫病，且耐旱，耐盐碱，且同为茄科植物这一理由创建本申请。本发明以枸杞和马铃薯为基础，有效降低了枸杞和马铃薯不亲和性，快速实现枸杞与马铃薯远缘嫁接，且首次获得了远缘杂交后代，为拓宽马铃薯的抗性育种资源和远缘有性杂交提供了物质基础。

附图说明

图1为马铃薯与枸杞嫁接株形态特征图。其中：A外部条件，B初期，C愈合，D接穗变态茎，E生长势，F开花期，G受枸杞花粉子房膨大，H成熟期接穗自交结实。

图2为马铃薯/枸杞嫁接株受枸杞花粉20d子房膨大图。

图3为马铃薯/枸杞嫁接株×枸杞子房内获得后代。

图4为微型薯生产，其中a：组织培养扩繁的瓶苗移栽至蛭石椰糠基质内；b：获得F

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。

以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

一种基于嫁接蒙导技术获得属间杂交马铃薯新种质的方法，包括以下步骤：

(1)砧木的培育与选择：

选用生长健壮无病虫害的枸杞偏上部位未木质化嫩枝为砧木。

(2)接穗的培育与选择：

二倍体原始栽培种马铃薯2～3片展开叶幼苗为接穗。

(3)嫁接：

嫁接前先用75％的酒精擦拭刀片和手，进行消毒，每完成一组嫁接后，均要用酒精来消毒刀片和手，待酒精完全挥发干后，方能进行下一步操作。以下具体来说：

(31)砧木的准备：

去除枸杞的顶芽，从顶部第一片完全叶与第二片完全叶之间的茎节间采用劈接法，用双面刀片从砧木顶端垂直向下切，刀口深度约1.0～1.5cm。

(32)接穗的品种筛选：

筛选与枸杞嫁接亲和力高的马铃薯品种。马铃薯与枸杞嫁接株较未嫁接马铃薯生长势明显减弱。嫁接后接穗株高均显著低于对照(表1)，株高下降幅度47.1％～52.8％；茎节数嫁接与对照差异不显著，但平均节间长度显著变短，嫁接组节间长度平均下降幅度为49.7％；嫁接组平均分枝数也显著下降。

表1不同品种接穗马铃薯与非嫁接马铃薯开花期生长势比较

注：表中同列不同小写字母表示多重范围检测分析中0.05水平下的差异显著，表中值表示均值±标准误。

(33)嫁接：

用刀片将马铃薯幼苗从基部切下，摘去全部叶片，然后用刀片将接穗削成一对称斜面的楔形，楔面大小与砧木切口大小一致，保持楔面干净整洁。以劈接的方式嫁接，将接穗插入砧木切口，使二者切口对齐，然后用保险膜将砧木与接穗固定。

(4)嫁接后管理：

嫁接完成后用塑封袋套住嫁接部位，然后进入保温保湿培养(见图1的A图、B图)。

每天喷施1g/L多菌灵，防止病菌滋生。

7d后，定时放风见阳，并随着接合部位的生长，慢慢延长放风时间。

20～25d后，当接穗马铃薯长出2～3片叶时，即可完全除去遮阴保温措施，常规管理，注意去除枸杞砧木上嫁接部位新生萌蘖。此时，为提供充足的营养和防止病虫害的滋生，须定时浇灌全营养液，并喷施杀菌剂和杀虫剂。

嫁接后10～15d马铃薯与枸杞嫁接成活，随后进入生长旺盛阶段，接穗匍匐茎未能进入土中形成块茎，导致营养物质无法运输到贮藏器官(地下块茎)，造成接口处茎的膨大，有的匍匐茎会发育成芽条(见图1的D图)。

接穗生长良好但茎节间缩短，生长势变弱(见图1的E图)。

(5)远缘杂交种质的获得：

亲和性强的马铃薯接穗生长后期可正常开花(见图1的F图)。

(51)选择嫁接苗马铃薯花蕾肥大，开花前1-2天的花蕾，拨开花瓣后，去除雄蕊；

(52)授粉，套袋，挂牌：采集枸杞花粉，每天上午对马铃薯/枸杞嫁接株进行授粉。采集父本枸杞的花粉涂抹在去雄后的花朵柱头上，并套袋挂标签，注明杂交日期，父本母本品种名称；

(53)子房膨大：初代嫁接马铃薯受枸杞花粉后子房少见膨大，脱落时间较同等对照(未嫁接马铃薯品种受枸杞花粉)延后5～7d。采集远缘嫁接亲和性好，接穗生长旺盛，能够自交结实的马铃薯品种种子(见图1的H图)，备用。

(54)自交种子催芽，生产实生小薯：上年获得接穗杂交种子，1000倍赤霉素液体，浸泡48小时。种子拌细沙，均匀撒在穴盘上，轻轻覆一层土。播种40d后移栽到10cm×10cm营养钵内，正常肥水管理，秋季收获实生小薯。

(55)实生小薯再次嫁接：马铃薯与枸杞嫁接后，同一品种自交结实种子生产的一系列实生小薯，称为姐妹系，将该姐妹系均播种，待出苗后与枸杞再次嫁接，方法同上步骤(3)。

(56)姐妹系接穗授粉：采集枸杞花粉，每天上午对马铃薯/枸杞嫁接株进行授粉。采集父本枸杞的花粉涂抹在去雄后的花朵柱头上，并套袋挂标签，注明杂交日期，父本母本品种名称。

(57)姐妹系接穗子房膨大：授粉后，7～10d子房能够膨大(见图2)。

(58)远缘杂交种子无菌培养：将获得远缘杂交种子播种在组培室1/2MS培养基上(见图3)，进行组织扩繁，将无性繁殖茎段栽种于温室蛭石中，收获F1代无性克隆系原原种(见图4)。

虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。