一种利用全细胞转化高效生产α-酮异戊酸的方法

技术领域

本发明涉及一种利用全细胞转化高效生产α-酮异戊酸的方法，属于分子生物技术与酶工程技术领域。

背景技术

α-酮异戊酸在食品、日化和医药等方面显示出了日益广阔的应用前景。在食品应用上，可作为运动营养饮料的成分；在功能型护肤化妆品中，能起到很好的保湿、防皱、防缩、抗老化和抗过敏作用。在医疗应用上，复方α-酮酸片(含酮异戊酸钙盐)可治疗因慢性肾功能不全而造成的损害，并可作为治疗尿毒症的特效药。α-酮异戊酸的合成主要有以下几种方法：采用格式试剂与草酸二乙酯反应，该方法摩尔收率较高，但反应条件苛刻，需无水、高纯度氮(氩)气氛和低温条件，特别是较低的温度，在工业条件下较难控制；采用海因与丙酮反应生成亚异丙基海因，亚异丙基海因再经过水解得到产品，该路线采用海因、丙酮，氯化钙等为原料，原料简单比较适合工业化，但应该考虑水解时分解产生的大量氨气和碳酸根造成的环境污染；采用腈醇为原料，经过反应转化为α-羟基-N-叔丁基酰胺，再氧化成酮胺，接着水解，得到目标产物，该方法原料昂贵、毒性大、污染严重、反应步骤多、成本高，因此不适合工业化生产。综上所述，目前公开制备α-酮异戊酸的方法中，存在产品杂质过多，不易精制，后处理步骤繁琐，成本高等问题，不适合工业上大规模生产。

发明内容

针对化学制备α-酮异戊酸的方法中，存在产品杂质过多，不易精制，后处理步骤繁琐，成本高等问题，不适合工业上大规模生产。本发明公开了一种利用全细胞转化高效生产α-酮异戊酸的方法，并利用L-氨基酸脱氨酶改造一定程度上提高了α-酮异戊酸的产量和转化率，构建了以大肠杆菌为宿主的高产α-酮异戊酸的工程菌。全细胞转化合成α-酮异戊酸中，在36h时α-酮异戊酸的产量可达到90.54g/L，转化率>90％。具有成本低、反应条件温和、下游分离纯化简单等特点，具有广阔的工业化开发前景。

本发明通过在大肠杆菌细胞中异源表达合成α-酮异戊酸的关键酶并进行改造。最后，通过全细胞催化体系的优化，实现了酮异戊酸的高效生产。本研究为开发大规模生产酮异戊酸及相关化合物的生物转化系统提供了借鉴。

本发明提供了一种L-氨基酸脱氨酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示的L-氨基酸脱氨酶的第72位、第79位、第80位、第315位的氨基酸中的一个或多个进行突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如SEQID NO.9所示的L-氨基酸脱氨酶的第72位的丝氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为S72A，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如SEQID NO.9所示的L-氨基酸脱氨酶的第79位的苏氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为T79A，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如SEQID NO.9所示的L-氨基酸脱氨酶的第80位的丝氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为S80A，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如SEQID NO.9所示的L-氨基酸脱氨酶的第315位的亮氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为L315A，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如SEQID NO.9所示的L-氨基酸脱氨酶的第72位的丝氨酸突变为丙氨酸，同时将第79位的苏氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为S72A/T79A，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如SEQID NO.9所示的L-氨基酸脱氨酶的第72位的丝氨酸突变为丙氨酸，同时将第80位的丝氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为S72A/S80A。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如SEQID NO.9所示的L-氨基酸脱氨酶的第72位的丝氨酸突变为丙氨酸，同时将第315位的亮氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为S72A/L315A。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如SEQID NO.9所示的L-氨基酸脱氨酶的第79位的苏氨酸突变为丙氨酸，同时将第80位的丝氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为T79A/S80A。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如SEQID NO.9所示的L-氨基酸脱氨酶的第79位的苏氨酸突变为丙氨酸，同时将第315位的亮氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为T79A/L315A。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如SEQID NO.9所示的L-氨基酸脱氨酶的第80位的丝氨酸突变为丙氨酸，同时将第315位的亮氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为S80A/L315A。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如SEQIDNO.9所示的L-氨基酸脱氨酶的第72位的丝氨酸突变为丙氨酸，第79位的苏氨酸突变为丙氨酸，同时将第80位的丝氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为S72A/T79A/S80A，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如SEQID NO.9所示的L-氨基酸脱氨酶的第72位的丝氨酸突变为丙氨酸，第79位的苏氨酸突变为丙氨酸，同时将第315位的亮氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为S72A/T79A/L315A。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如SEQID NO.9所示的L-氨基酸脱氨酶的第72位的丝氨酸突变为丙氨酸，第80位的丝氨酸突变为丙氨酸，同时将第315位的亮氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为S72A/S80A/L315A。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如SEQID NO.9所示的L-氨基酸脱氨酶的第79位的苏氨酸突变为丙氨酸，第80位的丝氨酸突变为丙氨酸，同时将第315位的亮氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为T79A/S80A/L315A。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如SEQID NO.9所示的L-氨基酸脱氨酶的第72位的丝氨酸突变为丙氨酸，第79位的苏氨酸突变为丙氨酸，第80位的丝氨酸突变为丙氨酸，同时将第315位的亮氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为S72A/T79A/S80A/L315A，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶来源于：Proteusmyxofaciens；编码所述亲本酶L-氨基酸脱氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了编码上述突变体的基因。

本发明还提供了携带上述基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以pET-28a(+)为表达载体。

本发明还提供了表达上述突变体，或携带上述基因，或含有上述重组载体的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以Escherichia coli BL21(DE3)为表达宿主。

本发明还提供了一种高效生产α-酮异戊酸的重组大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以pET-28a(+)质粒为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌表达了上述L-氨基酸脱氨酶或上述L-氨基酸脱氨酶突变体，所述L-氨基酸脱氨酶或L-氨基酸脱氨酶突变体位于pET-28a(+)质粒上。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶选自粘液变形杆菌，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为Escherichia coli BL21(DE3)。

本发明提供了一种获得所述pmyLAAD突变体的方法，所述方法包括：

(1)在粘液变形杆菌L-氨基酸脱氨酶pmyLAAD氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的引物，以携带L-氨基酸脱氨酶pmyLAAD基因的载体为模板进行定点突变；构建含所述突变体的重组质粒；

(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；

(3)挑选阳性克隆进行发酵培养、诱导，进而获得pmyLAAD突变体的蛋白，用于后续转化实验。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为Escherichia coli BL21(DE3)。

本发明提供一种全细胞催化剂，所述全细胞催化剂含有上述重组大肠杆菌。

本发明提供一种以自来水为溶剂的全细胞转化体系的催化方法。

在本发明的一种实施方式中，所述转化的体系包括L-缬氨酸浓度为90～110g/L，反应中无需添加缓冲液，反应体系中是以自来水为溶剂的制备液。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中添加0.5mM经IPTG诱导22～24h的上述重组大肠杆菌或全细胞催化剂。

在本发明的一种实施方式中，所述转化的全细胞催化剂浓度为20～45g/L，最优的全细胞催化剂浓度为35g/L

在本发明的一种实施方式中，所述转化的pH为6.5～8.5，最优的pH为7.0。

在本发明的一种实施方式中，所述转化的温度为30～45℃，最优的温度为35℃。

在本发明的一种实施方式中，所述转化时间为12～48h，最优的时间为36h。

本发明提供了一种所述重组大肠杆菌和全细胞催化剂在制药、食品或化工领域中的应用。

本发明还提供了一种提高L-氨基酸脱氨酶酶活的方法，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的L-氨基酸脱氨酶的第72位、第79位、第80位、第315位的氨基酸中的一个或多个进行突变，具体为：S72A、T79A、S80A、L315A、S72A/T79A、S72A/S80A、S72A/L315A、T79A/S80A、T79A/L315A、S80A/L315A、S72A/T79A/S80A、S72A/T79A/L315A、S72A/S80A/L315A或T79A/S80A/L315A。

本发明还提供了一种制备α-酮异戊酸的方法，所述方法为，以上述L-氨基酸脱氨酶突变体，或以上述重组细胞为催化剂，催化L-缬氨酸制备得到α-酮异戊酸。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将所述L-氨基酸脱氨酶突变体或重组细胞添加至含有90～110g/L L-缬氨酸的转化体系中，转化体系的溶剂为自来水，在通气量为1.5～3vvm的条件下反应12h，制备得到α-酮异戊酸。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞在转化体系中的终浓度为30～50g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述转化体系的反应条件为35～45℃、pH 6.5～8.5。

本发明还提供了上述L-氨基酸脱氨酶突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述重组细胞在制备α-酮异戊酸或含有α-酮异戊酸的化学品中的应用。

本发明还提供了上述宿主菌表达上述基因的5L发酵罐方法，所述方法为，

发酵培养基含安琪酵母8g/L、胰蛋白胨12g/L、甘油10g/L、磷酸三钾4g/L、氯化钠3g/L、硫酸铵2.5g/L、一水合柠檬酸2.1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、柠檬酸铁铵0.3；

在温度37℃，通气量为2-4vvm，发酵罐初始转速300rpm，控制pH＝7.0-7.2的条件下进行发酵培养，前2h保持转速300rpm，之后(OD

有益效果

(1)本发明公开了一种利用全细胞转化生产α-酮异戊酸的方法。通过pmyLAAD的蛋白质改造，分析pmyLAAD产物结合位点周围柔性Loop环结构，并设计最佳突变体，克服了之前野生型酶催化效率低的问题，并通过实验验证。最后，对转化体系的催化剂浓度、缓冲液种类、pH和温度行了优化。最终得到最佳突变体pmyLAAD在最优条件下，36h时α-酮异戊酸的产量可达到90.54g/L，转化率>90％。本发明的方法可以大大降低成本，加快了全细胞转化法生产α-酮异戊酸的工业化进程。

(2)使用其他来源的酶，扩大了高产α-酮异戊酸的酶库，且找到了生产效率更高的突变点；转化体系没有使用缓冲液，用自来水就可转化，便于后期分离纯化。

附图说明

图1为α-酮异戊酸生物合成路径示意图。

图2为全细胞转化时不同温度对合成α-酮异戊酸的影响。

图3为全细胞转化时不同pH及缓冲液种类及浓度对合成α-酮异戊酸的影响。

图4为全细胞转化时不同催化剂浓度对合成α-酮异戊酸的影响。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的基因来源：本发明所涉及到的生物酶pmyLAAD基因分别来源于粘液变形杆菌(Proteus myxofaciens)；其相对应的NCBI的Sequence ID为5FJM_A。

下述实施例中所涉及的质粒pET-28a(+)质粒来自实验室；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、prime STAR等购自TaKaRa(Dalian,China)。标样购自SIGMA。实验材料均从商业途径可得。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。

TB培养基(g/L)：蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，三水合磷酸氢二钾16.37，磷酸二氢钾2.31。

下述实施例中所涉及的样品预处理：

取转化液12,000rpm离心10min收集上清液，并以α-酮异戊酸作为标准品，配制标准溶液。将适度稀释后的上清液和标准溶液分别经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定α-酮异戊酸。

下述实施例中所涉及的诱导培养重组菌：

挑取重组菌株接种至含卡那抗性的LB培养基中，200rpm、37℃培养10 12h，以体积比2％的接种量接种至含相应抗性TB培养基中，200rpm、37℃培养至OD

下述实施例中所涉及的全细胞转化：

将收集好的湿菌体，以一定量添加至各类转化液中进行悬浮，向反应体系中添加一定量的底物L-缬氨酸，在适宜的温度条件下进行转化。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

HPLC测定：

底物L-缬氨酸产物α-酮异戊酸的浓度采用Agilent LC1260 HPLC系统测定。

L-缬氨酸检测所需的流动相溶液为A相和B相。A相为0.023％三乙胺(0.1M乙酸钠和0.5％四氢呋喃，pH 7.2)，B相为40％甲醇和40％乙腈(0.15M乙酸钠，pH 7.2)。氨基酸的HPLC分析通过OPA FMOC在线衍生化确定。色谱条件为：C18色谱柱(5μm，4.6×250mm，Agilent，USA)，40℃，1mL/min，338nm，A和B相梯度洗脱。

α-酮异戊酸检测所需的流动相5mM H

L-氨基酸脱氨酶pmyLAAD酶活的检测：

测定体系：向含有100mM L-缬氨酸、10mM Tris-HCl的5ml反应体系中加入100ul粗酶液(OD

酶活检测的比色法：取50ul样品，加入45ul 20％ TCA溶液，和20ul 20mM DNP显色液，混合均匀，反应15min，加入80ul 4M NaOH溶液进行显色，避光15min，在520nm处检测。

酶活定义：1min内，产1umolα-酮异戊酸所需酶量。

实施例1：单突变体的构建和筛选

具体步骤如下：

(1)单突变体的构建

1)含有原始酶基因的重组载体pET-28a-PmyLAAD的构建

pmyLAAD基因序列如SEQ ID NO.1所示，将上述基因序列连接至pET-28a载体上，送去基因合成公司进行合成，制备得到重组载体pET-28a-pmyLAAD。

2)含有突变体酶的重组载体的构建

以重组载体pET-28a-pmyLAAD为模板，设计第72位、第79位、第80位、第315位突变位点的引物，如表1所示，通过全质粒PCR进行构建。

表1：突变引物序列

构建反应PCR扩增体系：PrimeSTAR酶25μL、每个突变位点的两条引物各1μL、模板(pmyLAAD的核苷酸序列)1μL、水22μL；反应条件为：①94℃3min；②98℃10s；③55℃30s；④72℃3min；⑤将②～④三个步骤循环29次；⑥72℃5min；⑦12℃保温。

将上述反应体系在37℃孵育1h以消化质粒模板(消化体系为：DpnI 1μL、上述反应PCR产物50μL)，消化结束后将得到的消化产物通过化学转化方法导入大肠杆菌BL21感受态细胞，化学转化法具体步骤：1)将10μl同源重组产物导入100μl BL21感受态细胞；2)冰浴15-30min；3)42℃水浴热激90s，取出后迅速放入冰中静置冰浴3-5min；4)加入800μl无抗性LB培养基混匀，于37℃，200rpm培养1h；5)5000rpm离心2min收菌；6)移去上清，剩余100-200μl吹吸混匀涂布至含0.05mg/mL卡那霉素抗性平板上，37℃恒温培养12h左右。7)挑取单克隆于含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB中，200rpm、37℃恒温培养12h后，送去公司测序，测序正确的即为阳性转化子(突变体菌株)。

突变的位点分别为将第72位的S突变为A，将第79位的T突变为A，将第80位的S突变为A，将第315位的L突变为A。

分别制备得到含有突变体的重组载体(pET-28a-pmyLAAD

E.coli/BL21(DE3)/pET-28a-pmyLAAD S72A，E.coli/BL21(DE3)/pET-28a-pmyLAADT79A，E.coli/BL21(DE3)/pET-28a-pmyLAADS80A，E.coli/BL21(DE3)/pET-28a-pmyLAADL315A。

(2)L-氨基酸脱氨酶pmyLAAD酶活的检测

在4℃、10000r/min下离心10min收集上述重组细胞，弃去上清，细胞菌体用10mMTris-HCl缓冲液(pH 7.0)洗2次；最后，将细胞菌体悬浮于10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中并用超声破碎仪进行破碎，破碎液在4℃下离心20min，收集上清液，即为粗酶液。

酶活检测的比色法：取50ul样品，加入45ul 20％ TCA溶液，和20ul 20mM DNP显色液，混合均匀，反应15min，加入80ul 4M NaOH溶液进行显色，避光15min，在520nm处检测吸光值。结果如表2所示：

表2：单突变体摇瓶筛选结果

(3)α-酮异戊酸的制备：

将得到的4个突变体菌株E.coli/BL21(DE3)/pET-28a-pmyLAADS72A，E.coli/BL21(DE3)/pET-28a-pmyLAADT79A，E.coli/BL21(DE3)/pET-28a-pmyLAADS80A，E.coli/BL21(DE3)/pET-28a-pmyLAADL315A分别接种至LB种子培养基，200rpm、37℃培养培养10h左右，分别制备得到种子液；

分别将制备得到的种子液以培养基体积的2％的接种量接种至TB培养基，在200rpm、37℃培养至OD

转化体系：100g/L L-缬氨酸，细胞催化剂浓度为30g/L，缓冲液为10mM Tris。

转化条件为：转化温度25℃，反应pH为7.5，转化时间为48h。

将转化结束后的转化液用HPLC方法进行测定α-酮异戊酸的产量，结果如表3所示。

表3：单突变体摇瓶筛选结果

最终S72A生产得到α-酮异戊酸产量最高。

实施例2：双突、三突及四突突变体的构建和筛选

1、双突突变体构建：

(1)在含有突变体的质粒pET-28a-pmyLAADS72A的基础上，利用突变引物T79A-F和T79A-R、S80A-F和S80A-R、L315A-F和L315A-R，分别构建双突突变体；

在含有突变体的质粒pET-28a-pmyLAADT79A的基础上，利用突变引物S80A-F和S80A-R、L315A-F和L315A-R，分别构建双突突变体；

在含有突变体的质粒pET-28a-pmyLAADS80A的基础上，利用突变引物L315A-F和L315A-R；通过全质粒PCR进行双突突变体构建，具体实施方式参见实施例1中步骤(1)；

分别制备得到含有突变体的重组载体(pET-28a-pmyLAADS72A/T79A、pET-28a-pmyLAADS72A/S80A、pET-28a-pmyLAADS72A/L315A、pET-28a-pmyLAADT79A/S80A、pET-28a-pmyLAADT79A/L315A、pET-28a-pmyLAADS80A/L315A)及以下重组菌株：

E.coli/BL21(DE3)/pET-28a-pmyLAADS72A/T79A、E.coli/BL21(DE3)/pET-28a-pmyLAADS72A/S80A、E.coli/BL21(DE3)/pET-28a-pmyLAADS72A/L315A、E.coli/BL21(DE3)/pET-28a-pmyLAADT79A/S80A、E.coli/BL21(DE3)/pET-28a-pmyLAADT79A/L315A、E.coli/BL21(DE3)/pET-28a-pmyLAADS80A/L315A。

(2)L-氨基酸脱氨酶pmyLAAD酶活的检测

L-氨基酸脱氨酶pmyLAAD突变体粗酶液、纯酶液及其酶活的检测方法同实施例1，结果显示：S72A/T79A、S72A/S80A、S72A/L315A、T79A/S80A、T79A/L315A、S80A/L315A纯酶的酶活如表4所示：

表4：双突变体摇瓶筛选结果

(3)α-酮异戊酸的制备：

具体实施方式参见实施例1中步骤(2)，结果如表5所示。

表5：双突变体摇瓶筛选结果

最终S72A/T79A生产得到α-酮异戊酸产量最高。

2、三突突变体的构建：

在含有突变体的质粒pET-28a-pmyLAADS72A/T79A的基础上，利用突变引物S80A-F和S80A-R、L315A-F和L315A-R，分别构建三突突变体；

在含有突变体的质粒pET-28a-pmyLAADS72A/S79A和在含有突变体的质粒pET-28a-pmyLAADT79A/S80A的基础上，利用突变引物L315A-F、L315A-R，分别构建三突突变体，通过全质粒PCR进行三突变体的构建，具体实施方式参见实施例1中步骤(1)；

分别制备得到含有突变体的重组载体(pET-28a-pmyLAADS72A/T79A/S80A、pET-28a-pmyLAADS72A/T79A/L315A、pET-28a-pmyLAADS72A/S80A/L315A、pET-28a-pmyLAADT79A/S80A/L315A)及以下重组菌株：E.coli/BL21(DE3)/pET-28a-pmyLAADS72A/T79A/S80A 、E.coli/BL21(DE3)/pET-28a-pmyLAADS72A/T79A/L315A 、E.coli/BL21(DE3)/pET-28a-pmyLAADS72A/S80A/L315A 、E.coli/BL21(DE3)/pET-28a-pmyLAADT79A/S80A/L315A。

(2)L-氨基酸脱氨酶pmyLAAD酶活的检测

L-氨基酸脱氨酶pmyLAAD突变体粗酶液、纯酶液及其酶活的检测方法同实施例1，结果如表6所示：

表6：三突变体摇瓶筛选结果

(3)α-酮异戊酸的制备：

具体实施方式参见实施例1中步骤(2)，结果如表7所示

表7：三突变体摇瓶筛选结果

最终S72A/T79A/S80A生产得到α-酮异戊酸产量最高。

3、四突突变体构建：

在含有突变体的质粒pET-28a-pmyLAADS72A/T79A/S80A基础上对L315A进行突变：以含有突变体的质粒pET-28a-pmyLAADS72A/T79A/S80A为模板，利用突变引物L315A-F和L315A-R(表1)进行全质粒PCR，PCR产物进行消化，PCR体系与消化体系和实施例1相同，分别制备得到含有突变体的重组载体(pET-28a-pmyLAADS72A/T79A/S80A/L315A及以下重组菌株：E.coli/BL21(DE3)/pET-28a-pmyLAADS72A/T79A/S80A/L315A。

(2)L-氨基酸脱氨酶pmyLAAD酶活的检测

L-氨基酸脱氨酶pmyLAAD突变体粗酶液、及其酶活的检测方法同实施例1，结果显示：S72A/T79A/S80A/L315A粗酶的酶活为：0.176±0.003U/mL

(3)α-酮异戊酸的制备：

具体实施方式参见实施例1中步骤(2)，结果显示，最终含有S72A/T79A/S80A/L315A的重组菌的α-酮异戊酸产量最高为65.98g/L。

实施例3：1L体系水平优化L-缬氨酸生产α-酮异戊酸

从含抗生素(卡那霉素，终浓度50μg/mL)的LB平板上挑取单菌落(实施例2制备得到的)，接种到一级培养基LB中，进行初级培养的一级培养阶段，一级培养的条件为37℃的温度条件下，220rpm培养12h，至OD

将LB培养基中的菌液按2.5％的接种量接种于120mL新鲜LB中，37℃震荡培养6-7h，制备得到种子液；

按6％的接种量将菌种接种到2L发酵培养基(发酵培养基含安琪酵母8g/L、胰蛋白胨12g/L、甘油10g/L、磷酸三钾4g/L、氯化钠3g/L、硫酸铵2.5g/L、一水合柠檬酸2.1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、柠檬酸铁铵0.3)，在温度37℃，通气量为2-4vvm，发酵罐初始转速300rpm，控制pH＝7.0-7.2的条件下进行发酵培养，前2h保持转速300rpm，之后(OD

培养至OD

1、不同全细胞催化剂浓度对α-酮异戊酸浓度的影响

(1)在发酵罐中配制转化反应体系：

将L-缬氨酸溶解于一定量Tris-HCl缓冲液中，制备得到L-缬氨酸溶液；分别将上述制备得到的10g、15g、20g、25g、30g突变体湿菌体细胞(即为全细胞催化剂)同样使用Tris-HCl缓冲液溶解均匀；

(2)将L-缬氨酸溶液倒入发酵罐中，使得L-缬氨酸在反应体系中的终浓度为100g/L；调节温度至25℃，转速为300rpm，待转化液温度升至25℃，将溶解的菌液倒入发酵罐，使全细胞催化剂的浓度分别为20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L。

反应条件：在pH为7.5、25℃、600rpm、通气量为2.5vvm条件下进行转化反应，转化反应后总体积为1L。转化反应结束后取部分转化液12,000×g离心15min，上清液用0.22μm的微滤膜过滤后进行HPLC分析。

结果如图4及表8所示。

表8：催化剂添加量优化结果

结果显示：当催化剂的浓度从20g/L提高至35g/L，α-酮异戊酸的浓度从38.2g/L提高至78.06g/L。产物/催化剂的比值从1.91g/g提高至2.23g/g。35g/L的全细胞催化剂浓度同时具备较高α-酮异戊酸浓度及高产物/催化剂比例(即单位菌体生产α-酮异戊酸能力)2.23g/g，被用于转化实验。

2、不同转化反应温度对α-酮异戊酸浓度的影响

具体同步骤1，区别在于，将转化pH控制为7.5，全细胞化剂浓度控制为35g/L；

在600rpm、通气量为2.5vvm条件下，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下进行转化反应，转化反应后总体积为1L。结果如表9、图2所示。

表9：转化温度优化结果

结果显示，在温度为35℃时更适合α-酮异戊酸的合成，因此选择转化温度控制在35℃左右，此时α-酮异戊酸浓度为87.91g/L。

3、不同转化反应pH及缓冲液种类对α-酮异戊酸浓度的影响

具体同步骤1，将全细胞化剂浓度控制为35g/L，将L-缬氨酸浓度控制为100g/L，转化温度为35℃，通气量为2.5vvm，且将转化反应过程中的pH分别控制为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。结果如表10、图3中的a所示。

表10：转化pH优化结果

因此选择转化pH控制在7.0，此时α-酮异戊酸浓度为89.76g/L。

4、转化缓冲液种类的影响

具体步骤同步骤1，区别在于，调整步骤(1)中的Tris-HCl缓冲液分别为自来水、Tris-HCl(20mM、10mM、5mM)、氨水-氯化铵、PBS，同时将pH控制为7.0；即：将L-缬氨酸分别溶解于一定量自来水、Tris-HCl(20mM、10mM、5mM)、氨水-氯化铵、PBS(pH控制为7.0)溶液中，分别制备得到L-缬氨酸溶液；

分别将上述制备得到的突变体湿菌体细胞(即为全细胞催化剂)使用Tris-HCl缓冲液溶解均匀；将全细胞化剂浓度控制为35g/L，将L-缬氨酸浓度控制为100g/L，转化温度为35℃，通气量为2.5vvm，且转化反应过程中缓冲液种类分别为自来水、Tris-HCl(20mM、10mM、5mM)、氨水-氯化铵、PBS(pH控制为7.0)。结果如表11、图3中的b所示。

表11：转化缓冲液种类优化结果

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在自来水的条件下α-酮异戊酸的合成产量与控制pH的缓冲液相差不大，出于工业化生产中下游分析纯化简单的目的，选择自来水为α-酮异戊酸的制备液，此时α-酮异戊酸浓度为90.54g/L。

实施例4：α-酮异戊酸的生产方法

本实施例提供，生产方法的步骤如下：

(1)参考上述实施例的方法构建pET-28a(+)-pmyLAADS72A/T79A/S80A/L315A重组载体和工程菌E.coli/BL21(DE3)/pET-28a(+)-pmyLAADS72A/T79A/S80A/L315A；

(2)将工程菌E.coli/BL21(DE3)/pET-28a(+)-pmyLAADS72A/T79A/S80A/L315A从冻存管中取少量菌液划线于含抗生素(卡那霉素，终浓度50μg/mL)的LB平板上，37℃培养12h。

(3)从含抗生素(卡那霉素，终浓度50μg/mL)的LB平板上挑取单菌落，接种到一级培养基LB中，进行初级培养的一级培养阶段，一级培养的条件为37℃的温度条件下，220rpm培养12h，至OD

(4)将LB培养基中的菌液按2.5％的接种量接种于120mL新鲜LB中，37℃震荡培养6-7h，制备得到种子液；

(5)按6％的接种量将菌种接种到2L发酵培养基(发酵培养基含安琪酵母8g/L、胰蛋白胨12g/L、甘油10g/L、磷酸三钾4g/L、氯化钠3g/L、硫酸铵2.5g/L、一水合柠檬酸2.1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、柠檬酸铁铵0.3)，在温度37℃，通气量为2-4vvm，发酵罐初始转速300rpm，控制pH＝7.0-7.2的条件下进行发酵培养，前2h保持转速300rpm，之后(OD

(6)培养至OD

(7)取35g菌体1L反应液中，反应液是采用自来水配置的浓度为：100g/L的L-缬氨酸在35℃的温度，250rpm并通入空气转化培养；

结果显示，含有突变体的菌株E.coli/BL21(DE3)/pET-28a(+)-pmyLAADS72A/T79A/S80A/L315A最终的产量为：12h时α-酮异戊酸的产量可达到90.54g/L。

综上所述，本发明实施例提供的表达L-氨基酸脱氨酶及其改造酶的重组载体、突变工程菌及应用于α-酮异戊酸的生产方法获得能高效表达的重组载体。通过全细胞转化使缬氨酸高效转化成α-酮异戊酸，提高底物缬氨酸转化成α-酮异戊酸的效率，提高产品的得率和回收率。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。