基于温敏性海藻酸钠自组装胶束的蛋白质分子印迹电化学传感器及其制备方法和应用
文献发布时间:2023-06-19 11:02:01
技术领域
本发明属于电化学传感器,具体涉及一种基于温敏性海藻酸钠自组装胶束的蛋白质分子印迹电化学传感器及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白质组学是当今最为重要的研究领域之一,与人类健康和社会发展具有十分密切的关系。对蛋白质的深入研究不仅能为揭示生命活动规律提供物质基础,也能为众多疾病机理的阐明及攻克提供理论依据和解决途径。蛋白质组学研究中,需要发展从复杂基体样品中选择性地分离、识别和检测特定目标蛋白质的方法。因此,开发新的分离识别方法,将在蛋白质组学领域发挥重要作用。
蛋白质印迹技术是集大分子合成、蛋白质分子识别及仿生生物工程等众多学科发展起来的新型技术,是从复杂基体样品中选择性地分离和识别目标蛋白质的有效方法。但是,由于蛋白质分子具有较大的空间尺寸,在印迹聚合物中传质扩散困难。具有纳米结构的大分子自组装胶束有利于提高蛋白质在印迹聚合物胶束中的传质速率,但是,由于具有结构致密的特点,大分子自组装胶束中的模板使模板蛋白质的传质扩散阻力较大,不利于洗脱和再结合,限制了基于大分子自组装胶束的蛋白质分子印迹传感器识别检测性能的进一步提高。
温度敏感性分子印迹聚合物是目前最有前景的蛋白质印迹材料,它在温度刺激下会发生连续可逆的溶胀和收缩,促使印迹功能基团与模板蛋白质之间的距离和相对位置发生改变,从而有利于模板蛋白质脱离聚合物形成分子印迹聚合物或与分子印迹聚合物再结合实现特异性吸附,有效调控分子印迹聚合物与模板蛋白质的结合数量,提高分子印迹聚合物的吸附容量和识别检测性能。
发明内容
本发明的目的在于提供基于温敏性海藻酸钠自组装胶束的蛋白质分子印迹电化学传感器及其制备方法,先制备温敏性海藻酸钠、再制备蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束、制备蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束修饰电极,最后制备蛋白质分子印迹电化学传感器,制备方法简单,操作方便。
本发明另一目的在于提供基于温敏性海藻酸钠自组装胶束的蛋白质分子印迹电化学传感器的应用,用于检测蛋白质,检测灵敏度高、价格低廉、操作便利,在环境检测、药物分析、食品安全等方面具有潜在的应用前景。
本发明具体技术方案如下:
基于温敏性海藻酸钠自组装胶束的蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法,包括以下步骤:
1)制备温敏性海藻酸钠;
2)制备蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束;
3)蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束修饰电极;
4)制备蛋白质分子印迹电化学传感器。
进一步的,步骤1)中,所述制备温敏性海藻酸钠的方法为:
将海藻酸钠置于水中,搅拌溶解,去除水中氧气后,加入引发剂与N-异丙基丙烯酰胺单体,密封反应;反应结束后,静置,自然冷却,提纯,干燥,得到温敏性海藻酸钠。
步骤1)中所述水优选为蒸馏水。
步骤1)中,将海藻酸钠置于水中,搅拌溶解,所得海藻酸钠水溶液中,海藻酸钠重复单元的浓度为0.01-10mol/L。
步骤1)中,所述引发剂为硝酸铈铵、偶氮二异丁腈或过硫酸钾;引发剂与海藻酸钠重复单元的物质的量之比为1:20-1:2。
步骤1)中,海藻酸钠重复单元与N-异丙基丙烯酰胺单体的物质的量之比为1:10-10:1。
步骤1)中,所述反应,反应温度为10-80℃,反应时间为1-15h。
步骤1)中所示提纯,是通过透析提纯,将反应物装入透析袋MW8000-10000 中,使用蒸馏水透析。
所述干燥是指冷冻干燥,温度-70℃,时间24-72h。
步骤2)具体为:将步骤1)制备的温敏性海藻酸钠溶于水中,得到温敏性海藻酸钠溶液,向其中逐滴加入蛋白质的磷酸盐缓冲溶液,通过两者之间的弱相互作用力自组装为蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束。
进一步的,加入过程中,当前一滴蛋白质的磷酸盐缓冲溶液完全分散在溶液中后再加入下一滴。
步骤2)中所述水优选为蒸馏水。
步骤2)中所述蛋白质为牛血清白蛋白、白蛋白、牛血红蛋白、溶菌酶、胰蛋白酶、辣根过氧化物酶或葡萄糖酶。
步骤2)中蛋白质的磷酸盐缓冲溶液的制备方法为:将蛋白质溶于磷酸盐缓冲溶液中;所得蛋白质的磷酸盐缓冲溶液,蛋白质的浓度为0.001-100mg/mL。所用的磷酸盐缓冲溶液浓度为0.01-1.0mol/L,pH值为3.0-10.0。
步骤2)中的温敏性海藻酸钠溶于水中,所得温敏性海藻酸钠溶液的浓度为0.001-100mg/mL;
步骤2)中的温敏性海藻酸钠溶液与蛋白质的磷酸盐缓冲溶液的体积比为 10:1-1:10。
步骤3)具体为:将蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束溶液修饰到电极表面,干燥,得到蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束修饰电极。
所述电极为金电极或玻碳电极;
所述电极使用前,进行以下处理:将电极依次用0.3μm和0.05μm的α-Al
步骤3)中所述蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束溶液浓度为0.001-100mg/mL,修饰到电极表面,所用体积为1-20μL。
步骤3)中所述干燥,温度是20-60℃,干燥10-30h。
步骤4)具体为:将步骤3)制备的修饰电极浸泡在钙离子溶液中,利用Ca
将步骤3)制备的修饰电极浸泡在钙离子溶液中,在20-40℃下浸泡1-2h。
步骤4)中所述钙离子溶液浓度为0.001-100mg/mL;优选为CaCl
步骤4)所述干燥是指温度是20-60℃下干燥,干燥时间20-30h;
步骤4)中所述洗脱,所用洗脱液为甲醇与冰醋酸的混合溶液,甲醇与冰醋酸的体积比为10:1-1:10。
本发明提供的基于温敏性海藻酸钠自组装胶束的蛋白质分子印迹电化学传感器,采用上述方法制备得到。
本发明提供的基于温敏性海藻酸钠自组装胶束的蛋白质分子印迹电化学传感器的应用,用于检测蛋白质。具体检测方法为:
S1、将基于温敏性海藻酸钠自组装胶束的蛋白质分子印迹电化学传感器置于蛋白质浓度为0的磷酸盐溶液(空白溶液)中,静置吸附后置于电解质溶液中,利用差分常规脉冲伏安法测量空白溶液电化学响应值;
S2、将分子印迹电化学传感器置于一定浓度蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中,静置吸附后置于电解质溶液中,利用差分常规脉冲伏安法测量电化学响应值,将传感器取出洗脱蛋白质;
S3、将洗脱后的分子印迹电化学传感器再置于另一浓度的蛋白质溶液的磷酸盐缓冲溶液中,重复S2的步骤;
S4、以一定蛋白质浓度下测量所得电化学响应值与空白溶液测量所得电化学响应值的差值的绝对值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,构建线性关系。
进一步的,磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.2,浓度为0.1mol/L;差分常规脉冲伏安法(DNPV)测量时,扫描范围从0.1V到1.0V;扫描速率为20mV/s;电解质为含5mmol/L铁氰化钾、5mmol/L亚铁氰化钾和0.1mol/L氯化钾的pH 为7.2,浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。
将制备的电化学传感器分别置于空白溶液和未知浓度的蛋白质溶液中,用差分常规脉冲伏安法分别测量两者电化学响应值并计算差值的绝对值,根据得到的差值的绝对值和上述线性关系得到蛋白质浓度。
聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)大分子链上既有亲水性的酰胺基,又有疏水性的异丙基,具有温敏性聚合物。PNIPAAm的最低临界溶解温度(LCST) 为35℃。当温度低于LCST时,水分子与PNIPAAm基团的氢键的强有力的相互作用使其溶解于水中;当温度高于LCST时,氢键之间的相互作用力被破坏因而会使基团疏水性,PNIPAAm在水溶液中发生体积收缩。由于PNIPAAm的这一温敏特性,使得其在分子印迹聚合物制备领域具有广泛的应用前景。
本发明将N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单体通过自由基引发聚合到海藻酸钠侧链,制备温敏性海藻酸钠聚合物,利用蛋白质与温敏性海藻酸钠之间的弱相互作用力在溶液中自组装为蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束,将其修饰到电极的表面,晾干后置于CaCl
本发明的主要优点在于:
(1)本发明所用的蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束具有良好的生物相容性,有利于传感器制备过程中蛋白质活性的保持。
(2)本发明所制备的温敏性蛋白质分子印迹电化学传感器可以通过改变环境温度优化其检测性能。
(3)本发明所制备的温敏性蛋白质分子印迹电化学传感器具有检测灵敏度高、线性范围宽的优点、读数快速且简便,成本低廉等优点。
(4)本发明将温敏性海藻酸钠自组装技术、蛋白质分子印迹技术与电化学生物传感器相结合制备蛋白质分子印迹传感器,在环境检测、药物分析、食品安全等领域具有潜在的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中牛血清白蛋白/温敏性海藻酸钠胶束的扫描电镜(SEM) 图;
图2为蛋白质分子印迹传感器制备过程不同修饰阶段的循环伏安谱图;
图3为蛋白质分子印迹传感器在不同浓度蛋白质溶液中的差分常规脉冲伏安法曲线(a)和线性曲线(b)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者,均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
基于温敏性海藻酸钠自组装胶束的蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法,包括以下步骤:
1)制备温敏性海藻酸钠:将1g海藻酸钠(SA,海藻酸钠重复单元摩尔量 176)置于盛有100mL蒸馏水的三口烧瓶中,在室温下搅拌溶解,通入氮气体除去溶剂中溶解的氧气;加入0.5g硝酸铈铵和3g N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm) 单体,水浴加热至40℃,密闭反应6h;反应结束后,静置,自然冷却,将反应物装入透析袋MW8000-10000中透析提纯。提纯后将样品冷冻干燥,温度-70℃,时间72h,得到温敏性海藻酸钠(SA-g-PNIPAAm)共聚物。
2)制备蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束:将牛血清白蛋白溶解在pH为7.2、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中,得到0.25mg/mL牛血清白蛋白溶液,将温敏性海藻酸钠溶于蒸馏水中配置成0.05mg/mL的溶液,取1mL温敏性海藻酸钠溶液,向其中逐滴滴加200μL0.25g/L牛血清白蛋白溶液,当一滴牛血清白蛋白溶液完全分散在溶液中再加入下一滴溶液,在磁力搅拌下,通过两者之间的弱相互作用力自组装为牛血清白蛋白/温敏性海藻酸钠(BSA/SA-g-PNIPAAM) 胶束。
图1为实施例1中BSA/SA-g-PNIPAAM胶束的扫描电镜(SEM)图。由图可以看出,BSA/SA-g-PNIPAAM为球形聚集体,粒径为1μm左右。样品检测步骤:将0.1mg/mL的BSA/SA-g-PNIPAAM胶束水分散液滴在载玻片上,置于40℃烘箱中干燥后SEM表征。
3)蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束修饰电极:将裸金电极依次用0.3μm和0.05 μm的α-Al
4)蛋白质分子印迹电化学传感器的制备:将晾干后的蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束修饰电极浸泡在0.5mg/mL的CaCl
图2为实施例1蛋白质分子印迹传感器制备过程不同修饰阶段的循环伏安谱图。CV条件:扫描范围从-0.8V到0.2V;扫描速率为100mV/s。电解质为含铁氰化钾(5mmol/L)、亚铁氰化钾(5mmol/L)、氯化钾(0.1mol/L)的pH 为7.2,浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。实施例1步骤3)裸电极循环伏安曲线对应图2中裸金电极曲线,实施例1步骤3)制备的蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束修饰电极循环伏安曲线对应图2中胶束修饰电极曲线,实施例1步骤4)中Ca
利用上述制备的传感器检测牛血清白蛋白,具体方法为:将传感器分别置于0、1×10
实施例2
基于温敏性海藻酸钠自组装胶束的蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法,包括以下步骤:
1)温敏性海藻酸钠的制备
将1g海藻酸钠置于盛有100mL蒸馏水的三口烧瓶中,在室温下搅拌溶解,通入氮气体除去溶剂中溶解的氧气;加入0.4g硝酸铈铵和4g N-异丙基丙烯酰胺单体,水浴加热至50℃,密闭反应5h;反应结束后,静置,自然冷却,提纯,干燥后得到温敏性海藻酸钠。
2)蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束的制备
将温敏性海藻酸钠溶于蒸馏水中配置成0.2mg/mL的溶液,取1mL,向其中逐滴滴加200μL 0.2mg/mL牛血清白蛋白溶液,在磁力搅拌下,通过两者之间的弱相互作用力自组装为蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束。
3)蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束修饰电极的制备
将金电极依次用0.3μm和0.05μm的α-Al
4)蛋白质分子印迹电化学传感器的制备
将晾干后的蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束修饰电极浸泡在0.2mg/mL的 CaCl
实施例3
基于温敏性海藻酸钠自组装胶束的蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)温敏性海藻酸钠的制备
将2g海藻酸钠置于盛有100mL蒸馏水的三口烧瓶中,在室温下搅拌溶解,通入氮气体除去溶剂中溶解的氧气;加入0.5g硝酸铈铵和5g N-异丙基丙烯酰胺单体,水浴加热至40℃,密闭反应3h;反应结束后,静置,自然冷却,提纯,干燥后得到温敏性海藻酸钠。
(2)蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束的制备
将温敏性海藻酸钠溶于蒸馏水中配置成0.1mg/mL的溶液,取1mL,向其中逐滴加入100μL 0.1mg/mL牛血清白蛋白溶液,在磁力搅拌下,通过两者之间的弱相互作用力自组装为蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束。
(3)蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束修饰电极的制备
将金电极依次用0.3μm和0.05μm的α-Al
(4)蛋白质分子印迹电化学传感器的制备
将晾干后的蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束修饰电极浸泡在1.0mg/mL的 CaCl
实施例4
基于温敏性海藻酸钠自组装胶束的蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)温敏性海藻酸钠的制备
将2g海藻酸钠置于盛有100mL蒸馏水的三口烧瓶中,在室温下搅拌溶解,通入氮气体除去溶剂中溶解的氧气;加入0.5g硝酸铈铵和5g N-异丙基丙烯酰胺单体,水浴加热至40℃,密闭反应2h;反应结束后,静置,自然冷却,提纯,干燥后得到温敏性海藻酸钠。
(2)蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束的制备
将温敏性海藻酸钠溶于蒸馏水中配置成0.5mg/mL的溶液,取1mL,向其中逐滴加入100μL 0.5mg/mL牛血清白蛋白溶液,在磁力搅拌下,通过两者之间的弱相互作用力自组装为蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束。
(3)蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束修饰电极的制备
将金电极依次用0.3μm和0.05μm的α-Al
(4)蛋白质分子印迹电化学传感器的制备
将晾干后的蛋白质/温敏性海藻酸钠胶束修饰电极浸泡在1.5mg/mL的 CaCl
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- 一种抗坏血酸分子印迹自组装胶束电化学传感器制备方法