硝唑尼特及其衍生物在制备预防和治疗骨破坏性疾病药物中的用途

技术领域

本发明涉及一种硝唑尼特及其衍生物的新用途，特别涉及硝唑尼特及其衍生物在制备治疗和预防骨破坏性疾病药物中的用途。本发明属于医药技术领域。

背景技术

硝唑尼特(nitazoxanide，NTZ，结构式见a)是一种具有苯酰胺基噻唑结构的化合物，给药后在体内快速水解为其活性代谢产物替唑尼特(Tizoxanide，TIZ，结构式见b)。1996年该化合物首次作为抗寄生虫药在墨西哥上市。2002年美国FDA批准该药用于治疗1～11岁儿童的隐孢子虫病、蓝氏贾第鞭毛虫病等肠道原虫病，并以商品名Alinia口服混悬液投放美国市场。2004年7月批准该药在成人中用于治疗由隐孢子虫病、蓝氏贾第鞭毛虫引起的腹泻。硝唑尼特成为第一个被FDA批准专门用来治疗隐孢子虫感染的药物，也是40年来首次被批准用于治疗蓝氏贾第鞭毛虫感染引起腹泻的药物。

在硝唑尼特的抗菌方面，后续的系列研究发现其不仅仅是发挥抗原虫的作用，它还可以有效的抑制难辨梭菌、结核分枝杆菌及幽门螺旋杆菌的生长，同时它还具备抗病毒的作用。

在生物学功能方面，近些年的研究发现硝唑尼特可显著抑制c-Myc的活性，诱导肿瘤细胞的凋亡，发挥抗肿瘤作用。最近研究发现硝唑尼特可抑制胶质瘤细胞的晚期凋亡促进ING1诱导的细胞周期阻滞，为胶质瘤的治疗提供了新的选择。有关硝唑尼特生物学功能探讨研究显示，它不仅可以通过抑制PI3K/AKT/IκB/NFκB信号通路改善阿尔茨海默病小鼠模型的学习和记忆损伤情况，而且可以通过作用于肝脏的PPAR-γ受体改善糖尿病大鼠的胰岛素抵抗。除此之外，研究显示硝唑尼特可通过抑制NFκB和MAPK信号通路的活化，从而抑制LPS刺激的RAW264.7细胞释放IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子，提示该药物有一定的抗炎作用。2020年新近研究发生NTZ可通过抑制JAK2/STAT3信号通路活化发挥抑制结肠癌细胞增殖的作用。总之，硝唑尼特具备多样的生物学活性，具备治疗感染、肿瘤及炎症相关性疾病的潜能。

本发明发明人通过研究发现硝唑尼特在体外实验中可显著抑制破骨细胞的发生和破骨细胞的骨吸收活性，体内实验证实硝唑尼特可阻止卵巢切除小鼠(经典的骨质疏松动物模型)导致的骨量丢失，以及抑制胶原诱导关节炎(经典的类风湿关节炎动物模型)模型鼠关节骨的破坏。此外，本发明发明人进一步合成了多种硝唑尼特的衍生物，并对这些衍生物的活性进行了研究，结果发现，这些衍生物能够显著抑制破骨细胞生成，其中化合物14、15、16和24效果相对更佳。

本发明的提出为骨破坏性疾病的预防和治疗提供了新的药物选择，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的预防和治疗骨破坏性疾病的药物。具体的，本发明的目的在于提供硝唑尼特及其衍生物在制备预防和治疗骨破坏性疾病药物中的用途。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

首先，本发明提出了硝唑尼特或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物在制备预防和治疗骨破坏性疾病药物中的用途。

其次，本发明还提出了硝唑尼特衍生物在制备预防和治疗骨破坏性疾病药物中的用途，其中所述的硝唑尼特衍生物为通式(I)的化合物，或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物：

其中，

R

R

R

R

R

其中R

其中，优选的，R

其中，优选的，R

其中，优选的，R

其中，优选的，R

其中，优选的，R

其中，优选的，R

其中，优选的，R

其中，优选的，所述化合物具有以下结构的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物：

所述的硝唑尼特及其衍生物可以通过不同途径并以不同形式给药。例如，可以通过全身性方式、经口、肠胃外、通过吸入、通过鼻喷雾、通过鼻滴注或通过注射例如静脉内注射、通过肌肉内途径、通过皮下途径、通过透皮途径、通过表面途径、通过动脉内途径等给药。

其中，优选的，所述的药物的剂型可选自注射悬液、糖浆、凝胶、油、软膏、丸剂、片剂、栓剂、粉剂、凝胶帽、胶囊、气溶胶等形式。

下面更详细地描述具体官能团和化学术语的定义。

当列出数值范围时，既定包括每个值和在所述范围内的子范围。例如“C

“C

“C

“C

“卤代”或“卤素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)和碘(I)。在一些实施方案中，卤素基团是F、Cl或Br。在一些实施方案中，卤素基团是F或Cl。在一些实施方案中，卤素基团是F。

因此，“C

“C

“3至10元杂环基”或是指具有环碳原子和1至4个环杂原子的3至10元非芳香环系的基团，其中，每个杂原子独立地选自氮、氧、硫、硼、磷和硅。在包含一个或多个氮原子的杂环基中，只要化合价允许，连接点可为碳或氮原子。在一些实施方案中，3至7元杂环基是优选的，其为具有环碳原子和1至3个环杂原子的3至7元非芳香环系；在一些实施方案中，3至6元杂环基是特别优选的，其为具有环碳原子和1至3个环杂原子的3至6元非芳香环系；更优选5至6元杂环基，其为具有环碳原子和1至3个环杂原子的5至6元非芳香环系。杂环基还包括其中上述杂环基环与一个或多个环烷基、芳基或杂芳基稠合的环体系，其中连接点在杂环基环上；且在这样的情况下，环成员的数目继续表示在杂环基环体系中环成员的数目。不论杂环基前是否修饰有“取代的”，杂环基的每个独立地任选被取代，例如，1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基，适当的取代基如下定义。

示例性的包含一个杂原子的3元杂环基包括但不限于：氮杂环丙烷基、氧杂环丙烷基、硫杂环丙烷基(thiorenyl)。示例性的含有一个杂原子的4元杂环基包括但不限于：氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基和硫杂环丁烷基。示例性的含有一个杂原子的5元杂环基包括但不限于：四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、吡咯烷基、二氢吡咯基和吡咯基-2,5-二酮。示例性的包含两个杂原子的5元杂环基包括但不限于：二氧杂环戊烷基、氧硫杂环戊烷基(oxasulfuranyl)、二硫杂环戊烷基(disulfuranyl)和噁唑烷-2-酮。示例性的包含三个杂原子的5元杂环基包括但不限于：三唑啉基、噁二唑啉基和噻二唑啉基。示例性的包含一个杂原子的6元杂环基包括但不限于：哌啶基、四氢吡喃基、二氢吡啶基和硫杂环己烷基(thianyl)。示例性的包含两个杂原子的6元杂环基包括但不限于：哌嗪基、吗啉基、二硫杂环己烷基、二噁烷基。示例性的包含三个杂原子的6元杂环基包括但不限于：六氢三嗪基(triazinanyl)。示例性的含有一个杂原子的7元杂环基包括但不限于：氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基和硫杂环庚烷基。示例性的包含一个杂原子的8元杂环基包括但不限于：氮杂环辛烷基、氧杂环辛烷基和硫杂环辛烷基。示例性的与C

“C

“5至10元杂芳基”是指具有环碳原子和1-4个环杂原子的5-10元单环或双环的4n+2芳族环体系(例如，具有以环状排列共享的6或10个π电子)的基团，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫。在含有一个或多个氮原子的杂芳基中，只要化合价允许，连接点可以是碳或氮原子。杂芳基双环系统在一个或两个环中可以包括一个或多个杂原子。杂芳基还包括其中上述杂芳基环与一个或多个环烷基或杂环基稠合的环系统，而且连接点在所述杂芳基环上，在这种情况下，碳原子的数目继续表示所述杂芳基环系统中的碳原子数目。在一些实施方案中，5至6元杂芳基是特别优选的，其为具有环碳原子和1-4个环杂原子的5-6元单环或双环的4n+2芳族环体系。不论杂芳基前是否修饰有“取代的”，杂芳基的每个独立地任选被取代，例如，1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基，适当的取代基如下定义。

示例性的含有一个杂原子的5元杂芳基包括但不限于：吡咯基、呋喃基和噻吩基。示例性的含有两个杂原子的5元杂芳基包括但不限于：咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基和异噻唑基。示例性的含有三个杂原子的5元杂芳基包括但不限于：三唑基、噁二唑基和噻二唑基。示例性的含有四个杂原子的5元杂芳基包括但不限于：四唑基。示例性的含有一个杂原子的6元杂芳基包括但不限于：吡啶基。示例性的含有两个杂原子的6元杂芳基包括但不限于：哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。示例性的含有三个或四个杂原子的6元杂芳基分别包括但不限于：三嗪基和四嗪基。示例性的含有一个杂原子的7元杂芳基包括但不限于：氮杂环庚三烯基、氧杂环庚三烯基和硫杂环庚三烯基。示例性的5,6-双环杂芳基包括但不限于：吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、异苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并异呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噻二唑基、茚嗪基和嘌呤基。示例性的6,6-双环杂芳基包括但不限于：萘啶基、喋啶基、喹啉基、异喹啉基、噌琳基、喹喔啉基、酞嗪基和喹唑啉基。

示例性的碳原子上的取代基包括但不局限于：卤素、-CN、-NO

或者在碳原子上的两个偕氢被基团＝O、＝S、＝NN(R

R

R

R

R

R

R

R

示例性的氮原子上取代基包括但不局限于：氢、-OH、-OR

术语“药学上可接受的盐”是指，在可靠的医学判断范围内，适合与人和低等动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变态反应等等，并且与合理的益处/危险比例相称的那些盐。药学上可接受的盐在本领域是众所周知的。例如，Berge等人在J.PharmaceuticalSciences(1977)66:1-19中详细描述的药学上可接受的盐。本发明化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机和有机酸和无机和有机碱的盐。药学上可接受的无毒的酸加成盐的实例是与无机酸形成的盐，例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，或与有机酸形成的盐，例如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、枸橼酸、琥珀酸或丙二酸。也包括使用本领域常规方法形成的盐，例如，离子交换方法。其它药学上可接受的盐包括：已二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、重硫酸盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酯酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐，等等。衍生自合适的碱的药学上可接受的盐包括碱金属、碱土金属、铵和N

本领域技术人员将理解，有机化合物可以与溶剂形成复合物，其在该溶剂中发生反应或从该溶剂中沉淀或结晶出来。这些复合物称为“溶剂合物”。当溶剂是水时，复合物称为“水合物”。本发明涵盖了本发明化合物的所有溶剂合物。

术语“溶剂合物”是指通常由溶剂分解反应形成的与溶剂相结合的化合物或其盐的形式。这个物理缔合可包括氢键键合。常规溶剂包括包括水、甲醇、乙醇、乙酸、DMSO、THF、乙醚等。本文所述的化合物可制备成，例如，结晶形式，且可被溶剂化。合适的溶剂合物包括药学上可接受的溶剂合物且进一步包括化学计量的溶剂合物和非化学计量的溶剂合物。在一些情况下，所述溶剂合物将能够分离，例如，当一或多个溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时。“溶剂合物”包括溶液状态的溶剂合物和可分离的溶剂合物。代表性的溶剂合物包括水合物、乙醇合物和甲醇合物。

术语“水合物”是指与水相结合的化合物。通常，包含在化合物的水合物中的水分子数与该水合物中该化合物分子数的比率确定。因此，化合物的水合物可用例如通式R·xH

给药的“受试者”包括但不限于：人(即，任何年龄组的男性或女性，例如，儿科受试者(例如，婴儿、儿童、青少年)或成人受试者(例如，年轻的成人、中年的成人或年长的成人))和/或非人的动物，例如，哺乳动物，例如，灵长类(例如，食蟹猴、恒河猴)、牛、猪、马、绵羊、山羊、啮齿动物、猫和/或狗。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人动物。本文可互换使用术语“人”、“患者”和“受试者”。

“疾病”、“障碍”和“病症”在本文中可互换地使用。

除非另作说明，否则，本文使用的术语“治疗”包括受试者患有具体疾病、障碍或病症时所发生的作用，它降低疾病、障碍或病症的严重程度，或延迟或减缓疾病、障碍或病症的发展(“治疗性治疗”)，还包括受试者开始患有具体疾病、障碍或病症之前发生的作用(“预防性治疗”)。

“组合”以及相关术语是指同时或依次给药本发明的治疗剂。例如，本发明化合物可以与另一治疗剂以分开的单位剂型同时或依次给药，或与另一治疗剂一起呈单一单位剂型同时给药。

附图说明

图1为化合物3、8-11、13-22、24的一般合成路线(线路1)；

其中，试剂及反应条件：(a)氯化亚砜，吡啶，二氯甲烷；(b)无水四氢呋喃，三乙胺；

图2为化合物1、2、12和25的一般合成路线(路线2)；

其中，试剂及反应条件：(a)氢氧化钠，乙酸酐，水；(b)氯化亚砜，吡啶，二氯甲烷；无水四氢呋喃，三乙胺；(c)浓盐酸，浓硫酸，50℃；

图3为化合物4-7、23的一般合成路线(线路3)；

其中，试剂及反应条件：(a)EDCI，HOBt，DIEA，DMF；

图4为化合物26的一般合成路线(线路4)；

其中，试剂及反应条件：(a)炔丙基溴，碳酸钾，DMF；

图5为NTZ抑制破骨细胞生成；

其中，M代表M-CSF，R代表RANKL。**代表P<0.01,***代表P<0.001；

图6为NTZ抑制了破骨细胞标志分子的表达；其中，M代表M-CSF，R代表RANKL。***代表P<0.001.

图7为NTZ抑制了OVX小鼠胫骨骨密度的下降；

其中，*代表P<0.05,***代表P<0.001；

图8为NTZ抑制了CIA模型鼠骨破坏的发生；

图9为NTZ衍生物抑制了破骨细胞的生成；

其中，*代表P<0.05,

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明未描述制备方法的原料或产品均购自商品化产品。

本发明化合物的合成方法如下：

实施例1：TIZ(2-羟基-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺)的制备

将NTZ(2-乙酸基-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺)(5mmol)置于50mL圆底烧瓶中，加入15mL浓盐酸，10滴浓硫酸，混合物在50℃下搅拌反应至NTZ完全水解。将混合物过滤，用蒸馏水洗涤固体至中性，乙酸乙酯溶解，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后，柱层析法纯化(二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)得淡黄色TIZ固体，产率：92％。

实施例2：化合物3、8-11、13-22、24的合成

化合物3、8-11、13-22、24的一般合成路线(线路1)如图1所示。

(a)将对应的苯甲酸衍生物(1.5mmol，1.0当量)溶于无水二氯甲烷(5mL/mmol)，向反应液中加入氯化亚砜(1.8mmol，1.2当量)和两滴吡啶，加热回流至反应完全。旋蒸去除溶剂和过量的氯化亚砜，残留固体溶解于无水四氢呋喃中直接进行下一步反应。

(b)2-氨基-5-硝基噻唑(1.5mmol，1.0当量)溶于无水四氢呋喃(5mL/mmol)，并向反应液中加入三乙胺(1.8mmol，1.2当量)。-15℃下，将(a)步所制备苯甲酰氯溶液逐滴加入到上述预冷反应液中。反应液恢复至室温，加热回流过夜，反应至起始原料完全消耗，加水淬灭反应。乙酸乙酯萃取反应液，稀盐酸、饱和食盐水分别洗涤合并的有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏以获得粗品。粗品经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)得到目标化合物。

实施例3：化合物1、2、12和25的合成

化合物1、2、12和25的一般合成路线(路线2)如图2所示。

在按照上述方法将苯甲酸衍生物与2-氨基-5-硝基噻唑进行偶联之前，首先利用乙酸酐对相应苯甲酸的酚羟基进行乙酰化保护，并在得到乙酰化保护的偶联产物后，酸性条件下脱保护以获得最终产物。

酚羟基的乙酰化保护。将1.5g氢氧化钠溶解于20mL蒸馏水中并转移至100mL圆底烧瓶。向上述溶液中加入相应的羟基苯甲酸(18.1mmol)并搅拌至完全溶解。最后，在0℃下，向溶液中加入4ml乙酸酐，在室温下搅拌直至反应完成。过滤混合物，得到的白色固体用蒸馏水充分洗涤，干燥，得到乙酰氧基苯甲酸衍生物。

将待脱保护化合物(5mmol)置于50mL圆底烧瓶中，加入15mL浓盐酸，10滴浓硫酸，混合物在50℃下搅拌反应至原料完全水解。将混合物过滤，用蒸馏水洗涤固体至中性，乙酸乙酯溶解，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后，柱层析法纯化(二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)得脱保护产物。

实施例4：化合物4-7、23的合成

化合物4-7、23的一般合成路线(线路3)如图3所示。

化合物以相应的苯甲酸衍生物及2-氨基-5-硝基噻唑为原料，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)和1-羟基苯并三唑(HOBt)作为缩合试剂，N-二异丙基乙胺(DIEA)提供碱性环境，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，通过一步缩合反应得到，并经柱层析分离纯化。

具体来说，将苯甲酸衍生物(1.5mmol，1.0当量)、EDCI(2.25mmol，1.5当量)和HOBT(2.25mmol，1.5当量)溶解于10mL DMF中并在室温下搅拌30分钟。将2-氨基-5-硝基噻唑(1.5mmol，1.0当量)、DIEA(4.5mmol，3.0当量)溶解于10mL DMF中并在室温下搅拌30分钟。然后将上述反应液混合，室温下搅拌反应至起始原料完全消耗，加水淬灭反应。混合液用乙酸乙酯萃取，合并的有机层用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后，柱层析法纯化(二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)得到目标产物。

实施例5：化合物26的合成

化合物26的一般合成路线(线路4)如图4所示。

化合物26以化合物15为原料，使用炔丙基溴对化合物15进行N-炔丙基化得到。

具体来说，化合物15(2.00mmol，1.0当量)溶于10mL无水DMF中，0℃下，向溶液中加入碳酸钾(9.44mmol，4.7当量)搅拌30分钟。30分钟后，在冰浴条件下，向反应中逐滴加入炔丙基溴(5.00mmol，2.5当量)，恢复反应至室温，继续搅拌反应直到起始原料完全消耗。加水淬灭反应，并用二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤合并的有机层，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后，粗品通过柱层析法纯化(二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)得到化合物26。

实施例6：本发明化合物的表征

本发明中所涉及的化合物，均对其熔点进行了测定，并通过核磁氢谱，碳谱及高分辨质谱进行了表征。

2-羟基-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(TIZ)。淡黄色固体。产率：92％。m.p.:209-210℃.

3-羟基-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物1)。淡黄色固体。产率：35％。m.p.:245-246℃.

4-羟基-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物2)。淡黄色固体。产率：69％。m.p.:213-214℃.

N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物3)。淡黄色固体。产率：81％。m.p.:218-219℃.

2-甲基-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物4)。淡黄色固体。产率：68％。m.p.:182-183℃.

2-硝基-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物5)。淡黄色固体。产率：62％。m.p.:227-228℃.

2-氟-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物6)。淡黄色固体。产率：86％。m.p.:188-189℃.

2-溴-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物7)。淡黄色固体。产率：70％。m.p.:198-199℃.

2-氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物8)。淡黄色固体。产率：64％。m.p.:191-192℃.

2-羟基-3-甲基-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物9)。淡黄色固体。产率：31％。m.p.:181-182℃.

2-羟基-4-甲基-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物10)。淡黄色固体。产率：28％。m.p.:216-217℃.

2-羟基-5-甲基-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物11)。淡黄色固体。产率：22％。m.p.:209-210℃.

2,4-二羟基-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物12)。淡黄色固体。产率：45％。m.p.:243-244℃.

3-氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物13)。淡黄色固体。产率：62％。m.p.:192-193℃.

4-氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物14)。淡黄色固体。产率：72％。m.p.:244-245℃.

N-(5-硝基噻唑-2-基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺(化合物15)。淡黄色固体。产率：76％。m.p.:227-228℃.

4-叠氮-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物16)。淡黄色固体。产率：54％。m.p.:172-173℃.

4-甲氧基-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物17)。淡黄色固体。产率：41％。m.p.:231-232℃.

4-(4-甲基哌嗪-1-基)-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物18)。淡黄色固体。产率：17％。m.p.:210-211℃.

4-吗啉基-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物19)。淡黄色固体。产率：33％。m.p.:186-187℃.

4-(叔丁基)-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物20)。淡黄色固体。产率：68％。m.p.:179-180℃.

4-(甲磺酰基)-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物21)。淡黄色固体。产率：56％。m.p.:198-199℃.

N-(5-硝基噻唑-2-基)-4-氨基磺酰基苯甲酰胺(化合物22)。淡黄色固体。产率：21％。m.p.:193-194℃.

N-(5-硝基噻唑-2-基)-4-(N-苯基氨基磺酰基)苯甲酰胺(化合物23)。产率：71％。淡黄色固体。m.p.:175-176℃.

3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物24)。淡黄色固体。产率：67％。m.p.:202-203℃.

3,4-二羟基-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(化合物25)。淡黄色固体。产率：48％。m.p.:235-236℃.

实施例7：硝唑尼特在抑制骨破坏中的应用

1、硝唑尼特抑制破骨细胞的生成

本实验采用C57BL/6J小鼠骨髓来源的单核细胞作为破骨细胞前体细胞，分别在M-CSF、M-CSF+RANKL、M-CSF+RANKL+NTZ-10μM、M-CSF+RANKL+NTZ-20μM及M-CSF+RANKL+NTZ-40μM作用下诱导破骨细胞分化，期间每3天更换一次刺激因子和细胞培养基，于第6天时进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色，倒置显微镜下观察破骨细胞形成情况，如图5所示，M-CSF单独处理组镜下无典型的多核破骨细胞的生成，M-CSF+RANKL联合处理组镜下可见大量的多核破骨细胞的生成，加入NTZ的三组中，NTZ-40/20μM处理组可明显看到破骨细胞数量的减少，而NTZ10μM较M-CSF+RANKL联合处理组破骨细胞数目无减少。具体每个实验孔中破骨细胞数目计数及统计分析见图5的柱状图。

2、NTZ抑制了破骨细胞标志分子的表达

细胞的处理同1，待细胞培养72小时后收集细胞，提取mRNA，qRT-PCR检测各处理组破骨细胞标志分子TRAP、CathpthinK及MMP9的表达。结果如图6所示，40μM NTZ干预显著抑制了破骨细胞标志分子的表达，而10μM NTZ作用结果不明显，反而促进了破骨细胞标志分子的表达，提示NTZ抑制破骨细胞发生的作用具有浓度依赖性。

3.NTZ抑制的卵巢切除骨质疏松模型小鼠骨密度的下降

卵巢切除(OVX)小鼠模型是研究骨质疏松的经典模型，我们采用OVX模型初步在体研究了NTZ对于骨质疏松发生的影响。手术后1周，随机把试验动物分成5组：假手术组(sham组)、OVX组、NTZ(50mg/kg/d-Low)、NTZ(100mg/kg/d-Middle)和NTZ(200mg/kg/d-High)治疗组，开始给予NTZ及溶剂对照的灌胃干预，12周后处死实验小鼠，结果发现OVX小鼠较sham组小鼠的子宫出现明显的萎缩和子宫重量的下降(见图7A)，体重较NTZ治疗组和假手术组有增加(见图7B)，提示OVX造模成功，且NTZ实验用剂量未见明显毒性反应。胫骨骨密度分析显示，NTZ中等剂量治疗组较OVX组有明显的增加，低剂量和高剂量治疗组较OVX组无明显统计学差异(见图7C)。

4.NTZ显著抑制了胶原诱导关节炎(CIA)小鼠骨破坏的发生

胶原诱导关节炎(CIA)小鼠模型是研究骨破坏性疾病类风湿关节炎的经典模型，我们初步探索了NTZ对于CIA的治疗作用。选取6-8周龄雄性DBA/1小鼠，牛II型胶原溶于0.1mol乙酸中，4℃搅拌，加入等体积完全弗氏佐剂，制成白色乳剂。小鼠尾根部去毛，多点皮内注射50μg胶原乳剂，在初次免疫后第21天以50μg II型胶原溶于PBS，加入不完全弗氏佐剂加强免疫1次，次日开始给予NTZ或溶剂对照(1％羧甲基纤维素钠)干预42天，结果如图8受累关节HE染色所示：CIA组关节可见骨破坏及关节滑膜明显的增生，而NTZ(200mg/kg/d)干预组显著抑制了关节骨破坏的发生，保持了完整的关节结构。

实施例8：NTZ衍生物抑制破骨细胞的生成

我们选取了前述具有代表性的NTZ衍生物，包括化合物9、10、11、13、14、15、16和24，分别在M-CSF+RANKL诱导破骨细胞过程中加用上述化合物，作用浓度均为5μM，共诱导6天，期间3天更换一次培养基，第6天时行TRAP染色，结果如图9所示，NTZ系列衍生物较阳性对照组(M+R)相比，显著抑制了破骨细胞生成，其中化合物14、15、16和24效果相对更佳。