抗糖-MUC1抗体及其用途

1.相关申请的交叉引用

本申请要求2018年6月29日提交的美国临时申请第62/691,887号和2019年2月8日提交的美国临时申请第62/802,865号的优先权，其各自的内容通过引用整体并入本文。

2.序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并且通过引用整体并入本文。所述ASCII副本于2019年6月26日创建，名为GOT-002WO_SL，并且大小为33,365字节。

3.背景技术

人粘蛋白MUC1是多态性跨膜糖蛋白，表达于单层上皮和腺上皮的顶表面(Taylor-Papadimitriou et al.,1999,Biochim.Biophys.Acta,1455:301–313)。MUC1在腺癌中高度过表达且异常地O-糖基化。粘蛋白的细胞外结构域包含20个氨基酸残基的可变数目的串联重复(TR)(25-125)，该串联重复具有五个潜在的O-糖基化位点。O-聚糖在癌细胞中的加工不完全，从而导致泛癌碳水化合物抗原Tn(GalNAcα1-O-Ser/Thr)的表达(Springer,1984,Science 224:1198–1206)。简单的粘蛋白型O-聚糖Tn在腺癌(包括乳腺癌和卵巢癌)中广泛表达，并在正常成人组织中显示出有限的分布(Springer,1984,Science 224:1198–1206)。这些O-聚糖在癌症中的表达与不良预后相关，并且癌症患者中针对这些碳水化合物半抗原的天然抗体增加(Miles,et al.,1995,Br.J.Cancer.71:1074–1076；Soares et al.,1996,Pathol.Res.Pract.192:1181–1186；Werther et al.,1996,Int.J.Cancer.69:193–199)。本领域需要利用在癌细胞中过表达的糖-MUC1表位的治疗方式。

4.发明概述

本公开通过提供基于对糖-MUC1的癌症特异性表位具有选择性的抗体和抗原结合片段的治疗剂和诊断剂来捕获糖肽变体的肿瘤特异性。

本公开提供了结合MUC1的癌症特异性糖基化变体的抗糖-MUC1抗体及其抗原结合片段。本公开还提供了包含抗糖-MUC1抗体和抗原结合片段的融合蛋白和抗体药物缀合物，以及编码抗糖-MUC1抗体、抗原结合片段和融合蛋白的核酸。

本公开还提供了使用抗糖-MUC1抗体、抗原结合片段、融合蛋白、抗体药物缀合物和核酸用于癌症疗法的方法。

在某些方面，本公开提供了结合MUC1的癌症特异性糖基化变体和第二表位的双特异性和其他多特异性抗糖-MUC1抗体和抗原结合片段。第二表位可以在MUC1本身上，在与MUC1共同表达于癌细胞上的另一种蛋白质上，或在呈现于不同细胞例如活化的T细胞上的另一种蛋白质上。此外，还公开了编码此类抗体的核酸，包括包含密码子优化的编码区的核酸和包含未被密码子优化用于在特定宿主细胞中表达的编码区的核酸。

抗糖-MUC1抗体和结合片段可以是含有融合配偶体的融合蛋白的形式。融合配偶体可用于提供第二功能，例如T细胞信号传导蛋白的信号传导结构域的信号传导功能、T细胞活化的肽调节剂或标记系统的酶促组分。示例性的T细胞信号传导蛋白包括4-1BB、CO3C和融合肽，例如CD28-CD3-ζ和4-1BB-CD3-ζ。4-1BB或CD137是T细胞的共刺激受体；CD3-ζ是T细胞抗原受体的信号转导组分。提供第二功能的部分可以是T细胞活化的调节剂，例如IL-15、IL-15Ra或IL-15/IL-15Ra融合体，或者其可以编码标记或用于监测体内或体外结合的程度和/或位置的标记系统的酶促组分。在本公开的一些实施方案中，编码位于T细胞如自体T细胞的背景中的这些具有预防和治疗活性的生物分子的构建体提供了用于募集过继转移的T细胞以预防或治疗多种癌症的强有力平台。

在某些方面，本公开的抗糖-MUC1抗体和抗原结合片段包含表1A和表1B中所示的重链可变序列和/或轻链可变序列(或由核苷酸序列编码)。为了清楚起见，当在本文中使用术语“抗糖-MUC1抗体”时，除非上下文另有说明，其旨在包括单特异性和多特异性(包括双特异性)抗糖-MUC1抗体、单特异性和多特异性抗体的抗原结合片段以及含有抗体及其抗原结合片段的融合蛋白和缀合物。同样，当使用术语“抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段”时，除非上下文另有说明，其也旨在包括单特异性和多特异性(包括双特异性)抗糖-MUC1抗体及其抗原结合片段，以及含有此类抗体和抗原结合片段的融合蛋白和缀合物。

在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含表1-3中列出的重链和/或轻链CDR序列(或由核苷酸序列编码)。表1A和表1B中列出的CDR序列包括根据用于限定CDR界限的IMGT(Lefranc et al.,2003,Dev Comparat Immunol 27:55-77)、Kabat(Kabat et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)和Chothia(Al-Lazikani et al.,1997,J.Mol.Biol 273:927-948)方案所定义的CDR序列。表1C、表1D和表1E中列出的CDR序列是分别根据IMGT、Kabat和Chothia定义衍生自表1A和表1B中列出的CDR序列的共有序列。表2A和表2B中列出的CDR序列分别是表1A和表1B中列出的CDR序列的重叠的组合区域，其中IMGT、Kabat和Chothia序列以带下划线的粗体文本显示。表2C中列出的CDR序列是表1C、表1D和表1E中列出的共有CDR序列的重叠的组合区域。表3A和表3B中列出的CDR序列分别是表1A和表1B中所示的CDR序列的重叠的共同区域。表3C中列出的CDR序列是表1C、表1D和表1E中列出的CDR序列的重叠的共同区域。此类抗糖-MUC1抗体和抗原结合片段的框架序列可以是表1A或表1B中列出的VH和VL序列的天然鼠框架序列，或者可以是非天然的(例如人源化的或人的)框架序列。

在某些方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含CDR，其包含在编号的实施方案3至41中列出的任何CDR组合的氨基酸序列。因此，在某些实施方案中，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的CDR-H1、含有SEQ IDNO:94的氨基酸序列的CDR-H2、含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR-H3、含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR-L1、含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR-L2和含有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，CDR-H1包含SEQ ID NO:3、9、15、25、31、37、45、51、57、63、69、75、81、87或93的氨基酸序列。在一些实施方案中，CDR-H2包含SEQ ID NO:4、10、16、26、32、38、46、52、58、64、70、76、82、88或94的氨基酸序列。在一些实施方案中，CDR-H3包含SEQ ID NO:5、11、17、27、33、39、47、53、59、65、71、77、83、89或95的氨基酸序列。在一些实施方案中，CDR-L1包含SEQ ID NO:6、12、18、28、34、40、48、54、60、66、72、78、84、90或96的氨基酸序列。在一些实施方案中，CDR-L2包含SEQ ID NO:7、13、19、29、35、41、49、55、61、67、73、79、85、91或97的氨基酸序列。在一些实施方案中，CDR-L3包含SEQ ID NO:8、14、20、30、36、42、50、56、62、68、74、80、86或92的氨基酸序列。

在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:3-5的重链CDR和SEQ ID NOS:6-8的轻链CDR。在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:9-11的重链CDR和SEQ ID NOS:12-14的轻链CDR。在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:15-17的重链CDR和SEQ ID NOS:18-20的轻链CDR。在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:25-27的重链CDR和SEQ ID NOS:28-30的轻链CDR。在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:31-33的重链CDR和SEQ ID NOS:34-36的轻链CDR。在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:37-39的重链CDR和SEQ ID NOS:40-42的轻链CDR。在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:45-47的重链CDR和SEQ ID NOS:48-50的轻链CDR。在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:51-53的重链CDR和SEQ ID NOS:54-56的轻链CDR。在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:57-59的重链CDR和SEQ ID NOS:60-62的轻链CDR。在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:63-65的重链CDR和SEQ ID NOS:66-68的轻链CDR。在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:69-71的重链CDR和SEQ ID NOS:72-74的轻链CDR。在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:75-77的重链CDR和SEQ ID NOS:78-80的轻链CDR。在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:81-83的重链CDR和SEQ ID NOS:84-86的轻链CDR。在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID No:87-89的重链CDR和SEQ ID NOS:90-92的轻链CDR。

本公开的抗体和抗原结合片段可以是鼠的、嵌合的、人源化的或人的。

在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与包含分别为SEQ ID NO：1和2的重链和轻链可变区的抗体或抗原结合片段竞争。在其他方面，本公开提供了具有重链和轻链可变区的抗MUC1抗体或抗原结合片段，该重链和轻链可变区分别与SEQ ID NO：1和2具有至少95％、98％、99％或99.5％的序列同一性。

在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与包含分别为SEQ ID NO：23和24的重链和轻链可变区的抗体或抗原结合片段竞争。在其他方面，本公开提供了具有重链和轻链可变区的抗MUC1抗体或抗原结合片段，该重链和轻链可变区分别与SEQ ID NO：23和24具有至少95％、98％、99％或99.5％的序列同一性。

在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。示例性的scFv包含位于轻链可变片段N末端的重链可变片段。在一些实施方案中，scFv重链可变片段和轻链可变片段共价结合至4-15个氨基酸的接头序列。scFv可以是双特异性T细胞衔接子的形式，也可以在嵌合抗原受体(CAR)内。

抗糖-MUC1抗体和抗原结合片段可以是单链可变片段的多聚体、双特异性单链可变片段和双特异性单链可变片段的多聚体的形式。在一些实施方案中，单链可变片段的多聚体选自二价单链可变片段、三体(tribody)或四体(tetrabody)。在这些实施方案的一些中，双特异性单链可变片段的多聚体是双特异性T细胞衔接子。

本公开的其他方面涉及编码本公开的抗糖-MUC1抗体和抗原结合片段的核酸。在一些实施方案中，对编码抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段的核酸的部分进行密码子优化以在人细胞中表达。在某些方面，本公开提供了具有重链和轻链可变区的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，所述重链和轻链可变区由与SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:43具有至少95％、98％、99％或99.5％序列同一性的重链核苷酸序列和与SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：44具有至少95％、98％、99％或99.5％序列同一性的轻链核苷酸序列编码。包含核酸的载体(例如病毒载体，如慢病毒载体)和宿主细胞也在本公开的范围内。重链和轻链编码序列可以存在于单个载体或分开的载体。

本公开的另一方面是药物组合物，其包含根据本公开的抗糖-MUC1抗体、抗原结合片段、核酸(或核酸对)、载体(或载体对)或宿主细胞和生理上合适的缓冲液、佐剂或稀释剂。

本公开的另一方面是制备嵌合抗原受体的方法，其包括在适合于编码区表达的条件下孵育包含根据本公开的核酸或载体的细胞，并收集嵌合抗原受体。

本公开的另一方面是检测癌症的方法，其包括使细胞或组织样品与本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段接触，并检测抗体是否与细胞或组织样品结合。

本公开的另一方面是根据本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其用于检测癌症。

本公开的另一方面是治疗癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的根据本公开的抗糖-MUC1抗体、抗原结合片段、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物。

本公开的另一方面是根据本公开的抗糖-MUC1抗体、抗原结合片段、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其用于治疗癌症。

本公开的另一方面是根据本公开的抗糖-MUC1抗体、抗原结合片段、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

5.附图简要说明

图1A-EF：ELISA测定的结果，其显示了1AG和4AG与糖基化和非糖基化MUC1肽结合的特异性。图1A：肽C2；图1B：肽C3；图1C：肽C4；图1D：肽70；图1E：GST；图1F：BSA封闭的孔(对照)。

图2：ELISA测定的结果，其显示了1AG(图2A)和4AG(图2B)与不同的糖基化和非糖基化MUC1肽结合的特异性。

图3：用1AG和4AG进行的针对抗原GSTA的抗体滴定测定的结果。

图4：用肿瘤微阵列BCN721a进行抗体1AG免疫组织化学筛选的结果。

图5：用肿瘤微阵列BCN721a进行抗体4AG免疫组织化学筛选的结果。

图6：用肿瘤微阵列OV241c进行抗体1AG免疫组织化学筛选的结果。

图7：用肿瘤微阵列OV241c进行抗体4AG免疫组织化学筛选的结果。

图8：用肿瘤微阵列BC000119进行抗体1AG免疫组织化学筛选的结果。

图9：用肿瘤微阵列BC000119进行抗体4AG免疫组织化学筛选的结果。

图10：用抗体5E5进行丙氨酸扫描的结果。

图11：用抗体1AG进行丙氨酸扫描的结果。

图12：用抗体4AG进行丙氨酸扫描的结果。

6.发明详述

6.1抗体

本公开提供了针对存在于肿瘤细胞上的MUC1的糖型的新型抗体。这些抗体以抗体1AG和4AG为例。在抗体的筛选中鉴定了1AG和4AG，所述抗体结合MUC1中存在的糖基化15-mer，即

以抗体1AG和4AG为例的本公开的抗糖-MUC1抗体可用作癌症诊断和疗法中的工具。

因此，在某些方面，本公开提供了与存在于肿瘤细胞上的MUC1的糖型(在本文中称为“糖-MUC1”)结合，并优选与15-mer肽

本公开的抗糖-MUC1抗体可以是多克隆的、单克隆的、基因工程化的和/或在性质上以其他方式修饰的，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、灵长类抗体、单链抗体、双特异性抗体、双可变结构域抗体等。在各种实施方案中，抗体包含抗体恒定区的全部或部分。在一些实施方案中，恒定区是选自以下的同种型：IgA(例如IgA

如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体通过本领域可用或已知的任何方式衍生自单个克隆，包括任何真核克隆、原核克隆或噬菌体克隆。可以使用本领域已知的多种技术，包括使用杂交瘤技术、重组技术和噬菌体展示技术或其组合来制备可用于本公开的单克隆抗体。在本公开的多种用途中，包括在人类中体内使用抗糖-MUC1抗体，可以适当地使用嵌合抗体、灵长类化抗体、人源化抗体或人抗体。

如本文所用的术语“嵌合”抗体是指具有衍生自非人免疫球蛋白例如大鼠或小鼠抗体的可变序列和通常选自人免疫球蛋白模板的人免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7；Oi etal.,1986,BioTechniques 4:214-221；Gillies et al.,1985,J.Immunol.Methods 125:191-202；美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816397，其通过引用整体并入本文。

“人源化”形式的非人(例如鼠)抗体是嵌合的免疫球蛋白，其包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗体将包含至少一个、且通常两个基本上整个可变结构域，其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白共有序列的一部分。抗体人源化的方法是本领域已知的。参见例如，Riechmann et al.,1988,Nature 332:323-7；Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370；EP239400；PCT公开文本WO 91/09967；美国专利号5,225,539；EP592106；EP519596；Padlan,1991,Mol.Immunol.,28:489-498；Studnicka et al.,1994,Prot.Eng.7:805-814；Roguska et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.91:969-973；和美国专利号5,565,332，其全部通过引用整体并入本文。

“人抗体”包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库分离或从针对一种或多种人免疫球蛋白转基因且不表达内源性免疫球蛋白的动物分离的抗体。可以通过本领域已知的多种方法，包括使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法来制备人抗体。参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及PCT公开文本WO 98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO 96/33735；和WO 91/10741，其各自通过引用整体并入本文。也可以使用不能表达功能性内源性免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。参见例如，PCT公开文本WO98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598，其通过引用整体并入本文。可以使用称为“指导选择”的技术来生成识别选定表位的完全人抗体。在这种方法中，使用选定的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体来指导识别相同表位的完全人抗体的选择(参见，Jespers et al.,1988,Biotechnology 12:899-903)。

“灵长类化抗体”包含猴可变区和人恒定区。产生灵长类化抗体的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利号5,658,570；5,681,722；和5,693,780，其通过引用整体并入本文。

本公开的抗糖-MUC1抗体包括全长(完整)抗体分子，以及能够结合糖-MUC1的抗原结合片段两者。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')

Fab片段包含轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的区别在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab')片段通过切割在F(ab')

“Fv”片段是包含完整靶标识别和结合位点的抗体的最小片段。该区域由紧密非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体(V

“单链Fv”或“scFv”抗原结合片段包含抗体的V

“单结构域抗体”由对糖-MUC1呈现出足够亲和力的单个V

本公开的抗糖-MUC1抗体也可以是双特异性抗体和其他多种特异性抗体。双特异性抗体是对相同或不同抗原上的两个不同表位具有结合特异性的单克隆抗体，通常是人抗体或人源化抗体。在本公开中，一种结合特异性可以针对糖-MUC1，另一种可以针对任何其他抗原，例如针对细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒衍生蛋白、病毒编码的包膜蛋白、细菌衍生蛋白或细菌表面蛋白等。在某些优选的实施方案中，双特异性和其他多特异性抗糖-MUC1抗体和抗原结合片段特异性结合第二MUC1表位，在癌细胞上与MUC1共表达的另一种蛋白上的表位或在不同细胞例如活化的T细胞上呈现的另一种蛋白上的表位。本公开的双特异性抗体包括IgG形式的双特异性抗体和基于单链的双特异性抗体。

本公开的IgG形式的双特异性抗体可以是本领域已知的各种类型的IgG形式双特异性抗体中的任一种，例如四源杂交瘤双特异性抗体、“突出-入-孔(knobs-in-holes)”双特异性抗体、CrossMab双特异性抗体、电荷配对双特异性抗体、共同轻链双特异性抗体、单臂单链Fab-免疫球蛋白γ双特异性抗体、二硫化物稳定化的Fv双特异性抗体、DuetMab、受控Fab臂交换双特异性抗体、链交换工程化结构域体双特异性抗体、两臂亮氨酸拉链异二聚体单克隆双特异性抗体、κλ体双特异性抗体、双可变结构域双特异性抗体和交叉双可变结构域双特异性抗体。参见例如，

在一些实施方案中，本公开的双特异性抗体是CrossMab。CrossMab技术详细描述于WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2013/026833、WO 2016/020309和Schaefer et al.,2011,Proc Natl Acad Sci USA 108:11187-92，其通过引用整体并入本文。简而言之，CrossMab技术基于双特异性IgG的一条Fab臂内的重链和轻链之间的结构域交叉，从而促进正确的链缔合。本公开的CrossMab双特异性抗体可以是“CrossMab

在一些实施方案中，本公开的双特异性抗体是受控Fab臂交换双特异性抗体。制备Fab臂交换双特异性抗体的方法描述于PCT公开号WO2011/131746和Labrijn et al.,2014Nat Protoc.9(10):2450-63，其通过引用整体并入本文。简而言之，可通过分别表达两个在CH3结构域中包含单个匹配点突变的亲本IgG1，在体外氧化还原条件下混合亲本IgG1以使半分子重组，并去除还原剂以允许链间二硫键再氧化，从而形成双特异性抗体来制备受控Fab臂交换双特异性抗体。

本公开的双特异性抗体可以包含由第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域。在一个实施方案中，Fc结构域是IgG Fc结构域。在具体的实施方案中，Fc结构域是IgG

在具体的实施方案中，Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在CH3结构域中。因此，在一个实施方案中，所述修饰在Fc结构域的CH3结构域中。

在具体的实施方案中，所述促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰是所谓的“突出-入-孔”修饰，其包括在Fc结构域的两个亚基的一个中的“突出”修饰和Fc结构域的两个亚基的另一个中的“孔”修饰。突出-入-孔技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway et al.,1996,Prot Eng 9:617-621,和Carter,J,2001,Immunol Meth 248:7-15。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“突出”)，并在第二多肽的界面中引入相应的腔(“孔”)，使得突起可置于腔中以促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链替换为较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)来构建突起。通过将大的氨基酸侧链替换为较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)，在第二多肽的界面中产生与突起相同或相似大小的补偿腔。

因此，在一些实施方案中，将Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，从而在第一亚基的CH3结构域内产生突起，该突起可定位在第二亚基的CH3结构域内的腔中，并且将Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，从而在第二亚基的CH3结构域内产生腔，第一亚基的CH3结构域内的突起可定位到该腔内。优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自下组：精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自下组：丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。突起和腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成来制备。

在具体的此类实施方案中，在Fc结构域的第一亚基中，将366位的苏氨酸残基替换为色氨酸残基(T366W)，并且在Fc结构域的第二亚基中，将407位的酪氨酸残基替换为缬氨酸残基(Y407V)，并且任选地，将366位的苏氨酸残基替换为丝氨酸残基(T366S)，并且将368位的亮氨酸残基替换为丙氨酸残基(L368A)(根据Kabat EU索引编号)。在其他实施方案中，在Fc结构域的第一亚基中，另外将354位的丝氨酸残基替换为半胱氨酸残基(S354C)或将356位的谷氨酸残基替换为半胱氨酸残基(E356C)(特别地将354位的丝氨酸残基替换为半胱氨酸残基)，并且在Fc结构域的第二亚基中，另外将349位的酪氨酸残基替换为半胱氨酸残基(Y349C)(根据Kabat EU索引编号)。在具体的实施方案中，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。

在一些实施方案中，静电操纵(例如，如在Gunasekaran et al.,2010,J BiolChem 285(25):19637-46中所述)可用于促进Fc结构域的第一和第二亚基的缔合。

在一些实施方案中，Fc结构域包含减少与Fc受体的结合和/或效应子功能的一个或多个氨基酸取代。

在具体的实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，Fc受体是活化的Fc受体。在具体的实施方案中，Fc受体是活化的人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个实施方案中，效应子功能是选自下组的一种或多种：补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和细胞因子分泌。在具体的实施方案中，效应子功能是ADCC。

通常，在Fc结构域的两个亚基的每一个中存在相同的一个或多个氨基酸取代。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代降低了Fc结构域与Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代使Fc结构域与Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。

在一个实施方案中，Fc结构域在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329(根据Kabat EU索引编号)的位置处包含氨基酸取代。在更具体的实施方案中，Fc结构域在选自L234、L235和P329(根据Kabat EU索引编号)的位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)。在一个此类实施方案中，Fc结构域是IgG

本公开的基于单链的双特异性抗体可以是本领域已知的各种类型的基于单链的双特异性抗体中的任一种，例如双特异性T细胞衔接子(BiTE)、双抗体、串联双抗体(tandab)、双重亲和力重靶向分子(DART)和双特异性杀伤细胞衔接子。参见例如，

在一些实施方案中，本公开的双特异性抗体是双特异性T细胞衔接子(BiTE)。BiTE是具有两个抗原结合结构域的单多肽链分子，其中一个与T细胞抗原结合，且其中第二个与靶表面上存在的抗原结合(参见PCT公开WO 05/061547；Baeuerle et al.,2008,Drugs ofthe Future 33:137-147；Bargou,et al.,2008,Science 321:974-977，其通过引用整体并入本文)。因此，本公开的BiTE具有与T细胞抗原结合的抗原结合结构域和针对糖-MUC1的第二抗原结合结构域。

在一些实施方案中，本公开的双特异性抗体是双重亲和力重靶向分子(DART)。DART包含至少两条多肽链，它们结合(特别是通过共价相互作用)形成至少两个可以识别相同或不同表位的表位结合位点。DART的每条多肽链均包含免疫球蛋白轻链可变区和免疫球蛋白重链可变区，但这些区域不发生相互作用形成表位结合位点。而是，DART多肽链中的一条(例如第一条)的免疫球蛋白重链可变区与不同(例如第二条)DART

在本公开的双特异性抗体的一些实施方案中，一种结合特异性针对糖-MUC1，而另一种针对免疫效应细胞上表达的抗原。如本文所用的术语“免疫效应细胞”或“效应细胞”是指哺乳动物免疫系统中细胞天然库中的细胞，其可以被激活以影响靶细胞的活力。免疫效应细胞包括淋巴样谱系的细胞，例如自然杀伤(NK)细胞，T细胞，包括细胞毒性T细胞，或B细胞，但髓样谱系的细胞也可以视为免疫效应细胞，例如单核细胞或巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞。因此，所述效应细胞优选是NK细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞。效应细胞募集到异常细胞意味着免疫效应细胞被带到异常靶细胞附近，使得效应细胞可以直接杀死其被募集到的异常细胞或间接引发其被募集到的异常细胞的杀死。为了避免非特异性相互作用，优选地，本公开的双特异性抗体特异性识别免疫效应细胞上的抗原，其与体内其他细胞相比，至少由这些免疫效应细胞过表达。免疫效应细胞上存在的靶抗原可以包括CD3、CD8、CD16、CD25、CD28、CD64、CD89、NKG2D和NKp46。优选地，免疫效应细胞上的抗原是在T细胞上表达的CD3。

如本文所用，除非另有说明，否则“CD3”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3，脊椎动物包括哺乳动物，例如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语涵盖“全长”未加工的CD3以及在细胞中加工产生的任何形式的CD3。该术语还涵盖CD3的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。免疫效应细胞上最优选的抗原是CD3ε链。该抗原已显示出在将T细胞募集至异常细胞方面非常有效。因此，本公开的双特异性抗体优选地特异性识别CD3ε。人CD3ε的氨基酸序列显示为UniProt(www.uniprot.org)登录号P07766(版本144)，或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_000724.1。食蟹猴(Macaca fascicularis)CD3ε的氨基酸序列显示为NCBIGenBank no.BAB71849.1。为了用于人的治疗用途，使用其中CD3结合结构域特异性结合人CD3例如人CD3ε链的双特异性抗体。为了在非人动物和细胞系中进行临床前测试，可以使用其中CD3结合结构域特异性结合临床前测试所用物种中的CD3(例如，用于灵长类动物测试的食蟹猴CD3)的双特异性抗体。

如本文所用，“特异性结合”或“特异性识别”来自特定物种的靶抗原的结合结构域不排除与来自其他物种的抗原的结合或识别，因此涵盖其中一个或多个结合结构域具有种间交叉反应性的抗体。例如，“特异性结合”或“特异性识别”人CD3的CD3结合结构域也可以结合或识别食蟹猴CD3，反之亦然。

在一些实施方案中，本公开的双特异性抗体可以与单克隆抗体H2C(描述于PCT公开号WO2008/119567)竞争结合CD3的表位。在其他实施方案中，本公开的双特异性抗体可以与单克隆抗体V9(描述于Rodrigues et al.,1992,Int J Cancer Suppl 7:45-50和美国专利号6,054,297)竞争结合CD3的表位。在其他实施方案中，本公开的双特异性抗体可以与单克隆抗体FN18(描述于Nooij et al.,1986,Eur J Immunol 19:981-984)竞争结合CD3的表位。在其他实施方案中，本公开的双特异性抗体可以与单克隆抗体SP34(描述于Pessano etal.,1985,EMBO J 4:337-340)竞争结合CD3的表位。

本公开的抗糖-MUC1抗体包括衍生化抗体。例如但不作为限制，衍生化抗体通常通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质连接来修饰。多种化学修饰中的任何一种都可以通过已知技术进行，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生物可以包含一种或多种非天然氨基酸，例如，使用ambrx技术(参见，例如，Wolfson,2006,Chem.Biol.13(10):1011-2)。

抗糖-MUC1抗体或结合片段可以是其序列已被修饰以改变至少一种恒定区介导的生物学效应子功能的抗体或片段。例如，在一些实施方案中，抗糖-MUC1抗体可以被修饰以相对于未经修饰的抗体降低至少一种恒定区介导的生物学效应子功能，例如，降低与Fc受体(FcγR)的结合。可以通过在对FcγR相互作用必要的特定区域突变抗体的免疫球蛋白恒定区片段来降低FcγR结合(参见例如，Canfield和Morrison,1991,J.Exp.Med.173:1483-1491；和Lund et al.,1991,J.Immunol.147:2657-2662)。抗体的FcγR结合能力的降低还可降低依赖于FcγR相互作用的其他效应子功能，例如调理作用、吞噬作用和抗原依赖性细胞毒性(“ADCC”)。

本文所述的抗糖-MUC1抗体或结合片段包括已被修饰以相对于未经修饰的抗体获得或改善至少一种恒定区介导的生物学效应子功能，例如增强FcγR相互作用的抗体和/或结合片段(参见例如US 2006/0134709)。例如，本公开的抗糖-MUC1抗体可以具有以比相应的野生型恒定区更高的亲和力结合FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的恒定区。

因此，本公开的抗体可具有生物学活性的改变，从而导致调理作用、吞噬作用或ADCC增加或降低。此类改变是本领域已知的。例如，在美国专利号5,834,597中描述了降低ADCC活性的抗体修饰。示例性降低ADCC的变体对应于“突变体3”(示于美国专利号5,834,597的图4，其中残基236被删除，且残基234、235和237(使用EU编号)被丙氨酸取代。另一个示例性降低ADCC的变体包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”)。氨基酸取代的“P329G LALA”组合几乎完全消除了人IgG

在一些实施方案中，本公开的抗糖-MUC1抗体具有低水平的岩藻糖或缺乏岩藻糖。缺乏岩藻糖的抗体与ADCC活性增强相关，尤其是在低剂量抗体下。参见Shields et al.,2002,J.Biol.Chem.277:26733-26740；Shinkawa et al.,2003,J.Biol.Chem.278:3466-73。制备无岩藻糖抗体的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0细胞(ATCC CRL 1662)中生长。YB2/0细胞表达低水平的FUT8mRNA，其编码α-1,6-岩藻糖基转移酶，该酶是多肽岩藻糖基化所必需的酶。

在一些实施方案中，抗糖-MUC1抗体或结合片段包括一分为二的寡糖，例如其中附接至Fc结构域的双触角寡糖(biantennary oligosaccharide)被GlcNAc一分为二。如上所述，此类变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如，Umana et al.,1999,Nat Biotechnol 17:176-180；Ferrara et al.,2006,BiotechnBioeng 93:851-861；WO 99/54342；WO 2004/065540；和WO 2003/011878。

在另一方面，抗糖-MUC1抗体或结合片段包括增加或降低其与胎儿Fc受体FcRn的结合亲和力的修饰，例如，通过在参与FcRn相互作用的特定区域突变免疫球蛋白恒定区片段(参见例如WO 2005/123780)。在具体的实施方案中，使IgG类的抗糖-MUC1抗体突变，使得重链恒定区的氨基酸残基250、314和428中的至少一个单独地被取代，或以其任何组合被取代，例如在位置250和428、或在位置250和314、或在位置314和428、或在位置250、314和428，其中位置250和428是特定的组合。对于位置250，取代的氨基酸残基可以是除苏氨酸以外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于位置314，取代的氨基酸残基可以是除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于位置428，取代的氨基酸残基可以是除甲硫氨酸以外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。合适的氨基酸取代的特定组合在美国专利号7,217,797的表1中鉴定，其通过引用并入本文。此类突变增加与FcRn的结合，从而保护抗体免于降解并延长其半衰期。

在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段具有插入到一个或多个其高变区中的一个或多个氨基酸，例如，如Jung和Pluckthun,1997,Protein Engineering10:9,959-966；Yazaki et al.,2004,Protein Eng.Des Sel.17(5):481-9.Epub 2004Aug.17；和美国专利申请号2007/0280931中所述。

在其他方面，特别对于诊断应用有用的是，将本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段附接至可检测部分。可检测部分包括放射性部分、比色分子、荧光部分、化学发光部分、抗原、酶、可检测珠(例如磁性珠或电极(例如金)珠)、或与另一分子结合的分子(例如生物素或链霉抗生物素蛋白)。

放射性同位素或放射性核素可包括

荧光标记可包括罗丹明、镧系元素磷光体、荧光素及其衍生物、荧光染料、GFP(GFP表示“绿色荧光蛋白”)、丹磺酰基、伞形酮、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。

酶标记可包括辣根过氧化物酶、β半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6PDH”)、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶和过氧化物酶。

化学发光标记或化学发光剂例如为异鲁米诺，鲁米诺和二氧杂环丁烷。

其他可检测部分包括例如生物素、洋地黄毒苷或5-溴脱氧尿苷的分子。

在某些方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与1AG或包含1AG的重链和轻链可变区(分别为SEQ ID NO：1和2)的抗体或抗原结合片段竞争。

在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与4AG或包含4AG的重链和轻链可变区(分别为SEQ ID NO：23和24)的抗体或抗原结合片段竞争。

可以对表达被1AG或4AG结合的糖-MUC1表位的细胞或对包含被1AG或4AG结合的表位的糖基化MUC1肽，例如在以粗体和下划线文本显示的丝氨酸和苏氨酸残基上被GalNAc糖基化的15-mer肽

可对其进行竞争性测定的细胞包括但不限于乳腺癌细胞系MCF7或T47D，和经工程化改造以表达糖-MUC1表位的重组细胞。在一个非限制性实例中，将缺乏UDP-Gal/GalNAc差向异构酶并且在缺少外源添加GalNAc和Gal的情况下分别缺少GalNAc O-糖基化和半乳糖基化的CHO IdID细胞改造成表达MUC1并使其在缺少或存在GalNAc的情况下培养，后者产生表达与1AG和4AG结合的MUC1的Tn糖型的细胞。表达未糖基化形式的MUC1的细胞可用作阴性对照。

竞争性测定包括但不限于放射性物质标记免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、夹心ELISA、荧光激活细胞分选(FACS)测定和表面等离振子共振(例如Biacore)测定。

在参考抗体和测试抗体(不论种类或同种型)之间进行抗体竞争性测定时，可以先用可检测标记例如荧光团、生物素或酶(或甚至放射性)标记，来标记参考物，以便能够进行随后的鉴定。在这种情况下，将表达糖-MUC1的细胞与未标记的测试抗体一起孵育，添加标记的参考抗体，并测量结合标记的强度。如果测试抗体通过结合重叠的表位与标记的参考抗体竞争，则相对于没有测试抗体的情况下进行的对照反应，强度将会降低。

在该测定的具体实施方案中，首先确定在测定条件(例如，指定的细胞密度)下产生最大结合的80％(“conc

抑制可以表示为抑制常数或K

K

其中IC

在各种实施方案中，在所使用的特定测定条件下，参考抗体浓度为最大结合的80％，且测试抗体浓度比参考抗体浓度高10倍时，如果测试抗体使参考抗体的结合降低至少约20％或更多，例如降低至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至更多或降低介于上述任何值之间的百分比，则认为测试抗体与参考抗体竞争。

在竞争测定的一个实例中，通过使板与肽溶液接触(例如，在PBS中浓度为1μg/mL，4℃过夜)，使糖基化的MUC1 15-mer肽粘附到固体表面，例如微孔板。将板洗涤(例如，在PBS中的0.1％Tween 20)并封闭(例如，在Superblock中，Thermo Scientific，Rockford，IL)。将在ELISA缓冲液(例如PBS中的1％BSA和0.1％Tween 20)中系列稀释(例如，浓度为2.8μg/mL，8.3μg/mL或25μg/mL)的亚饱和量的生物素化1AG或4AG(例如，浓度为80ng/mL)和未标记的1AG或4AG(“参考”抗体)或竞争性抗糖-MUC1抗体(“测试”抗体)的混合物添加至孔并将板轻轻摇动孵育1小时。洗涤板，将在ELISA缓冲液中稀释的1μg/mL HRP缀合的链霉抗生物素蛋白添加至每个孔，并将板孵育1小时。洗涤板并通过添加底物(例如，TMB，BiofxLaboratories Inc.，Owings Mills，MD)来检测结合的抗体。通过添加终止缓冲液(例如，Bio FX终止试剂，Biofx Laboratories Inc.，Owings Mills，MD)来终止反应，并使用酶标仪(例如，VERSAmax，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在650nm处测量吸光度。

该竞争测定的变型也可以用于测试1AG或4AG与另一种抗糖-MUC1抗体之间的竞争。例如，在某些方面，抗糖-MUC1抗体用作参考抗体，而1AG或4AG用作测试抗体。另外，代替糖基化的MUC1 15-mer肽，可以使用培养中的在细胞表面上(例如在上述一种细胞类型的表面上)表达的膜结合的糖-MUC1。通常，使用约10

在各种实施方案中，当抗糖-MUC1抗体的使用浓度为0.08μg/mL、0.4μg/mL、2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL或范围介于上述任何值之间的浓度(例如，范围为2μg/mL至10μg/mL的浓度)时，本公开的抗糖-MUC1抗体使标记的1AG或4AG的结合降低至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，或降低范围介于任何上述值之间的百分比(例如，本公开的抗糖-MUC1抗体使标记的1AG或4AG的结合降低50％至70％)。

在其他实施方案中，当1AG或4AG的使用浓度为0.4μg/mL、2μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、250μg/mL或范围介于任何上述值之间的浓度(例如，范围为2μg/mL至10μg/mL的浓度)时，1AG或4AG使本公开的标记的抗糖-MUC1抗体的结合降低至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，或降低范围介于任何上述值之间的百分比(例如1AG或4AG使本公开的标记的抗糖-MUC1抗体的结合降低50％至70％)。

在前述测定中，可用包含1AG或4AG的CDR或重链和轻链可变区的任何抗体或抗原结合片段(例如1AG或4AG的人源化或嵌合对应物)替换1AG或4AG抗体。

在某些方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段具有与1AG或4AG的表位相同或相似的表位。本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段的表位可以通过进行例如如实施例9中所述的丙氨酸扫描来表征。实施例9描述了12个糖肽(SEQ ID NO：106-117)的文库，每个糖肽与MUC1肽

在一些实施方案中，如通过ELISA所测量的，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

在一些实施方案中，如通过ELISA所测量的，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

在一些实施方案中，如通过ELISA所测量的，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

在一些实施方案中，如通过ELISA所测量的，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

在一些实施方案中，如通过ELISA所测量的，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

在一些实施方案中，如通过ELISA所测量的，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

在一些实施方案中，如通过ELISA所测量的，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

在一些实施方案中，如通过ELISA所测量的，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

在一些实施方案中，如通过ELISA所测量的，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

在一些实施方案中，如通过ELISA所测量的，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

在一些实施方案中，如通过ELISA所测量的，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

在一些实施方案中，如通过ELISA所测量的，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

在某些方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含表1A或表1B中列出的重链和/或轻链可变区序列(或由核苷酸序列编码)。在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段包含表1A、表1B、表1C、表1D、表1E、表2A、表2B、表2C、表3A或表3B中列出的重链和/或轻链CDR序列(或由核苷酸序列编码)。此类抗糖-MUC1抗体和抗原结合片段的框架序列可以是表1A或表1B中列出的VH和VL序列的天然鼠框架序列，或者可以是非天然的(例如人源化的或人的)框架序列。

在其他方面，本公开提供了具有重链和轻链可变区的抗MUC1抗体或抗原结合片段，该重链和轻链可变区分别与SEQ ID NO：1和2具有至少95％、98％、99％或99.5％的序列同一性。

在其他方面，本公开提供了具有重链和轻链可变区的抗MUC1抗体或抗原结合片段，该重链和轻链可变区分别与SEQ ID NO：23和24具有至少95％、98％、99％或99.5％的序列同一性。

在其他方面，本公开的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。示例性的scFv包含位于轻链可变片段N末端的重链可变片段。在一些实施方案中，scFv重链可变片段和轻链可变片段共价结合至4-15个氨基酸的接头序列。scFv可以是双特异性T细胞衔接子的形式，也可以在嵌合抗原受体(CAR)内。

6.2抗体-药物缀合物

本公开的另一方面涉及抗体药物缀合物(ADC)，其包括本公开的抗糖-MUC1抗体和抗原结合片段。ADC通常包含如本文所述的抗糖-MUC1抗体和/或结合片段，其通过一个或多个接头与一种或多种细胞毒性剂和/或细胞抑制剂连接。在具体的实施方案中，ADC是根据结构式(I)的化合物或其盐：

[D-L-XY]

其中每个“D”彼此独立地表示细胞毒性剂和/或细胞抑制剂(“药物”)；每个“L”彼此独立地表示接头；“Ab”表示抗糖-MUC1抗原结合结构域，例如本文所述的抗糖-MUC1抗体或结合片段；每个“XY”表示接头上的官能团R

可包含ADC的各种抗体(Ab)的具体实施方案包括上述抗糖-MUC1抗体和/或结合片段的各种实施方案。

在结构式(I)的ADC和/或盐的一些具体实施方案中，每个D是相同的和/或每个L是相同的。

下面更详细地描述了可包含本公开内容的抗糖-MUC1ADC的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂(D)和接头(L)，以及与ADC连接的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的数量的具体实施方案。

6.2.1.细胞毒性剂和/或细胞抑制剂

细胞毒性剂和/或细胞抑制剂可以是已知抑制细胞，且特别是癌细胞和/或肿瘤细胞的生长和/或复制和/或杀死细胞，且特别是癌细胞和/或肿瘤细胞的任何试剂。具有细胞毒性和/或细胞抑制特性的许多试剂在文献中是已知的。各类细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的非限制性实例包括例如但不限于放射性核素、烷基化剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、DNA嵌入剂(例如，沟结合剂，例如小沟结合剂)、RNA/DNA抗代谢物、细胞周期调节剂、激酶抑制剂、蛋白质合成抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、线粒体抑制剂和抗有丝分裂剂。

下面提供了这些各种类别中某些类别内的试剂的具体非限制性实例。

包括或可以被修饰以包括与抗体的附接的位点的任何这些试剂可以包含在本文公开的ADC中。

在具体的实施方案中，细胞毒性剂和/或细胞抑制剂是抗有丝分裂剂。

在另一个具体的实施方案中，细胞毒性剂和/或细胞抑制剂是澳瑞他汀，例如一甲基澳瑞他汀E(“MMAE”)或一甲基澳瑞他汀F(“MMAF”)。

6.2.2.接头

在本公开的抗糖-MUC1ADC中，细胞毒性剂和/或细胞抑制剂通过接头与抗体连接。使细胞毒性剂和/或细胞抑制剂与ADC的抗体连接的接头可以是短的、长的、疏水的、亲水的、柔性的或刚性的，或者可以由各自独立地具有一种或多种上述性质的区段组成，使得接头可以包括具有不同性质的区段。接头可以是多价的，使得它们将一个以上试剂共价连接至抗体的单个位点，或者可以是单价的，使得它们将单个试剂共价连接至抗体的单个位点。

本领域技术人员将理解，接头通过在一个位置与细胞毒性剂和/或细胞抑制剂形成共价连接并在另一位置与抗体形成共价连接，使细胞毒性剂和/或细胞抑制剂与抗体连接。通过接头上的官能团与试剂和抗体上的官能团之间的反应形成共价连接。如本文所用，表述“接头”旨在包括(i)非缀合形式的接头，其包括能够使接头与细胞毒性剂和/或细胞抑制剂共价连接的官能团，和能够使接头与抗体共价连接的官能团；(ii)部分缀合形式的接头，其包括能够使接头与抗体共价连接的官能团，并且其与细胞毒性剂和/或细胞抑制剂共价连接，反之亦然；和(iii)完全缀合形式的接头，其与细胞毒性剂和/或细胞抑制剂和抗体两者共价连接。在本公开的接头和抗糖-MUC1ADC以及用于使接头试剂与抗体缀合的合成子的某些具体实施方案中，包含接头上的官能团的部分以及在接头和抗体之间形成的共价连接分别具体表示为R

接头优选但不必须是对细胞外部的条件是化学稳定的，并且可以被设计成在细胞内部切割、毁灭和/或以其他方式特异性降解。替代地，可以使用没有被设计成在细胞内特异性切割或降解的接头。选择稳定的接头还是不稳定的接头可取决于细胞毒性即和/或细胞抑制剂的毒性。对于对正常细胞有毒性的试剂，稳定的接头是优选的。可以利用选择性或靶向性并且对正常细胞具有较低毒性的试剂，接头与细胞外环境的化学稳定性不太重要。在ADC的背景下，可用于使药物与抗体连接的各种接头在本领域是已知的。任何这些接头以及其他接头可用于使细胞毒性剂和/或细胞抑制剂与本公开的抗糖-MUC1ADC的抗体连接。

可用于使许多细胞毒性剂和/或细胞抑制剂与单个抗体分子连接的示例性多价接头例如在WO 2009/073445、WO 2010/068795、WO 2010/138719、WO 2011/120053、WO 2011/171020、WO 2013/096901、WO 2014/008375、WO 2014/093379、WO 2014/093394、WO 2014/093640，其内容通过引用整体并入本文。例如，Mersana等人开发的Fleximer接头技术具有使高DAR ADC具有良好理化特性的潜力。如下所示，Mersana技术基于通过一系列酯键将药物分子掺入可溶解的聚缩醛主链中。该方法使高负荷ADC(DAR高达20)成为可能，并同时保持良好的理化特性。

树突型接头的其他实例可以在以下中找到：US 2006/116422；US 2005/271615；deGroot et al.(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42:4490-4494；Amir et al.(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42:4494-4499；Shamis et al.(2004)J.Am.Chem.Soc.126:1726-1731；Sun et al.(2002)Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215；Sunet al.(2003)Bioorganic&Medicinal Chemistry 11:1761-1768；King et al.(2002)Tetrahedron Letters 43:1987-1990，其中的每一个通过引用并入本文。

可以使用的示例性多价接头描述于例如Nolting,2013,Antibody-DrugConjugates,Methods in Molecular Biology 1045:71-100；Kitson et al.,2013,CROs/CMOs--Chemica Oggi--Chemistry Today 31(4):30-38；Ducry et al.,2010,Bioconjugate Chem.21:5-13；Zhao et al.,2011,J.Med.Chem.54:3606-3623；美国专利号7,223,837；美国专利号8,568,728；美国专利号8,535,678；和WO2004010957，其中的每一个通过引用并入本文。

作为实例而非限制，以下描述了可包括在本公开的抗糖-MUC1 ADC中的一些可切割接头和不可切割接头。

6.2.3.可切割接头

在某些实施方案中，选择的接头是体内可切割的。可切割接头可以包括化学或酶学上不稳定或可降解的连接。可切割接头通常依赖于细胞内的过程来释放药物，例如细胞质中的还原，暴露于溶酶体中的酸性条件，或被细胞内的特定蛋白酶或其他酶切割。可切割接头通常掺入一个或多个化学或酶促可切割的化学键，而接头的其余部分不可切割。在某些实施方案中，接头包含化学上不稳定的基团，例如腙和/或二硫化物基团。包含化学上不稳定基团的接头利用了血浆和某些细胞质区室之间的差异性。促进含腙接头的药物释放的细胞内条件是内体和溶酶体的酸性环境，而含二硫化物接头在含有高硫醇浓度(例如谷胱甘肽)的胞质溶胶中被还原。在某些实施方案中，可以通过使用化学不稳定基团附近的取代基引入空间位阻来提高包含化学不稳定基团的接头的血浆稳定性。

酸不稳定基团例如腙在血液的中性pH环境(pH 7.3-7.5)的系统循环期间保持完整，并在ADC被内化至细胞的弱酸性内体(pH 5.0-6.5)和溶酶体区(pH 4.5-5.0)区室后，发生水解并释放药物。这种pH依赖性释放机制与药物的非特异性释放有关。为增加接头的腙基团的稳定性，可通过化学修饰例如取代来改变接头，从而允许调节以在溶酶体中实现更有效的释放，同时循环中的损失最小。

含腙接头可以含有另外的切割位点，例如另外的酸不稳定的切割位点和/或酶不稳定的切割位点。包括示例性的含腙接头的ADC包括以下结构：

其中D和Ab分别代表细胞毒性剂和/或细胞抑制剂(药物)和Ab，n代表与抗体连接的药物接头的数目。在某些接头如接头(Ig)中，接头包含两个可切割基团，即二硫化物和腙部分。对于此类接头，未修饰的游离药物的有效释放需要酸性pH或二硫化物的还原和酸性pH。接头例如(Ih)和(Ii)已显示出对单个腙切割位点是有效的。

在系统循环期间保持完整并在ADC被内化至酸性细胞区室时发生水解并释放药物的其他接头包括碳酸盐/酯。在细胞毒性剂和/或细胞抑制剂可通过氧共价连接的情况下，此类接头可以是有用的。

可以包含在接头中的其他酸不稳定基团包括含顺式乌头酰基的接头。顺式乌头酰基化学使用与酰胺键并列的羧酸，以加速在酸性条件下酰胺的水解。

可切割接头还可以包括二硫化物基团。二硫化物在生理pH下是热力学稳定的，并且被设计为在细胞内部内化后释放药物，其中胞质溶胶与细胞外环境相比提供了明显更加还原的环境。二硫键的断开通常需要胞质硫醇辅因子的存在，例如(还原的)谷胱甘肽(GSH)，以使含二硫化物的接头在循环中相当稳定，从而选择性地将药物释放到胞质溶胶中。胞内酶蛋白二硫化物异构酶或能够切割二硫键的类似酶也可有助于细胞内二硫键的优先切割。据报道，GSH以0.5-10mM的浓度范围存在于细胞中，而相比之下在循环中，GSH或半胱氨酸(最丰富的低分子量硫醇)的浓度却明显更低，为约5。肿瘤细胞(其中不规则血流导致缺氧状态)导致还原酶的活性增强，从而导致甚至更高的谷胱甘肽浓度。在某些实施方案中，含二硫化物的接头的体内稳定性可通过接头的化学修饰例如使用与二硫键相邻的位阻而增强。

包括示例性的含二硫化物接头的ADC包括以下结构：

其中D和Ab分别代表药物和抗体，n代表与抗体连接的药物接头的数目，R在每次出现时独立地选自例如氢或烷基。在某些实施方案中，增加邻近二硫键的空间位阻增加了接头的稳定性。当一个或多个R基团选自低级烷基如甲基时，例如(Ij)和(II)的结构显示出增加的体内稳定性。

可以使用的另一种类型的可切割接头是被酶特异性切割的接头。这类接头通常是基于肽的或包括充当酶底物的肽区。与化学不稳定的接头相比，基于肽的接头在血浆和细胞外环境中往往更稳定。肽键通常具有良好的血清稳定性，因为溶酶体蛋白水解酶由于内源性抑制剂和相比溶酶体的不利的高血液pH值而在血液中具有非常低的活性。药物从抗体的释放特别是由于溶酶体蛋白酶例如组织蛋白酶和纤溶酶的作用而发生。这些蛋白酶在某些肿瘤细胞中可能以升高的水平存在。

在示例性实施方案中，可切割肽选自四肽，例如Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:100)、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:101)或二肽，例如Val-Cit、Val-Ala、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Val-(D)Asp、Phe-Lys、Ile-Val、Asp-Val、His-Val、NorVal-(D)Asp、Ala-(D)Asp 5、Met-Lys、Asn-Lys、Ile-Pro、Me3Lys-Pro、PhenylGly-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Pro-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、AM Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、AW Met-(D)Lys和Asn-(D)Lys。在某些实施方案中，由于较长肽的疏水性，二肽优于较长多肽。

已经描述了用于将药物例如阿霉素、丝裂霉素、喜树碱、吡咯并苯并二氮杂卓、他利霉素和澳瑞他汀/澳瑞他汀家族成员与抗体连接的多种基于二肽的可切割接头(参见Dubowchik et al.,1998,J.Org.Chem.67:1866-1872；Dubowchik et al.,1998,Bioorg.Med.Chem.Lett.8(21):3341-3346；Walker et al.,2002,Bioorg.Med.Chem.Lett.12:217-219；Walker et al.,2004,Bioorg.Med.Chem.Lett.14:4323-4327；Sutherland et al.,2013,Blood 122:1455-1463；和Francisco et al.,2003,Blood 102:1458-1465，其中每一个通过引用并入本文)。所有这些二肽接头或这些二肽接头的修饰形式可以用于本公开的抗糖-MUC1ADC中。可以使用的其他二肽接头包括在ADC中发现的那些，例如Seattle Genetics的Brentuximab Vendotin SGN-35(Adcetris

酶促可切割接头可包括自降解间隔物(self-immolative spacer)，以使药物与酶促切割位点在空间上分开。药物与肽接头的直接附接可导致药物的氨基酸加合物的蛋白水解释放，从而削弱其活性。自降解间隔物的使用允许消除酰胺键水解后的完全活性的化学未修饰药物。

一个自降解间隔物是双功能的对氨基苄醇基团，其通过氨基与肽连接，从而形成酰胺键，而含胺药物可以通过氨基甲酸酯官能团附接至接头的苄基羟基(PABC)。所得的前药在蛋白酶介导的切割后被激活，从而导致1,6-消除反应，释放出未修饰的药物、二氧化碳和接头基团的残基。以下方案描绘了对氨基苄基醚的片段化和药物的释放：

其中X-D代表未修饰的药物。

还描述了该自降解基团的杂环变体。参见例如美国专利号7,989,434，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，酶促可切割接头是基于β-葡萄糖醛酸的接头。可以通过溶酶体酶β-葡糖醛酸糖苷酶切割β-葡糖苷酸糖苷键来实现药物的轻松释放。该酶大量存在于溶酶体内，并且在某些肿瘤类型中过表达，而细胞外的酶活性较低。基于β-葡糖醛酸的接头可用于避免由于β-葡糖苷酸的亲水性质而使ADC发生聚集的趋势。在一些实施方案中，基于β-葡萄糖醛酸的接头优选作为与疏水性药物连接的ADC的接头。以下方案描绘了药物从ADC释放以及包含基于β-葡萄糖醛酸的接头的ADC：

已描述了多种可切割的基于β-葡萄糖醛酸的接头，其可用于将药物如澳瑞他汀、喜树碱和阿霉素类似物、CBI小沟结合剂和psymberin与抗体连接(参见Nolting,Chapter5"Linker Technology in Antibody-Drug Conjugates,"In:Antibody-Drug Conjugates:Methods in Molecular Biology,vol.1045,pp.71-100,Laurent Ducry(Ed.),SpringerScience&Business Medica,LLC,2013；Jeffrey et al.,2006,Bioconjug.Chem.17:831-840；Jeffrey et al.,2007,Bioorg.Med.Chem.Lett.17:2278-2280；和Jiang et al.,2005,J.Am.Chem.Soc.127:11254-11255，其中每一个通过引用并入本文)。所有这些基于β-葡萄糖醛酸的接头可以用于本公开的抗糖-MUC1ADC中。

另外，含有酚基的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂可以通过酚氧共价键合至接头。在WO 2007/089149中描述的一种这样的接头依赖于以下方法，其中二氨基乙烷“SpaceLink”与传统的基于“PABO”的自降解基团联合使用以递送酚。接头的切割如下图所示，其中D代表具有酚羟基的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂。

可切割接头可包括不可切割的部分或区段，和/或可切割的区段或部分可包含在其他不可切割的接头中以使其可切割。仅作为示例，聚乙二醇(PEG)和相关聚合物可在聚合物主链中包括可切割基团。例如，聚乙二醇或聚合物接头可包含一个或多个可切割基团，例如二硫化物、腙或二肽。

可以包含在接头中的其他可降解的键包括通过PEG羧酸或活化的PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应形成的酯键，其中此类酯基通常在生理条件下水解以释放生物活性剂。可水解降解的键包括但不限于碳酸酯键；由胺和醛反应产生的亚胺键；通过使醇与磷酸基团反应形成的磷酸酯键；作为醛和醇的反应产物的乙缩醛键；作为甲酸酯和醇的反应产物的原酸酯键；以及由亚磷酰胺基团(包括但不限于在聚合物末端的亚磷酰胺基团)和寡核苷酸的5'羟基形成的寡核苷酸键。

在某些实施方案中，接头包含酶促可切割的肽部分，例如，包含结构式(IVa)或(IVb)的接头或其盐：

其中：肽表示可被溶酶体酶切割的肽(图示了C→N，未显示羧基和氨基“末端”)；T表示包含一个或多个乙二醇单元或亚烷基链或其组合的聚合物；R

在某些实施方案中，肽选自三肽或二肽。在具体的实施方案中，二肽选自Val-Cit；Cit-Val；Ala-Ala；Ala-Cit；Cit-Ala；Asn-Cit；Cit-Asn；Cit-Cit；Val-Glu；Glu-Val；Ser-Cit；Cit-Ser；Lys-Cit；Cit-Lys；Asp-Cit；Cit-Asp；Ala-Val；Val-Ala；Phe-Lys；Val-Lys；Ala-Lys；Phe-Cit；Leu-Cit；Ile-Cit；Phe-Arg和Trp-Cit。在某些实施方案中，二肽选自Cit-Val和Ala-Val。

可以包含在本公开的抗糖-MUC1ADC中的根据结构式(IVa)的接头的具体示例性实施方案包括以下所示的接头(如所示的，接头包括适于将接头共价连接至抗体的基团)：

可以包含在本公开的抗糖-MUC1ADC中的根据结构式(IVb)的接头的具体示例性实施方案包括以下所示的接头(如所示的，接头包括适于将接头共价连接至抗体的基团)：

在某些实施方案中，接头包含酶促可切割的肽部分，例如，包含结构式(IVc)或(IVd)的接头或其盐：

其中：肽表示可被溶酶体酶切割的肽(图示了C→N，未显示羧基和氨基“末端”)；T表示包含一个或多个乙二醇单元或亚烷基链或其组合的聚合物；R

可以包含在本公开的抗糖-MUC1ADC中的根据结构式(IVc)的接头的具体示例性实施方案包括以下所示的接头(如所示的，接头包括适于将接头共价连接至抗体的基团)：

可以包含在本公开的抗糖-MUC1ADC中的根据结构式(IVd)的接头的具体示例性实施方案包括以下所示的接头(如所示的，接头包括适于将接头共价连接至抗体的基团)：

在某些实施方案中，包含结构式(IVa)、(IVb)、(IVc)或(IVd)的接头还包含可通过暴露于酸性介质而切割的碳酸酯部分。在具体的实施方案中，接头通过氧附接至细胞毒性剂和/或细胞抑制剂。

6.2.4.不可切割接头

尽管可切割接头可以提供某些优点，但是包含本公开的抗糖-MUC1ADC的接头不必需是可切割的。对于不可切割接头，药物的释放不取决于血浆和某些细胞质区室之间的差异特性。假定药物的释放发生在ADC通过抗原介导的内吞作用内化并递送至溶酶体区室之后，在该区室中抗体通过细胞内蛋白水解降解而降解至氨基酸水平。该过程释放出药物衍生物，该药物衍生物由药物、接头和与接头共价附接的氨基酸残基形成。与具有可切割接头的缀合物相比，来自具有不可切割接头的缀合物的氨基酸药物代谢物具有更大的亲水性和通常更小的膜渗透性，这导致较少的旁观者效应和较小的非特异性毒性。通常，具有不可切割接头的ADC比具有可切割接头的ADC在循环中具有更高的稳定性。不可切割接头可以是亚烷基链，或者可以本质上是聚合物，例如基于聚亚烷基二醇聚合物、酰胺聚合物，或者可以包括亚烷基链、聚亚烷基二醇和/或酰胺聚合物的区段。

已经描述了用于将药物连接至抗体的多种不可切割接头。参见Jeffrey et al.,2006,Bioconjug.Chem.17；831-840；Jeffrey et al.,2007,Bioorg.Med.Chem.Lett.17:2278-2280；and Jiang et al.,2005,J.Am.Chem.Soc.127:11254-11255，其中每一个通过引用并入本文。所有这些接头可包括在本公开的抗糖-MUC1ADC中。

在某些实施方案中，接头在体内是不可切割的，例如根据结构式(VIa)、(VIb)、(VIc)或(VId)的接头(如所示的，接头包括适于将接头共价连接至抗体的基团)或其盐：

其中：R

可以包含在本公开的抗糖-MUCl ADC中的根据结构式(VIa)-(IVd)的接头的具体示例性实施方案包括以下所示的接头(如所示的，接头包括适于将接头共价连接至抗体的基团，并且

6.2.5.用于使接头和抗体附接的基团

可以使用各种基团将接头药物合成子附接至抗体以产生ADC。附接基团本质上可以是亲电的并且包括：马来酰亚胺基团，活化的二硫化物，活性酯，酰胺。如下所述，还存在可以根据本公开使用的与“自稳定”马来酰亚胺和“桥联二硫化物”有关的新兴技术。使用的具体基团将部分取决于抗体的附接位点。

在下面的示意图中描绘了“自稳定”马来酰亚胺基团的一个实例，该基团在抗体缀合条件下自发水解，以提供具有改善的稳定性的ADC物质。参见US20130309256 A1；以及Lyon et al.,Nature Biotech published online,doi:10.1038/nbt.2968。

导致随时间的“DAR损失”

SGN MalDPR(马来酰亚胺基二丙基氨基)体系：

Polytherics公开了桥接一对衍生自天然铰链二硫键还原的巯基的方法。参见Badescu et al.,2014,Bioconjugate Chem.25:1124-1136。反应如下图所示。该方法的优点是能够通过完全还原IgG(产生4对巯基)，然后与4当量的烷基化剂反应来合成富集的DAR4 ADC。还声称含有“桥联二硫键”的ADC具有增加的稳定性。

类似地，如下所述，已经开发了能够桥接一对巯基的马来酰亚胺衍生物(1，下文)。参见WO2013/085925。

6.2.6.接头选择考虑因素

如技术人员已知的，针对特定ADC选择的接头可能受多种因素影响，包括但不限于与抗体的附接位点(例如，lys、cys或其他氨基酸残基)、药物药效团的结构限制和药物的亲脂性。针对ADC选择的特定接头应设法平衡特定抗体/药物组合的这些不同因素。有关影响ADC中接头选择的因素的综述，参见Nolting,Chapter 5“Linker Technology inAntibody-Drug Conjugates,”In:Antibody-Drug Conjugates:Methods in MolecularBiology,vol.1045,pp.71-100,Laurent Ducry(Ed.),Springer Science&BusinessMedica,LLC,2013。

例如，已经观察到ADC实现杀伤存在于抗原阳性肿瘤细胞附近的旁观者抗原阴性细胞。ADC的旁观者细胞杀伤的机制表明，ADC的细胞内加工期间形成的代谢产物可能发挥作用。由抗原阳性细胞中ADC代谢产生的中性细胞毒性代谢物似乎在旁观者细胞杀伤中发挥作用，而带电荷的代谢物可防止跨膜扩散到介质中，因此不会影响旁观者杀伤。在某些实施方案中，选择接头以减弱由ADC的细胞代谢物引起的旁观者杀伤效应。在某些实施方案中，选择接头以增强旁观者杀伤效应。

在使用和/或储存的条件下，接头的性质也可能影响ADC的聚集。通常，文献中报道的ADC包含每个抗体分子不超过3-4个药物分子(参见例如，Chari,2008,Acc Chem Res 41:98-107)。由于ADC的聚集，尝试获得更高的药物与抗体的比率(“DAR”)常常失败，尤其是如果药物和接头都是疏水的(King et al.,2002,J Med Chem 45:4336-4343；Hollander etal.,2008,Bioconjugate Chem 19:358-361；Burke et al.,2009 Bioconjugate Chem 20:1242-1250)。在许多情况下，高于3-4的DAR作为提高效价的手段可以是有益的。在细胞毒性剂和/或细胞抑制剂本质上是疏水的情况下，可能希望选择相对亲水的接头作为减少ADC聚集的手段，尤其是在需要大于3-4的DAR的情况下。因此，在某些实施方案中，接头掺入了减少在储存和/或使用期间ADC的聚集的化学部分。接头可掺入极性或亲水基团，例如带电荷基团或在生理pH下带电荷的基团，以减少ADC的聚集。例如，接头可掺入带电荷的基团，例如盐或在生理pH下去质子化例如羧酸盐或质子化例如胺的基团。

已报道产生高达20的DAR、可用于使许多细胞毒性剂和/或细胞抑制剂与抗体连接的示例性多价接头描述于WO 2009/073445、WO 2010/068795、WO 2010/138719、WO 2011/120053、WO 2011/171020、WO 2013/096901、WO 2014/008375、WO 2014/093379、WO 2014/093394、WO 2014/093640，其内容通过引用整体并入本文。

在具体的实施方案中，如通过尺寸排阻色谱法(SEC)所确定的，在储存或使用期间ADC的聚集小于约10％。在具体的实施方案中，如通过尺寸排阻色谱法(SEC)所确定的，在储存或使用期间ADC的聚集小于10％，例如小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％、小于约0.1％或甚至更小。

6.2.7.制备抗糖-MUC1ADC的方法

可以使用众所周知的化学方法来合成本公开的抗糖-MUC1ADC。所选择的化学物质尤其将取决于细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的身份、接头和用于将接头连接至抗体的基团。通常，可以根据以下方案制备根据式(I)的ADC：

D-L-R

其中D、L、Ab、XY和n如先前所定义，并且R

R

用于将合成子连接至可接近的赖氨酸残基的许多官能团R

用于将合成子连接至半胱氨酸残基的可接近的游离巯基的许多官能团R

然而，缀合化学不限于可获得的侧链基团。通过将适当的小分子与胺连接，可以将侧链例如胺转化为其他有用的基团例如羟基。通过将多功能小分子与抗体的可接近氨基酸残基的侧链缀合，该策略可用于增加抗体上可用连接位点的数量。适于将合成子共价连接至这些“转化的”官能团的官能团R

抗体也可被工程化以包括用于缀合的氨基酸残基。Axup et al.,2012,Proc NatlAcad Sci USA.109(40):16101-16106描述了工程化改造抗体以包括在ADC的背景下用于缀合药物的非遗传编码氨基酸残基的方法，作为用于将合成子连接至非编码氨基酸的化学物质和官能团也是如此。

通常，合成子与抗体的氨基酸残基的侧链连接，该侧链包括例如可接近的赖氨酸残基的伯氨基或可接近的半胱氨酸残基的巯基。游离巯基可通过还原链间二硫键获得。

对于其中R

不参与二硫化物桥的半胱氨酸残基可通过一个或多个密码子的突变而工程化为抗体。还原这些未配对的半胱氨酸产生适于缀合的巯基。用于掺入工程化半胱氨酸的优选位置包括例如但不限于人IgG

如本领域技术人员将理解的，与抗体分子连接的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的数量可以变化，以使得ADC的集合在性质上可以是异质的，其中一些抗体包含一种连接剂，一些抗体包含两种，一些抗体包含三种等(并且一些抗体不包含连接剂)。异质性的程度将尤其取决于用于连接细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的化学方法。例如，在还原抗体以产生用于附接的巯基的情况下，通常产生每个分子具有零、2、4、6或8个连接剂的抗体的异质混合物。此外，通过限制附接化合物的摩尔比，通常产生每个分子具有零、1、2、3、4、5、6、7或8个连接剂的抗体。因此，将会理解，取决于上下文，所述DAR可以是抗体集合的平均值。例如，“DAR4”可以指未经过纯化以分离特定DAR峰并且可以包含ADC分子的异质混合物的ADC制剂，其中每个抗体具有不同数量的细胞抑制剂和/或细胞毒性剂(例如，每个抗体0、2、4、6、8个试剂)，但平均药物与抗体比为4。类似地，在一些实施方案中，“DAR2”是指异质ADC制剂，其中平均药物与抗体比为2。

当期望富集的制剂时，可以通过纯化异质混合物，例如通过柱色谱法，例如疏水相互作用色谱法，来获得具有确定数量的连接的细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的抗体。

如本领域已知的，可以通过多种方法评估纯度。作为具体的实例，可以通过HPLC或其他色谱法来分析ADC制剂，并通过分析所得峰的曲线下面积来评估纯度。

6.3嵌合抗原受体

本公开提供了包含本文所述的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段的嵌合抗原受体(CAR)。

本公开的CAR通常包含可操作地连接至跨膜结构域的胞外结构域，该跨膜结构域又可操作地连接至用于信号传导的胞内结构域。

本公开的CAR的胞外结构域包含抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段的序列(例如，如6.1节或实施方案1至145中所述)。

示例性的跨膜结构域序列和胞内结构域序列分别在6.3.1节和6.3.2节中描述。

本文所述的几种融合蛋白(例如，实施方案152和153)是CAR，并且CAR相关的公开内容适用于此类融合蛋白。

6.3.1.跨膜结构域

关于跨膜结构域，可以将CAR设计为包含与CAR的胞外结构域可操作地连接(例如融合)的跨膜结构域。

跨膜结构域可以源自天然来源或合成来源。如果来源是天然的，则该结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本公开中特别使用的跨膜区可以衍生自T细胞受体的α链、β链或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154(即，至少包含上述链的跨膜区)。在某些情况下，也可以使用各种人铰链，包括人Ig(免疫球蛋白)铰链。

在一个实施方案中，跨膜结构域是合成的(即，非天然存在的)。合成的跨膜结构域的实例是主要包含疏水残基如亮氨酸和缬氨酸的肽。优选地，在合成的跨膜结构域的每个末端存在苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽接头，优选长度为2至10个氨基酸的寡肽或多肽接头，可以在CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供了特别合适的接头。

在一个实施方案中，本公开的CAR中的跨膜结构域是CD8跨膜结构域。在一个实施方案中，CD8跨膜结构域包含氨基酸序列YLHLGALGRDLWGPSPVTGYHPLL(SEQ ID NO:102)。

在一个实施方案中，本公开的CAR中的跨膜结构域是CD28跨膜结构域。在一个实施方案中，CD28跨膜结构域包含氨基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:103)。

在一些实施方案中，本公开的CAR中的跨膜结构域包含CD8a铰链结构域。在一个实施方案中，CD8a铰链结构域包含氨基酸序列TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFAC(SEQ ID NO:104)。

6.3.2.胞内结构域

本公开的CAR的胞内信号传导结构域负责激活表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的专门功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指蛋白质的一部分，其转导效应子功能信号并指导细胞执行专门的功能。尽管通常可以使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用整条链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要截短部分转导效应子功能信号，就可以使用此类截短部分代替完整链。因此，术语胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。

用于本公开的CAR中的胞内信号传导结构域的优选实例包括T细胞受体(TCR)和协同作用以在抗原受体结合后启动信号转导的共受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。

仅通过TCR产生的信号可能不足以完全激活T细胞，并且还需要次级信号或共刺激信号。因此，可以说T细胞活化是由两类不同的细胞质信号传导序列介导的：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的序列(初级细胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式作用以提供次级信号或共刺激信号的序列(次级细胞质信号传导序列)。

初级细胞质信号传导序列以刺激性方式或抑制性方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激性方式作用的初级细胞质信号传导序列可以包含信号传导基序，该基序被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。

在本公开的CAR中特别使用的包含ITAM的初级细胞质信号传导序列的实例包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。特别优选地，本公开的CAR中的细胞质信号传导分子包含来自CD3-ζ的细胞质信号传导序列。

在优选的实施方案中，CAR的细胞质结构域被设计成本身包括或者与任何其他期望的可用于本公开的CAR中的细胞质结构域组合包括含有ITAM的初级细胞质信号传导序列结构域(例如，CD3-ζ的细胞质信号传导序列结构域)。例如，CAR的细胞质结构域可以包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。

共刺激信号传导区是指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR的部分。共刺激分子是除淋巴细胞对抗原的有效应答所需的抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体等。

本公开的CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质信号传导序列可以以随机或指定顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，优选长度为2至10个氨基酸的寡肽或多肽接头，可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供了特别合适的接头。

在一个实施方案中，细胞质结构域包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一个实施方案中，细胞质结构域包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。

6.4核酸、重组载体和宿主细胞

本公开涵盖编码抗糖-MUC1抗体的免疫球蛋白轻链和重链基因的核酸分子、包含此类核酸的载体和能够产生本公开的抗糖-MUC1抗体的宿主细胞。在某些方面，核酸分子编码并且宿主细胞能够表达本公开的抗糖-MUC1抗体和抗体结合片段(例如，如6.1节和实施方案1至145中所述)以及融合蛋白(例如，如实施方案146-151所述)和包含它们的嵌合抗原受体(例如，如6.3节和实施方案152-153所述)。在实施方案166-168中描述了本公开的示例性载体，在实施方案169-172中描述了示例性宿主细胞。

可以通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备本公开的抗糖-MUC1抗体。为了重组表达抗体，用一种或多种携带编码抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，以使轻链和重链在宿主细胞中表达，并任选地分泌到培养宿主细胞的培养基中，从该培养基中可以回收抗体。使用标准的重组DNA方法来获得抗体的重链和轻链基因，将这些基因整合到重组表达载体中，然后将载体引入宿主细胞中，例如在以下文献中所述的那些：Molecular Cloning；A Laboratory Manual,SecondEdition(Sambrook,Fritsch and Maniatis(eds),Cold Spring Harbor,N.Y.,1989),Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,F.M.et al.,eds.,GreenePublishing Associates,1989)和美国专利号4,816,397。

为了产生编码此类抗糖-MUC1抗体的核酸，首先获得编码轻链和重链可变区的DNA片段。这些DNA可以通过扩增和修饰编码轻链和重链可变序列的种系DNA或cDNA而获得，例如使用聚合酶链反应(PCR)。人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列是本领域已知的(参见例如“VBASE”人种系序列数据库；还参见Kabat et al.,1991,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242；Tomlinson et al.,1992,J.Mol.Biol.22T:116-198；和Cox et al.,1994,Eur.J.Immunol.24:827-836；其中每一个的内容通过引用并入本文。

一旦获得编码抗糖-MUC1抗体相关的V

可以通过将编码V

可以通过将编码V

为了产生scFv基因，可以将编码V

为了表达本公开的抗糖-MUC1抗体，将如上所述获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体，使得基因可操作地连接至转录和翻译控制序列。在本文中，术语“可操作地连接”意在指将抗体基因连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其预期的调节抗体基因的转录和翻译的功能。选择表达载体和表达控制序列以使其与所使用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入分开的载体中，或更典型地，将两个基因插入相同的表达载体中。

通过标准方法(例如，抗体基因片段和载体上的互补限制性位点的连接，或者如果不存在限制性位点，则进行平末端连接)将抗体基因插入表达载体中。在插入抗糖-MUC1抗体相关的轻链或重链序列之前，表达载体可以已经携带抗体恒定区序列。例如，将抗糖-MUC1单克隆抗体相关的V

除抗体链基因外，本公开的重组表达载体还携带控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调控序列。术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子和控制抗体链基因的转录或翻译的其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。此类调控序列描述于例如Goeddel,GeneExpression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.,1990。本领域技术人员将认识到，表达载体的设计，包括调控序列的选择，可以取决于例如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的合适调控序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件，例如衍生自巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。对于病毒调控元件及其序列的进一步描述，参见例如，Stinski的美国专利号5,168,062、Bell等人的美国专利号4,510,245和Schaffner等人的美国专利号4,968,615。

除了抗体链基因和调控序列之外，本公开的重组表达载体还可以携带其他序列，例如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和可选择标记基因。可选择标记基因有助于选择已引入载体的宿主细胞(参见例如，Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常，可选择标记基因在已引入载体的宿主细胞上赋予对药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。合适的可选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的DHFR

有可能在原核或真核宿主细胞中表达本公开的抗体。在某些实施方案中，抗体的表达在正确折叠且具有免疫活性的抗体的最佳分泌的真核细胞例如哺乳动物宿主细胞中进行。用于表达本公开的重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括DHFR

为了表达本公开的CAR，例如如6.3节以及实施方案152和153中所述，优选宿主细胞是T细胞，优选人T细胞。在一些实施方案中，当细胞与肿瘤细胞上的MUC1交联时，宿主细胞表现出抗肿瘤免疫性。在6.4.1节中描述了产生本公开的T细胞的详细方法。

重组DNA技术也可以用于去除编码结合糖MUC1所不需要的轻链和重链中的一个或两个的DNA的部分或全部。由这种截短的DNA分子表达的分子也被本公开的抗体所涵盖。

为了重组表达本公开的抗糖-MUC1抗体，可以用本公开的两个表达载体共转染宿主细胞，其中第一载体编码重链衍生的多肽，第二载体编码轻链衍生的多肽。这两个载体可以包含相同的可选择标记，或者它们各自可以包含单独的可选择标记。或者，可以使用编码重链和轻链多肽两者的单个载体。

一旦核酸编码抗糖-MUC1抗体一个或多个部分，可以将进一步的改变或突变引入编码序列，例如以产生编码具有不同CDR序列的抗体、对Fc受体亲和力降低的抗体、或不同亚类的抗体的核酸。

还可以通过化学合成(例如，通过Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.,1984The Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.中描述的方法)产生本公开的抗糖-MUC1抗体。还可以使用无细胞平台产生变体抗体(参见例如，Chu et al.,Biochemia No.2,2001(Roche Molecular Biologicals)和Murray et al.,2013,Current Opinion in ChemicalBiology,17:420-426)。

一旦通过重组表达产生了本公开的抗糖-MUC1抗体，就可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法进行纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱和分级柱色谱(sizing column chromatography))、离心、差异溶解度或通过任何其他用于纯化蛋白质的标准技术。此外，本公开的抗糖-MUC1抗体和/或结合片段可以与本文所述或本领域已知的异源多肽序列融合，以促进纯化。

分离后，如果需要，可以例如通过高效液相色谱法(参见例如，Fisher,LaboratoryTechniques In Biochemistry And Molecular Biology,Work and Burdon,eds.,Elsevier,1980)或通过Superdex

6.4.1.T细胞中CAR的重组产生

在一些实施方案中，使用逆转录病毒或慢病毒载体将编码本公开的抗糖-MUC1CAR的核酸递送到细胞中。可以使用转导的细胞作为运送体或使用包封的、结合的或裸露的载体的无细胞局部或全身递送将表达CAR的逆转录病毒和慢病毒载体递送到不同类型的真核细胞以及组织和整个生物体。所使用的方法可以用于需要或足以稳定表达的任何目的。

在其他实施方案中，使用体外转录的mRNA将CAR序列递送到细胞中。可以使用转染的细胞作为运送体或使用包封的、结合的或裸露的mRNA的无细胞局部或全身递送将体外转录的mRNA CAR递送到不同类型的真核细胞以及组织和整个生物体。所使用的方法可以用于需要或足以瞬时表达的任何目的。

在另一个实施方案中，所期望的CAR可以通过转座子在细胞中表达。

本公开的RNA转染方法的一个优点在于RNA转染基本上是瞬时的且无载体：RNA转基因可以被递送至淋巴细胞并在简要的体外细胞活化后作为最小表达盒而不需要任何其他病毒序列在淋巴细胞中表达。在这些条件下，转基因整合到宿主细胞基因组中是不可能的。由于RNA的转染效率及其均匀修饰整个淋巴细胞群的能力，因此无需克隆细胞。

用体外转录的RNA(IVT-RNA)对T细胞进行遗传修饰利用了两种不同的策略，这两种策略已在各种动物模型中进行了连续测试。通过脂质转染或电穿孔用体外转录的RNA转染细胞。优选地，期望使用各种修饰来稳定IVT-RNA，以实现转移的IVT-RNA的延长表达。

一些IVT载体在文献中是已知的，其以标准化方式用作体外转录的模板，并且已经以产生稳定的RNA转录物的方式进行了遗传修饰。目前，本领域中使用的方案基于具有以下结构的质粒载体：能够进行RNA转录的5'RNA聚合酶启动子，随后是在3'和/或5'侧接非翻译区(UTR)的目的基因，和包含50-70A核苷酸的3'聚腺苷酸盒。在体外转录之前，通过II型限制性酶(识别序列对应于切割位点)将环状质粒线性化至聚腺苷酸盒的下游。因此，聚腺苷酸盒对应于转录物中的后面的poly(A)序列。该程序的结果是，一些核苷酸在线性化后保留为酶切割位点的一部分，并在3'端延伸或掩盖了poly(A)序列。尚不清楚这种非生理性的突出是否影响从此类构建体细胞内产生的蛋白质的量。

与更加传统的质粒或病毒方法相比，RNA具有多个优势。从RNA来源表达基因不需要转录，并且在转染后迅速产生蛋白质产物。此外，由于RNA仅需要进入细胞质而不需要进入细胞核，因此典型的转染方法导致极高的转染率。另外，基于质粒的方法要求驱动目的基因表达的启动子在被研究的细胞中具有活性。

在另一个方面，可以通过电穿孔将RNA构建体递送至细胞中。参见例如，如US2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1中所教导的通过电穿孔将核酸构建体递送至哺乳动物细胞中的制剂和方法。在相关研究文献以及该领域中的许多专利和申请中，通常已知各种参数，包括任何已知细胞类型的电穿孔所需的电场强度。参见例如美国专利号6,678,556、美国专利号7,171,264和美国专利号7,173,116。用于电穿孔的治疗应用的装置可商购获得，例如，MedPulser

6.4.1.1T细胞的来源

在扩增和遗传修饰之前，从受试者获得T细胞的来源。术语“受试者”旨在包括可以引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。优选地，受试者是人。

T细胞可以从许多来源，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织以及肿瘤获得。在本公开的某些实施方案中，可以使用本领域中可用的任何数量的T细胞系。在本公开的某些实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术如Ficoll

在另一实施方案中，通过溶解红细胞并消耗单核细胞，例如通过PERCOLL

可以使用针对负选择的细胞所特有的表面标志物的抗体组合来完成通过负选择进行的T细胞群富集。一种方法是细胞分选和/或经由负磁性免疫黏附或流式细胞术(其使用针对存在于经负选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物)进行分选。例如，为了通过负选择来富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可能期望富集或正面选择通常表达CD4

为了通过正或负选择来分离期望的细胞群，可以改变细胞和表面(例如颗粒，如珠)的浓度。在某些实施方案中，可能期望显著降低珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个实施方案中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个实施方案中，使用7500万个细胞/ml、8000万个细胞/ml、8500万个细胞/ml、9000万个细胞/ml、9500万个细胞/ml或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在其他实施方案中，使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度可以更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞，或捕获来自存在许多肿瘤细胞(即，白血病血液，肿瘤组织等)的样品的细胞。这样的细胞群可具有治疗价值并且将是期望获得的。例如，使用高浓度的细胞可以更有效地选择通常具有较弱的CD28表达的CD8

在相关的实施方案中，可能期望使用较低的细胞浓度。通过显著稀释T细胞和表面(例如颗粒，例如珠)的混合物，颗粒和细胞之间的相互作用被最小化。这选择了表达大量期望抗原以与颗粒结合的细胞。例如，与稀释浓度的CD8

在其他实施方案中，可以在2-10℃或在室温下在旋转器上以不同的速度将细胞孵育不同的时间长度。

用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。希望不受理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过去除细胞群中的粒细胞和某种程度上的单核细胞而提供了更均匀的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮于冷冻溶液中。尽管许多冷冻溶液和参数是本领域已知的，并且在此情况下将会是有用的，但一种方法涉及使用包含20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或包含10％右旋糖酐40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖、0.45％NaCl、10％右旋糖酐40和5％右旋糖，20％人血清白蛋白和7.5％DMSO或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其他合适的细胞冷冻培养基，然后以每分钟1°的速率将细胞冷冻至-80℃，并储存在液氮储存罐的气相中。可以使用其他控制冷冻的方法以及在-20℃或在液氮中立即进行非控制冷冻。

在某些实施方案中，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻并洗涤，并在使用本公开的方法活化之前使其在室温下静置一小时。

在本公开的上下文中还预期在可能需要如本文所述的扩增细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采术产物。这样，可以在任何必要的时间点收集待扩增的细胞的来源，并将所需的细胞例如T细胞分离并冷冻，以用于后续的多种疾病或病症(例如本文所述的那些)的T细胞疗法中，该多种疾病或病症受益于T细胞疗法。在一个实施方案中，血液样品或单采术样品取自总体上健康的受试者。在某些实施方案中，血液样品或单采术样品取自总体上健康的受试者，该受试者具有发展为疾病的风险但尚未发展为疾病，并分离和冷冻目的细胞以备后续使用。在某些实施方案中，可以将T细胞扩增、冷冻并在以后的时间使用。在某些实施方案中，在诊断如本文所述特定疾病之后不久但在任何治疗之前从患者收集样品。在另一个实施方案中，在任何数量的相关治疗方式(包括但不限于采用例如那他珠单抗，依法珠单抗，抗病毒剂，化学疗法，放射，免疫抑制剂例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯和FK506，抗体，或其他免疫消融剂例如CAMPATH，抗CD3抗体，cytoxan，氟达拉滨，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，麦考酚酸，类固醇，FR901228和辐射的试剂进行治疗)之前，从受试者的血液样品或单采术样品分离细胞。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢霉素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)。(Liu et al.,Cell 66:807-815,1991；Henderson et al.,Immun.73:316-321,1991；Bierer et al.,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在另一个实施方案中，为患者分离细胞并冷冻，以供后续(例如，之前、同时或之后)与使用化学治疗剂例如氟达拉滨、外部射束放射疗法(XRT)、环磷酰胺的骨髓或干细胞移植或T细胞消融疗法联合使用。

在本公开的另一个实施方案中，在治疗后直接从患者获得T细胞。在这方面，已经观察到，在某些癌症治疗之后，特别是在用损害免疫系统的药物治疗之后，在患者通常会从治疗中恢复的时期内的治疗后不久，获得的T细胞的质量可能是最佳的或具有改善的离体扩增能力。同样，在使用本文所述的方法进行离体操作后，这些细胞可以处于增强的移植和体内扩增的优选状态。因此，预期在本公开的上下文中在恢复阶段期间收集血细胞，包括T细胞、树突状细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在某些实施方案中，动员(例如，用GM-CSF动员)和调理方案可用于在受试者中产生其中特定细胞类型的重新聚集、再循环、再生和/或扩增是有利的状态，尤其是在治疗后确定的时间范围内。示例性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树突状细胞和免疫系统的其他细胞。

6.4.1.2T细胞的活化和扩增

通常使用例如以下文献中所述的方法活化和扩增T细胞：美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005。

通常，本公开的T细胞通过与其上附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触而扩增。特别地，可以如本文所述刺激T细胞群，例如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触，或通过与同钙离子载体缀合的蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素)接触来刺激T细胞群。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合该辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下使T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4

在某些实施方案中，可以通过不同的方案提供T细胞的初级刺激信号和共刺激信号。例如，提供每个信号的试剂可以在溶液中或偶联至表面。当偶联至表面时，试剂可以偶联至同一表面(即，以“顺式”形式)或偶联至独立的表面(即，以“反式”形式)。或者，一种试剂可偶联至表面，而另一种试剂在溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的试剂与细胞表面结合，并且提供初级激活信号的试剂在溶液中或偶联至表面。在某些实施方案中，两种试剂都可以在溶液中。在另一个实施方案中，试剂可以是可溶形式，然后交联至表面，例如表达Fc受体的细胞或抗体或将会结合试剂的其他结合剂。就此而言，参见例如，美国专利申请公开号20040101519和20060034810的人工抗原呈递细胞(aAPC)，该人工抗原呈递细胞(aAPC)被设想用于激活和扩增本公开中的T细胞。

在一个实施方案中，两种试剂固定在珠上，固定在同一珠上，即“顺式”，或固定在分开的珠上，即“反式”。例如，提供初级激活信号的试剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，提供共刺激信号的试剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并将两种试剂以等分子量共固定在同一珠上。在一个实施方案中，针对CD4

颗粒与细胞的比例为1：500至500：1，并且介于它们之间的任何整数值均可用于刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易地理解的，颗粒与细胞的比例可以取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，小尺寸的珠只能结合几个细胞，而更大的珠可以结合许多细胞。在某些实施方案中，细胞与颗粒的比例为1：100至100：1，以及介于它们之间的任何整数值；在其他实施方案中，该比例包括1：9至9：1，并且介于它们之间的任何整数值也可用于刺激T细胞。如上所述，导致T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联颗粒与T细胞的比例可以变化，但是某些优选值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，其中一个优选的比例为每个T细胞至少1:1颗粒。在一个实施方案中，使用1:1或更小的颗粒与细胞的比例。在一个特定的实施方案中，优选的颗粒：细胞比例为1：5。在其他实施方案中，颗粒与细胞的比例可以根据刺激的天数而变化。例如，在一个实施方案中，在第一天，颗粒与细胞的比例为1：1至10：1，并且此后每天或每隔一天将另外的颗粒以从1：1到1:10的最终比例(基于添加当天的细胞计数)添加至细胞，直至10天。在一个具体的实施方案中，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比例为1：1，并且在刺激的第三和第五天将其调整为1：5。在另一个实施方案中，基于刺激第一天的最终比例1：1以及刺激第三天和第五天的最终比例1：5，每天或每隔一天添加颗粒。在另一个实施方案中，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比例为2：1，并且在刺激的第三和第五天调整为1:10。在另一个实施方案中，基于刺激第一天的最终比例1：1以及刺激第三天和第五天的最终比例1：10，每天或每隔一天添加颗粒。本领域技术人员将意识到，各种其他比例可适用于本公开。特别地，比例将根据颗粒大小以及细胞大小和类型而变化。

在本公开的其他实施方案中，将细胞例如T细胞与试剂包被的珠组合，随后分离珠和细胞，然后培养细胞。在替代的实施方案中，在培养之前，没有分离试剂包被的珠和细胞，而是一起培养。在另一个实施方案中，首先通过施加力例如磁力来浓缩珠和细胞，导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。

例如，可以通过使附着有抗CD3和抗CD28的顺磁性珠(3x 28个珠)接触T细胞来连接细胞表面蛋白。在一个实施方案中，将细胞(例如10

在本公开的一个实施方案中，可将混合物培养数小时(约3小时)至约14天或介于它们之间的任何小时整数值。在另一个实施方案中，可以将混合物培养21天。在本公开的一个实施方案中，将珠和T细胞一起培养约八天。在另一个实施方案中，将珠和T细胞一起培养2-3天。可能还需要几个刺激周期，以使T细胞的培养时间可以是60天或更长。适用于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如，最小基本培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15，(Lonza))，该培养基可包含增殖和活力所需的因子，包括血清(例如胎牛血清或人血清)、白介素2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂，血浆制品(plasmanate)和还原剂，例如N-乙酰基半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，其添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有足量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不包括在要注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如合适的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％CO

暴露于不同刺激时间的T细胞可表现出不同的特征。例如，典型的血液或单采术外周血单核细胞产物具有辅助T细胞群(T

此外，除了CD4和CD8标志物外，其他表型标志物在细胞扩增过程中也显著变化，但在很大程度上是可再现地变化。因此，这种再现性使得能够针对特定目的定制活化的T细胞产物。

6.5组合物

本公开的抗糖-MUC1抗体和/或抗糖-MUC1ADC可以是包含抗糖-MUC1抗体和/或ADC以及一种或多种载剂、赋形剂和/或稀释剂的组合物形式。可以将组合物配制成用于特定用途，例如用于兽医用途或人类的药物用途。组合物的形式(例如干粉、液体制剂等)以及所用的赋形剂、稀释剂和/或载剂将取决于抗体和/或ADC的预期用途以及治疗用途、给药方式。

对于治疗用途，组合物可以作为包括药学上可接受的载剂的无菌药物组合物的一部分提供。该组合物可以是任何合适的形式(取决于将其施用于患者所需的方法)。可以通过多种途径，例如口服、透皮、皮下、鼻内、静脉内、肌内、肿瘤内、鞘内、外用或局部，将药物组合物施用至患者。在任何给定情况下，最合适的施用途径将取决于特定的抗体和/或ADC、受试者、疾病的性质和严重程度以及受试者的身体状况。通常，药物组合物将静脉内或皮下施用。

药物组合物可以方便地以每剂量含有预定量的本公开的抗糖-MUC1抗体和/或抗糖-MUC1ADC的单位剂型存在。单位剂量中包含的抗体和/或ADC的量将取决于所治疗的疾病以及本领域众所周知的其他因素。此类单位剂量可以是包含适合于单次施用的量的抗体和/或ADC的冻干粉的形式，或液体的形式。干粉单位剂型可以包装在试剂盒中，该试剂盒含有注射器、适量的稀释剂和/或其他用于施用的组分。液体形式的单位剂量可以方便地以预填充有适合于单次施用的量的抗体和/或ADC的注射器的形式提供。

药物组合物也可以由包含适合于多次施用的量的ADC批量形式提供。

可以通过将具有期望纯度的抗体和/或ADC与任选的本领域通常使用的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(所有这些在本文中被称为“载剂”)，即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子型去污剂、抗氧化剂和其他混杂添加剂混合来制备药物组合物以用于以冻干制剂或水溶液形式储存。参见，Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版(Osol,ed.1980)。此类添加剂在所采用的剂量和浓度下应该是对接受者无毒的。

缓冲剂有助于将pH维持在接近生理条件的范围。它们可以以多种浓度存在，但通常以约2mM至约50mM的浓度存在。用于本公开的合适的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲剂(例如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)，琥珀酸盐缓冲剂(例如，琥珀酸-琥珀酸一钠的混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)，酒石酸盐缓冲剂(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)，富马酸缓冲剂(例如，富马酸-富马酸一钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)，葡萄糖酸缓冲剂(例如葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)，草酸盐缓冲剂(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)，乳酸缓冲剂(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(例如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可以使用磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐，例如Tris。

可以添加防腐剂以阻止微生物生长，并且可以以约0.2％-1％(w/v)的量添加。用于本公开的合适的防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤化铵(例如氯化物、溴化物和碘化物)，氯化六甲铵、和对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。可以添加有时被称为“稳定剂”的等渗剂以确保本公开的液体组合物的等渗性，并且等渗剂包括多元糖醇，例如三元或更高级的糖醇，例如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。稳定剂是指广泛的赋形剂，其涵盖范围可以从填充剂到使治疗剂溶解或有助于防止变性或粘附于容器壁的添加剂。典型的稳定剂可以是多元糖醇(上面列举的)；氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，例如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括环糖醇如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫的还原剂，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如10个残基或以下的肽)；蛋白质，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮单糖，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，例如乳糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖；和三糖苷，例如棉子糖；和多糖，如右旋糖酐。稳定剂可以为每重量ADC 0.5至10重量％的量存在。

可以添加非离子型表面活性剂或去污剂(也称为“湿润剂”)以帮助溶解糖蛋白，并保护糖蛋白免于搅动引起的聚集，这也使制剂可以暴露于有应力的剪切表面而不会引起蛋白质变性。合适的非离子型表面活性剂包括聚山梨酸酯(20、80等)、polyoxamer(184、188等)和普朗尼克多元醇。非离子型表面活性剂可以以约0.05mg/mL至约1.0mg/mL，例如约0.07mg/mL至约0.2mg/mL存在。

其他混杂赋形剂包括填充剂(例如淀粉)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和助溶剂。

6.6使用方法

本文所述的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段可用于各种诊断测定中。例如，抗体和结合片段可用于免疫测定，例如竞争性结合测定，直接和间接夹心测定以及免疫沉淀测定，包括免疫组织化学测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光激活细胞分选(FACS)和蛋白质印迹。

本文所述的抗糖-MUC1抗体或结合片段还可用于放射照相的体内成像，其中将用可检测部分(例如不透射线的试剂或放射性同位素)标记的抗体施用于受试者，优选施用至血流，并测定标记抗体在宿主中的存在和位置。此类成像技术可用于恶性肿瘤的分期和治疗。

本文所述的抗糖-MUC1抗体或结合片段、ADC和CAR可用于治疗表达糖-MUC1的癌症，包括膀胱癌、肺癌、脑癌、乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、胆管癌、软骨肉瘤、胰腺癌、食道癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌、白血病、甲状腺癌、肝癌、子宫癌和宫颈癌。在一些实施方案中，癌症是上皮癌，例如乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌或肺癌。

因此，本公开提供了如本文所述的抗糖-MUC1抗体、结合片段、ADC和CAR，其用作药物，例如用于治疗癌症，例如前文中指出的任何癌症，用于诊断测定，以及用于放射照相的体内成像。本公开还提供了如本文所述的抗糖-MUC1抗体、结合片段、ADC和CAR在制备药物中的用途，所述药物例如用于治疗癌症，例如，前文中指出的任何癌症。

当使用本公开的CAR进行治疗时，本公开的治疗方法包括向具有表达糖-MUC1的肿瘤的受试者施用有效量的经工程化以表达本公开的CAR的基因修饰细胞，例如如6.3节或实施方案152或实施方案153中所述。在6.4.1节描述了修饰细胞，特别是T细胞以表达CAR的方法。

7.实施例

7.1实施例1：抗糖-Muc1抗体的鉴定

7.1.1.材料和方法

7.1.1.1Tn MUC1糖肽的合成

使用标准合成肽化学和针对糖基化位点的F-MOC-GalNAc-Ser/Thr合成GST-MUC115-mer肽(生物素

7.1.1.2免疫方案

使用戊二醛将GST-糖肽与KLH(Pierce，Rockford，IL)偶联。通过使用级分的抗MUC1ELISA在PD-10色谱柱上进行尺寸排阻色谱分析反应来评估缀合的效率。基本上所有反应性存在于排除的级分中，而预期包含肽的保留的级分的反应性不明显。进一步的评估包括以ELISA对具有相应糖肽的KLH缀合物进行比较滴定分析。两种分析表明，缀合几乎是完全的，这应导致KLH与糖肽的比例为1：300。向雌性Balb/c野生型小鼠皮下注射10或15μg(糖)肽，总体积为200μL(与Sigma的Freunds佐剂1：1混合)。小鼠以14天间隔接受四次免疫接种，并且在第三次和第四次免疫接种后1周通过尾巴或眼睛出血获得血液样品。

7.1.1.3小鼠单克隆抗体抗Tn-MUC1的产生

使用糖肽ELISA，然后用乳腺癌细胞系(MCF7和T47D)进行免疫细胞学检查并用癌组织进行免疫组织学检查来筛选来自经偶联至KLH的GST-MUC1糖肽免疫的野生型Balb/c小鼠的单克隆抗体(mAb)。基于与相同小鼠的总血清相似的反应性模式进行选择。选择两种抗体1AG和4AG进行进一步表征。

7.2实施例2：通过ELISA对1AG和4AG抗体进行功能表征

7.2.1.概述

通过间接ELISA对1AG和4AG进行表征，以测试抗MUC1mAb对如表4所示的具有不同糖基化位点的滴定的MUC1肽(包括非糖基化肽)的反应性。

7.2.2.材料和方法

ELISA板用经浓度为0.08μg/ml至10μg/ml、在pH 9.4的0.2M碳酸氢盐缓冲液中滴定的MUC1肽包被过夜。BSA被用作对照/背景的度量。然后在室温下将板用SuperBlock

7.2.3.结果

结果示于图1A至图1F和图2A至图2B。如图所示，1AG和4AG特异性结合糖基化肽C3、C4和GST，但不结合糖基化肽C2或非糖基化肽70。

7.3实施例3：通过抗体滴定对1AG和4AG抗体进行功能表征

通过针对恒定浓度的抗原GSTA的抗体滴定测定来表征1AG和4AG。

结果示于图3。

7.4实施例4：通过表面等离振子共振对1AG和4AG抗体进行功能表征

7.4.1.材料和方法

通过表面等离振子共振(SPR)来评估1AG和4AG抗体与一种糖基化肽和一种非糖基化肽(表5)的结合。

所有SPR实验在具有CM5传感器芯片、在每个通道上采用10000RU抗小鼠抗体(GEHealthcare)的Biacore T200上在25℃下进行，以HBS-P+作为运行样品缓冲液(10mMHEPES，pH 7.4，150mM NaCl，0.05％Tween 20和1mg/ml BSA)，以pH 1.7的10mM甘氨酸作为再生缓冲液。

使用标准胺偶联化学(EDC/NHS活化)，将1AG和4AG抗体以30μg/mL溶液的形式固定在pH 5.0的10mM乙酸钠中。使用10X稀释液以5μL/min在反应缓冲液中进行抗体捕获7至10分钟。使用600至1000RU的固定化水平。将肽样品制成在运行缓冲液中的起始浓度为100nM(6.25nM、12.5nM、25nM、50nM和100nM)的两倍稀释系列，并以50μL/min以单循环注射的方式注射2分钟。监测解离5分钟至30分钟。

7.4.2.结果

结果示于表6。如表6所示，1AG对糖基化肽的亲和力在两位数纳摩尔范围内，而4AG对糖基化肽的亲和力在一位数纳摩尔范围内。

7.5实施例5：抗糖-Muc1抗体的序列分析

进行cDNA末端的快速扩增(RACE)以确定1AG和4AG的重链和轻链核苷酸序列。

编码1AG的重链和轻链可变区的核苷酸序列分别在SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22中示出。由SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22编码的重链和轻链可变区分别在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中示出。预测的重链CDR序列(IMGT定义)分别在SEQ ID NO:3-5中示出，预测的轻链CDR序列(IMGT定义)分别在SEQ ID NO:6-8中示出。预测的重链CDR序列(Kabat定义)分别在SEQ ID NO:9-11中示出，预测的轻链CDR序列(Kabat定义)分别在SEQ ID NO:12-14中示出。预测的重链CDR序列(Chothia定义)分别在SEQ ID NO:15-17中示出，预测的轻链CDR序列(Chothia定义)分别在SEQ ID NO:18-20中示出。

编码4AG的重链和轻链可变区的核苷酸序列分别在SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44中示出。由SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44编码的重链和轻链可变区分别在SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24中示出。预测的重链CDR序列(IMGT定义)分别在SEQ ID NO:25-27中示出，预测的轻链CDR序列(IMGT定义)分别在SEQ ID NO:28-30中示出。预测的重链CDR序列(Kabat定义)分别在SEQ ID NO:31-33中示出，预测的轻链CDR序列(Kabat定义)分别在SEQ ID NO:34-36中示出。预测的重链CDR序列(Chothia定义)分别在SEQ ID NO:37-39中示出，预测的轻链CDR序列(Chothia定义)分别在SEQ ID NO:40-42中示出。

7.6实施例6：使用抗糖-Muc1抗体对各种肿瘤组织进行免疫组织化学染色

7.6.1.材料和方法

使用人组织微阵列(TMA)BCN721a(美国Biomax)来筛选抗体1AG和4AG对各种肿瘤组织染色的能力。TMA包含来自12种人器官的组织样品，包括食道、胃、结肠、直肠、肝、肺、肾、乳腺、子宫颈、卵巢、前列腺和胰腺，每种均取自三个正常人类个体，每个案例单个芯片。

表7示出了TMA中每个组织的身份。

将切片在冷的10％缓冲中性福尔马林中固定15分钟。通过将载玻片在4℃或室温下与未稀释的杂交瘤上清液或纯化的mAb(1AG和4AG)一起孵育24小时进行免疫组织化学(IHC)。用FITC偶联的兔抗小鼠免疫球蛋白(1：100；丹麦Dako)或过氧化物酶偶联的兔抗小鼠免疫球蛋白检测结合的mAb。用具有DAPI(Invitrogen)的Prolong Gold防褪色剂固定载玻片，并在Leica宽视野荧光显微镜上获得显微照片。

7.6.2.结果

1AG的结果示于图4。4AG的结果示于图5。mAb 1AG以及mAb 4AG与大多数检查过的癌组织发生特异性反应。健康组织的染色显示，尽管尤其在胃组织中看到了一些细胞内结构的标记，但与表面结构的反应性非常有限。

7.7实施例7：使用抗糖-Muc1抗体对卵巢肿瘤组织进行免疫组织化学染色

7.7.1.材料和方法

使用人组织微阵列(TMA)OV241c(美国Biomax)来筛选抗体1AG和4AG对卵巢肿瘤组织染色的能力。

表8示出了TMA中每个组织的身份。

将切片在冷的10％缓冲中性福尔马林中固定15分钟。通过将载玻片在4℃或室温下与未稀释的杂交瘤上清液或纯化的mAb(1AG和4AG)一起孵育24小时进行免疫组织化学(IHC)。用FITC偶联的兔抗小鼠免疫球蛋白(1：100；丹麦Dako)或过氧化物酶偶联的兔抗小鼠免疫球蛋白检测结合的mAb。用具有DAPI(Invitrogen)的Prolong Gold防褪色剂固定载玻片，并在Leica宽视野荧光显微镜上获得显微照片。

7.7.2.结果

1AG的结果示于图6。4AG的结果示于图7。mAb 4AG与来自卵巢腺癌的大多数检查过的组织发生特异性反应。相邻健康组织的染色显示出细胞内结构的某些标记。在这些条件下，未发现卵巢癌和肿瘤邻近组织的mAb 1AG具有明显标记。

7.8实施例8：使用抗糖-Muc1抗体对肿瘤组织进行免疫组织化学染色

7.8.1.材料和方法

使用人组织微阵列(TMA)BC000119(美国Biomax)来筛选抗体1AG和4AG对各种肿瘤组织染色的能力。TMA包含40例乳腺浸润性导管癌、肺鳞状细胞癌、结肠腺癌、前列腺腺癌和胰腺腺癌。由多器官正常组织阵列评估健康对照样品。

表9示出了TMA中每个组织的身份。

将切片在冷的10％缓冲中性福尔马林中固定15分钟。通过将载玻片在4℃或室温下与未稀释的杂交瘤上清液或纯化的mAb(1AG和4AG)一起孵育24小时进行免疫组织化学(IHC)。用FITC偶联的兔抗小鼠免疫球蛋白(1：100；丹麦Dako)或过氧化物酶偶联的兔抗小鼠免疫球蛋白检测结合的mAb。用具有DAPI(Invitrogen)的Prolong Gold防褪色剂固定载玻片，并在Leica宽视野荧光显微镜上获得显微照片。

7.8.2.结果

1AG的结果示于图8。4AG的结果示于图9。mAb 1AG与来自大多数检查过的癌组织(包括来自乳腺癌、肺癌、结肠癌和胰腺癌的组织)的比例的肿瘤发生特异性反应。mAb 4AG与来自大部分检查过的癌症(包括来自乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和胰腺癌的组织)的显著比例的肿瘤发生强烈的特异性反应。

7.9实施例9：通过丙氨酸扫描对1AG和4AG抗体进行表位作图

7.9.1.材料和方法

7.9.1.1材料

在本实施例中所述的研究中使用了以下试剂。

7.9.1.2步移丙氨酸文库合成

构建了步移丙氨酸文库，该文库包含基于MUC1蛋白的28-mer部分

7.9.1.3 5E5、1AG和4AG的表位作图

该文库用于ELISA格式以绘制以下MUC1-Tn抗体的表位：5E5、1AG和4AG。非糖基化的MUC1肽用作阴性对照，而在以粗体下划线显示的丝氨酸和苏氨酸残基上被GalNAc糖基化的肽

将糖肽和相关对照在pH 9.8的0.2M碳酸氢盐缓冲液中稀释至0.25μg/ml，并将100μl铺到高结合ELISA板的每个孔中。然后将板在4℃下孵育过夜。弃去包被缓冲液后，在室温下用每孔300μl的封闭缓冲液(1xPBS中的2.5％BSA)封闭板1小时。然后弃去封闭缓冲液，加入100μl每孔的5E5、1AG和4AG的每一个的抗体上清液(在封闭缓冲液中稀释)并在室温下孵育1小时。事先针对每种抗体优化了抗体上清液稀释度(数据未显示)。将生物素化的VillaVillosa凝集素(每孔100μl，1μg/ml在封闭缓冲液中)加入板中作为对照，以检测肽上GalNAc修饰的残基的存在。将板用300μl每孔的1x TBS/0.05％Tween-20(TBST)洗涤3次。将二抗山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP在封闭缓冲液中以1/5000稀释，每孔加入100μl稀释的抗体，并在室温下在板上孵育1小时。将链霉抗生物素蛋白-HRP在封闭缓冲液中以1/3000稀释，并将100μl稀释的链霉抗生物素蛋白-HRP加入含有生物素化凝集素的孔中。二次孵育后，将板用每孔300μl的TBST洗涤4次，然后用75μl室温的1-Step TMB底物显影。1分钟后，用75μl的2N硫酸的停止显影。然后用酶标仪(Molecular Device SpectraMax i3)在450nm读板。

7.9.1.4数据分析

在Microsoft Excel软件中分析数据。通过将每种抗体与“突变”肽的反应性转换为与野生型肽相比的结合百分比来解释数据。使用公式(OD_突变肽/OD_野生型肽)计算结合百分比。然后以所有值在0-1之间的条形图显示结合百分比。

7.9.2.结果

5E5、1AG和4AG与肽的结合百分比分别示于图10-12。残基17-23区域内的丙氨酸取代极大地降低了1AG和4AG的结合。与5E5相比，1AG和4AG的结合被更多的丙氨酸取代降低。对于肽5-11中的每一种，4AG的结合与“野生型”肽相比大大降低。这表明4AG的结合表位在残基17-23的区域内。1AG的结合甚至限制性更强，其对肽3-12(对应于残基15-24的区域)中的每一种的结合与野生型相比大大降低。在残基19-22的区域，1AG和4AG的结合被肽8上的Ser-GalNAc取代几乎完全抑制(分别为2.23％和1.63％)，而5E5仍可以结合(18％)。相比之下，肽9上的Thr-GalNAc取代几乎完全抑制了5E5结合(2.93％)，而4AG和1AG仍可以分别以14.62％和6.07％结合。这表明，糖基化的丝氨酸比GalNAc-Thr在1AG和4AG的结合中发挥更大的作用，这对于5E5正好相反。总体而言，丙氨酸扫描的结果表明，1AG和4AG的表位似乎与5E5不同。区别包括与糖-MUC1的更大数量的接触，这(不受理论的束缚)被认为赋予了对癌症抗原的更大程度的选择性。

8.具体实施方案、参考文献的引用

尽管已经示出和描述了各种特定的实施方案，但是应当理解，可以在不脱离本公开的精神和范围的情况下进行各种改变。通过以下示出的编号的实施方案来示例本公开。

1.一种与包含以下项的抗体或抗原结合片段竞争结合MUC1肽

2.一种与包含以下项的抗体或抗原结合片段竞争结合乳腺癌细胞系MCF7或T47D的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段：(i)SEQ ID NO:1的重链可变(VH)序列和SEQ ID NO:2的轻链可变(VL)序列或(ii)SEQ ID NO:23的重链可变(VH)序列和SEQ ID NO:24的轻链可变(VL)序列。

3.一种抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H1、含有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR-H2、含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR-H3、含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR-L1、含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR-L2、和含有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR-L3。

4.实施方案1或实施方案2的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其包含含有SEQ IDNO:93的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H1、含有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR-H2、含有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR-H3、含有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR-L1、含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR-L2、和含有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR-L3。

5.实施方案3或实施方案4的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H1包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

6.实施方案3或实施方案4的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

7.实施方案3或实施方案4的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H1包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。

8.实施方案3或实施方案4的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H1包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。

9.实施方案3或实施方案4的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。

10.实施方案3或实施方案4的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H1包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。

11.实施方案3或实施方案4的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H1包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。

12.实施方案3或实施方案4的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H1包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。

13.实施方案3或实施方案4的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H1包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。

14.实施方案3或实施方案4的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H1包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。

15.实施方案3或实施方案4的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H1包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。

16.实施方案3或实施方案4的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H1包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列。

17.实施方案3或实施方案4的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H1包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。

18.实施方案3或实施方案4的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H1包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列。

19.实施方案3至18中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H2包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

20.实施方案3至18中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H2包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

21.实施方案3至18中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H2包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。

22.实施方案3至18中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H2包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。

23.实施方案3至18中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。

24.实施方案3至18中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H2包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。

25.实施方案3至18中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H2包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。

26.实施方案3至18中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H2包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列。

27.实施方案3至26中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H3包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

28.实施方案3至26中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H3包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

29.实施方案3至26中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H3包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。

30.实施方案3至26中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。

31.实施方案3至26中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-H3包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。

32.实施方案3至31中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-L1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

33.实施方案3至31中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-L1包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

34.实施方案3至31中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-L1包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。

35.实施方案3至31中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-L1包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。

36.实施方案3至31中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-L1包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。

37.实施方案3至31中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-L1包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。

38.实施方案3至31中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-L1包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。

39.实施方案3至31中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-L1包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。

40.实施方案3至39中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-L2包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

41.实施方案3至40中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中，CDR-L3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

42.实施方案1至4中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含SEQ IDNO:3-5的互补决定区(CDR)的VH和包含SEQ ID NO:6-8的CDR的VL。

43.实施方案1至4中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含SEQ IDNO:9-11的互补决定区(CDR)的VH和包含SEQ ID NO:12-14的CDR的VL。

44.实施方案1至4中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含SEQ IDNO:15-17的互补决定区(CDR)的VH和包含SEQ ID NO:18-20的CDR的VL。

45.实施方案1至4中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含SEQ IDNO:25-27的互补决定区(CDR)的VH和包含SEQ ID NO:28-30的CDR的VL。

46.实施方案1至4中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含SEQ IDNO:31-33的互补决定区(CDR)的VH和包含SEQ ID NO:34-36的CDR的VL。

47.实施方案1至4中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含SEQ IDNO:37-39的互补决定区(CDR)的VH和包含SEQ ID NO:40-42的CDR的VL。

48.实施方案1至4中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含SEQ IDNO:45-47的互补决定区(CDR)的VH和包含SEQ ID NO:48-50的CDR的VL。

49.实施方案1至4中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含SEQ IDNO:51-53的互补决定区(CDR)的VH和包含SEQ ID NO:54-56的CDR的VL。

50.实施方案1至4中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含SEQ IDNO:57-59的互补决定区(CDR)的VH和包含SEQ ID NO:60-62的CDR的VL。

51.实施方案1至4中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含SEQ IDNO:63-65的互补决定区(CDR)的VH和包含SEQ ID NO:66-68的CDR的VL。

52.实施方案1至4中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含SEQ IDNO:69-71的互补决定区(CDR)的VH和包含SEQ ID NO:72-74的CDR的VL。

53.实施方案1至4中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含SEQ IDNO:75-77的互补决定区(CDR)的VH和包含SEQ ID NO:78-80的CDR的VL。

54.实施方案1至4中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含SEQ IDNO:81-83的互补决定区(CDR)的VH和包含SEQ ID NO:84-86的CDR的VL。

55.实施方案1至4中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含SEQ IDNO:87-89的互补决定区(CDR)的VH和包含SEQ ID NO:90-92的CDR的VL。

56.实施方案1至55中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其为嵌合抗体或人源化抗体。

57.实施方案1至56中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含与SEQID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VL。

58.实施方案1至56中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含与SEQID NO:1具有至少97％序列同一性的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:2具有至少97％序列同一性的氨基酸序列的VL。

59.实施方案1至56中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含与SEQID NO:1具有至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:2具有至少99％序列同一性的氨基酸序列的VL。

60.实施方案1至4中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL。

61.实施方案1至56中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含与SEQID NO:23具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:24具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VL。

62.实施方案1至56中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含与SEQID NO:23具有至少97％序列同一性的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:24具有至少97％序列同一性的氨基酸序列的VL。

63.实施方案1至56中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含与SEQID NO:23具有至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:24具有至少99％序列同一性的氨基酸序列的VL。

64.实施方案1至4中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其具有包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL。

65.实施方案1至4中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

66.实施方案65的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

67.实施方案65的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

68.实施方案65至67中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

69.实施方案68的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与

70.实施方案68的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与

71.实施方案68至70中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

72.实施方案71的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

73.实施方案71的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

74.实施方案71的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

75.实施方案71至74中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

76.实施方案75的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

77.实施方案75的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

78.实施方案75至77中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

79.实施方案78的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

80.实施方案78的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

81.实施方案78的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

82.实施方案65至81中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

83.实施方案82的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

84.实施方案82的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

85.实施方案82至84中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

86.实施方案85的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

87.实施方案85的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

88.实施方案85至87中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

89.实施方案88的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

90.实施方案88的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

91.实施方案88至90中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

92.实施方案91的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

93.实施方案91的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

94.实施方案91的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

95.实施方案91的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

96.实施方案91至95中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

97.实施方案96的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

98.实施方案96的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

99.实施方案96的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

100.实施方案96的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中如通过ELISA所测量的，所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与肽

101.实施方案65至100中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述ELISA包括以0.25μg/ml的浓度使用所述肽的ELISA。

102.实施方案65至101中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述ELISA包括对来自表达所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段的细胞系的细胞培养上清液进行的ELISA。

103.实施方案65至101中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述ELISA包括对来自表达所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段的细胞系的稀释的细胞培养上清液进行的ELISA。

104.实施方案103的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述稀释的细胞培养上清液包括用缓冲液稀释2至20倍的细胞培养上清液。

105.实施方案65至104中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中ELISA中抗体或抗原结合片段的浓度为0.1mg/mL至2mg/mL，任选地，其中ELISA中抗体或抗原结合片段的浓度为0.5mg/mL至1mg/mL。

106.实施方案65至105中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中ELISA中抗体或抗原结合片段的浓度导致与MUC1肽

107.实施方案65至106中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述ELISA如实施例9所述进行。

108.一种与参考抗体或抗原结合片段竞争结合MUC1肽

(a)在所述VH序列内具有第一、第二和第三CDR的VH序列；和

(b)在所述VL序列内具有第四、第五和第六CDR的VL序列，

其中所述第一、第二、第三、第四、第五和第六CDR协作以实现与参考抗体或抗原结合片段的结合竞争的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与MUC1肽的结合。

109.实施方案108的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与包含SEQ ID NO:23的VH序列和SEQ ID NO:24的VL序列的参考抗体或抗原结合片段竞争。

110.实施方案108的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段与包含SEQ ID NO:1的VH序列和SEQ ID NO:2的VL序列的参考抗体或抗原结合片段竞争。

111.实施方案1至110中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，与正常细胞相比，其优先结合在癌细胞上过表达的糖-MUC1表位。

112.实施方案1至111中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其以通过表面等离振子共振测量的1nM至50nM的结合亲和力(K

113.实施方案112的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其以通过表面等离振子共振测量的3nM至50nM的结合亲和力(K

114.实施方案112的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其以通过表面等离振子共振测量的3nM至40nM的结合亲和力(K

115.实施方案112的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其以通过表面等离振子共振测量的3nM至25nM的结合亲和力(K

116.实施方案112的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其以通过表面等离振子共振测量的5nM至50nM的结合亲和力(K

117.实施方案112的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其以通过表面等离振子共振测量的5nM至25nM的结合亲和力(K

118.实施方案112的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其以通过表面等离振子共振测量的10nM至50nM的结合亲和力(K

119.实施方案112的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其以通过表面等离振子共振测量的10nM至25nM的结合亲和力(K

120.实施方案112的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其以通过表面等离振子共振测量的15nM至50nM的结合亲和力(K

121.实施方案112的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其以通过表面等离振子共振测量的15nM至25nM的结合亲和力(K

122.实施方案112的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其以通过表面等离振子共振测量的20nM至50nM的结合亲和力(K

123.实施方案112的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其以通过表面等离振子共振测量的25nM至50nM的结合亲和力(K

124.实施方案1至123中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其为多价的。

125.实施方案1至123中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其是单链可变片段(scFv)的形式。

126.实施方案125的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述scFv包含位于轻链可变片段N末端的重链可变片段。

127.实施方案125或实施方案126的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述scFv重链可变片段和轻链可变片段共价结合至4-15个氨基酸的接头序列。

128.实施方案1至123中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其是多特异性抗体的形式。

129.实施方案128的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述多特异性抗体是与不同于第一表位的第二表位结合的双特异性抗体。

130.实施方案129的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是CrossMab、Fab臂交换抗体、双特异性T细胞衔接子(BiTE)或双亲和性重定向分子(DART)。

131.实施方案130的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是CrossMab。

132.实施方案131的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是CrossMab

133.实施方案131的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是CrossMab

134.实施方案131的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是CrossMab

135.实施方案130的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是Fab臂交换抗体。

136.实施方案130的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是双亲和性重定向分子(DART)。

137.实施方案130的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述双特异性抗体是双特异性T细胞衔接子(BiTE)。

138.实施方案129至137中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述第二表位是MUC1表位。

139.实施方案129至137中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述第二表位是与正常细胞相比在癌细胞上过表达的MUC1表位。

140.实施方案129至137中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述第二表位是T细胞表位。

141.实施方案140的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述T细胞表位包括CD3表位、CD8表位、CD16表位、CD25表位、CD28表位、或NKG2D表位。

142.实施方案141的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述T细胞表位包括CD3表位，其任选地是存在于人CD3中表位。

143.实施方案142的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述CD3表位包括CD3γ表位、CD3δ表位、CD3ε表位或CD3ζ表位。

144.实施方案1至143中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其与可检测部分缀合。

145.实施方案144的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段，其中所述可检测部分是酶、放射性同位素或荧光标记。

146.一种融合蛋白，其包含至少可操作地连接至第二氨基酸序列的实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段的氨基酸序列。

147.实施方案146的融合蛋白，其中所述第二氨基酸序列是4-1BB、CD3ζ或其片段的氨基酸序列。

148.实施方案146的融合蛋白，其中所述第二氨基酸序列是融合肽的氨基酸序列。

149.实施方案148的融合蛋白，其中所述融合肽是CD28-CD3ζ或4-1BB(CD137)-CD3ζ融合肽。

150.实施方案146的融合蛋白，其中所述第二氨基酸序列是T细胞活化的调节剂或其片段的氨基酸序列。

151.实施方案150的融合蛋白，其中所述T细胞活化的调节剂是IL-15或IL-15Ra。

152.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含实施方案125至127中任一项的scFv。

153.实施方案152的CAR，其以氨基末端至羧基末端的顺序包含：人CD8前导肽、scFv、人CD8铰链结构域、人CD8跨膜结构域和CD3ζ信号传导结构域。

154.一种抗体药物缀合物，其包含与细胞毒性剂缀合的实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段或实施方案146至151中任一项的融合蛋白。

155.实施方案154的抗体药物缀合物，其中所述细胞毒性剂是澳瑞他汀、DNA小沟结合剂、烷化剂、烯二炔、lexitropsin、倍癌霉素(duocarmycin)、紫杉烷、尾海兔素、美登素或长春花生物碱。

156.实施方案155的抗体药物缀合物，其中所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段或双特异性抗体通过接头与细胞毒剂缀合。

157.实施方案156的抗体药物缀合物，其中所述接头在细胞内条件下是可切割的。

158.实施方案157的抗体药物缀合物，其中所述可切割接头可被细胞内蛋白酶切割。

159.实施方案158的抗体药物缀合物，其中所述接头包含二肽。

160.实施方案159的抗体药物缀合物，其中所述二肽是val-cit或phe-lys。

161.实施方案157的抗体药物缀合物，其中所述可切割接头在小于5.5的pH下可水解。

162.实施方案161的抗体药物缀合物，其中所述可水解接头是腙接头。

163.实施方案157的抗体药物缀合物，其中所述可切割接头是二硫化物接头。

164.一种核酸，其包含实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、或实施方案146至151中任一项的融合蛋白、或实施方案152或实施方案153的CAR的编码区。

165.实施方案164的核酸，其中所述编码区经密码子优化以在人细胞中表达。

166.一种载体，其包含实施方案164或实施方案165的核酸。

167.实施方案166的载体，其是病毒载体。

168.实施方案167的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体。

169.一种宿主细胞，其被工程化以表达实施方案164或实施方案165的核酸。

170.实施方案169的宿主细胞，其是被工程化以表达实施方案152或实施方案153的CAR的人T细胞。

171.一种宿主细胞，其包含实施方案166至168中任一项的载体。

172.实施方案171的宿主细胞，其是T细胞，并且其中所述载体编码实施方案152或实施方案153的CAR。

173.一种药物组合物，其包含(a)实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、或实施方案169至172中任一项的宿主细胞，和(b)生理学上合适的缓冲液、佐剂或稀释剂。

174.一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物。

175.实施方案174的方法，其中所述受试者患有乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、食道癌、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、脑癌、非霍奇金淋巴瘤，宫颈癌、胃癌、胆管癌、软骨肉瘤、肾癌、皮肤癌、白血病、甲状腺癌或肝癌。

176.实施方案175的方法，其中所述受试者患有乳腺癌。

177.实施方案175的方法，其中所述受试者患有肺癌。

178.实施方案177的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。

179.实施方案175的方法，其中所述受试者患有前列腺癌。

180.实施方案175的方法，其中所述受试者患有胰腺癌。

181.实施方案175的方法，其中所述受试者患有食道癌。

182.实施方案175的方法，其中所述受试者患有结肠直肠癌。

183.实施方案175的方法，其中所述受试者患有卵巢癌。

184.实施方案175的方法，其中所述受试者患有子宫癌。

185.实施方案175的方法，其中所述受试者患有宫颈癌。

186.实施方案175的方法，其中所述受试者患有膀胱癌。

187.实施方案175的方法，其中所述受试者患有脑癌。

188.实施方案175的方法，其中所述受试者患有非霍奇金淋巴瘤。

189.实施方案175的方法，其中所述受试者患有宫颈癌。

190.实施方案175的方法，其中所述受试者患有胃癌。

191.实施方案175的方法，其中所述受试者患有胆管癌。

192.实施方案175的方法，其中所述受试者患有软骨肉瘤。

193.实施方案175的方法，其中所述受试者患有肾癌。

194.实施方案175的方法，其中所述受试者患有皮肤癌。

195.实施方案175的方法，其中所述受试者患有白血病。

196.实施方案175的方法，其中所述受试者患甲状腺癌。

197.实施方案175的方法，其中所述受试者患有肝癌。

198.一种检测生物样品中的癌症的方法，其包括使样品与实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段接触，并检测所述抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段的结合。

199.实施方案198的方法，其还包括对抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段的结合进行定量。

200.实施方案198或实施方案199的方法，其中将所述结合与作为阴性/基线对照的正常组织对照和/或与作为阳性对照的癌性组织对照进行比较。

201.实施方案198至200中任一项的方法，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、食道癌、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、脑癌、非霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、胃癌、胆管癌、软骨肉瘤、肾癌、皮肤癌、白血病、甲状腺癌或肝癌。

202.实施方案201的方法，其中所述癌症为乳腺癌。

203.实施方案201的方法，其中所述癌症为肺癌。

204.实施方案203的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。

205.实施方案201的方法，其中所述癌症为前列腺癌。

206.实施方案201的方法，其中所述癌症为胰腺癌。

207.实施方案201的方法，其中所述癌症为食道癌。

208.实施方案201的方法，其中所述癌症为结肠直肠癌。

209.实施方案201的方法，其中所述癌症为卵巢癌。

210.实施方案201的方法，其中所述癌症为子宫癌。

211.实施方案201的方法，其中所述癌症为宫颈癌。

212.实施方案201的方法，其中所述癌症为膀胱癌。

213.实施方案201的方法，其中所述癌症为脑癌。

214.实施方案201的方法，其中所述癌症为非霍奇金淋巴瘤。

215.实施方案201的方法，其中所述癌症为宫颈癌。

216.实施方案201的方法，其中所述癌症为胃癌。

217.实施方案201的方法，其中所述癌症为胆管癌。

218.实施方案201的方法，其中所述癌症为软骨肉瘤。

219.实施方案201的方法，其中所述癌症为肾癌。

220.实施方案201的方法，其中所述癌症为皮肤癌。

221.实施方案201的方法，其中所述癌症为白血病。

222.实施方案201的方法，其中所述癌症为甲状腺癌。

223.实施方案201的方法，其中所述癌症为肝癌。

224.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用作药物。

225.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗癌症，任选地，其中所述癌症为乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、食道癌、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、脑癌、非霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、胃癌、胆管癌、软骨肉瘤、肾癌、皮肤癌、白血病、甲状腺癌或肝癌。

226.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗乳腺癌。

227.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗肺癌。

228.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗前列腺癌。

229.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗胰腺癌。

230.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗食道癌。

231.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗结肠直肠癌。

232.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗卵巢癌。

233.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗子宫癌。

234.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗宫颈癌。

235.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗膀胱癌。

236.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗脑癌。

237.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗非霍奇金淋巴瘤。

238.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗宫颈癌。

239.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗胃癌。

240.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗胆管癌。

241.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗软骨肉瘤。

242.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗肾癌。

243.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗皮肤癌。

244.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗白血病。

245.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗甲状腺癌。

246.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物，其用于治疗肝癌。

247.实施方案1至145中任一项的抗糖-MUC1抗体或抗原结合片段、实施方案146至151中任一项的融合蛋白、实施方案152或实施方案153的CAR、实施方案154至163中任一项的抗体药物缀合物、实施方案164或实施方案165的核酸、实施方案166至168中任一项的载体、实施方案169至172中任一项的宿主细胞、或实施方案173的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，任选地，其中所述癌症为乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、食道癌、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、脑癌、非霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、胃癌、胆管癌、软骨肉瘤、肾癌、皮肤癌、白血病、甲状腺癌或肝癌。

248.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为乳腺癌。

249.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为肺癌。

250.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为前列腺癌。

251.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为胰腺癌。

252.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为食道癌。

253.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为结肠直肠癌。

254.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为卵巢癌。

255.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为子宫癌。

256.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为宫颈癌。

257.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为膀胱癌。

258.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为脑癌。

259.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为非霍奇金淋巴瘤。

260.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为宫颈癌。

261.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为胃癌。

262.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为胆管癌。

263.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为软骨肉瘤。

264.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为肾癌。

265.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为皮肤癌。

266.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为白血病。

267.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为甲状腺癌。

268.根据实施方案247的用途，其中所述癌症为肝癌。

在本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文件通过引用整体并入本文用于所有目的，其程度如同单独指出每个独立的出版物、专利、专利申请或其他文件通过引用而并入用于所有目的。如果并入本文的一个或多个参考文献的教导与本公开之间存在不一致的情况，则遵循本说明书的教导。

序列表

<110> GO医疗股份有限公司

<120> 抗糖-MUC1抗体及其用途

<130> GOT-002WO

<150> 62/691,887

<151> 2018-06-29

<150> 62/802,865

<151> 2019-02-08

<160> 118

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 1

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1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Asp

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Thr Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe

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Leu Gln Met Ser Ser Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

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Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 2

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 2

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Glu Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 3

Gly Phe Asp Phe Ser Arg Asp Trp

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 4

Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Lys

1 5

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 5

Ala Thr Ser His Tyr Tyr Gly Leu Phe Gly Tyr

1 5 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 6

Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 7

Leu Ala Ser

1

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 8

Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Arg Thr

1 5

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 9

Arg Asp Trp Met Ser

1 5

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 10

Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 11

Ser His Tyr Tyr Gly Leu Phe Gly Tyr

1 5

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 12

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His

1 5 10 15

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 13

Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 14

Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Arg Thr

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 15

Gly Phe Asp Phe Ser Arg Asp

1 5

<210> 16

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 16

Asn Pro Asp Ser Ser Thr

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 17

Ser His Tyr Tyr Gly Leu Phe Gly Tyr

1 5

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 18

Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210> 19

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 19

Leu Ala Ser

1

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 20

Ser Arg Glu Leu Pro Arg Thr

1 5

<210> 21

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的核苷酸序列

<400> 21

gaggtgaagc ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaattg 60

tcctgtgcag cctcaggatt cgattttagt agagactgga tgagttgggt ccggcaggct 120

ccagggaaag ggctagaatg gattggagag attaatccag atagcagtac gaaaaactac 180

acgccatctc taaaggataa attcatcatt tccagagaca acgccaaaaa tacgctgttc 240

ctgcaaatga gcagcgtgag atctgaggac acagcccttt attactgtgc aacctctcat 300

tactacggcc tgtttggtta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgcagaggtg 360

aagcttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa attgtcctgt 420

gcagcctcag gattcgattt tagtagagac tggatgagtt gggtccggca ggctccaggg 480

aaagggctag aatggattgg agagattaat ccagatagca gtacgaaaaa ctacacgcca 540

tctctaaagg ataaattcat catttccaga gacaacgcca aaaatacgct gttcctgcaa 600

atgagcagcg tgagatctga ggacacagcc ctttattact gtgcaacctc tcattactac 660

ggcctgtttg gttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 708

<210> 22

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的核苷酸序列

<400> 22

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttaactgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggtac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcttccta cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga gcttcctcgg 300

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333

<210> 23

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 23

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Glu Ser Asn Thr Met Asn Tyr Ser Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Glu Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Thr Ala Lys Asn Met Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ser His His Tyr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 24

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 24

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Asn Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Glu Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Phe Lys

100 105 110

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 25

Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp

1 5

<210> 26

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 26

Ile Asn Pro Glu Ser Asn Thr Met

1 5

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 27

Ala Thr Ser His His Tyr Gly Leu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 28

Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 29

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 29

Leu Ala Ser

1

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 30

Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Arg Thr

1 5

<210> 31

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 31

Arg Tyr Trp Met Ser

1 5

<210> 32

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 32

Glu Ile Asn Pro Glu Ser Asn Thr Met Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Lys

1 5 10 15

Glu

<210> 33

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 33

Ser His His Tyr Gly Leu Phe Asp Tyr

1 5

<210> 34

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 34

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Asn Tyr Ile His

1 5 10 15

<210> 35

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 35

Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 36

Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Arg Thr

1 5

<210> 37

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 37

Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr

1 5

<210> 38

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 38

Asn Pro Glu Ser Asn Thr

1 5

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 39

Ser His His Tyr Gly Leu Phe Asp Tyr

1 5

<210> 40

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 40

Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 41

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 41

Leu Ala Ser

1

<210> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 42

Ser Arg Glu Leu Pro Arg Thr

1 5

<210> 43

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的核苷酸序列

<400> 43

gaggtgaagc ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc 60

tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct 120

ccagggaaag ggccagaatg gattggagaa attaatccag aaagcaatac gatgaactat 180

tcgccatctc taaaggaaaa attcatcatc tccagagaca ccgccaaaaa tatgttgtac 240

ctgcaaatga gcaaagtgag atctgaggac acagcccttt attactgtgc aacctctcat 300

cactacggcc tattcgatta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354

<210> 44

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的核苷酸序列

<400> 44

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtgt ctctggggca gagggccacc 60

atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acttctggct ataattatat acactggtac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccta cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccac 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat ttctgtcagc acagtaggga gcttcctcgg 300

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaattc aaa 333

<210> 45

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> D或Y

<400> 45

Gly Phe Asp Phe Ser Arg Xaa Trp

1 5

<210> 46

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> D或E

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> S或N

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> K或M

<400> 46

Ile Asn Pro Xaa Ser Xaa Thr Xaa

1 5

<210> 47

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Y或H

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> G或D

<400> 47

Ala Thr Ser His Xaa Tyr Gly Leu Phe Xaa Tyr

1 5 10

<210> 48

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> S或N

<400> 48

Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Xaa Tyr

1 5 10

<210> 49

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 49

Leu Ala Ser

1

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 50

Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Arg Thr

1 5

<210> 51

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> D或Y

<400> 51

Arg Xaa Trp Met Ser

1 5

<210> 52

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> D或E

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> S或N

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> K或M

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> T或S

<220>

<221> MOD_RES

<222> (17)..(17)

<223> D或E

<400> 52

Glu Ile Asn Pro Xaa Ser Xaa Thr Xaa Asn Tyr Xaa Pro Ser Leu Lys

1 5 10 15

Xaa

<210> 53

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Y或H

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> G或D

<400> 53

Ser His Xaa Tyr Gly Leu Phe Xaa Tyr

1 5

<210> 54

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> S或N

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> M或I

<400> 54

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Xaa Tyr Xaa His

1 5 10 15

<210> 55

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 55

Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 56

Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Arg Thr

1 5

<210> 57

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> D或Y

<400> 57

Gly Phe Asp Phe Ser Arg Xaa

1 5

<210> 58

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> D或E

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> S或N

<400> 58

Asn Pro Xaa Ser Xaa Thr

1 5

<210> 59

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Y或H

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> G或D

<400> 59

Ser His Xaa Tyr Gly Leu Phe Xaa Tyr

1 5

<210> 60

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> S或N

<400> 60

Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Xaa Tyr

1 5 10

<210> 61

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 61

Leu Ala Ser

1

<210> 62

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 62

Ser Arg Glu Leu Pro Arg Thr

1 5

<210> 63

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 63

Gly Phe Asp Phe Ser Arg Asp Trp Met Ser

1 5 10

<210> 64

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 64

Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 65

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 65

Ala Thr Ser His Tyr Tyr Gly Leu Phe Gly Tyr

1 5 10

<210> 66

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 66

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His

1 5 10 15

<210> 67

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 67

Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210> 68

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 68

Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Arg Thr

1 5

<210> 69

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 69

Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp Met Ser

1 5 10

<210> 70

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 70

Glu Ile Asn Pro Glu Ser Asn Thr Met Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Lys

1 5 10 15

Glu

<210> 71

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 71

Ala Thr Ser His His Tyr Gly Leu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 72

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 72

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Asn Tyr Ile His

1 5 10 15

<210> 73

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 73

Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210> 74

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 74

Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Arg Thr

1 5

<210> 75

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> D或Y

<400> 75

Gly Phe Asp Phe Ser Arg Xaa Trp Met Ser

1 5 10

<210> 76

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> D或E

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> S或N

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> K或M

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> T或S

<220>

<221> MOD_RES

<222> (17)..(17)

<223> D或E

<400> 76

Glu Ile Asn Pro Xaa Ser Xaa Thr Xaa Asn Tyr Xaa Pro Ser Leu Lys

1 5 10 15

Xaa

<210> 77

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Y或H

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> G或D

<400> 77

Ala Thr Ser His Xaa Tyr Gly Leu Phe Xaa Tyr

1 5 10

<210> 78

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> S或N

<220>

<221> MOD_RES

<222> (14)..(14)

<223> M或I

<400> 78

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Xaa Tyr Xaa His

1 5 10 15

<210> 79

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 79

Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210> 80

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 80

Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Arg Thr

1 5

<210> 81

<211> 2

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 81

Arg Asp

1

<210> 82

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 82

Asn Pro Asp Ser Ser Thr

1 5

<210> 83

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 83

Ser His Tyr Tyr Gly Leu Phe Gly Tyr

1 5

<210> 84

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 84

Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210> 85

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 85

Leu Ala Ser

1

<210> 86

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 86

Ser Arg Glu Leu Pro Arg Thr

1 5

<210> 87

<211> 2

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 87

Arg Tyr

1

<210> 88

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 88

Asn Pro Glu Ser Asn Thr

1 5

<210> 89

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 89

Ser His His Tyr Gly Leu Phe Asp Tyr

1 5

<210> 90

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 90

Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Asn Tyr

1 5 10

<210> 91

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 91

Leu Ala Ser

1

<210> 92

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 92

Ser Arg Glu Leu Pro Arg Thr

1 5

<210> 93

<211> 2

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> D或Y

<400> 93

Arg Xaa

1

<210> 94

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> D或E

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> S或N

<400> 94

Asn Pro Xaa Ser Xaa Thr

1 5

<210> 95

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Y或H

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> G或D

<400> 95

Ser His Xaa Tyr Gly Leu Phe Xaa Tyr

1 5

<210> 96

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> S或N

<400> 96

Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Xaa Tyr

1 5 10

<210> 97

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 97

Leu Ala Ser

1

<210> 98

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 98

Ser Arg Glu Leu Pro Arg Thr

1 5

<210> 99

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 99

Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr

1 5 10 15

<210> 100

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 100

Gly Phe Leu Gly

1

<210> 101

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 101

Ala Leu Ala Leu

1

<210> 102

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 102

Tyr Leu His Leu Gly Ala Leu Gly Arg Asp Leu Trp Gly Pro Ser Pro

1 5 10 15

Val Thr Gly Tyr His Pro Leu Leu

20

<210> 103

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 103

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 104

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 104

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys

35 40

<210> 105

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 105

Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro

1 5 10 15

Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val

20 25

<210> 106

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 106

Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Ala Thr Arg Pro

1 5 10 15

Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val

20 25

<210> 107

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 107

Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Ala Arg Pro

1 5 10 15

Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val

20 25

<210> 108

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 108

Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Ala Pro

1 5 10 15

Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val

20 25

<210> 109

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 109

Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Ala

1 5 10 15

Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val

20 25

<210> 110

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 110

Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro

1 5 10 15

Gly Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val

20 25

<210> 111

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 111

Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro

1 5 10 15

Ala Ala Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val

20 25

<210> 112

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 112

Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro

1 5 10 15

Ala Pro Ala Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val

20 25

<210> 113

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 113

Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro

1 5 10 15

Ala Pro Gly Ala Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val

20 25

<210> 114

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 114

Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro

1 5 10 15

Ala Pro Gly Ser Ala Ala Pro Pro Ala His Gly Val

20 25

<210> 115

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 115

Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro

1 5 10 15

Ala Pro Gly Ser Thr Gly Pro Pro Ala His Gly Val

20 25

<210> 116

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 116

Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro

1 5 10 15

Ala Pro Gly Ser Thr Ala Ala Pro Ala His Gly Val

20 25

<210> 117

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 117

Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro

1 5 10 15

Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Ala Ala His Gly Val

20 25

<210> 118

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 118

Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr

1 5 10 15

Ala Glu Asn Pro

20