工程化的细胞外囊泡及其用途

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技术领域

本公开提供了富含与细胞外囊泡的内腔表面缔合的支架蛋白的细胞外囊泡(例如，外来体)，其可用作预防或治疗癌症和其它疾病的剂。

背景技术

外来体是细胞间通讯的重要介质。在许多疾病(诸如癌症)的诊断和预后中，它们也是重要的生物标志物。作为药物递送媒介物，外来体作为新的治疗方式在许多治疗领域中提供了优于常规药物递送方法的许多有利方面。

外来体的主要特征是其将生物活性有效载荷包含在其内部空间或内腔内的能力。众所周知，外来体包含内源性有效载荷，包括mRNA、miRNA、DNA、蛋白质、碳水化合物和脂质，但指导所需治疗有效载荷的特异性装载的能力目前受到限制。外来体可以通过在生产者细胞中过表达所需的治疗有效载荷来装载，但由于有效载荷随机定位到细胞外来体加工中心，这种装载的效率通常有限。或者，可通过例如电穿孔来离体装载纯化的外来体。这些方法的效率可能很低，或者仅限于小的有效载荷，诸如siRNA。因此，需要用于产生高效且定义明确的装载型外来体(loaded exosome)的合适方法，以更好地实现基于外来体的技术的治疗性用途和其它应用。

发明内容

本公开的方面涉及装载细胞外囊泡(EV)(例如，外来体)以用于治疗用途的新型方法。具体而言，所述方法使用从外来体内腔表面新鉴定的蛋白质标志物。特别地，经鉴定一组蛋白质(例如，富含豆蔻酰化的丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS)；富含豆蔻酰化的丙氨酸的蛋白激酶C底物样蛋白1(MARCKSL1)；以及脑酸可溶性蛋白1(BASP1))在外来体的内腔表面上高度富集。此外，已显示，BASP1的氨基末端的短序列，例如至少七个氨基酸，足以以与全长BASP1蛋白相同的程度指导荧光蛋白分子的高效装载。该片段为至少7个氨基酸并少于10个氨基酸，在工程化的EV装载领域表现出显著进步，并允许将任何生物活性分子(例如，治疗性蛋白有效载荷)高效、可再现地装载到EV(例如，外来体)的内腔中而无需额外的离体操作步骤。与迄今为止描述的任何其它基因工程方法相比，使用本文所述的融合蛋白装载EV(例如，外来体)产生了具有显著更高的有效载荷水平的工程化EV(例如工程化外来体)。

从外来体新鉴定的蛋白质和肽序列用于本公开的各种实施方案中。例如，一些实施方案涉及通过将EV(例如，外来体)蛋白或蛋白片段(即，支架蛋白)和生物活性分子(例如，治疗相关蛋白)缀合来产生融合蛋白，并产生在EV的内腔表面上包含所述融合蛋白的EV(例如，外来体)。天然全长蛋白或生物活性分子(例如，治疗相关蛋白质)的生物活性片段可以通过与外来体富集的蛋白或蛋白片段缀合而转运至EV(例如，外来体)的内腔表面。

本公开还涉及内腔工程化的EV(例如，内腔工程化的外来体)的产生或用途，所述内腔工程化的EV被设计用于更高效的装载或用于将生物活性分子(例如，治疗相关蛋白)装载在EV(例如，外来体)的内腔中。例如，EV的内腔表面可被修饰以在内腔表面上包含更高浓度的天然全长EV(例如，外来体)蛋白和/或天然EV(例如，外来体)蛋白的片段或经修饰的蛋白质。

本公开的一些实施方案涉及生产者细胞或产生该生产者细胞以产生这种内腔工程化EV的方法。可以将外源多核苷酸瞬时或稳定地引入生产者细胞，以从生产者细胞产生内腔工程化的EV(例如，内腔工程化的外来体)。

因此，一方面，本公开提供了包含支架蛋白的EV(例如，外来体)，其中所述支架蛋白的至少一部分由外源序列表达，并且所述支架蛋白包括MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段、变体、衍生物或修饰。

在一些方面，支架蛋白以相较于不同的EV(例如，外来体)中的不同的支架蛋白更高的密度存在于EV(例如，外来体)中，其中所述不同的支架蛋白包括常规EV(例如，外来体)蛋白或其变体。在一些实施方案中，常规EV(例如，外来体)蛋白选自由以下组成的组：CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚定蛋白、乳凝集素(lactadherin)、LAMP2、LAMP2B及其片段。

在一些实施方案中，EV(例如，外来体)由经遗传修饰以包含外源序列的细胞产生，任选地其中所述细胞是HEK293细胞。

在一些实施方案中，细胞包含含有外源序列的质粒。

在一些实施方案中，外源序列被插入相对于编码MARCKS、MARCKSL1或BASP1的基因组序列位于3'或5'的基因组位点中。在一些实施方案中，外源序列被插入编码MARCKS、MARCKSL1或BASP1的基因组序列中。

在一些实施方案中，支架蛋白是包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段和治疗性肽的融合蛋白。

在一些实施方案中，生物活性分子包括治疗性肽，所述治疗性肽选自由以下组成的组：天然肽、重组肽、合成肽或连接至治疗性化合物的接头。在一些实施方案中，生物活性分子(例如，治疗性化合物)选自由以下组成的组：核苷酸、氨基酸、脂质、碳水化合物和小分子。在一些实施方案中，生物活性分子(例如，治疗性肽)是抗体或其片段或修饰。在一些实施方案中，治疗性肽是酶、配体、受体、转录因子或其片段或修饰。在一些实施方案中，治疗性肽是抗微生物肽或其片段或修饰。

在一些实施方案中，EV(例如，外来体)还包含第二支架蛋白，其中所述第二支架蛋白包括MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段。在一些实施方案中，EV(例如，外来体)还包含第二支架蛋白，其中所述第二支架蛋白包括PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段。

在一些实施方案中，支架蛋白包含对应于模式(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO:118)或不含N端(M)的所述模式的肽序列。在一些实施方案中，支架蛋白包含(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)的肽或不含N端(M)的所述肽，其中每个括号里面的位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任意氨基酸，X是任意氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任意氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在一些实施方案中，支架蛋白包含序列(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)的肽，或不含N端(M)的所述肽，其中每个括号里面的位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任意氨基酸，ξ是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)组成的组的任意氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任意氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)。关于氨基酸的命名，参见R.Aasland等人，FEBS Letters 513(2002):141-144。

在一些实施方案中，支架蛋白包含SEQ ID NO:4-110中任一个的肽。在一些实施方案中，支架蛋白包含MGXKLSKKK(SEQ ID NO:116)的肽或不含N端M的所述肽，其中X是任意氨基酸。在一些实施方案中，支架蛋白包含SEQ ID NO:110的肽，或不含N端M的相应肽。在一些实施方案中，支架蛋白包含SEQ ID NO:13的肽，或不含N端(M)的相应肽。

在一些实施方案中，支架蛋白还包含有效载荷，例如，肽。

在另一个实施方案中，本公开提供了药物组合物，其包含本公开的EV(例如，外来体)和赋形剂。

在一些实施方案中，药物组合物基本上不含大分子，其中所述大分子选自核酸、外源蛋白质、脂质、碳水化合物、代谢物及其组合。

在又一另外的实施方案中，本公开提供了用于产生本文提供的EV(例如，外来体)的细胞群。

在一些实施方案中，细胞群包含编码支架蛋白的外源序列，所述支架蛋白包括MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修饰。在一些实施方案中，细胞群还包含编码第二支架蛋白的第二外源序列，其中所述第二支架蛋白包括MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修饰。在一些实施方案中，细胞群还包含编码第二支架蛋白的第二外源序列，其中所述第二支架蛋白包括PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段。

在一些实施方案中，将外源序列插入编码MARCKS、MARCKSL1或BASP1的基因组序列，其中所述外源序列和所述基因组序列编码支架蛋白。在一些实施方案中，外源序列在质粒中。

在一些实施方案中，外源序列编码生物活性分子(例如，治疗性肽)。在一些实施方案中，治疗性肽选自由以下组成的组：天然肽、重组肽、合成肽或连接至治疗性化合物的接头。在一些实施方案中，所述治疗性化合物选自由以下组成的组：核苷酸、氨基酸、脂质、碳水化合物和小分子。在一些实施方案中，治疗性肽是抗体或其片段或其修饰。在特定的实施方案中，抗体是纳米抗体。本领域普通技术人员将理解，本公开的EV中使用的抗体可以是本领域已知的任何抗原结合分子，包括例如替代抗体形式、抗原-药物缀合物(ADC)或免疫毒素。

在一些实施方案中，治疗性肽是酶、配体、受体、转录因子或其片段或修饰。在一些实施方案中，治疗性肽是抗微生物肽或其片段或修饰。

在一些实施方案中，外源序列编码靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分对器官、组织或细胞是特异的。

在一些实施方案中，第二支架蛋白还包含靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分对器官、组织或细胞是特异的。

在一个实施方案中，本公开提供了用于修饰EV(例如外来体)的多肽，所述多肽包含以下序列：

(i)(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO:118)或不含N端(M)的相应序列；

(ii)(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)或不含N端(M)的相应序列，其中每个括号里面的位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任意氨基酸，X是任意氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任意氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)；或者

(iii)(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)或不含N端(M)的相应序列，其中每个括号里面的位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任意氨基酸，ξ是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)组成的组的任意氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任意氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)。

在一些实施方案中，支架的多肽包含SEQ ID NO:4-110中任一个的序列，或不含N端M的任何相应序列。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:13的序列或不含N端M的相应序列。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:110的序列或不含N端M的相应序列。在一些实施方案中，所述多肽包含序列MGXKLSKKK(SEQ ID NO:116)，其中X是任意氨基酸，或不含N端M的相应序列。

一方面，本公开提供了包含编码本文提供的多肽的编码序列的多核苷酸构建体。在一些实施方案中，所述编码序列被密码子优化。

另一方面，本公开提供了制备工程化EV(例如，外来体)的方法，其包括以下步骤：

a.将编码融合多肽的核酸构建体引入细胞，所述融合多肽包含

(i)编码MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或其修饰的第一序列，和

(ii)编码有效载荷(例如，生物活性分子诸如治疗性肽)的第二序列；

b.将细胞维持在允许细胞表达融合多肽的条件下；以及，

c.从所述细胞获得包含所述融合多肽的工程化外来体。

在一些实施方案中，所述第一序列包括以下序列；

(i)(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO:118)或不含N端(M)的相应序列；

(ii)(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)或不含N端(M)的相应序列。其中每个括号里面的位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任意氨基酸，X是任意氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任意氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)；或者

(iii)(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)或不含N端(M)的相应序列，其中每个括号里面的位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任意氨基酸，ξ是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)组成的组的任意氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任意氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)。

在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:4-110中任一个的序列，或不含N端M的任何相应序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:13的序列或不含N端(M)的相应序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:110的序列或不含N端(M)的相应序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含序列MGXKLSKKK(SEQ ID NO:116)的或不含N端M的相应序列，其中X是任意氨基酸。

在一些实施方案中，所述融合多肽以相较于不同的EV(例如，外来体)中的不同的支架蛋白更高的密度存在于工程化EV(例如，工程化外来体)的内腔表面上，其中所述不同的支架蛋白包括常规EV(例如外来体)蛋白或其变体。在一些实施方案中，所述融合多肽以是不同的EV(例如，外来体)中的不同的支架蛋白的超过2倍的密度存在。

在一些实施方案中，所述融合多肽以是不同的EV(例如，外来体)中的不同的支架蛋白的超过4倍、16倍、100倍或10,000倍的密度存在。

本公开涉及分离的细胞外囊泡(EV)，其包含连接至支架蛋白的生物活性分子，其中所述支架蛋白包含N端结构域(ND)和效应结构域(ED)，其中所述ND和ED通过离子相互作用与EV的内腔表面缔合，其中ED在序列中包含至少两个连续的赖氨酸(Lys)。在一些实施方案中，ND通过豆蔻酰化与EV的内腔表面缔合。在其它实施方案中，ND在N端具有Gly。

在一些实施方案中，ED包含至少三个Lys，至少四个Lys，至少五个Lys，至少六个Lys或至少七个Lys。在其它实施方案中，ED通过肽键连接至ND。在一些实施例中，ED包含(Lys)n，其中n是1和10之间的整数。在其它实施方案中，ED包含KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO:151)、KKKKK(SEQ ID NO:152)或其任意组合。

在其它实施方案中，ND包含如G:X2:X3:X4:X5:X6所示的氨基酸序列，其中G是表示为Gly的甘氨酸；其中“：”表示肽键，其中X2至X6中的每个独立地是氨基酸；并且其中X6包括碱性氨基酸。在一些实施方案中，X6选自由以下组成的组：Lys、Arg和His。

在其它实施方案中，本公开是分离的细胞外囊泡(EV)，其包含连接至支架蛋白的生物活性分子，其中所述支架蛋白包含N端结构域(ND)和效应结构域(ED)，其中所述ND包含如G:X2:X3:X4:X5:X6所示的氨基酸序列，其中G是由Gly表示的甘氨酸；其中“：”表示肽键，其中X2至X6中的每个独立地是氨基酸；其中X6包括碱性氨基酸，并且其中ED通过肽键连接至X6并且包含在ED的N端处的至少一个赖氨酸。在一些实施方案中，ED不包含病毒的跨膜结构域或细胞质结构域。在一些实施方案中，X2选自由以下组成的组：Pro、Gly、Ala和Ser。在其它实施方案中，X4选自由以下组成的组：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met。在一些实施方案中，X5选自由以下组成的组：Pro、Gly、Ala和Ser。

在一些实施方案中，支架蛋白的ND包含氨基酸序列G:X2:X3:X4:X5:X6，其中

G表示Gly；

“:”表示肽键；

X2是选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala和Ser；

X3是氨基酸；

X4是选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met；

X5是选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala和Ser；以及

X6是选自由以下组成的组的氨基酸：Lys、Arg和His。

在一些实施方案中，X3选自由以下组成的组：Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His和Arg。

在一些实施方案中，ND和ED通过接头连接。在一些实施方案中，接头包含一个或多个氨基酸。

在一些实施方案中，本公开涉及分离的细胞外囊泡(EV)，其包含连接至支架蛋白的生物活性分子，其中所述支架蛋白包含ND-ED，其中：

ND包含G:X2:X3:X4:X5:X6；其中：

G表示Gly；

“:”表示肽键；

X2是选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala和Ser；

X3是氨基酸；

X4是选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Glu和Met；

X5是选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala和Ser；

X6是选自由以下组成的组的氨基酸：Lys、Arg和His；

“—”是包含一个或多个氨基酸的任选的接头；以及

ED是效应结构域，其包含(i)至少两个连续的赖氨酸(Lys)，其通过肽键或一个或多个氨基酸连接至X6；或(ii)至少一个赖氨酸，其通过肽键直接连接至X6。

在一些实施方案中，X2选自由以下组成的组：Gly和Ala。在一些实施方案中，X3是Lys。在一些实施方案中，X4是Leu或Glu。在一些实施方案中，X5选自由以下组成的组：Ser和Ala。在一些实施方案中，X6是Lys。在其它实施方案中，X2是Gly、Ala或Ser；X3是Lys或Glu，X4是Leu、Phe、Ser和Glu，X5是Ser或Ala；以及X6是Lys。

在一些实施方案中，ND和ED通过包含一个或多个氨基酸的接头连接。在一些实施方案中，ED包含Lys(K)、KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO:151)、KKKKK(SEQ ID NO:152)或其任意组合。

在一些实施方案中，支架蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSKK(SEQ ID NO:157)、(ii)GAKLSKK(SEQ ID NO:158)、(iii)GGKQSKK(SEQ ID NO:159)、(iv)GGKLAKK(SEQ ID NO:160)或(v)其任意组合。在一些实施方案中，支架蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSKKK(SEQ ID NO:161)、(ii)GGKLSKKS(SEQ IDNO:162)、(iii)GAKLSKKK(SEQ ID NO:163)、(iv)GAKLSKKS(SEQ ID NO:164)、(v)GGKQSKKK(SEQ ID NO:165)、(vi)GGKQSKKS(SEQ ID NO:166)、(vii)GGKLAKKK(SEQ ID NO:167)、(viii)GGKLAKKS(SEQ ID NO:168)和(ix)其任意组合。在一些实施方案中，支架蛋白的长度为至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、至少约22个、至少约23个、至少约24个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个、至少约80个、至少约85个、至少约90个、至少约95个、至少约100个、至少约105个、至少约110个、至少约120个、至少约130个、至少约140个、至少约150个、至少约160个、至少约170个、至少约180个、至少约190个或至少约200个氨基酸。

在一些实施方案中，支架蛋白包含(i)GGKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:169)、(ii)GAKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:170)、(iii)GGKQSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:171)、(iv)GGKLAKKKKGYNVN(SEQ ID NO:172)、(v)GGKLSKKKKGYSGG(SEQ ID NO:173)、(vi)GGKLSKKKKGSGGS(SEQ ID NO:174)、(vii)GGKLSKKKKSGGSG(SEQ ID NO:175)、(viii)GGKLSKKKSGGSGG(SEQ ID NO:176)、(ix)GGKLSKKSGGSGGS(SEQ ID NO:177)、(x)GGKLSKSGGSGGSV(SEQ ID NO:178)或(xi)GAKKSKKRFSFKKS(SEQ ID NO:179)。

在一些实施方案中，支架蛋白不包含在N端的Met。在一些实施方案中，支架蛋白包含在所述支架蛋白的N端处的豆蔻酰化的氨基酸残基。在一些实施方案中，支架蛋白的N端处的氨基酸残基是Gly。在一些实施方案中，支架蛋白的N端处的氨基酸残基是合成的。在一些实施方案中，支架蛋白的N端处的氨基酸残基是甘氨酸类似物。

在一些实施方案中，支架蛋白包含与SEQ ID NO:1(MARKS)、SEQ ID NO:2(MARCKSL1)或SEQ ID NO:3(BASP1)具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，生物活性分子在EV的内腔表面或内腔上。在一些实施方案中，支架蛋白还包含跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域在支架蛋白的ED结构域与生物活性分子之间。在一些实施方案中，支架蛋白还包含囊泡外结构域。在一些实施方案中，生物活性分子连接至囊泡外结构域。

在一些实施方案中，支架蛋白通过接头连接至生物活性分子。在一些实施方案中，ND结构域通过接头连接至ED结构域。在一些实施方案中，接头包含一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，接头包括可切割的接头。在一些实施方案中，接头包括柔性接头。

在其它实施方案中，生物活性分子包括蛋白质、多肽、肽、多核苷酸(DNA和/或RNA)、化合物、病毒、离子载体，离子载体的载剂、形成通道或孔的部分或其任意组合。在一些实施方案中，蛋白质包括重组肽、天然肽、合成肽、抗体、融合蛋白或其任意组合。在一些实施方案中，蛋白质包括酶、细胞因子、配体、受体、转录因子或其组合。在一些实施方案中，病毒包括腺相关病毒、细小病毒、逆转录病毒、腺病毒或其任意组合。

在其它实施方案中，EV还包含第二支架蛋白。在一些实施方案中，第二支架蛋白包括PTGFRN多肽、BSG多肽、IGSF2多肽、IGSF3多肽、IGSF8多肽、ITGB1多肽、ITGA4多肽、SLC3A2多肽、ATP转运蛋白多肽、氨基肽酶N(ANPEP)多肽、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(ENPP1)多肽、脑啡肽酶(neprilysin)(MME)多肽、神经纤毛蛋白-1(Neuropilin-1)(NRP1)多肽或其片段。在一些实施方案中，生物活性分子是负检查点调节剂的抑制剂或负检查点调节剂的结合配偶体的抑制剂。在一些实施方案中，负检查点调节剂选自由以下组成的组：细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)、含T细胞免疫球蛋白粘蛋白的蛋白3(TIM-3)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)、腺苷A2a受体(A2aR)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、CD20、CD39和CD73。在一些实施方案中，生物活性分子是免疫原性蛋白。

在其它实施方案中，生物活性分子是毒素、类毒素或毒素的无毒突变体。在一些实施方案中，毒素是白喉毒素。在一些实施方案中，类毒素是破伤风类毒素。在一些实施方案中，生物活性分子是白喉毒素的无毒突变体。

在一些实施方案中，生物活性分子是正共刺激分子的激活剂或正共刺激分子的结合配偶体的激活剂。在一些实施方案中，正共刺激分子是TNF受体超家族成员。在一些实施方案中，TNF受体超家族成员选自由以下组成的组：CD120a、CD120b、CD18、OX40、CD40、Fas受体、M68、CD27、CD30、4-1BB、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、TRAILR4、RANK、OCIF、TWEAK受体、TACI、BAFF受体、ATAR、CD271、CD269、AITR、TROY、CD358、TRAMP和XEDAR。在一些实施方案中，正共刺激分子的激活剂是TNF超家族成员。在一些实施方案中，TNF超家族成员选自由以下组成的组：TNFα、TNF-C、OX40L、CD40L、FasL、LIGHT、TL1A、CD27L、Siva、CD153、4-1BB配体、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、CAMLG、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITR配体和EDA-2。在一些实施方案中，正共刺激分子是CD28超家族共刺激分子。在一些实施方案中，CD28超家族共刺激分子是ICOS或CD28。在一些实施方案中，正共刺激分子的激活剂是ICOSL、CD80或CD86。

在其它实施方案中，细胞因子选自由以下组成的组：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12和IL-15。在一些实施方案中，所述蛋白质包括T细胞受体(TCR)、T细胞共受体、主要组织相容性复合物(MHC)、人白细胞抗原(HLA)或其衍生物。在一些实施方案中，所述蛋白质包括肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、粘蛋白1(MUC1)、Tn-MUC1、粘蛋白16(MUC16)、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(MAGE)、肿瘤蛋白p53(p53)、CD4、CD8、CD45、CD80、CD86、程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡配体2(PD-L2)、NY-ESO-1、PSMA、TAG-72、HER2、GD2、cMET、EGFR、间皮素、VEGFR、α-叶酸受体、CE7R、IL-3、癌-睾丸抗原、MART-1gp100和TNF相关凋亡诱导配体。

在其它实施方案中，EV是外来体。

在一些实施方案中，本公开涉及包含本公开的EV和药学上可接受的载剂的药物组合物。在一些实施方案中，本公开涉及产生本公开的EV的细胞。在一些实施例中，本公开涉及包括本公开的EV和使用说明书的试剂盒。

在其它实施方案中，本发明涉及制备EV的方法，所述方法包括在合适的条件下培养本公开的细胞并获得EV。在一些实施方案中，本公开涉及将生物活性分子锚定至细胞外囊泡的方法，其包括将生物活性分子连接至本文公开的支架蛋白。

在其它实施方案中，本公开涉及预防或治疗有需要的受试者的疾病的方法，其包括施用本公开的EV，其中所述疾病与抗原相关。在一些实施方案中，EV通过肠胃外、口服、静脉内、肌内、瘤内、鼻内、皮下或腹膜内施用。

实施方案

E1.包含支架蛋白的EV(例如，外来体)，其中所述支架蛋白的至少一部分由外源序列表达，并且所述支架蛋白包括MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修饰。

E2.实施方案E1的EV(例如，外来体)，其中所述支架蛋白以相较于不同的EV(例如，外来体)中的不同的支架蛋白更高的密度存在于所述EV(例如，外来体)中，其中所述不同的支架蛋白包括常规EV(例如，外来体)蛋白或其变体。

E3.实施方案E2的EV(例如，外来体)，其中所述常规EV(例如，外来体)蛋白选自由以下组成的组：CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚定蛋白、乳凝集素、LAMP2、LAMP2B及其片段。

E4.实施方案E1至E3中任一项的EV(例如，外来体)，其中所述EV(例如，外来体)由经遗传修饰以包含外源序列的细胞产生，任选地其中所述细胞是HEK293细胞。

E5.实施方案E1至E4的EV(例如，外来体)，其中所述细胞包含含有外源序列的质粒。

E6.实施方案E1至E5的EV(例如，外来体)，其中所述细胞包含插入细胞基因组中的外源序列。

E7.实施方案E1至E6的EV(例如，外来体)，其中所述外源序列被插入相对于编码MARCKS、MARCKSL1或BASP1的基因组序列位于3’或5’的基因组位点中。

E8.实施方案E1至E7的EV(例如，外来体)，其中所述外源序列被插入编码MARCKS、MARCKSL1或BASP1的基因组序列中。

E9.实施方案E1至E8中任一项所述的EV(例如，外来体)，其中所述支架蛋白是包含MARCKS、MARCKSL1或BASP1或其片段和治疗性肽的融合蛋白。

E10.实施方案E9的EV(例如，外来体)，其中所述治疗性肽选自由以下组成的组：天然肽、重组肽、合成肽或连接至治疗性化合物的接头。

E11.实施方案E9的EV(例如，外来体)，其中所述治疗性化合物选自由以下组成的组：核苷酸、氨基酸、脂质、碳水化合物和小分子。

E12.实施方案E9的EV(例如，外来体)，其中所述治疗性肽是抗体或其片段或修饰。

E13.实施方案E9的EV(例如，外来体)，其中所述治疗性肽是酶、配体、受体、转录因子或其片段或修饰。

E14.实施方案E9的EV(例如，外来体)，其中所述治疗性肽是抗微生物肽或其片段或修饰。

E15.实施方案E1至E14中任一项所述的EV(例如，外来体)，所述EV还包含第二支架蛋白，其中所述第二支架蛋白包括MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段。

E16.实施方案E1至E14中任一项所述的EV(例如，外来体)，所述EV还包含第二支架蛋白，其中所述第二支架蛋白包括PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段。

E17.实施方案E1至E16中任一项所述的EV(例如，外来体)，其中所述支架蛋白包含序列(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO:118)的肽，或不含N端(M)的相应序列。

E18.实施方案E1至E17中任一项所述的EV(例如，外来体)，其中所述支架蛋白包含序列(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)的肽或不含N端(M)的相应序列，其中每个括号里面的位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任意氨基酸，X是任意氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任意氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)。

E19.实施方案E1至E18中任一项所述的EV(例如，外来体)，其中所述支架蛋白包含序列(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)的肽或不含N端(M)的相应序列，其中每个括号里面的位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任意氨基酸，ξ是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)组成的组的任意氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任意氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)。

E20.实施方案E18或E19中任一项的EV(例如，外来体)，其中所述支架蛋白包含SEQID NO:4-110中任一个的肽，或不含N端M的任何相应序列。

E21.实施方案E18或E19中任一项所述的EV(例如，外来体)，其中所述支架蛋白包含MGXKLSKKK(SEQ ID NO:116)的肽，或不含N端M的相应序列，其中X是任意氨基酸。

E22.实施方案E20的EV(例如，外来体)，其中所述支架蛋白包含SEQ ID NO:110的肽，或不含N端M的相应序列。

E23.实施方案E20的EV(例如，外来体)，其中所述支架蛋白包含SEQ ID NO:13的肽或不含N端M的相应序列。

E24.实施方案E1至E24中任一项所述的EV(例如，外来体)，其中所述支架蛋白还包含有效载荷，例如，生物活性分子诸如肽。

E25.一种药物组合物，其包含实施方案E1至E24中任一项所述EV(例如，外来体)和赋形剂。

E26.实施方案E25的药物组合物，其基本上不含大分子，其中所述大分子选自核酸、外源蛋白质、脂质、碳水化合物、代谢物及其组合。

E27.一个细胞群，所述细胞群用于产生实施方案E1至E24中任一项所述的EV(例如，外来体)。

E28.实施方案E27的细胞群，其包含编码支架蛋白的外源序列，所述支架蛋白包括MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修饰。

E29.实施方案E28的细胞群，所述细胞群还包含编码第二支架蛋白的第二外源序列，其中所述第二支架蛋白包括MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修饰。

E30.实施方案E28的细胞群，所述细胞群还包含编码第二支架蛋白的第二外源序列，其中所述第二支架蛋白包括PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段。

E31.实施方案E27至E30中任一项所述的细胞群，其中将所述外源序列插入编码MARCKS、MARCKSL1或BASP1的基因组序列，其中所述外源序列和所述基因组序列编码支架蛋白。

E32.实施方案E27至E30中任一项所述的细胞群，其中所述外源序列在质粒中。

E33.实施方案E27至E32中任一项所述的细胞群，其中所述外源序列编码生物活性分子(例如，治疗性肽)。

E34.实施方案E33的细胞群，其中所述治疗性肽选自由以下组成的组：天然肽、重组肽、合成肽或连接至治疗性化合物的接头。

E35.实施方案E33的细胞群，其中所述治疗性化合物选自由以下组成的组：核苷酸、氨基酸、脂质、碳水化合物和小分子。

E36.实施方案E33的细胞群，其中所述治疗性肽是抗体或其片段或修饰。

E37.实施方案E33的细胞群，其中所述治疗性肽是酶、配体、受体、转录因子或其片段或修饰。

E38.实施方案E33的细胞群，其中所述治疗性肽是抗微生物肽或其片段或修饰。

E39.实施方案E28的细胞群，其中所述外源序列编码靶向部分。

E40.实施方案E39的细胞群，其中所述靶向部分对器官、组织或细胞是特异的。

E41.实施方案E29或E30的细胞群，其中所述第二支架蛋白还包含靶向部分。

E42.实施方案E41的细胞群，其中所述靶向部分对器官、组织或细胞是特异的。

E43.一种用于修饰EV(例如，外来体)的多肽，其包含以下序列：

(i)(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO:118)或不含N端(M)的相应序列；

(ii)(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)或不含N端(M)的相应序列，其中每个括号里面的位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任意氨基酸，X是任意氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任意氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)；或者

(iii)(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)或不含N端(M)的相应序列，其中每个括号里面的位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任意氨基酸，ξ是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)组成的组的任意氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任意氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)。

E44.实施方案E43的多肽，其包含SEQ ID NO:4-110中任一个的序列，或不含N端M的任何相应序列。

E45.实施方案E43的多肽，其包含SEQ ID NO:13的序列或不含N端M的相应序列。

E46.实施方案E43的多肽，其包含SEQ ID NO:110的序列或不含N端M的相应序列。

E47.实施方案E43的多肽，其包含序列MGXKLSKKK(SEQ ID NO:116)或不含N端M的相应序列，其中X是任意氨基酸。

E48.实施方案E43至E47中任一项所述的多肽，其中所述多肽与有效载荷(例如生物活性分子诸如肽)融合。

E49.实施方案E48的多肽，其中所述多肽与所述肽的N端融合。

E50.一种多核苷酸构建体，其包含编码实施方案E43至E49中任一项所述的多肽的编码序列。

E51.实施方案E50的多核苷酸构建体，其中所述编码序列被密码子优化。

E52.一种制备工程化EV(例如，外来体)的方法，所述方法包括以下步骤：

a.将编码融合多肽的核酸构建体引入细胞，所述核酸构建体包含(i)编码MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段或修饰的第一序列，和(ii)编码有效载荷，例如，生物活性分子诸如肽的第二序列；

b.将所述细胞维持在允许所述细胞表达所述融合多肽的条件下；以及，

c.从所述细胞获得包含所述融合多肽的工程化EV(例如，外来体)。

E53.实施方案E52的方法，其中所述第一序列包括以下序列：

(i)(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO:118)或不含N端(M)的相应序列；

(ii)(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)或不含N端(M)的相应序列，其中每个括号里面的位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任意氨基酸，X是任意氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任意氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)；或者

(iii)(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)或不含N端(M)的相应序列，其中每个括号里面的位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任意氨基酸，ξ是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)组成的组的任意氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任意氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)。

E54.实施方案E52或E53中任一项所述的方法，其中所述第一序列包含SEQ ID NO:4-110中的任一个，或不含N端M的任何相应序列。

E55.实施方案E54的方法，其中所述第一序列包含SEQ ID NO:13，或不含N端M的相应序列。

E56.实施方案E55的方法，其中所述第一序列包含SEQ ID NO:110，或不含N端M的相应序列。

E57.实施方案E53的方法，其中所这第一序列包含MGXKLSKKK(SEQ ID NO:116)或不含N端M的相应序列，其中X是任意氨基酸。

E58.实施方案E52至E57中任一项所述的方法，其中所述融合多肽以相较于不同的EV(例如，外来体)中的不同的支架蛋白更高的密度存在于工程化EV(例如，外来体)的内腔表面上，其中所述不同的支架蛋白包括常规EV，例如，外来体蛋白或其变体。

E59.实施方案E58的方法，其中所述融合多肽以是不同的EV(例如，外来体)中的不同的支架蛋白的超过2倍的密度存在。

E60.实施方案E59的方法，其中所述融合多肽以是不同的EV(例如，外来体)中的不同的支架蛋白的超过4倍、16倍、100倍或10,000倍的密度存在。

附图说明

附图仅出于说明的目的描绘了本公开的各个方面。本领域的技术人员将从以下论述中容易地认识到，在不脱离本文所述的本公开的原理的情况下，可以采用本文示出的结构和方法的替代方面。

图1A显示融合蛋白的序列(SEQ ID NO:135-142，分别按出现的顺序)，所述融合蛋白包含与

图2A显示了来自与

图2B显示了从稳定地表达图2A中的融合蛋白之一的细胞纯化的外来体的抗

图3显示了考

图4显示了BASP1的前28个氨基酸(保守区1)、MARCKS的氨基酸1-7和152-173(保守区2)和MARCKSL1的氨基酸1-7和87-110(保守区3)之间的蛋白质序列比对。

图5A显示了BASP1的氨基酸1-30("BASP1-30")(SEQ ID NO:4)和融合蛋白(按出现的顺序分别为SEQ ID NOS:146-149)的序列，所述融合蛋白包含与MARCKS的PSD结构域或其修饰融合的MARCKS的氨基酸1-3或其修饰("MARCKS-MG-PSD"、"MARCKS-MA-PSD"、"MARCKS-MG-PSD-K6S"和"MARCKS-MG-PSD-K6A")。引入MARCKS序列中的点突变以粗体显示。氨基酸位置，例如BASP1的aa 1-30或MARCKS的aa 1-3，是指最初由基因构建体编码的片段。在加工过程中切除了第一Met。

图5B显示了从稳定表达融合蛋白的细胞纯化的外来体的抗

图6显示了源自MARCKS、MARCKSL1和BASP1的功能研究的三个不同的共有序列(所有三个序列均由SEQ ID NO:118表示)，以及用于将有效载荷通过附接至内腔表面而装载到外来体的内腔中的序列中的每个序列的氨基酸需求。

图7A显示了天然外来体或从细胞中纯化的外来体以及递减量的重组Cas9的总蛋白质(上图)和抗Cas9蛋白质印迹(下图)，所述细胞稳定地表达与BASP1的氨基酸1-10或1-30融合的Cas9。氨基酸位置，例如，BASP的aa 1-10或BASP1的aa 1-30是指最初由基因构建体编码的片段。在加工过程中切除了第一Met。

图7B上图显示了源自图7A的蛋白质印迹结果的Cas9光密度测定法的标准曲线。下图还提供了基于标准曲线估计的每个纯化的外来体的装载的Cas9的量，所述Cas9为与BASP1的1-30个氨基酸或1-10个氨基酸的片段(加工(即，第一Met被切掉)后BASP1的2-30个氨基酸或2-10个氨基酸的片段)缀合的融合蛋白的形式。

图8A显示了从细胞纯化的外来体的蛋白质凝胶图像，所述细胞为用表达与卵清蛋白融合的BASP1 N端(氨基酸1-10)的构建体("BASP1(1-10)-OVA")稳定转染的细胞，或用两种构建体(一种表达与卵清蛋白融合的BASP1 N端(氨基酸1-10)，另一种表达与跨膜蛋白PTGFRN融合的CD40L("BASP1(1-10)-OVA；3XCD40L-PTGFRN"))稳定转染的细胞。图8A还显示了装载递减量的重组OVA的蛋白质凝胶的图像。氨基酸编号，例如，氨基酸1-10，是指最初由基因构建体编码的片段。在加工过程中切除了第一Met。

图8B显示了来自图8A的样品的抗卵清蛋白蛋白质印迹结果。

图8C显示了比较重组ova和与exoTOPE融合的ova的蛋白质印迹结果。图8D显示了如下外来体的图示，所述外来体包含(i)外来体的内腔侧中的连接至卵清蛋白的exoTOPE和(ii)外来体的内腔中的免疫刺激剂。

图9A显示了针对与BASP1的氨基酸1-10和

图9B显示从细胞中纯化的外来体的蛋白凝胶和抗

图10显示了外来体mRNA装载系统的示意图，其包含(i)与

图11A显示了外来体的蛋白质凝胶，所述外来体包含图10中描述的mRNA装载构建体(荧光素酶mRNA(811)与各种BASP1融合蛋白(815、817或819)的组合)。

图11B显示了图11A中的样品的抗

图12A显示了含有图10所示的mRNA装载构建体的细胞(顶部)或外来体(底部)中萤光素酶mRNA的量的RT-qPCR结果。

图12B显示了定量来自图12A中的样品的纯化的外来体中萤光素酶mRNA的量(包括来自萤光素酶mRNA的随机装载的富集倍数)的表。

图13显示了与MARCKS、MARCKSL1和BASP1的N端片段融合以允许锚定在外来体内腔表面的跨膜蛋白的外表面展示的CD40L三聚体的示意图。氨基酸编号，例如，MARCKS 1-30、MARCKSL1 1-30、BASP1 1-30、BASP1 1-10ExoTOPE，是指最初由基因构建体编码的片段。在加工过程中切除了第一Met。

图14A显示了在和与MARCKS、MARCKSL1和BASP1的N端片段融合的CD40L表面表达外来体一起孵育的培养物中小鼠B细胞活化的结果。

图14B显示了在和与MARCKS、MARCKSL1和BASP1的N端片段融合CD40L表面表达外来体一起孵育的培养物中的人B细胞活化的结果。

图14C显示了当与MARCKS、MARCKSL1、BASP1的N端序列或全长PTGFRN融合时，不同CD40L表面展示外来体的相对效力的图表。氨基酸编号，例如，BASP1 1-30是指最初由基因构建体编码的片段。在加工过程中切除了第一Met。

图15显示了从不同来源的各种细胞系(HEK293SF，肾脏；HT1080，结缔组织；K562，骨髓；MDA-MB-231，乳腺；Raji，淋巴母细胞；间充质干细胞(MSC)，骨髓)纯化的外来体中的内腔蛋白(MARCKS、MARCKSL1和BASP 1)和常规EV(例如，外来体)蛋白(CD81和CD9)的肽匹配图谱(PSM)的数量。

图16显示了单独的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞来源的外来体或来自过表达与

具体实施方式

本公开涉及细胞外囊泡(EV)(例如，外来体)，其包含至少一种通过支架蛋白与所述EV(例如，外来体)连接的生物活性分子，其中所述支架蛋白包含N端结构域(ND)和效应结构域(ED)，其中所述ND和/或所述ED与EV(例如，外来体)的内腔表面缔合，其中所述ED包含(i)ED中的赖氨酸重复序列或(ii)当与ND结合时赖氨酸重复序列，例如，ND中的C端处的K和ED中的N端的K，其中ND与ED直接连接，即，通过肽键连接。本公开还提供了能够将有效载荷(例如，生物活性分子)锚定至EV(例如，外来体)的内腔表面的最小数目的氨基酸，例如，7至15个、7至14个、7至13个、7至12个、7至11个、7至10个、7至9个或7至8个氨基酸的片段。ND可以通过豆蔻酰化作用与EV(例如，外来体)的内腔表面缔合，而ED可以通过离子相互作用，例如通过吸引性静电相互作用与EV(例如，外来体)的内腔表面缔合。在本公开中显示了各个方面的非限制性实例。

在更详细地描述本公开之前，应理解，本公开不限于所描述的特定组合物或过程步骤，并因此当然可以变化。本领域技术人员在阅读本公开时将显而易见的是，本文所描述且说明的各个个别方面具有离散的组分和特征，所述组分和特征可容易地与任何另外的若干方面的特征分离或组合而不偏离本公开的范围或精神。任何所陈述的方法均可以以所陈述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行。

本文提供的标题并非是对本公开的各个方面的限制，所述各个方面可通过参考说明书整体来限定。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定方面的目的，且不旨在是限制性的，因为本公开的范围将只由所附权利要求限制。

因此，通过参考说明书整体，以下紧接着定义的术语得到更充分定义。

I.定义

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术性和科学性术语具有本公开所属领域中的普通技术人员通常所理解的含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；The Dictionary of Celland Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；和Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology,修订板,2000,Oxford University Press，给普通技术人员提供本公开中使用的许多术语的通用字典。如本文中所用，以下术语具有下面赋予其的含义。

应注意术语“一个(种)(a/an)”实体是指一个(种)或多个(种)所述实体；例如“一个(种)核苷酸序列”应理解为表示一个(种)或多个(种)核苷酸序列。因此，术语“一个(种)”、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可互换使用。还应注意，权利要求可以被草拟为排除任何任选的元素。因此，对于与叙述权利要求要素结合使用的象“单独”、“只”等这样的排他性术语或所使用的“否定性”限制，这份说明书仅欲充当一个先行基础。

此外，当在本文中使用时，“和/或”应视为特定公开两个指定特征或组分中的每一者，伴有或不伴有另一者。因此，如本文在诸如“A和/或B”的短语中所用的术语“和/或”意图包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如诸如“A、B和/或C”的短语中所用的术语“和/或”意图涵盖以下方面中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

应了解，每当在本文中以措辞“包含”描述各个方面的情况下，还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的另外类似方面。

单位、前缀和符号以它们的国际单位制(SI)接受形式表示。

数值范围包括界定范围的数值。在列举值的范围的情况下，应理解的是，还具体公开了在该范围的所列举的上限与下限之间的每个居间整数值及其每个分数，以及在此类值之间的每个子范围。任何范围的上限和下限都可以独立地包括在该范围内或从该范围中排除，并且其中包括任一个限值、两个限值都不包括或包括两个限值的每个范围也涵盖于本公开中。

因此，本文所列举的范围应理解为该范围内的所有值的简写形式，包括所列举的端点。例如，1至50的范围应理解为包括选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50组成的组中的任何数字、数字的组合或子范围。

除非另有说明，否则提及具有一个或多个立体中心的化合物意欲指每种立体异构体及其立体异构体的所有组合。

在明确列举值的情况下，应当理解，与所述值大致相同数量或量的值也在本公开的范围内。在公开组合的情况下，还具体公开了该组合的元素的每个子组合，并且所述子组合在本公开的范围内。相反，在分别公开不同元素或元素组的情况下，也公开了其组合。在本公开的任何元素被公开为具有多个备选方案的情况下，在此还公开了其中每个备选方案被单独排除或与其它备选方案以任何组合被排除的该公开的实例；本公开的不止一个元素可以具有此类排除，并且由此公开了具有此类排除的元素的所有组合。

核苷酸可以由其普遍接受的单字母码表示。除非另外指示，否则核苷酸序列以5'至3'定向从左至右书写。核苷酸在本文中由其通常已知的由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。因此，A表示腺嘌呤，C表示胞嘧啶，G表示鸟嘌呤，T表示胸腺嘧啶，U表示尿嘧啶。

氨基酸序列以氨基至羧基定向从左至右书写。氨基酸可以在本文中由其通常已知的由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的三字母符号或单字母符号来表示。

术语“约”在本文中用于意指近似、大致、大约或在……左右。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过使边界延伸高于和低于阐述的数值来修饰那个范围。一般来说，术语“约”可通过向上或向下(升高或降低)变化例如10％来将数值修饰为高于和低于陈述值。

如本文中所使用，应用于一个或多个目标值的术语“约”是指与所陈述的参考值相似的值。在某些方面，除非另有说明或从上下文中可以明显看出(除非该数字将超过可能值的100％)，否则术语“约”是指落入陈述参考值的任一方向(大于或小于)上的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的范围内的值的范围。

术语“施用(administration)”、“施用(administering)”及其语法变型是指通过药学上可接受的途径将组合物，诸如本公开的EV(例如，外来体)引入受试者。将组合物，诸如本公开的EV(例如，外来体)引入受试者是通过任何合适的途径，包括瘤内、口服、经肺、鼻内、肠胃外(静脉内、动脉内、肌内、腹膜内或皮下)、直肠、淋巴内、鞘内、眼周或局部。施用包括自我施用和通过另外的人施用。合适的施用途径可使组合物或剂执行其预期功能。例如，如果合适的途径是静脉内，则通过将组合物或剂引入受试者的静脉内来施用所述组合物。

如本文中所用，术语“激动剂”是指与受体结合并激活受体以产生生物反应的分子。受体可被内源性或外源性激动剂激活。内源性激动剂的非限制性实例包括激素、神经递质和环二核苷酸。外源性激动剂的非限制性实例包括药物、小分子和环二核苷酸。激动剂可以是完全、部分或反向激动剂。

如本文中所用，术语“拮抗剂”是指与受体结合后阻断或减弱激动剂介导的反应而不是自身引发生物反应的分子。许多拮抗剂通过在受体上的结构确定的结合位点与内源性配体或底物竞争来实现其功效。拮抗剂的非限制性实例包括α阻滞剂、β阻滞剂和钙通道阻滞剂。拮抗剂可以是竞争性、非竞争性或反竞争性(uncompetitive)拮抗剂。

如本文中所用，术语“细胞外囊泡”或“EV”是指细胞来源的囊泡，其包含包围内部空间(内腔)的膜。细胞外囊泡包括直径小于其所源自的细胞的所有膜结合的囊泡。通常，细胞外囊泡的直径范围为20nm至1000nm，并且可包含在内部空间(即，内腔)中的、展示在细胞外囊泡的外表面或内腔表面上的和/或跨膜的各种有效载荷。有效载荷可包括例如，核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或其组合。例如但不限于，细胞外囊泡包括凋亡小体、细胞碎片、通过直接或间接操作(例如，通过连续挤压或用碱性溶液处理)从细胞衍生的囊泡、泡囊化的细胞器和由活细胞产生(例如，通过直接质膜出芽或晚期内体与质膜融合)的囊泡。细胞外囊泡可源自活的或死亡的生物体、外植的组织或器官和/或培养的细胞。在一些方面，EV包含本文公开的支架蛋白。

如本文所用，术语“外来体”是指细胞来源的小的(直径在20nm与300nm之间，更优选直径为40nm-200nm)细胞外囊泡(EV)，其包含包围内部空间(内腔)的膜，并且在一些方面，其例如通过直接质膜出芽或通过晚期内体与质膜的融合而由细胞(例如，生产者细胞)产生。外来体是一种细胞外囊泡(EV)。在一些方面，外来体包含脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包含有效载荷(例如，生物活性分子，诸如治疗剂)、接受者(例如，靶向部分)、多核苷酸(例如，核酸，RNA或DNA)、糖(例如，单糖、多糖或聚糖)或其它分子。外来体可源自生产者细胞，并基于其大小、密度、生化参数或其组合从生产者细胞分离而来。在一些方面，外来体包含本公开的支架蛋白。在一些方面，本公开的外来体由表达一种或多种转基因产物的细胞产生。

如本文中所用，术语“外来体内腔蛋白”是指支架蛋白，即附着或缔合于EV(例如，外来体)的内腔表面的蛋白质例如MARCKS、MARKSL1、BASP1或其任何功能片段、其任何变体，其任何衍生物或其任意组合，并且适合用作支架以将有效载荷(例如，生物活性分子(例如，治疗性蛋白))靶向到EV(例如，外来体)的内腔表面。

如本文中所用，术语“纳米囊泡”是指细胞来源的小的(直径在20nm至250nm之间，例如，直径为30nm-150nm)的泡囊，其包含包围内部空间的膜，并且通过直接或间接操作从细胞(例如，生产者细胞)产生，使得没有进行这种操作的生产者细胞不会产生纳米囊泡。使生产者细胞产生纳米囊泡的适当操作包括但不限于连续挤压、用碱性溶液处理、超声处理或其组合。在一些情况下，纳米囊泡的产生可导致生产者细胞的破坏。在一些方面，本文所述的纳米囊泡群基本上不含通过直接从质膜出芽或晚期内体与质膜融合的方式从生产者细胞衍生的囊泡。在一些方面，纳米囊泡包含脂质或脂肪酸和多肽，并且任选地包含有效载荷(例如，治疗剂)、接受者(例如，靶向部分)、多核苷酸(例如，核酸，RNA或DNA)、糖(例如，单糖、多糖或聚糖)或其它分子。一旦根据操作从生产者细胞衍生出纳米囊泡，就可以基于其大小、密度、生化参数或其组合从生产者细胞中分离出纳米囊泡。在一些方面，纳米囊泡可包含本文公开的支架蛋白。

如本文中所用，术语“内腔工程化的EV”是指这样的EV(例如，外来体)，所述EV(例如，外来体)的膜的内腔表面或内腔的组成被修饰，使得工程化的EV(例如，外来体)的内腔表面或内腔与修饰前的EV(例如，外来体)或天然存在的EV(例如，外来体)的内腔表面或内腔不同。

工程化可以直接在内腔中(即，EV内的空隙)或在EV(例如，外来体)的膜中，尤其是在EV的内腔表面中，从而使EV(例如，外来体)的内腔和/或内腔表面被改变。例如，膜的蛋白质、脂质、小分子、碳水化合物等的组成被修饰，从而使得EV(例如，外来体)的内腔表面被修饰。类似地，可以修饰内腔的内容物。可通过化学、物理或生物学方法改变组成，或通过由先前通过化学、物理或生物方法修饰的细胞产生来改变组成。具体地，可通过基因工程或通过由先前通过基因工程修饰的细胞产生来改变组成。在一些方面，内腔工程化的EV(例如，内腔工程化的外来体)包含外源蛋白质(即，EV(例如，外来体)天然不表达的蛋白质)或其片段或变体，所述外源蛋白质或其片段或片段可以暴露于EV(例如，外来体)的内腔表面或内腔，或者可以是暴露在EV(例如，外来体)的内层上的部分的锚定点(附着)。在其它方面，内腔工程化的EV(例如，内腔工程化的外来体)包含天然EV(例如，外来体)蛋白(例如，支架蛋白)或其片段或变体的较高表达，所述蛋白或其片段或变体可以暴露于在EV(例如，外来体)的内腔，或者可以是暴露在EV(例如，外来体)的内腔表面上的部分的锚定点(附着)。

如本文中所用，术语“表面工程化的EV”是指这样的EV，所述EV的外表面在其组成上被修饰，使得工程化的EV的外表面不同于修饰前的EV或天然存在的EV的外表面。

如本文中所用，术语“表面工程化的外来体”是指这样的外来体，所述外来体的外表面在其组成上被修饰，使得工程化的外来体的外表面不同于修饰前的外来体或天然存在的外来体的外表面。

术语“经修饰的”，当在本文所述的EV(例如，外来体)的上下文中使用时，是指改变和/或工程化EV(例如，外来体)和/或其生产者细胞，使得经修饰的EV(例如，外来体)和不同于天然存在的EV(例如，外来体)。在一些方面，本文描述的经修饰的EV(例如，外来体)包含与天然存在的EV(例如，外来体)的膜相比在蛋白质、脂质、小分子、碳水化合物等的组成上不同的膜。例如，所述膜包含更高密度或数量的天然EV(例如，外来体)蛋白并且/或者所述膜包含非天然存在于EV(例如，外来体)中的蛋白质。在某些方面，对膜的此类修饰改变了EV(例如，外来体(例如，本文所述的表面工程化的EV和外来体))的外表面。在某些方面，对膜的此类修饰改变了EV(例如，外来体(例如，本文所述的内腔工程化的EV和外来体))的内腔表面。

例如，内腔的蛋白质、脂质、小分子、碳水化合物等组成被修饰。可通过化学、物理或生物学方法改变组成，或通过由先前通过化学、物理或生物方法修饰的细胞产生来改变组成。具体地，可通过基因工程或通过由先前通过基因工程修饰的细胞产生来改变组成。

如本文中所用，术语蛋白质的“修饰”，例如，如在“经修饰的蛋白质”或“蛋白质修饰”或其语法变型中，是指与蛋白质的非突变氨基酸序列具有至少15％同一性的蛋白质。蛋白质的修饰包括蛋白质的片段或变体。蛋白质的修饰还包括对蛋白质的片段或变体的化学或物理修饰。在一些方面，经修饰的蛋白质保留了非修饰的蛋白质的至少一种生理功能。

如本文中所用，术语蛋白质(例如，本文公开的生物活性分子诸如治疗性蛋白或支架蛋白)的“片段”是指比天然存在的序列更短的蛋白质，例如与天然存在的蛋白质相比删除了N端和/或C端的蛋白质。

如本文中所用，术语“功能片段”是指保留蛋白质功能的蛋白质片段。因此，在一些方面，本文公开的支架蛋白诸如MARCKS、MARCKSL1或BASP1的功能片段保留了将生物活性分子锚定在EV(例如，外来体)的内腔表面上的能力。

在该意义上，片段是否是功能片段可以通过任何本领域已知的测定EV(例如，外来体)的蛋白质含量的方法来评估，所述方法包括蛋白质印迹、FACS分析以及片段与自发荧光蛋白(如例如GFP)的融合。在特定方面，MARCKS、MARCKSL1或BASP1的片段保留例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约100％的天然存在的MARCKS、MARCKSL1或BASP1将有效载荷(例如，生物活性分子)锚定在EV(例如，外来体)内腔表面或外表面上的能力。在特定方面，MARCKS、MARCKSL1、BASP1或MARCKS、MARCKSL1或BASP1的片段的变体的能力分别为MARCKS、MARCKSL1或BASP1将有效载荷(例如，生物活性分子)锚定在EV(例如，外来体)的内腔表面或外表面上的能力的至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约100％。该能力可以例如通过在实验部分描述的测定中的荧光标记的变体来评估。

如本文中所用，术语“衍生物”是指本公开的EV(例如，外来体)、组分(例如，蛋白质或脂质)、支架蛋白，或指有效载荷，例如，经化学或酶促修饰的生物活性分子(例如，多肽、多核苷酸、脂质、碳水化合物、抗体或其片段)。

如本文中所用，术语蛋白质的“变体”是指通过本领域已知的方法进行比较(例如，通过序列比对)时与另一种蛋白质共享某种结构(例如，氨基酸序列同一性)和功能同一性的蛋白质。例如，蛋白质的变体可包括另一蛋白质中的取代、插入、缺失、移码或重排。在一些方面，蛋白质的变体保留了非变体蛋白质的至少一种生理功能。

在一个特定的方面，变体是与全长、成熟的MARCKS、MARCKSL1、BASP1或者MARCKS、MARCKSL1或BASP1的片段具有至少70％同一性的变体蛋白。

在一些方面，MARCKS的变体或片段的变体与根据SEQ ID NO:1的MARCKS或其功能片段共享至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性，如，例如，通过使用Needleman-Wunsch算法进行配对比对所测定的。

在一些方面，MARCKSL1的变体或片段的变体与根据SEQ ID NO:2的MARCKSL1或其功能片段共享至少70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性，如，例如，通过使用Needleman-Wunsch算法进行配对比对所测定的。

在一些方面，BASP1的变体或片段的变体与根据SEQ ID NO:3的BASP1或其功能片段共享至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性，如，例如，通过使用Needleman-Wunsch算法进行配对比对所测定的。

在一些方面，支架蛋白(例如，MARCKS、MARCKSL1或BASP1)的变体、支架蛋白的功能片段或支架蛋白的功能片段的变体是衍生物。

在上述每种情况下，支架蛋白的变体或片段的变体(例如，MARCKS、MARCKSL1、BASP1或者MARCKS、MARCKSL1或BASP1的片段的变体)保留了将有效载荷(例如，生物活性分子)锚定在EV(例如，外来体)的内腔表面或外表面上的能力。

本文提供的任何蛋白质的引述涵盖该蛋白质的功能变体。术语蛋白质的“功能变体”是指保留将生物活性分子锚定在EV(例如，外来体)的内腔表面或外表面上的能力的蛋白质的变体。在特定方面，MARCKS、MARCKSL1、BASP1或MARCKS、MARCKSL1或BASP1的片段的功能变体的能力分别为MARCKS、MARCKSL1或BASP1将有效载荷(例如，生物活性分子)锚定在EV(例如，外来体)的内腔表面或外表面上的能力的至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。

天然存在的变体称为“等位基因变体”，并且是指占据生物体染色体上给定的基因座的基因的几种替代形式之一(Genes II,Lewin,B.，编辑，John Wiley&Sons,New York(1985))。这些等位基因变体可以在多核苷酸和/或多肽水平上变化，并且包括在本公开中。或者，可以通过诱变技术或通过直接合成来产生非天然存在的变体。

使用蛋白质工程和重组DNA技术的已知方法，可以产生变体来改善或改变多肽的特性。例如，可从分泌的蛋白质的N端或C端缺失一个或多个氨基酸，而基本不丧失生物功能。Ron等人，J.Biol.Chem.268:2984-2988(1993)(通过引用以其整体并入本文)报道了即使在缺失3个、8个或27个氨基末端氨基酸残基之后仍具有肝素结合活性的变体KGF蛋白。类似地，从干扰素γ的羧基末端缺失8-10个氨基酸残基后，该蛋白质表现最高十倍的活性。(Dobeli等人，J.Biotechnology 7:199-216(1988)，通过引用以其整体并入本文)。

此外，大量证据表明，变体通常保留与天然存在的蛋白质的生物活性相似的生物活性。例如，Gayle及同事(J.Biol.Chem 268:22105-22111(1993)，通过引用以其整体并入本文)对人细胞因子IL-1a进行了广泛的突变分析。他们利用随机诱变产生了超过3,500单独的IL-1a突变体，所述突变体在分子的整个长度上平均每个变体具有2.5个氨基酸变化。在每个可能的氨基酸位置检查到多个突变。研究人员发现“该分子的大部分可以被改变，而对[结合或生物活性]几乎没有影响”。(参见摘要)。实际上，在所检查的超过3,500个核苷酸序列中，只有23个独特的氨基酸序列产生活性与野生型显著不同的蛋白质。

如上所述，变体或衍生物包括例如经修饰的多肽。在一些方面，例如多肽、多核苷酸、脂质、糖蛋白的变体或衍生物是化学修饰和/或内源修饰的结果。在一些方面，变体或衍生物是体内修饰的结果。在一些方面，变体或衍生物是体外修饰的结果。在其它方面，变体或衍生物是生产者细胞中细胞内修饰的结果。

存在于变体和衍生物中的修饰包括，例如，乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附接、血红素部分的共价附接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附接、脂质或脂质衍生物的共价附接、磷脂酰肌醇的共价附接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化(Mei等人，Blood 116:270-79(2010)，其通过引用以其整体并入本文)、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯基化、外消旋化、硒酰化(selenoylation)、硫酸化、转运RNA介导的氨基酸至蛋白质的添加诸如精氨酰化和遍在蛋白化。

术语“氨基酸取代”是指用另一个氨基酸残基替换存在于亲本或参考序列(例如，野生型序列)中的氨基酸残基。可以例如通过化学肽合成或通过本领域已知的重组方法取代亲本或参考序列(例如，野生型多肽序列)中的氨基酸。因此，提及“位置X处的取代”是指在位置X处存在的氨基酸被替代氨基酸残基取代。在一些方面，可以根据图式AnY描述取代模式，其中A是对应于天然或最初存在于位置n处的氨基酸的单字母代码，并且Y是取代氨基酸残基。在其它方面，可根据图式An(YZ)描述取代模式，其中A是对应于取代天然或最初存在于位置n处的氨基酸的氨基酸残基的单字母代码，并且Y和Z是可替换A的替代性取代氨基酸残基。

如本文中所用，术语“抗体”涵盖无论是天然产生的还是部分或全部合成产生的免疫球蛋白及其片段。所述术语还涵盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源的结合结构域的任何蛋白质。“抗体”还包括包含来自免疫球蛋白基因或其片段的框架区的多肽，其特异性结合并识别抗原。术语抗体的使用意指包括完整抗体、多克隆、单克隆和重组抗体、其片段，并且还包括单链抗体、人源化抗体、鼠抗体、嵌合抗体、小鼠-人抗体、小鼠-灵长类动物抗体、灵长类动物-人单克隆抗体、抗独特型抗体、抗体片段，诸如，例如，scFv、(scFv)

术语“抗体-药物缀合物”和“ADC”可互换使用，并且是指例如与治疗剂(在本文中有时称为剂、药物或活性药物成分)或剂共价连接的抗体。在本公开的一些方面，有效载荷是包括抗体-药物缀合物在内的生物活性分子。

“保守的氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已被定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，如果多肽中的氨基酸被另一个来自相同侧链家族的氨基酸替代，则该取代被认为是保守的。在另一方面，氨基酸串可以被侧链家族成员的顺序和/或组成不同而结构上类似的串保守替代。

如本文中所用，术语“保守的”分别是指这样的多核苷酸序列或多肽序列的核苷酸或氨基酸残基，所述核苷酸或氨基酸残基是在被比较的两个或更多个序列的相同位置上未改变地存在的那些核苷酸或氨基酸残基。相对保守的核苷酸或氨基酸是与序列中其它地方出现的核苷酸或氨基酸相比，在更多相关序列中保守的核苷酸或氨基酸。

在一些方面，如果两个或更多个序列彼此具有100％同一性，则称它们为“完全保守的”或“相同的”。在一些方面，如果两个或更多个序列彼此具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性，则它们被认为是“高度保守的”。

在一些方面，如果两个或更多个序列彼此具有约70％同一性、约80％同一性、约90％同一性或约95％、约98％或约99％同一性，则它们被认为是“高度保守的”。在一些方面，如果两个或更多个序列彼此具有至少30％同一性、至少40％同一性、至少50％同一性、至少60％同一性、至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性，则它们被认为是“保守的”。在一些方面，如果两个或更多个序列彼此具有约30％同一性、约40％同一性、约50％同一性、至约60％同一性、约70％同一性、约80％同一性、约90％同一性、约95％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性，则它们被认为是“保守的”。序列的保守性可以应用于多核苷酸或多肽的全长，或者可以应用于其一部分、区域或特征。

如本文中所用，术语“同源性”是指聚合物分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。通常，术语“同源性”表示两个分子之间的进化关系。因此，两个同源的分子将具有共同的进化祖先。在本公开的上下文中，术语同源性涵盖同一性和相似性。

在一些方面，如果分子中至少25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％或99％的单体相同(完全相同的单体)或相似(保守取代)，则认为聚合物分子彼此“同源”。术语“同源的”必然是指至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。

在本公开的上下文中，在核酸水平上进行取代(即使当它们被称为氨基酸取代时)，即，通过用编码第二氨基酸的密码子取代编码第一氨基酸的密码子来进行用替代氨基酸残基取代氨基酸残基。

如本文中所用，术语“同一性”是指聚合物分子之间，例如，多肽分子或多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间的总体单体保守。没有任何其它限定词的术语“同一的”，例如，蛋白A与蛋白B同一，表示序列是100％同一(100％序列同一性)。将两个序列描述为例如“70％同一”，等同于将它们描述为具有例如“70％序列同一性”。

例如，可通过出于最佳比较目的比对(例如，可以在第一多肽序列和第二个多肽序列之一或两者中引入缺口以实现最佳比对，并且出于比较目的，可以忽略非同一的序列)两个序列来进行两个多肽序列的同一性百分比的计算。在某些方面，为了比较目的而比对的序列的长度为参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后比较相应氨基酸位置处的氨基酸。

当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸占据时，则所述分子在该位置处是同一的。两个序列之间的同一性百分比是在考虑需要被引入以获得两个序列的最优比对的缺口的数目和每个缺口的长度的情况下，由序列共享的相同位置的数目的函数。可使用数学算法来实现序列比较以及确定两个序列之间的同一性百分比。

用于比较的序列比对方法是本领域公知的。各种程序和比对算法描述于以下文献中：Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)；Needleman和Wunsch,J.Mol.Bio.48:443(1970)；Pearson和Lipman,Methods in Mol.Biol.24:307-31(1988)；Higgins和Sharp,Gene 73:15 237-44(1988)；Higgins和Sharp,CABIOS 5:151-3(1989)Corpet等人，Nuc.Acids Res.16:10881-90(1988)；Huang等人，Comp.Appl.BioSci.8:155-65(1992)；和Pearson等人，Meth.Mol.Biol.24:307-31(1994)。NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)[Altschul 20等人，J.Mol.Biol.215:403-10(1990)J可从包括美国国家生物信息中心(NBCl,Bethesda,Md.)和互联网上等多个来源获得，与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。可以在NIH(美国国立卫生研究院)的NCBI(国家生物技术信息中心)的官方网站上访问BLAST以及如何使用该程序确定序列身份的说明。

其它合适的程序为，例如，Needle、Stretcher、Water或Matcher，其为生物信息学程序的EMBOSS系列的一部分并且也可从欧洲生物信息学研究所(EBI)在www.ebi.ac.uk/Tools/psa获得。序列比对可以使用本领域已知的方法诸如MAFFT、Clustal(ClustalW、Clustal X或Clustal Omega)、MUSCLE等进行。

与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶向序列内的不同区域可各自具有其自身的序列同一性百分比。应注意，序列同一性百分比值四舍五入至最接近的十分之一。例如，80.11、80.12、80.13和80.14被舍到80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18和80.19被入到80.2。还要注意的是，长度值将始终是整数。

在某些实施方案中，第一氨基酸序列(或核苷酸序列)与第二序列氨基酸(或核苷酸序列)的同一性百分比(ID％)被计算成ID％＝100x(Y/Z)，其中Y为在第一序列与第二序列的比对(如通过目测或特殊的序列比对程序比对的)中被评分为相同匹配的氨基酸残基(或核碱基)数并且Z为第二序列中的残基总数。如果第一序列的长度长于第二序列，则第一序列与第二序列的同一性百分比将高于第二序列与第一序列的同一性百分比。

本领域技术人员将理解，用于计算序列同一性百分比而产生的序列比对不限于仅通过一级序列数据驱动的二进制序列-序列比较。还应当理解，可通过整合序列数据与来自异源诸如结构数据(例如，结晶蛋白结构)、功能数据(例如，突变的位置)或系统发育数据的数据来产生序列比对。整合异源数据以产生多重序列对比的合适程序是从www.tcoffee.org获得并且或者例如从EBI获得的T-Coffee。还应当理解，用于计算序列同一性百分比的最终比对可以自动或手动进行(curated)。

如本文中所用，术语“相似性”是指聚合物分子之间，例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。聚合物分子彼此相似性百分比的计算可以以与计算同一性百分比相同的方式进行，不同之处在于相似性百分比的计算考虑了本领域已知的保守取代。应当理解，相似性的百分比取决于所使用的比较标准，即，是否例如根据氨基酸的进化接近度、电荷、体积、柔性、极性、疏水性、芳香性、等电点、抗原性或其组合来比较氨基酸。

如本文中所用，术语“生产者细胞”是指用于产生EV(例如，外来体)的细胞。生产者细胞可以是体外培养的细胞或体内细胞。生产者细胞包括但不限于已知有效产生EV(例如，外来体)的细胞，例如，HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和间充质干细胞(MSC)、BJ人包皮成纤维细胞、fHDF成纤维细胞、

如本文中所用，术语“分离(isolate)”、“分离的(isolated)”和“分离(isolating)”或“纯化(purify)”，“纯化的(purified)”和“纯化(purifying)”以及“提取的(extracted)”和“提取(extracting)”及其语法变型可互换使用，并指已经历一个或多个纯化过程(例如，所需EV(例如，外来体)制剂的选择或富集)的所需EV(例如，外来体)的制剂状态(例如，多种已知或未知量和/或浓度)。在一些实施方案中，如本文中所用，分离或纯化是从包含生产者细胞的样品中去除，部分去除(例如，一部分)EV(例如，外来体)的过程。在一些实施方案中，分离的EV(例如，外来体)组合物没有可检测的不希望的活性，或者，不希望的活性的水平或量等于或低于可接受的水平或量。

在其它实施方案中，分离的EV(例如，外来体)组合物具有为或高于可接受的量和/或浓度的期望的EV(例如，外来体)的量和/或浓度。在其它方面，与从其获得组合物的起始材料(例如，生产者细胞制剂)相比，分离的EV(例如，外来体)组合物被富集。与起始材料相比，该富集可以是至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％、至少约99.99％、至少约99.999％、至少约99.9999％或大于约99.9999％。

在一些方面，分离的EV(例如，外来体)制剂基本上不含残留的生物产物(例如，污染物)。在一些方面，分离的EV(例如，外来体)制剂约100％不含、至少约99％不含、至少约98％不含、至少约97％不含、至少约96％不含、至少约95％不含、至少约94％不含、至少约93％不含、至少约92％不含、至少约91％不含或至少约90％不含任何污染性生物物质。残留的生物产物可包括非生物材料(包括化学品)或不想要的核酸、蛋白质、脂质或代谢产物。在某些方面，分离的EV(例如，外来体)制剂约100％不含、至少约99％不含、至少约98％不含、至少约97％不含、至少约96％不含、至少约95％不含、至少约94％不含、至少约93％不含、至少约92％不含、至少约91％不含或至少约90％不含任何大分子，例如，不含任何核酸、蛋白质、脂质和/或碳水化合物。基本上不含残留的生物产物也可以意指EV(例如，外来体)组合物不包含可检测的生产者细胞，并且仅EV(例如，外来体)是可检测的。

术语“赋形剂”或“载剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进化合物施用的惰性物质。术语“药学上可接受的载剂”、“药学上可接受的赋形剂”及其语法变型涵盖经美国联邦政府监管机构批准或在《美国药典》中列出的用于动物(包括人)的任何剂，以及不会对受试者造成明显刺激并且不会消除所施用化合物的生物学活性和特性的任何载体或稀释剂。包括可用于制备药物组合物且通常是安全、无毒和需要的赋形剂和载剂。

如本文中所用，术语“有效载荷”是指可以附接至本公开的支架并随后锚定至本公开的EV(例如，外来体)的膜的任何分子。在一些实施例中，有效载荷附接至EV(例如，外来体)膜的内腔表面。术语有效载荷涵盖生物活性分子，例如可具有治疗和/或预防作用的分子以及诊断分子。因此，术语有效载荷还涵盖可检测部分，诸如放射性核素、荧光分子、造影剂、标签或可被可检测部分(例如，配体或标签)识别的分子实体。

如本文中所用，术语有效载荷等同于术语“货物(cargo)”并且可以与术语“货物”互换。因此，“货物蛋白质”或“货物肽”是指附接于本公开的支架的特定类型的有效载荷分子(分别为蛋白质和肽)。

如本文中所用，术语“生物活性分子”是指可以通过本公开的支架附接至EV(例如，外来体)的任何分子，其中该分子可以在有需要的受试者中具有治疗或预防作用，或影响受试者中的细胞或组织的动态平衡。可引入到EV(例如，外来体)和/或生产者细胞中的生物活性分子的非限制性实例包括例如治疗剂，诸如核苷酸(例如，包含可检测部分或毒素或破坏转录的核苷酸)、核酸(例如，编码多肽(诸如酶)的DNA或mRNA分子或具有调节功能的RNA分子(诸如miRNA、dsDNA、lncRNA和siRNA))、氨基酸(例如，含有可检测部分或毒素的氨基酸或破坏翻译的氨基酸)、多肽(例如，酶或抗体)、脂质、碳水化合物、病毒和病毒颗粒(例如，腺相关病毒和病毒颗粒、逆转录病毒、腺病毒等)和小分子(例如，小分子药物和毒素)，包括小分子STING激动剂，包括环二核苷酸诸如ML-RR S2和3'-3’cAIMPdFSH)。在某些方面，有效载荷包括抗原。在某些方面，当与本文公开的支架蛋白融合时，生物学活性分子，例如治疗剂(例如，人的治疗剂)保留生物功能，例如治疗功能。在一些方面，生物活性分子可具有至少5个氨基酸、至少6个氨基酸、至少7个氨基酸、至少8个氨基酸、至少9个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸、至少40个氨基酸、至少45个氨基酸、至少50个氨基酸、至少55个氨基酸、至少60个氨基酸、至少65个氨基酸、至少70个氨基酸、至少75个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸、至少300个氨基酸、至少350个氨基酸、至少400个氨基酸或至少500个氨基酸。在一些方面，生物活性分子可具有至少5个氨基酸。在一些方面，生物活性分子可具有至少10个氨基酸。在一些方面，生物活性分子可具有至少50个氨基酸。在一些方面，生物活性分子可具有至少100个氨基酸。在一些方面，生物活性分子可具有至少5个氨基酸，例如5-500个、5-450个、5-400个、5-350个、5-300个、5-250个、5-200个、5-150个、5-100个、5-90个、5-80个、5-70个、5-60个、5-50个、5-40个、5-30个、5-20个、5-15个或5-10个氨基酸。在一些方面，生物活性分子可具有至少10个氨基酸，例如10-500个、10-450个、10-400个、10-350个、10-300个、10-250个、10-200个、10-150个、10-100个、10-90个、10-80个、10-70个、10-60个、10-50个、10-40个、10-30个、10-20个或10-15个氨基酸。在一些方面，生物活性分子可具有至少50个氨基酸，例如，50-500个、50-450个、50-400个、50-350个、50-300个、50-250个、50-200个、50-150个、50-100个、50-90个、50-80个、50-50个或50-60个氨基酸。在一些方面，生物活性分子可具有至少100个氨基酸，例如100-500个、100-450个、100-400个、100-350个、100-300个、100-250个、100-200个或100-150个氨基酸。在其它方面，生物活性分子具有至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少11个、至少12个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个、至少160个、至少170个、至少180个、至少190个、至少200个、至少300个、至少400个或至少500个核苷酸。在其它方面，生物活性分子具有至少两个核苷酸，例如2-1000个、2-900个、2-500个、2-300个或2-50个核苷酸。在其它方面，生物活性分子具有至少10核苷酸，例如10-1000个、10-900个、10-500个、10-300个或10-50个核苷酸。在其它方面，生物活性分子具有至少15核苷酸，例如15-1000个、15-900个、15-500个、15-300个或15-50个核苷酸。在其它方面，生物活性分子具有至少20核苷酸，例如20-1000个、20-900个、20-500个、20-300个或20-50个核苷酸。在其它方面，生物活性分子具有至少50核苷酸，例如50-1000个、50-900个、50-500个、50-300个或50-100个核苷酸。在其它方面，生物活性分子具有至少100核苷酸，例如100-10000个、100-9000个、100-5005个、100-3000个或100-500个核苷酸。在其它方面，生物活性分子具有至少200核苷酸，例如200-10000个、200-9000个、200-5000个、200-3000个或200-500个核苷酸。在其它方面，生物活性分子具有至少500个核苷酸，例如500-10000个、500-9000个、500-5000个或500-3000个核苷酸。如本文中所用，术语“抗原”是指当引入受试者时引发对其自身的免疫反应(细胞的或体液的)的任何剂。在一些方面，有效载荷分子共价连接至EV(例如，外来体)。在其它方面，有效载荷包括佐剂。

“重组”多肽或蛋白质是指通过重组DNA技术产生的多肽或蛋白质。为了本公开的目的而分离的在工程化宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是已通过任何合适的技术被分离、分级分离或部分或基本上被纯化的天然或重组多肽。可以使用本领域已知的方法重组产生本文公开的多肽。或者，可以化学合成本文公开的蛋白质和肽。在本公开的一些方面，存在于EV(例如，外来体)中的支架蛋白是通过在生产者细胞中过表达支架蛋白而重组产生的，所述支架蛋白的过表达使得相对于不过表达此类支架蛋白的生产者细胞的EV(例如，外来体)中存在的支架蛋白的水平，所得EV(例如，外体)中支架蛋白的水平显著升高加。

如本文中所用，术语通过支架蛋白将生物活性分子“锚定(anchor)”或“锚定(anchoring)”在本公开的EV(例如，外来体)的内腔表面或外表面上是指将所述生物活性分子分别共价附接至位于EV(例如，外来体)的内腔表面或外表面上的支架分子的部分。

术语“缔合的”、“缔合”及其语法变型可互换使用，并且是指第一部分(例如，第一氨基酸序列或核苷酸序列)分别共价或非共价地连接至第二部分(例如，第二氨基酸序列或核苷酸序列)。所述第一部分可以直接连接或并列于所述第二部分，或者，可选地居间部分可将所述第一部分共价连接至所述第二部分。在一些实施方案中，术语“缔合的”包括豆蔻酰化、离子相互作用或其任意组合。

如本文中所用，术语“连接的”或“融合的”是指第一部分通过肽键或通过一个或多个氨基酸的接头在C端或N端与第二部分的融合。术语“连接的”或“融合的”还包括将整个第一部分(或第二部分)分别插入到例如第二部分(或第一部分)中的任意两点(例如，氨基酸)之间。一方面，第一部分通过肽键或接头与第二部分连接。第一部分可以通过磷酸二酯键或接头与第二部分连接。接头可以是肽或多肽(对于多肽链)或者核苷酸或核苷酸链(对于核苷酸链)或任何化学部分(对于多肽或多核苷酸链或任何化学分子)。术语“连接的”也可以用连字符(-)表示。在一些方面，EV(例如，外来体)上的支架蛋白可与有效载何(例如，生物活性分子)连接或融合。

如本文中所用，“哺乳动物受试者”包括所有哺乳动物，包括但不限于人、家畜(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，牛、绵羊、猪、马等)和实验室动物(例如，猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。

术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”及其变型在本文中可互换使用并且是指希望对其进行诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，特别是人。本文描述的方法适用于人疗法和兽医应用。在一些方面，受试者是哺乳动物，在其它方面，受试者是人。

如本文中所用，术语“基本上不含”意指按质量/体积(m/v)的百分比浓度，包含EV(例如，外来体)的样品包含少于10％的大分子(例如，污染物)。一些级分可包含小于约0.001％、小于约0.01％、小于约0.05％、小于约0.1％、小于约0.2％、小于约0.3％、小于约0.4％、小于约0.5％、小于约0.6％、小于约0.7％、小于约0.8％、小于约0.9％、小于约1％、小于约2％、小于约3％、小于约4％、小于约5％、小于约6％、小于约7％、小于约8％、小于约9％或小于约10％(m/v)的大分子。

如本文中所用，术语“大分子”意指核酸、外源蛋白质、脂质、碳水化合物、代谢物(例如，聚合代谢物)或其组合。

如本文中所用，术语“常规EV蛋白”是指先前已知在EV中富集的蛋白质。

如本文中所用，术语“常规EV(例如，外来体)蛋白”意指先前已知在外来体中富集的蛋白，包括但不限于CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚定蛋白、乳凝集素LAMP2和LAMP2B、其片段或与其结合的肽。为免生疑问，PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体不是常规EV(例如，外来体)蛋白。

如本文中所用，术语“药物组合物”是指与一种或多种其它化学组分(诸如药学上可接受的载剂和赋形剂)混合或掺混或悬浮于其中的本文所述的一种或多种化合物，诸如，例如，EV，诸如本公开的外来体。药物组合物的一个目的是促进将EV(例如，外来体)的制剂施用于受试者。

如本文中所用，术语“多核苷酸”是指具有任何长度的核苷酸(包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物或其混合物)的聚合物。所述术语是指分子的一级结构。因此，所述术语包括三链，双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)，以及三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。其还包括多核苷酸的经修饰(例如通过烷基化和/或通过加帽)和未修饰的形式。更特别地，术语“多核苷酸”包括聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括tRNA、rRNA、hRNA、siRNA和mRNA(无论是剪接的还是未剪接的)、为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷或C-糖苷的任何其它类型的多核苷酸，以及含有非核苷酸主链的其它聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸“PNA”)和多吗啉代聚合物，以及其它合成的序列特异性核酸聚合物，前提是所述聚合物包含以允许碱基配对和碱基堆积的构型存在的核碱基，诸如存在于DNA和RNA中的碱基。在特定方面，多核苷酸包括mRNA。在其它方面，mRNA是合成mRNA。在一些方面，合成mRNA包含至少一种非天然核碱基。在一些方面，某一类的所有核苷碱基已被非天然核苷碱基替代(例如，本文公开的多核苷酸中的所有尿苷均可被非天然核苷碱基(例如，5-甲氧基尿苷)替代)。在本公开的一些方面，生物活性分子是多核苷酸。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指具有任何长度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可包含经修饰的氨基酸。这些术语还涵盖已被天然修饰或通过介入修饰的氨基酸的聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰(诸如与标记组分缀合)。所述定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括，例如，非天然氨基酸，诸如高半胱氨酸、鸟氨酸、对乙酰基苯丙氨酸、D-氨基酸和肌氨酸)以及本领域已知的其它修饰的多肽。在本公开的一些方面，附接至EV(例如，外来体)的有效载荷例如生物活性分子是多肽，例如抗体或其衍生物，诸如ADC、PROTAC、毒素、融合蛋白或酶。

如本文中所用，术语“多肽”是指具有任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同系物、直向同源物、旁系同源物、前述物质的片段和其它等同物、变体和类似物。多肽可以是单个多肽，也可以是多分子复合物，诸如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可包含单链或多链多肽。最常见地，二硫键联存在于多链多肽中。术语多肽还可以应用于氨基酸聚合物，在所述氨基酸聚合物中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。在一些方面，“肽”的长度可以少于或等于50个氨基酸，例如，长度为约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个氨基酸。在一些方面，“肽”的长度可为至少约2至约50个、至少约3至约50个、至少约4至约50个、至少约5至约50个、至少约10至约50个、至少约15至约50个、至少约20至约50个、至少约25至约50个、至少约30至约50个、至少约35至约50个、至少约40至约50个或至少约45至约50个氨基酸。

如本文中所用，术语“本公开的支架蛋白”或语法变型是指

(i)位于EV(例如，外来体)内腔表面的蛋白质(天然表达的、化学或酶促合成的或重组产生的)诸如MARCKS、MARKSL1或BASP1；

(ii)(i)的任何功能片段；

(iii)(i)-(ii)的任何功能性变体；

(iv)(i)-(iii)的任何衍生物；

(v)与源自(i)中的蛋白质的结构域或其组合相对应的任何肽或包含所述肽的分子，所述肽可与EV(例如，外来体)的内腔表面结合；

(vi)源自来源于(i)中蛋白质的基序的任何肽或包含所述肽的分子，所述肽可与EV(例如，外来体)的内腔表面结合；

(vii)(i)至(vi)的分子，其包含至少一种非天然氨基酸；

(viii)或其任意组合，

其适合用作支架以将有效载荷(例如，生物活性分子(例如，治疗性蛋白))靶向(附接)至EV(例如，外来体)的内腔表面。

如本文中所用，术语“本公开的EV(例如，外来体)”或语法变型是指包含至少一种本公开的支架蛋白的EV(例如，外来体)。

如本文中所用，术语“本公开的生产者细胞”或语法变型是指可以产生本公开的EV(例如，外来体)的细胞。

II.细胞外囊泡蛋白，例如，外来体蛋白

本公开的一些方面涉及EV(例如，外来体)蛋白(支架蛋白)的鉴定、用途和修饰，所述EV蛋白在EV(例如，外来体)内腔表面中高度富集。可通过使用质谱或本领域已知的其它方法分析高度纯化的EV(例如，外来体)来鉴定出此类EV蛋白或外来体蛋白(支架蛋白)。

本公开的支架蛋白包括富集在EV(例如，外来体)膜上的各种内腔蛋白或膜蛋白，诸如跨膜蛋白(即，通过一个或多个跨膜螺旋跨越EV膜的蛋白)、整合蛋白和外周蛋白(即，在内腔表面上通过静电相互作用和/或锚定部分与表面相互作用的蛋白)。具体地，本公开的支架蛋白包括但不限于，

(1)富含豆蔻酰化的丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS)；

(2)富含豆蔻酰化的丙氨酸的蛋白激酶C底物样蛋白1(MARCKSL1)；和

(3)脑酸可溶性蛋白1(BASP1)。

可以根据生产者细胞、生产条件、纯化方法或外来体的预期应用来选择性地使用本文鉴定的一种或多种EV(例如，外来体)蛋白(支架蛋白)。

具有特定大小范围、靶向部分、电荷密度、有效载荷等的富集在某些EV(例如，外来体)的内腔中(例如，在EV膜的内腔表面上)的EV(例如，外来体)蛋白，可被鉴定并用于本公开的某些方面。

在一些方面，可以同时使用不止一种本文公开的EV(例如，外来体)蛋白(例如，支架蛋白，诸如MARCKS、MARKSL1、BASP1、其任何功能片段、变体或衍生物，或其任意组合)，或者可将其随后用于产生或分离本公开的治疗性EV(例如，外来体)。

III.内腔工程化的EV(例如，外来体)

细胞外囊泡(EV)，例如，外来体，直径通常为20nm至1000nm。外来体是小的细胞外囊泡，直径通常为100-200nm。EV(例如，外来体)由限制性脂质双层和不同组的蛋白质和核酸组成(Maas,S.L.N.等人，Trends.Cell Biol.27(3):172-188(2017))。EV(例如，外来体)在离散的细胞类型和组织中表现出优先摄取，并且它们的向性可通过向其表面添加与靶细胞表面上的受体相互作用的蛋白质来进行指导(Alvarez-Erviti,L.,等人，Nat.Biotechnol.29(4):341-345(2011))。

与抗体不同，EV(例如，外来体)可以容纳大量附接至其表面的分子，每EV(例如，外来体)约数千至数万个分子。因此，包含EV(例如，外来体)和有效载荷(例如，生物活性分子(例如，治疗分子))的缀合物或复合物代表了这样的平台，所述平台将高浓度的治疗性或诊断性化合物递送至离散的细胞类型，同时限制对该化合物的整体全身性暴露，这又降低了脱靶毒性。此外，EV(例如，外来体)提供了在不同隔室中容纳多种有效载荷(例如，生物活性分子)的可能性。例如，EV(例如，外来体)可包含例如靶向部分(所述靶向部分附接至EV的外表面，其将EV引导至某一靶细胞(例如，癌细胞)或靶组织(例如，肝或脑))、一种或多种治疗性部分(例如，药物)和/或一种或多种可检测的部分(例如，造影剂或放射性核素)。

EV(例如，外来体)还可包含不同的有效载荷，例如，附接至EV的内腔表面的治疗性部分(例如，药物)和/或可检测部分(例如，造影剂或放射性核素)。此外，EV(例如，外来体)还可在EV(例如，外来体)的内腔中包含一种或多种有效载荷，例如，生物活性分子(例如，治疗剂剂、诊断试剂、佐剂等)。

因此，EV(例如，外来体)提供了递送形式，所述递送形式将多种具有相同或不同作用的有效载荷(例如，生物活性分子)以极高的密度组合在单个递送媒介物中。

本文所述的EV(例如，外来体)是直径为约20nm至300nm的细胞外囊泡。在某些实施方案中，本公开的EV(例如，外来体)的直径约为20nm至290nm、20nm至280nm、20nm至270nm、20nm至260nm、20nm至250nm、20nm至240nm、20nm至230nm、20nm至220nm、20nm至210nm、20nm至200nm、20nm至190nm、20nm至180nm、20nm至170nm、20nm至160nm、20nm至150nm、20nm至140nm、20nm至130nm、20nm至120nm、20nm至110nm、20nm至100nm、20nm至90nm、20nm至80nm、20nm至70nm、20nm至60nm、20nm至50nm、20nm至40nm、20nm至30nm、30nm至300nm、30nm至290nm、30nm至280nm、30nm至270nm、30nm至260nm、30nm至250nm、30nm至240nm、30nm至230nm、30nm至220nm、30nm至210nm、30nm至200nm、30nm至190nm、30nm至180nm、30nm至170nm、30nm至160nm、30nm至150nm、30nm至140nm、30nm至130nm、30nm至120nm、30nm至110nm、30nm至100nm、30nm至90nm、30nm至80nm、30nm至70nm、30nm至60nm、30nm至50nm、30nm至40nm、40nm至300nm、40nm至290nm、40nm至280nm、40nm至270nm、40nm至260nm、40nm至250nm、40nm至240nm、40nm至230nm、40nm至220nm、40nm至210nm、40nm至200nm、40nm至190nm、40nm至180nm、40nm至170nm、40nm至160nm、40nm至150nm、40nm至140nm、40nm至130nm、40nm至120nm、40nm至110nm、40nm至100nm、40nm至90nm、40nm至80nm、40nm至70nm、40nm至60nm、40nm至50nm、50nm至300nm、50nm至290nm、50nm至280nm、50nm至270nm、50nm至260nm、50nm至250nm、50nm至240nm、50nm至230nm、50nm至220nm、50nm至210nm、50nm至200nm、50nm至190nm、50nm至180nm、50nm至170nm、50nm至160nm、50nm至150nm、50nm至140nm、50nm至130nm、50nm至120nm、50nm至110nm、50nm至100nm、50nm至90nm、50nm至80nm、50nm至70nm、50nm至60nm、60nm至300nm、60nm至290nm、60nm至280nm、60nm至270nm、60nm至260nm、60nm至250nm、60nm至240nm、60nm至230nm、60nm至220nm、60nm至210nm、60nm至200nm、60nm至190nm、60nm至180nm、60nm至170nm、60nm至160nm、60nm至150nm、60nm至140nm、60nm至130nm、60nm至120nm、60nm至110nm、60nm至100nm、60nm至90nm、60nm至80nm、60nm至70nm、70nm至300nm、70nm至290nm、70nm至280nm、70nm至270nm、70nm至260nm、70nm至250nm、70nm至240nm、70nm至230nm、70nm至220nm、70nm至210nm、70nm至200nm、70nm至190nm、70nm至180nm、70nm至170nm、70nm至160nm、70nm至150nm、70nm至140nm、70nm至130nm、70nm至120nm、70nm至110nm、70nm至100nm、70nm至90nm、70nm至80nm、80nm至300nm、80nm至290nm、80nm至280nm、80nm至270nm、80nm至260nm、80nm至250nm、80nm至240nm、80nm至230nm、80nm至220nm、80nm至210nm、80nm至200nm、80nm至190nm、80nm至180nm、80nm至170nm、80nm至160nm、80nm至150nm、80nm至140nm、80nm至130nm、80nm至120nm、80nm至110nm、80nm至100nm、80nm至90nm、90nm至300nm、90nm至290nm、90nm至280nm、90nm至270nm、90nm至260nm、90nm至250nm、90nm至240nm、90nm至230nm、90nm至220nm、90nm至210nm、90nm至200nm、90nm至190nm、90nm至180nm、90nm至170nm、90nm至160nm、90nm至150nm、90nm至140nm、90nm至130nm、90nm至120nm、90nm至110nm、90nm至100nm、100nm至300nm、110nm至290nm、120nm至280nm、130nm至270nm、140nm至260nm、150nm至250nm、160nm至240nm、170nm至230nm、180nm至220nm或190nm至210nm。本文所述的EV(例如，外来体)的尺寸可以根据下文所述的方法来测量。

在一些方面，本公开的EV(例如，外来体)包含双脂质膜(“EV(例如，外来体)膜”)，其包括内表面和外表面。在某些实施方案中，内表面面对EV(例如，外来体)的内核(即，内腔)。在某些方面，外表面可以与生产者细胞或靶细胞的内体、多囊体或膜/细胞质接触。

在一些方面，EV(例如，外来体)膜包含脂质和脂肪酸。在一些方面，EV(例如，外来体)膜包含磷脂、糖脂、脂肪酸、鞘脂、甘油磷酯、固醇、胆固醇和磷脂酰丝氨酸。

在一些方面，EV(例如，外来体)膜包含内部小叶和外部小叶。内部小叶和外部小叶的组成可通过本领域已知的跨双层分布测定法(transbilayer distribution assay)来确定，参见，例如Kuypers等人，Biohim Biophys Acta 1985 819:170。在一些方面，外部小叶的组成为约70-90％的胆碱磷脂，约0-15％的酸性磷脂和约5-30％的磷脂酰乙醇胺。在一些方面，外部小叶的组成为约15-40％的胆碱磷脂，约10-50％的酸性磷脂和约30-60％的磷脂酰乙醇胺。

一方面，本公开涉及内腔工程化的EV(例如，外来体)的产生和用途。内腔工程化的外来体具有在其组成上经修饰的，例如相对于自然界中存在的外来体的组成经修饰的内部空间(EV的内腔表面)。例如，可通过改变EV(例如，外来体)膜的内腔侧的组分的蛋白质、脂质或聚糖含量来修饰内腔表面的组成。在一些方面，EV(例如，外来体)的内腔表面可包含对于EV(例如，外来体)不是天然的一种或多种重组表达的蛋白质，例如，本公开的支架蛋白，例如，外来体内腔蛋白。因此，本公开提供了允许将有效载荷(例如，生物活性分子)锚定至EV(例如，外来体)的组合物，所述锚定包括将所述有效载荷(例如，生物活性分子)连接至本公开的支架蛋白(例如，外来体内腔蛋白)。本公开还提供了将有效载荷(例如，生物活性分子)锚定至EV(例如，外来体)的方法，其包括将生物活性分子连接至本公开的支架蛋白(例如，外来体内腔蛋白)。

在一些方面，将本公开的支架蛋白(例如，外来体内腔蛋白)通过脂化附接至EV(例如，外来体)的内腔表面。在一些方面，本公开的支架蛋白被脂肪酰化。在一些方面，支架蛋白被豆蔻酰化。

豆蔻酰化是其中衍生自豆蔻酸的豆蔻酰基通过酰胺键共价附接至N端甘氨酸的α-氨基的脂化修饰。豆蔻酸是14-碳饱和脂肪酸(14:4)，系统名称为正十四烷酸。可在翻译的同时或翻译后添加该修饰。在豆蔻酰基的翻译同时添加过程中，在新形成的、正在生长的多肽中的N端甲硫氨酸残基被切割后，N端甘氨酸被修饰。这发生在约80％的豆蔻酰化的蛋白质中。翻译后豆蔻酰化通常发生在半胱天冬酶切割事件之后，导致内部甘氨酸残基暴露，这然后可用于豆蔻酸的添加。除了翻译同时或翻译后豆蔻酰化(在体内或体外，例如，通过酶进行)之外，本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白的豆蔻酰化也可通过化学合成(例如，通过在化学合成过程中作为合成步骤将豆蔻酸附加至支架蛋白上)发生。

在一些实施方案中，脂质锚定至生物膜不是棕榈酰化(即，棕榈酸通常至半胱氨酸的附接，并且较低频率至丝氨酸或苏氨酸的附接)。在其它实施方案中，脂质锚定至生物膜是异戊烯基化(异戊二烯基的附接)或糖基磷脂酰肌醇连接(GPI连接)。异戊烯基化的蛋白质是在蛋白质的半胱氨酸残基处具有共价附接的疏水异戊二烯聚合物(即，支链五碳烃)的蛋白质。GPI连接的蛋白质通过与蛋白质的C端羧基基团的酰胺键联附接至GPI复合物分子的基团。GPI附接通过GPI-转酰胺酶复合物的作用而发生。磷脂酰肌醇的脂肪酸链插入膜中，因此是将蛋白质锚定至膜上的原因。

在一些实施方案中，通过化学和/或物理方法，诸如PEG诱导的融合和/或超声融合，产生内腔工程化的EV(例如，外来体)。

在其它实施方案中，通过基因工程产生内腔工程化的EV(例如，外来体)。从经遗传修饰的生产者细胞或经遗传修饰的细胞的后代产生的外来体可包含经修饰的内腔组成。在一些实施方案中，内腔工程化的EV(例如，外来体)以较高或较低的密度具有EV(例如，外来体)蛋白(例如，支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，诸如MARCKS、MARKSL1、BASP1或其组合)，或者包含EV(例如，外来体)蛋白的修饰或片段(例如，其任何功能片段、变体或衍生物，或其任意组合)。

例如，内腔工程化的EV(例如，外来体)可从用外源序列转化的细胞产生，所外源序列编码EV(例如，外来体)蛋白或EV(例如，外来体)蛋白的修饰或片段(例如，支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，诸如MARCKS、MARKSL1、BASP1、其任何功能片段、变体或衍生物，或其任意组合)。EV(例如，外来体)(包括从外源序列表达的蛋白质)可包括经修饰的内腔表面蛋白(支架蛋白)组成。

EV蛋白(例如，外来体蛋白)的各种修饰或片段(例如，支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，诸如MARCKS、MARKSL1、BASP1、其任何功能片段、变体或衍生物或其任意组合)可用于本公开的实施方案。例如，可使用经修饰以更有效地靶向EV(例如，外来体)内腔表面的蛋白质。还可使用经修饰以包含对EV(例如，外来体)内腔表面的特异性和有效靶向所需的最小片段的蛋白质。

在一些方面，本公开的支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，包括MARCKS蛋白或其片段、变体或衍生物。MARCKS蛋白(Uniprot登录号P29966)也被称为蛋白激酶C底物，80kDa的蛋白质，轻链。全长人MARCKS蛋白的长度为332个氨基酸，并在氨基酸残基152-176处包含钙调蛋白结合结构域。在一些实施方案中，本公开的支架蛋白包括成熟的MARCKS蛋白(即，不含N端甲硫氨酸)。在一些方面，本公开的支架蛋白源自成熟的MARCKS蛋白，即，其为成熟的MARCKS蛋白的片段、变体或衍生物，因此其缺少非成熟蛋白中存在的N端甲硫氨酸。

在一些方面，本公开的支架蛋白，例如外来体内腔蛋白包括MARCKSL1蛋白(Uniprot登录号P49006)(也称为MARCKS样蛋白1)和巨噬细胞富含豆蔻酰化的丙氨酸的C激酶底物。全长人MARCKSL1蛋白的长度为195个氨基酸。MARCKSL1蛋白具有在氨基酸残基87-110处的参与脂质结合和钙调蛋白结合的效应结构域。在一些实施方案中，本公开的支架蛋白包括成熟的MARCKSL1蛋白(即，不含N端甲硫氨酸)。在一些方面，本公开的支架蛋白源自成熟的MARCKSL1蛋白，即，其为成熟MARCKSL1蛋白的片段、变体或衍生物，因此其缺乏非成熟蛋白中存在的N端甲硫氨酸。

在一些方面，本公开的支架包括BASP1蛋白(Uniprot登录号P80723)，也称为22kDa的神经元组织富集的酸性蛋白或神经元轴突膜蛋白NAP-22。全长人BASP1蛋白质序列(异构体1)的长度为227个氨基酸。通过选择性剪接产生的异构体自异构体1缺失氨基酸88至141。在一些实施方案中，本公开的支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，包括成熟的BASP1蛋白(即，不含N端甲硫氨酸)。在一些方面，本公开的支架蛋白源自成熟的BASP1蛋白，即，其为成熟的BASP1蛋白的片段、变体或衍生物，因此其缺乏非成熟蛋白中存在的N端甲硫氨酸。

在一些方面，本公开的支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，包含“N端结构域”(ND)和“效应结构域”，其中ND和/或ED与EV(例如，外来体)的内腔表面缔合。如本文中所用，术语“与......缔合”是指本公开的支架蛋白与EV(例如，外来体)的内腔表面之间的相互作用，其不涉及与膜组分的共价连接。例如，本公开的支架可以例如通过脂质锚(例如，豆蔻酸)和/或与膜磷脂的带负电的头部静电相互作用的多元结构域与EV的内腔表面缔合。在其它方面，所述支架蛋白包含N端结构域(ND)和效应结构域(ED)，其中所述ND与EV的内腔表面缔合，并且所述ED通过离子相互作用与所述EV的内腔表面缔合，其中所述ED在序列中包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个连续的赖氨酸(Lys)。

在其它方面，ED还包含一个或多个低复杂度区域，例如PEST基序。PEST序列是富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的肽序列。在一些方面，ED还包含带负电荷的残基(例如，Glu)以及许多Ser和Thr，所述氨基酸经历瞬时磷酸化(因此，都向ED外的区域添加负电荷)。

在一些方面，ND通过脂化，例如通过豆蔻酰化与EV(例如，外来体)的内腔表面缔合。在一些实施方案中，ND具有在N端的Gly。在一些实施方案中，N端Gly被豆蔻酰化。在一些实施方案中，ND不包含在N端的Met。在其它实施方案中，ND包含被豆蔻基化的Gly，并且不包含在N端的Met。

在一些方面，ED通过离子相互作用与EV(例如，外来体)的内腔表面缔合。在一些实施方案中，ED通过静电相互作用，特别是吸引性静电相互作用与EV(例如，外来体)的内腔表面缔合。

在一些方面，ED包含(i)碱性氨基酸(例如，赖氨酸)，或(ii)在多肽序列中彼此相邻的两个或更多个碱性氨基酸(例如，赖氨酸)。在一些方面，碱性氨基酸是赖氨酸(Lys；K)、精氨酸(Arg，R)或组氨酸(His，H)。在一些实施方案中，碱性氨基酸是(Lys)n，其中n是1和10之间的整数。

在其它方面，如果ED的N端与ND的C端处的赖氨酸直接连接，即，赖氨酸在ED的N端中并且与ND的C端中的赖氨酸融合，则ED至少包含赖氨酸并且ND包含在C端的赖氨酸。在其它实施方案中，当ED的N端通过接头(例如一个或多个氨基酸)连接至ND的C端时，ED包含至少两个赖氨酸、至少三个赖氨酸、至少四个赖氨酸、至少五个赖氨酸、至少六个赖氨酸或至少七个赖氨酸。

在一些方面，ED包含K、KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO:151)、KKKKK(SEQ ID NO:152)或其任意组合。本公开还提供了，在一些方面，赖氨酸重复可被精氨酸替代。在其它方面，与赖氨酸功效相比，ED或支架蛋白中的精氨酸重复提供较低的装载功效。

在一些方面，可用于本公开的支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，需要至少两个赖氨酸或至少三个赖氨酸，所述赖氨酸在序列上在ED中或在ED与ND中重复，即，赖氨酸在ND的C端处并且K在ED的N端中。在一些实施方案中，ED包含K、KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO:151)、KKKKK(SEQ ID NO:152)或其任意组合。在一些方面，ND包含如G:X2:X3:X4:X5:X6所示的氨基酸序列，其中G表示Gly；其中“：”表示肽键，其中X2至X6中的每个独立地表示氨基酸；并且其中X6表示碱性氨基酸。在一些方面，X6氨基酸选自由以下组成的组：Lys、Arg和His。在一些方面，X5氨基酸选自由以下组成的组：Pro、Gly、Ala和Ser。在一些方面，X2氨基酸选自由以下组成的组：Pro、Gly、Ala和Ser。在一些方面，X4选自由以下组成的组：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met。在一些方面，支架蛋白不包含在N端的Met(例如，豆蔻酰化的)。

在一些方面，支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，包含ND和ED，其中ND包含如G:X2:X3:X4:X5:X6所示的氨基酸序列，其中G表示Gly；其中“：”表示肽键，其中X2至X6中的每个独立地表示氨基酸；其中X6表示碱性氨基酸，X5氨基酸选自由以下组成的组：Pro、Gly、Ala和Ser，X4选自由以下组成的组：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met，X3表示氨基酸，并且X2氨基酸选自由以下组成的组：Pro、Gly、Ala和Ser，其中ED包含至少一个氨基酸，例如，至少一个Lys，并且其中支架蛋白不是(i)包含SEQ ID NO:4-114、116-118、122-150或180-190的氨基酸序列，或(ii)由SEQ ID NO:115或118至121编码的氨基酸序列。

在一些方面，支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，包含N端结构域(ND)和效应结构域(ED)，其中ND包含如G:X2:X3:X4:X5:X6所示的氨基酸序列，其中G是表示为Gly的甘氨酸；其中“：”表示肽键，其中X2至X6中的每个独立地是氨基酸；其中X6包括碱性氨基酸，并且其中ED通过肽键连接至X6并且在ED的N端包含至少一个赖氨酸。在一些方面，支架蛋白不包含在N端的Met(例如，豆蔻酰化的)。在其它方面，支架蛋白不包含以下氨基酸序列或不由以下氨基酸序列组成：(i)含有SEQ ID NO:4-114、116-118、122-150或180-190的氨基酸序列，或(ii)由SEQ ID NO:115或118至121编码的氨基酸序列。

在一些实施方案中，支架蛋白例如外来体内腔蛋白的ND包含氨基酸序列G:X2:X3:X4:X5:X6，其中

a.G表示Gly；

b.“:”表示肽键；

c.X2表示选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala和Ser；

d.X3表示任意氨基酸；

e.X4表示选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met；

f.X5表示选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala和Ser；以及

g.X6表示选自由以下组成的组的氨基酸：Lys、Arg和His。

在一些方面，支架蛋白例如外来体内腔蛋白不包含在N端的Met(例如，豆蔻酰化的)。在其它方面，支架蛋白不包含以下氨基酸序列或不由以下氨基酸序列组成：(i)包含SEQ ID NO:4至114、116至118、122至150或180至190的氨基酸序列或(ii)由SEQ ID NO:115或118至121编码的氨基酸序列。在一些方面，X3氨基酸选自由以下组成的组：Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His和Arg。

在一些方面，ND和ED通过接头连接。在一些实施方案中，接头包含一个或多个氨基酸。在一些方面，术语“接头”是指肽或多肽序列(例如，合成的肽或多肽序列)或非多肽，例如烷基链。在一些方面，两个或更多个接头可以串联连接。通常，接头提供柔性或防止/减小空间位阻。接头通常不被切割；然而，在某些方面，此类切割可以是期望的。因此，在一些实施方案中，接头可包含一个或多个蛋白酶可切割的位点，该位点可位于接头序列内或在接头序列的任一端与接头侧接。当ND和ED通过接头连接时，ED包含至少两个赖氨酸、至少三个赖氨酸、至少四个赖氨酸、至少五个赖氨酸、至少六个赖氨酸或至少七个赖氨酸。

在一些方面，接头是肽接头。在一些方面，所述肽接头可包含至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个、至少约80个、至少约85个、至少约90个、至少约95个或至少约100个氨基酸。

在一些方面，接头是甘氨酸/丝氨酸接头。在一些实施方案中，肽接头是根据式[(Gly)n-Ser]m的甘氨酸/丝氨酸接头，其中n为1至100的任何整数，并且m为1至100的任何整数。在其它方面，所述甘氨酸/丝氨酸接头根据式[(Gly)x-Sery]z，其中x为1至4的整数，y为0或1，并且z为1至50的整数。在一些方面，肽接头包含序列Gn，其中n可为1至100的整数。在一些方面，肽接头可包含序列(GlyAla)n，其中n为1至100的整数。在其它方面，肽接头可包含序列(GlyGlySer)n，其中n为1和100之间的整数。

在一些方面，肽接头是合成的，即，非天然存在的。在一个实施方案中，肽接头包括肽(或多肽)(例如，天然或非天然存在的肽)，其包含连接或基因融合第一线性氨基酸序列与第二线性氨基酸序列的氨基酸序列，其与所述第二线性氨基酸序列为非天然地连接或天然地基因融合。例如，一方面，肽接头可包含非天然存在的多肽，其为天然存在的多肽的修饰形式(例如，包含诸如添加、取代或缺失等的突变)。

在其它方面，肽接头可包含非天然存在的氨基酸。在仍然其它方面，肽接头可包含天然存在的氨基酸，所述氨基酸存在于自然界中不存在的线性序列中。在其它方面，肽接头可包含天然存在的多肽序列。

本公开还提供了分离的细胞外囊泡(EV)(例如，外来体)，其包含与支架蛋白例如外来体内腔蛋白连接的生物活性分子，其中所述支架蛋白包含ND-ED，其中：

a.ND包含G:X2:X3:X4:X5:X6；其中：

i.G表示Gly；

ii.“:”表示肽键；

iii.X2表示选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala和Ser。

iv.X3表示任意氨基酸；

v.X4表示选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Glu和Met；

vi.X5表示选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala和Ser。

vii.X6表示选自由以下组成的组的氨基酸：Lys、Arg和His；

b.“—”表示任选的接头；以及

c.ED是效应结构域，其包含(i)至少两个连续的赖氨酸(Lys)，N端赖氨酸通过肽键或一个或多个氨基酸连接至X6；或(ii)至少一个赖氨酸，其通过肽键直接连接至X6。在一些方面，支架蛋白不包含在N端的Met(例如，豆蔻酰化的)。在其它方面，支架蛋白不包含以下氨基酸序列或不由以下氨基酸序列组成：(i)包含SEQ ID NO:4至114、116至118、122至150或180至190的氨基酸序列或(ii)由SEQ ID NO:115或118至121编码的氨基酸序列。

在一些方面，X2氨基酸选自由Gly和Ala组成的组。在一些方面，X3氨基酸是Lys。在一些方面，X4氨基酸是Leu或Glu。在一些方面，X5氨基酸选自由Ser和Ala组成的组。在一些方面，X6氨基酸是Lys。在其它实施方案中，X2氨基酸为Gly、Ala或Ser；X3氨基酸是Lys或Glu，X4氨基酸是Leu、Phe、Ser和Glu，X5氨基酸是Ser或Ala；以及X6氨基酸是Lys。在一些方面，—接头包含肽键或一个或多个氨基酸。

在一些方面，支架蛋白例如外来体内腔蛋白中的ED包含Lys(K)、KK、KKK、KKKK(SEQID NO:151)、KKKKK(SEQ ID NO:152)、Arg(R)、RR、RRR、RRRR(SEQ ID NO:153)；RRRRR(SEQID NO:154)、KR、RK、KKR、KRK、RKK、KRR、RRK、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:155)、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:156)或其任意组合。

在一些方面，支架蛋白例如外来体内腔蛋白包含如(i)GGKLSKK(SEQ ID NO:157)、(ii)GAKLSKK(SEQ ID NO:158)、(iii)GGKQSKK(SEQ ID NO:159)、(iv)GGKLAKK(SEQ ID NO:160)或(v)其任意组合所示的氨基酸序列。在一些方面，支架蛋白不包含具有在(i)至(v)中的序列的N端的Met的氨基酸序列。在其它方面，支架蛋白不包含以下氨基酸序列或不由以下氨基酸序列组成：(i)包含SEQ ID NO:4至114、116至118或122至150的氨基酸序列或(ii)由SEQ ID NO:115或118至121编码的氨基酸序列。

在一些方面，支架蛋白例如外来体内腔蛋白中的ND包含以下氨基酸序列：(i)GGKLSK(SEQ ID NO:203)、(ii)GAKLSK(SEQ ID NO:204)、(iii)GGKQSK(SEQ ID NO:205)、(iv)GGKLAK(SEQ ID NO:206)或(v)其任意组合，并且支架蛋白中的ED包含(a)K、(b)KK、(c)KKK、(d)KKKG(SEQ ID NO:207)、(e)KKKGY(SEQ ID NO:208)、(f)KKKGYN(SEQ ID NO:209)、(g)KKKGYNV(SEQ ID NO:210)、(h)KKKGYNVN(SEQ ID NO:211)、(i)KKKGYS(SEQ ID NO:212)、(k)KKKGYG(SEQ ID NO:213)、(l)KKKGYGG(SEQ ID NO:214)、(m)KKKGS(SEQ ID NO:215)、(n)KKKGSG(SEQ ID NO:216)、(o)KKKGSG(SEQ ID NO:217)、(p)KKKGSGS(SEQ ID NO:218)、(q)KKKS(SEQ ID NO:219)、(r)KKKSG(SEQ ID NO:220)、(s)KKKSGG(SEQ ID NO:221)、(t)KKKSGGS(SEQ ID NO:222)、(u)KKKSGGSG(SEQ ID NO:223)、(v)KKSGGSGG(SEQ ID NO:224)、(w)KKKSGGSGGS(SEQ ID NO:225)、(x)KRFSFKKS(SEQ ID NO:226)或其任意组合。在一些方面，支架蛋白不包含具有在(i)至(v)中的序列的N端的Met的氨基酸序列。在一些方面，支架蛋白不包含以下氨基酸序列或不由以下氨基酸序列组成：(i)包含SEQ ID NO:4至114、116至118、122至150或180至190的氨基酸序列或(ii)由SEQ ID NO:115或118至121编码的氨基酸序列。

在一些方面，本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白的多肽序列由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：(i)GGKLSKK(SEQ ID NO:157)、(ii)GAKLSKK(SEQ ID NO:158)、(iii)GGKQSKK(SEQ ID NO:159)、(iv)GGKLAKK(SEQ ID NO:160)或(v)其任意组合。

在一些方面，支架蛋白例如外来体内腔蛋白包含以下的氨基酸序列：(i)GGKLSKKK(SEQ ID NO:161)、(ii)GGKLSKKS(SEQ ID NO:162)、(iii)GAKLSKKK(SEQ ID NO:163)、(iv)GAKLSKKS(SEQ ID NO:164)、(v)GGKQSKKK(SEQ ID NO:165)、(vi)GGKQSKKS(SEQ ID NO:166)、(vii)GGKLAKKK(SEQ ID NO:167)、(viii)GGKLAKKS(SEQ ID NO:168)或(ix)其任意组合。在一些方面，支架蛋白不包含在(i)至(ix)中的序列的N端具有Met的氨基酸序列。在一些方面，支架蛋白不包含以下氨基酸序列或不由以下氨基酸序列组成：(i)包含SEQ ID NO:4至114、116至118、122至150或180至190的氨基酸序列或(ii)由SEQ ID NO:115或118至121编码的氨基酸序列。

在一些方面，本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白的多肽序列由如下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自由以下组成的组：(i)GGKLSKKK(SEQ ID NO:161)、(ii)GGKLSKKS(SEQ ID NO:162)、(iii)GAKLSKKK(SEQ ID NO:163)、(iv)GAKLSKKS(SEQ ID NO:164)、(v)GGKQSKKK(SEQ ID NO:165)、(vi)GGKQSKKS(SEQ ID NO:166)、(vii)GGKLAKKK(SEQID NO:167)、(viii)GGKLAKKS(SEQ ID NO:168)及(ix)其任意组合。

在一些方面，支架蛋白例如外来体内腔蛋白的长度为至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、至少约22个、至少约23个、至少约24个、至少约25个、至少约26个、至少约27个、至少约28个、至少约29个、至少约30、至少31个、至少约32个、至少约33个、至少约34个、至少约35个、至少约36个、至少约37个、至少约38个、至少约39个、至少约39个、至少约40个、至少约41个、至少约42个、至少约43个、至少约44个、至少约50个、至少约46个、至少约47个、至少约48个、至少约49个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个、至少约80、至少85个、至少约90个、至少约95个、至少约100个、至少约105个、至少约110个、至少约115个、至少约120个、至少约125个、至少约130个、至少约135个、至少约140个、至少约145个、至少约150个、至少约155个、至少约160个、至少约165个、至少约170个、至少约175个、至少约180个、至少约185个、至少约190个、至少约195个、至少约200个、至少约205个、至少约210个、至少约215个、至少约220个、至少约225个、至少约230个、至少约235个、至少约240个、至少约245个、至少约250个、至少约255个、至少约260个、至少约265个、至少约270个、至少约275个、至少约280个、至少约285个、至少约290个、至少约295个、至少约300个、至少约305个、至少约310个、至少约315个、至少约320个、至少约325个、至少约330个、至少约335个、至少约340个、至少约345个或至少约350个氨基酸。

在一些方面，支架蛋白例如外来体内腔蛋白的长度为约5个至约10个、约10个至约20个、约20个至约30个、约30个至约40个、约40个至约50个、约50个至约60个、约60个至约70个、约70个至约80个、约80个至约90个、约90个至约100个、约100个至约110个、约110个至约120个、约120个至约130个、约130个至约140个、约140个至约150个、约150个至约160个、约160个至约170个、约170个至约180个、约180个至约190个、约190个至约200个、约200个至约210个、约210个至约220个、约220个至约230个、约230个至约240个、约240个至约250个、约250个至约260个、约260个至约270个、约270个至约280个、约280个至约290个、约290个至约300个、约300个至约310个、约310个至约320个、约320个至约330个、约330个至约340或约340个至约250个氨基酸。

在一些方面，支架蛋白例如外来体内腔蛋白包含(i)GGKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:169)、(ii)GAKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:170)、(iii)GGKQSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:171)、(iv)GGKLAKKKKGYNVN(SEQ ID NO:172)、(v)GGKLSKKKKGYSGG(SEQ ID NO:173)、(vi)GGKLSKKKKGSGGS(SEQ ID NO:174)、(vii)GGKLSKKKKSGGSG(SEQ ID NO:175)、(viii)GGKLSKKKSGGSGG(SEQ ID NO:176)、(ix)GGKLSKKSGGSGGS(SEQ ID NO:177)、(x)GGKLSKSGGSGGSV(SEQ ID NO:178)或(xi)GAKKSKKRFSFKKS(SEQ ID NO:179)。在一些方面，支架蛋白不包含具有在(i)至(xi)中的序列的N端的Met的氨基酸序列。在一些方面，支架蛋白不包含以下氨基酸序列或不由以下氨基酸序列组成：(i)包含SEQ ID NO:4至114、116至118、122至150或180至190的氨基酸序列或(ii)由SEQ ID NO:115或118至121编码的氨基酸序列。

在一些方面，本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白的多肽序列由以下组成：(i)GGKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:169)、(ii)GAKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:170)、(iii)GGKQSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:171)、(iv)GGKLAKKKKGYNVN(SEQ ID NO:172)、(v)GGKLSKKKKGYSGG(SEQ ID NO:173)、(vi)GGKLSKKKKGSGGS(SEQ ID NO:174)、(vii)GGKLSKKKKSGGSG(SEQ ID NO:175)、(viii)GGKLSKKKSGGSGG(SEQ ID NO:176)、(ix)GGKLSKKSGGSGGS(SEQ ID NO:177)、(x)GGKLSKSGGSGGSV(SEQ ID NO:178)或(xi)GAKKSKKRFSFKKS(SEQ ID NO:179)。在一些方面，支架蛋白不包含具有在(i)至(xi)中的序列的N端的Met的氨基酸序列。在一些方面，支架蛋白不包含以下氨基酸序列或不由以下氨基酸序列组成：(i)包含SEQ ID NO:4至114、116至118、122至150或180至190的氨基酸序列或(ii)由SEQ ID NO:115或118至121编码的氨基酸序列。

在其它方面，支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，包含本文公开的任一序列，但不包含在N端具有Met的相应序列，例如，SEQ ID NO:4至109。在一些方面，支架蛋白包含表1中的任一序列，但不包含以下氨基酸序列或不由以下氨基酸序列组成：(i)包含SEQ ID NO:4至114、116至118、122至150或180至190的氨基酸序列或(ii)由SEQ ID NO:115或118至121编码的氨基酸序列。

以下列出了可用于本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白的非限制性实例：

表1

在一些方面，本公开的支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，由本公开中的任何序列组成或基本上由其组成。在一些方面，本公开的支架由表1中公开的序列组成。在一些方面，本公开的支架由共价附接至膜锚(membrane anchor)(例如，豆蔻酸)的本文中公开的序列(例如，表1中公开的序列)组成。在一些方面，可通过脂化进行膜锚定。在一些实施方案中，脂化可以是例如脂肪酰化。在一些方面，脂肪酰化可以是例如，豆蔻酰化。在一些方面，所述膜锚共价附接至本文公开的序列，例如表1中公开的序列的N端氨基酸。在一些方面，所述膜锚共价附接至本文公开的序列，例如表1中公开的序列的N端甘氨酸。因此，在一些方面，本公开的支架由已被N-豆蔻酰化的公开的序列，例如表1中公开的序列组成。

在一些方面，本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白，不包含N端Met。在一些方面，支架蛋白包含在支架蛋白的N端的脂化的氨基酸，例如豆蔻酰化的氨基酸，其起脂质锚的作用。在一些方面，支架蛋白的N端处的氨基酸残基是Gly。N端Gly的存在是N-豆蔻酰化所需。在一些方面，支架蛋白的N端处的氨基酸残基是合成的。在一些方面，支架蛋白的N端处的氨基酸残基是甘氨酸类似物，例如，烯丙基甘氨酸、丁基甘氨酸或炔丙基甘氨酸。

在一些方面，脂质锚可以通过化学合成或酶促地附接至本公开的支架蛋白的任何N端氨基酸。

在其它方面，脂质锚可以是本领域已知的任何脂质锚，例如，棕榈酸或糖基磷脂酰肌醇。在罕见的情况下，例如，通过使用豆蔻酸受限的培养基，一些其它脂肪酸(包括短链和不饱和脂肪酸)可被附接至N端甘氨酸。例如，据报道在BK通道中，豆蔻酸酯通过羟基酯键联翻译后附接至内部丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸残基上。下表中给出了本领域已知的膜锚。

表2

在一些实施方案中，支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，包含与SEQ ID NO:1(MARCKS)、SEQ ID NO:2(MARCKSL1)或SEQ ID NO:3(BASP1)的成熟形式(即，在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中不存在N端甲硫氨酸)具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，支架蛋白(例如，外来体内腔蛋白)包含与SEQ ID NO:1(MARCKS)、SEQ ID NO:2(MARCKSL1)或SEQ ID NO:3(BASP1)的成熟形式(即，在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中不存在N端甲硫氨酸氨基酸)的功能片段具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。

在一些方面，附接至本公开的支架蛋白的生物活性分子在EV(例如，外来体)的内腔侧上。

在一些方面，支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，还包含跨膜结构域。在一些方面，跨膜结构域插入位于EV(例如，外来体)的内腔侧上的支架蛋白的ED结构域与有效载荷(例如，生物活性分子)之间。因此，有效载荷(例如，生物活性分子)被锚定至EV(例如，外来体)的外表面。

在一些方面，支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，还包含囊泡外结构域。在一些实施方案中，囊泡外结构域插入跨膜结构域与生物活性分子之间。

在一些方面，支架蛋白通过至少一个接头，例如，肽接头连接至生物活性分子。在一些方面，ND通过直接插入两个结构域之间的接头连接至ED。在一些方面，接头包含例如肽键或一个或多个氨基酸。在一些方面，接头包括可切割的接头。在一些方面，接头包括柔性接头。在一些方面，接头包括自消耗(self-immolative)接头。

也可使用本公开的支架蛋白与生物活性分子(例如，具有治疗活性的分子)之间的融合物。例如，融合蛋白可包含诸如MARCKS、MARCKSL1、BASP1等的支架蛋白或其修饰，特别是其片段或变体，以及有效载荷例如生物活性分子(例如，治疗性肽)。在一些方面，融合蛋白包含含有BASP1的氨基端的片段的支架蛋白。在其它方面，生物活性分子包括蛋白质、多肽、肽、多核苷酸(DNA和/或RNA)、化合物、病毒、离子载体，离子载体的载剂、形成通道或孔的部分或其任意组合。

生物活性分子(例如，治疗性肽)可选自由以下组成的组：天然肽、重组肽、合成肽、融合蛋白或连接至治疗性化合物的接头。生物活性分子(例如，治疗化合物)也可以是核苷酸、氨基酸、脂质、碳水化合物或小分子。生物活性分子(例如，治疗性肽)可以是抗体、酶、配体、抗原(例如，肿瘤抗原或来自诸如细菌、病毒、真菌或原生动物等传染原的抗原)、受体、抗微生物肽、转录因子或其片段或修饰。

包含与有效载荷例如生物活性分子融合或缀合的本公开的支架的融合蛋白可以附接至EV(例如，外来体)的内腔表面，并向EV(例如，外来体)提供例如治疗活性。

在一些实施方案中，生物活性分子(例如，治疗性肽)是基因组编辑复合物的组分。在一些实施方案中，所述基因组编辑复合物是转录激活物样效应核酸酶(TAL-效应核酸酶或TALEN)；锌指核酸酶(ZFN)；重组酶；CRISPR/Cas9复合物、CRISPR/Cpf1复合物、CRISPR/C2c1、C2c2或C2c3复合物、CRISPR/CasY或CasX复合物或本领域已知的任何其它合适的CRISPR复合物；或本领域已知的任何其它合适的基因组编辑复合物或其任意组合。

在一些实施方案中，生物活性分子(例如，治疗性肽)是跨膜肽。本文所述的跨膜肽可以表达为与本文所述的任何序列或其任何片段或变体的融合蛋白。在一些实施方案中，跨膜蛋白具有与EV(例如，外来体)的内腔中的内腔序列融合的第一末端，和在EV(例如，外来体)的表面上表达的第二末端。

在一些实施方案中，本公开的EV(例如，)可包含第二支架蛋白。在一些实施方案中，第二支架蛋白包括跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包括PTGFRN多肽、BSG多肽、IGSF2多肽、IGSF3多肽、IGSF8多肽、ITGB1多肽、ITGA4多肽、SLC3A2多肽、ATP转运蛋白多肽、氨基肽酶N(ANPEP)多肽、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(ENPP1)多肽、脑啡肽酶(MME)多肽、神经纤毛蛋白-1(NRP1)多肽或其片段、变体或衍生物。第二支架蛋白的非限制性实例可见于美国专利第10,195,290号和PCT公布第WO 2019/040920号中，所述专利或公布通过引用以其整体并入本文。

在一些实施方案中，生物活性分子(例如，治疗性肽)是核酸结合蛋白。在一些实施方案中，核酸结合蛋白是Dicer、Argonaute蛋白、TRBP、MS2噬菌体外壳蛋白。在一些实施方案中，核酸结合蛋白另外还包含一个或多个RNA或DNA分子。在一些实施方案中，所述一个或多个RNA是miRNA、siRNA、引导RNA、lincRNA、mRNA、反义RNA、dsRNA或其组合。

在一些实施方案中，生物活性分子(例如，治疗性肽)是蛋白质间相互作用系统的一部分。在一些实施方案中，蛋白质间相互作用系统包括FRB-FKBP相互作用系统，例如，如在Banaszynski等人，J Am Chem Soc.2005年4月6日；127(13):4715-21中描述的FRB-FKBP相互作用系统。

融合蛋白可被靶向至EV(例如，外来体)的内腔表面并且向EV(例如，外来体)提供治疗活性。

在一些实施方案中，使用具有靶向部分的融合蛋白。例如，融合蛋白可包含(i)支架蛋白，诸如MARCKS、MARCKSL1、BASP1、或其片段、变体或修饰，和(ii)靶向部分。靶向部分可用于将EV(例如，外来体)靶向至特定器官、组织或细胞，以使用EV(例如，外来体)进行治疗。在一些实施方案中，所述靶向部分是抗体或其抗原结合片段。

抗体及其抗原结合片段包括完整抗体、多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体及其片段，还包括单链抗体、人源化抗体、鼠抗体、嵌合抗体、小鼠-人抗体、小鼠-灵长类动物抗体、灵长类动物-人单克隆抗体、抗独特型抗体、抗体片段，诸如，例如，scFv、(scFv)

抗体及其抗原结合片段还包括双特异性抗体和多特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性或功能即可。抗体的模块化结构已被利用来生成超过60种不同的双特异性抗体形式。参见Spiess等人(2015)Molecular Immunology 67:95-106，其通过引用以其整体并入本文。因此，在一些实施方案中，双特异性抗体形式选自crossMab、DAF(双重作用Fab)(二合一)、DAF(四合一)、DutaMab、DT-IgG、普通杵臼LC(Knobs-in-holes common LC)、杵臼组件(Knobs-in-holes assembly)、电荷对，Fab臂交换，SEEDbody、三功能单抗(triomab)、LUZ-Y(具有诱导2个HC的异二聚化的亮氨酸拉链的异双特异性抗体)、Fcab、Kλ-体、正交Fab、DVD-IgG(双可变结构域IgG)、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zybody、DVI-IgG(四合一)、纳米抗体、纳米抗体-HSA、BiTE(双特异性T细胞衔接剂)、双抗体、DART(双亲和性靶向)、TandAb(串联抗体)、scDiabody、scDiabody-CH3、三重抗体(Triple Body)、微型抗体、微抗体、TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2、F(ab')2-ScFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HC Ab、scDiabody-Fc、双抗体-Fc、串联scFv-Fc、细胞内抗体、Dock and Locck、ImmTAC、HSAbody、scDiabody-HSA、串联scFv-毒素、IgG-IgG、Cov-X-Body和scFv1-PEG-scFV2。双特异性抗体可以是通过在轻链或重链的氨基或羧基末端附加另外的抗原结合单元而针对双特异性工程化的单特异性抗体。这些额外的抗原结合单元的替代物包括单结构域抗体(未配对的VL或VH)、配对的抗体可变结构域(例如，Fv或scFv)或工程化的蛋白质支架。许多缺乏一些或所有双特异性抗体恒定结构域的双特异性片段形式是本领域已知的。

在一些实施方案中，生物学活性分子(例如，治疗性肽)是包含本公开的支架蛋白和病毒蛋白的融合蛋白。在一些实施方案中，病毒蛋白包括病毒衣壳、包膜蛋白或其组合。在一些实施方案中，融合蛋白允许保留在EV(例如，外来体)的内腔表面上的完整病毒的组装。

在一些实施方案中，生物活性分子是负检查点调节剂的抑制剂或负检查点调节剂的结合配偶体的抑制剂。在一些实施方案中，负检查点调节剂选自由以下组成的组：细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)、含T细胞免疫球蛋白粘蛋白的蛋白3(TIM-3)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)、腺苷A2a受体(A2aR)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、CD20、CD39和CD73。

在一些实施方案中，生物活性分子是免疫原性蛋白。在一些实施方案中，生物活性分子是毒素、类毒素或毒素的无毒突变体。在一些实施方案中，毒素是白喉毒素。在一些实施方案中，类毒素是破伤风类毒素。在一些实施方案中，白喉毒素是白喉毒素的无毒突变体。

在一些实施方案中，生物活性分子是正共刺激分子的激活剂或正共刺激分子的结合配偶体的激活剂。在一些实施方案中，正共刺激分子是TNF受体超家族成员，其选自由以下组成的组：CD120a、CD120b、CD18、OX40、CD40、Fas受体、M68、CD27、CD30、4-1BB、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、TRAILR4、RANK、OCIF、TWEAK受体、TACI、BAFF受体、ATAR、CD271、CD269、AITR、TROY、CD358、TRAMP和XEDAR。在一些实施方案中，正共刺激分子的激活剂是TNF受体超家族成员，其选自由以下组成的组：TNFα、TNF-C、OX40L、CD40L、FasL、LIGHT、TL1A、CD27L、Siva、CD153、4-1BB配体、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、CAMLG、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、GITR配体和EDA-2。在一些实施方案中，正共刺激分子是CD28超家族共刺激分子。在一些实施方案中，CD28超家族共刺激分子是ICOS或CD28。在一些实施方案中，正共刺激分子的激活剂是ICOSL、CD80或CD86。

在一些实施方案中，生物活性分子是选自由以下组成的组的细胞因子：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12和IL-15。在一些实施方案中，生物活性分子是如下蛋白质，其包括T细胞受体(TCR)、T细胞共受体、主要组织相容性复合物(MHC)、人白细胞抗原(HLA)或其衍生物。在一些实施方案中，生物活性分子是包括肿瘤抗原在内的蛋白质。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、粘蛋白1(MUC1)、Tn-MUC1、粘蛋白16(MUC16)、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(MAGE)、肿瘤蛋白p53(p53)、CD4、CD8、CD45、CD80、CD86、程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡配体2(PD-L2)、NY-ESO-1、PSMA、TAG-72、HER2、GD2、cMET、EGFR、间皮素、VEGFR、α-叶酸受体、CE7R、IL-3、癌-睾丸抗原、MART-1gp100和TNF相关凋亡诱导配体。

在一些方面，包含本公开的生物活性分子和支架蛋白(例如，MARCKS、MARCKSL1、BASP1、SEQ ID NO:4-109中的任一个、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)公开的任何支架蛋白序列，或其修饰，特别是其片段或变体)的融合蛋白导致与缺少支架蛋白的生物活性分子的表达相比，生物活性分子在EV(例如，外来体)中的富集。在一些方面，包含生物活性分子和本公开的支架蛋白(例如，不含N端M的MARCKS、MARCKSL1、BASP1、不含N端M的SEQID NO:4至114、116至118、122至150或180至190的氨基酸序列、由SEQ ID NO:115或118至121编码的氨基酸序列或本文(例如，表1)公开的不含N端M的任何支架蛋白序列)的融合蛋白导致与缺少所述支架蛋白的生物活性分子的表达相比，生物活性分子在EV(例如，外来体)中的富集。

在一些实施方案中，可用于本公开的支架蛋白包括SEQ ID NO:4-109中的任一个、不含N端M的相应序列或表1中公开的任何序列。在一些方面，可用于本公开的支架蛋白包括SEQ ID NO:4-109中的任一个，其中所述支架蛋白不包含N端Met。在一些方面，支架蛋白包含表1中公开的序列，其中所述支架蛋白不包含N端Met。在一些方面，可用于本公开的支架蛋白包括不含N端M的MARCKS、MARCKSL1、BASP1、不含N端M的SEQ ID NO:4至114、116至118、122至150或180至190的氨基酸序列、由SEQ ID NO:115或118至121编码的氨基酸序列或本文(例如，表1)公开的不含N端M的任何支架蛋白序列。在一些方面，用于本公开的支架蛋白包括MARCKS、MARCKSL1或BASP1，其中所述支架蛋白不包含N端Met。在一些方面，支架蛋白包含SEQ ID NO:4至114、116至118、122至150或180至190的氨基酸序列，其中所述支架蛋白不包含N端Met。在一些方面，支架蛋白包含由SEQ ID NO:115或118至121编码的氨基酸序列，其中所述支架蛋白不包含N端Met。在其它实施方案中，可用于本公开的支架蛋白包含本文公开的任何序列，但不是SEQ ID NO:4-109中的任一个、不含N端M的相应序列或表1中公开的不含N端M的任何序列。在其它实施方案中，可用于本公开的支架蛋白包含本文公开的任何序列，但不包含SEQ ID NO:4-109中的任何一个。

在一些实施方案中，融合蛋白包含支架蛋白，所述支架蛋白包含具有序列MGXKLSKKK的肽，其中X是丙氨酸或任何其它氨基酸(SEQ ID NO:117)；或具有序列(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)的肽，其中N端M被切割，使得所得融合蛋白包含与生物活性分子连接的GXKLSKKK(SEQ ID NO:425)或(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)，其中每个括号里面的位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任意氨基酸，ξ是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)组成的组的任意氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任意氨基酸，并且(+)是选自由(Lys,Arg,His)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是(+)，并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在一些实施方案中，可用于本公开的支架蛋白不是MGXKLSKKK，其中X是丙氨酸或任何其它氨基酸(SEQ ID NO:117)或不是具有序列(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)的肽。在一些实施方案中，可用于本公开的支架蛋白不包含MGXKLSKKK，其中X是丙氨酸或任何其它氨基酸(SEQ ID NO:117)或者不包含具有序列(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)的肽。

在一些实施方案中，融合蛋白包含支架蛋白，所述支架蛋白包含具有序列(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)或(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)的肽，其中每个括号里面的位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任意氨基酸，X是任意氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任意氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在一些实施方案中，融合蛋白包含支架蛋白，所述支架蛋白包含具有序列(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)的肽，其中所述支架蛋白不包含N端M(例如，N端甲硫氨酸)。

在一些方面，融合蛋白包含支架蛋白，所述支架蛋白包含具有序列(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)的肽，其中每个括号里面的位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任意氨基酸，X是任意氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任意氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)，其中所述序列不是(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)。在一些实施方案中，所述支架蛋白包含具有序列(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)的肽，其中所述支架蛋白不包含N端Met。

在一些实施方案中，常规EV(例如，外来体)蛋白选自由以下组成的列表：CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚定蛋白、LAMP2、LAMP2B及其片段、变体或衍生物。

在一些实施方案中，相比于缺少MARCKS、MARCKSL1、BASP1、SEQ ID NO:4-109中的任一个的融合蛋白或者相较于包含常规EV(例如，外来体)蛋白的融合蛋白，包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1或SEQ ID NO:4-109中的任一个的融合蛋白在外来体中的富集度高至>2倍、>4倍、>8倍、>16倍、>25倍、>50倍、>100倍、>200倍、>500倍、>750倍、>1,000倍、>2,000倍、>5,000倍、>7,500倍、>10,000倍。在一些方面，相比于缺少不含N端M的MARCKS、MARCKSL1、BASP1、不含N端M的SEQ ID NO:4-109中的任一个或本文(例如，表1)公开的不含N端M的任何序列的融合蛋白或者相较于包含常规EV(例如，外来体)蛋白的融合蛋白，包含不含N端M的MARCKS、MARCKSL1、BASP1、不含N端M的SEQ ID NO:4-109中的任一个或本文(例如，表1)公开的不含N端M的任何序列的融合蛋白在外来体中的富集度高至>2倍、>4倍、>8倍、>16倍、>25倍、>50倍、>100倍、>200倍、>500倍、>750倍、>1,000倍、>2,000倍、>5,000倍、>7,500倍、>10,000倍。

在一些实施方案中，相比于缺少MARCKS、MARCKSL1、BASP1、SEQ ID NO:4-109中的任一个、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)公开的不含N端M的任何支架蛋白序列的融合蛋白或者相较于包含常规EV(例如，外来体)蛋白的融合蛋白，包含MARCKS、MARCKSL1、BASP1、SEQ ID NO:4-109中的任一个、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)公开的不含N端M的任何支架蛋白序列的融合蛋白在外来体中的富集度高至少约2倍、至少约4倍、至少约6倍、至少约8倍、至少约10倍、至少约12倍、至少约14倍、至少约16倍、至少约18倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约750倍、至少约1,000倍、至少约1,500倍、至少约2,000倍、至少约2,500倍、至少约3,000倍、至少约3,500倍、至少约4,000倍、至少约4,500倍、至少约5,000倍、至少约5,500倍、至少约6,000倍、至少约6,500倍、至少约7,000倍、至少约7,500倍、至少约8,000倍、至少约8,500倍、至少约9,000倍、至少约9,500倍或至少约10,000倍。

在一些实施方案中，SEQ ID NO:1-109中的任一个的蛋白质序列、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)公开的不含N端M的任何支架蛋白序列足以用融合蛋白装载EV(例如，外来体)。

在一些实施方案中，包含含有外源序列(例如，生物活性分子)和本文新鉴定的EV(例如，外来体)内腔蛋白(支架蛋白)的融合蛋白的内腔工程化的EV(例如，外来体)的融合蛋白的密度高于类似地工程化的EV(例如，外来体)，后者包含与本领域已知的常规EV(例如，外来体)蛋白(例如，CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚蛋白、乳凝集素、LAMP2和LAMP2B、其片段或与其结合的肽)缀合的外源序列。

在一些实施方案中，包含本文新鉴定的EV(例如，外来体)内腔蛋白(支架蛋白)的融合蛋白在所述EV(例如，外来体)内腔表面中的存在密度为使用常规EV(例如，外来体)蛋白类似地修饰的其它EV(例如，外来体)内腔表面中的融合蛋白的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍。

在一些实施方案中，包含本文新鉴定的EV(例如,外来体)内腔蛋白(支架蛋白)的融合蛋白在所述EV(例如，外来体)内腔表面中的存在密度为使用常规EV(例如，外来体)蛋白类似地修饰的其它EV(例如，外来体)内腔表面中的融合蛋白的2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKS、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用CD9类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKS、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用CD63类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKS、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用CD81类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKS、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用PDGFR类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKS、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用GPI锚蛋白类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKS、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用乳凝集素类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKS、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用LAMP2类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKS、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用LAMP2B类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKS、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用常规蛋白类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKS、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用常规EV(例如，外来体)蛋白的变体类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKSL1、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用CD9类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKSL1、其变体、片段、片段的变体或其修饰)的融合蛋白的存在密度为使用CD63类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKSL1、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用CD81类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKSL1、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用PDGFR类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKSL1、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用GPI锚蛋白类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKSL1、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用乳凝集素类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKSL1、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用LAMP2类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKSL1、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用LAMP2B类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKSL1、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用常规蛋白类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，MARCKSL1、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用常规EV(例如，外来体)蛋白类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，BASP1、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用CD9类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，BASP1、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用CD63类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，BASP1、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用CD81类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，BASP1、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用PDGFR类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，BASP1、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用GPI锚蛋白类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，BASP1、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用乳凝集素类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，BASP1、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用LAMP2类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，BASP1、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用LAMP2B类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，BASP1、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用常规蛋白类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白(例如，BASP1、其变体、片段、片段的变体或修饰)的融合蛋白的存在密度为使用常规EV(例如，外来体)蛋白的变体类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1-109中的任一个、不含N端M的相应序列或不含N端M的本文(例如，表1)公开的任何支架蛋白序列的融合蛋白的存在密度为使用CD9类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。在一些实施方案中，EV(例如，外来体)包含含有SEQ ID NO:1-109中的任一个的融合蛋白，其中所述融合蛋白不包含N端Met，并且其中所述融合蛋白的存在密度为使用CD9类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1-109中的任一个、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)公开的不含N端M的任何支架蛋白序列的融合蛋白的存在密度为使用CD63类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。在一些实施方案中，EV(例如，外来体)包含融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:1-109中的任一个，其中所述融合蛋白不包含N端Met，并且其中所述融合蛋白的存在密度为使用CD63类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1-109中的任一个、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)公开的不含N端M的任何支架蛋白序列的融合蛋白的存在密度为使用CD81类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。在一些实施方案中，EV(例如，外来体)包含融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:1-109中的任一个，其中所述融合蛋白不包含N端Met，并且其中所述融合蛋白的存在密度为使用CD81类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1-109中的任一个、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)公开的不含N端M的任何支架蛋白序列的融合蛋白的存在密度为使用PDGFR类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。在一些实施方案中，EV(例如，外来体)包含融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:1-109中的任一个，其中所述融合蛋白不包含N端Met，并且其中所述融合蛋白的存在密度为使用PDGFR类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1-109中的任一个、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)公开的不含N端M的任何支架蛋白序列的融合蛋白的存在密度为使用GPI锚蛋白类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。在一些实施方案中，EV(例如，外来体)包含融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:1-109中的任一个，其中所述融合蛋白不包含N端Met，并且其中所述融合蛋白的存在密度为使用GPI锚蛋白类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1-109中的任一个、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)公开的不含N端M的任何支架蛋白序列的融合蛋白的存在密度为使用乳凝集素类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。在一些实施方案中，EV(例如，外来体)包含融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:1-109中的任一个，其中所述融合蛋白不包含N端Met，并且其中所述融合蛋白的存在密度为使用乳凝集素类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1-109中的任一个、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)公开的不含N端M的任何支架蛋白序列的融合蛋白的存在密度为使用LAMP2类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。在一些实施方案中，EV(例如，外来体)包含融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:1-109中的任一个，其中所述融合蛋白不包含N端Met，并且其中所述融合蛋白的存在密度为使用LAMP2类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1-109中的任一个、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)公开的不含N端M的任何支架蛋白序列的融合蛋白的存在密度为使用LAMP2B类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。在一些实施方案中，EV(例如，外来体)包含融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:1-109中的任一个，其中所述融合蛋白不包含N端Met，并且其中所述融合蛋白的存在密度为使用LAMP2Bt类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1-109中的任一个、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)公开的不含N端M的任何支架蛋白序列的融合蛋白的存在密度为使用常规蛋白类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。在一些实施方案中，EV(例如，外来体)包含融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:1-109中的任一个，其中所述融合蛋白不包含N端Met，并且其中所述融合蛋白的存在密度为使用常规蛋白类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:1-109中的任一个、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)公开的不含N端M的任何支架蛋白序列的融合蛋白的存在密度为使用常规EV蛋白(例如，外来体蛋白)修类似地饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。在一些实施方案中，EV(例如，外来体)包含融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:1-109中的任一个，其中所述融合蛋白不包含N端Met，并且其中所述融合蛋白的存在密度为使用常规EV蛋白(例如，外来体蛋白)类似地修饰的EV(例如，外来体)上的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，本文描述的内腔工程化的EV(例如，外来体)相较于本领域已知的内腔工程化的EV(例如，外来体)展示出更优的特性。例如，通过使用本文提供的新鉴定的EV(例如，外来体)蛋白产生的内腔工程化的EV(例如，外来体)包含经修饰的蛋白质，所述经修饰的蛋白质相较于现有技术水平的EV(例如，外来体)(例如，使用常规EV(例如，外来体)蛋白产生的那些)更加高度富集在它们的内腔表面上的。

此外，与本领域已知的内腔工程化的EV(例如，外来体)相比，本公开的内腔工程化的EV(例如，外来体)可具有更大、更特异性或更受控的生物活性。例如，包含有效载荷(例如与本文所述的EV(例如，外来体)蛋白或其片段(例如，本公开的支架诸如BASP1或其片段、变体或衍生物)融合的治疗或生物学相关外源序列)的内腔工程化的EV(例如，外来体)，可具有比与本领域已知的支架的融合物更多的期望的工程化特征。

本领域已知的支架蛋白包括四跨膜蛋白(tetraspanin)分子(例如，CD63、CD81、CD9等)、溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2和LAMP2B)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、GPI锚蛋白、乳凝集素及其片段，以及对这些蛋白或其片段中的任一种具有亲和力的肽。为免生疑问，PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或其片段或变体不是常规EV(例如，外来体)蛋白。以前，外源蛋白的过表达依赖于将外源蛋白随机或任意地布置到外来体中以产生内腔工程化的外来体。这导致了外来体中外源蛋白的低水平、不可预测的密度。因此，本文所述的EV(例如，外来体)蛋白及其片段在新型EV(例如，外来体)组合物及其制备方法方面提供了重要的进展。

本文提供的融合蛋白可包含本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白，诸如MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段、变体或衍生物，以及另外的肽。额外的肽可附接至EV(例如，外来体)蛋白(支架蛋白)或其片段、变体或衍生物的N端或C端。

在一些实施方案中，本文提供的融合蛋白可包含本公开的支架蛋白诸如MARCKS、MARCKSL1、BASP1或其片段、变体或衍生物，以及两种另外的肽。两种额外的肽均可附接至EV(例如，外来体)蛋白(支架蛋白)或其片段、变体或衍生物的N端或C端。在一些实施方案中，两种另外的肽之一附接至N端，而两种另外的肽中的另一种附接至EV(例如，外来体)蛋白(支架蛋白)或其片段、变体或衍生物的C端。

在一些实施方案中，本文所述的产生内腔工程化的细胞外囊泡的组合物和方法包括纳米囊泡。

IV.用于产生内腔工程化的EV(例如，外来体)的生产者细胞

可从体外生长的细胞或受试者的体液中产生本公开的EV(例如，外来体)。当从体外细胞培养物、各种生产者细胞例如HEK293产生EV(例如，外来体)时，所述EV可以用于本公开。可用于产生本文所述的内腔工程的EV(例如外来体)的其它细胞类型，包括但不限于间充质干细胞、T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞和癌细胞系。

因此，本公开提供了产生本公开的EV(例如，外来体)的细胞。在一些实施方案中，所述包含一种或多种载体，其中所述载体包含编码支架蛋白和有效载荷(例如，生物活性分子)的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列编码支架蛋白，并且第二核酸序列编码有效载荷，例如，生物活性分子。在一些实施方案中，编码支架蛋白的核酸序列和编码有效载荷(例如，生物活性分子)的核酸序列处于单个开放阅读框中；因此，表达产物将是包含与有效载荷(例如，生物活性分子)融合的支架蛋白的融合蛋白。在一些实施方案中，核酸序列可操作地连接至启动子。

可以对生产者细胞进行遗传修饰，以包含一个或多个外源序列来产生内腔工程化的EV(例如，外来体)。经遗传修饰的生产者细胞可通过瞬时或稳定转化包含外源序列。可将外源序列作为质粒进行转化。外源序列可被稳定地整合到生产者细胞的基因组序列中的靶位点或随机位点处。在一些实施方案中，产生稳定的细胞系以用于产生内腔工程的EV(例如，外来体)。

可将外源序列插入生产者细胞的基因组序列中，位于编码EV(例如，外来体)蛋白的内源序列的上游(5'-末端)或下游(3'-末端)内。本领域已知的各种方法可用于将外源序列引入生产者细胞。例如，使用各种基因编辑方法(例如，使用同源重组、转座子介导的系统、loxP-Cre系统、CRISPR/Cas9或TALEN的方法)修饰的细胞在本公开的范围内。

外源序列可包括编码本公开的支架蛋白(例如，EV(例如，外来体)蛋白或EV(例如，外来体)蛋白的修饰或片段)的序列。可引入编码支架蛋白(例如，EV(例如，外来体)蛋白)的序列的额外拷贝以产生具有较高密度的EV(例如，外来体)蛋白的内腔工程化的EV(例如，外来体)。可引入编码EV(例如，外来体)蛋白的修饰或片段的外源序列，以产生包含EV(例如，外来体)蛋白的修饰或片段的内腔工程化的EV(例如，外来体)。可引入编码亲和标签的外源序列以产生包含融合蛋白的内腔工程的EV(例如，外来体)，所述融合蛋白包含附接至EV(例如，外来体)蛋白的亲和标签。

在一些实施方案中，与从同一或相似生产者细胞类型分离的天然EV(例如，外来体)相比，内腔工程化的EV(例如，外来体)具有更高密度的EV(例如，外来体)蛋白(支架蛋白)。在一些实施方案中，所述EV(例如，外来体)蛋白(支架蛋白)在所述内腔工程化的EV(例如，外来体)上存在的密度为天然EV<(例如，外来体)的2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1,000倍或更多倍。在一些实施方案中，EV(例如,外来体)蛋白(支架蛋白)在内腔工程化的EV(例如，外来体)上的存在密度为天然EV(例如，外来体)的2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更多倍。在一些实施方案中，包含EV(例如，外来体)蛋白(支架蛋白)的融合蛋白在所述内腔工程化的EV(例如，外来体)上的存在密度为天然EV(例如，外来体)上的未修饰的EV(例如，外来体)蛋白(支架蛋白)的2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更多倍。在一些实施方案中，EV(例如，外来体)蛋白(支架蛋白)的片段或变体在内腔工程化的EV(例如，外来体)上的存在密度为天然EV(例如，外来体)上的未修饰的EV(例如，外来体)蛋白(支架蛋白)的2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，MARCKS、MARCKS的片段或变体或其修饰在所述内腔工程化的EV(例如，外来体)上的存在密度为所述天然EV(例如，外来体)上的未修饰的MARCKS的2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更多倍。在一些实施方案中，MARCKSL1、MARCKSL1的片段或变体或其修饰在所述内腔工程化的EV(例如，外来体)上的存在密度为所述天然EV(例如，外来体)上的未修饰的MARCKSL1的2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更多倍。在一些实施方案中，BASP1、BASP1的片段或变体或其修饰在所述内腔工程化的EV(例如，外来体)上的存在密度为所述天然EV(例如，外来体)上的未修饰的BASP1的2至4倍、4至8倍、8至16倍、16至32倍、32至64倍、64至100倍、100至200倍、200至400倍、400至800倍、800至1,000倍或更多倍。

在一些实施方案中，生产者细胞被进一步修饰以包含另外的外源序列。例如，可包含另外的外源序列以调节内源基因表达，或产生包含某种多肽作为有效载荷的外来体。在一些实施方案中，生产者细胞被修饰以包含两种外源序列，一种编码EV(例如，外来体)蛋白(支架蛋白)或EV(例如，外来体)蛋白(支架蛋白)的修饰或片段，而另一种编码有效载荷。

更具体地，可从用编码一种或多种外来体内腔蛋白(支架蛋白)的序列转化的细胞中产生内腔工程化的EV(例如，外来体)，所述外来体内腔蛋白包括但不限于(1)富含豆蔻酰化的丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS)；(2)富含豆蔻酰化的丙氨酸的蛋白激酶C底物样蛋白1(MARCKSL1)；和(3)脑酸可溶性蛋白1(BASP1)。可从质粒、插入基因组中的外源序列或其它外源核酸(诸如合成信使RNA(mRNA))表达本文所述的一种或多种EV(例如，外来体)内腔蛋白(支架蛋白)中的任一种。

在一些实施方案中，所述一种或多种EV(例如，外来体)内腔蛋白(支架蛋白)在用编码其全长内源形式的外源序列转化的细胞中表达。在一些实施方案中，这样的外源序列编码SEQ ID NO:1的MARCKS蛋白或不含N端M的相应序列。在某些方面，这样的外源序列编码SEQ ID NO:1的MARCKS蛋白。在一些实施方案中，这样的外源序列编码SEQ ID NO:1的MARCKS蛋白，其中由外源序列编码的MARKS蛋白不包含N端Met。在一些实施方案中，这样的外源序列编码SEQ ID NO:2的MARCKSL1蛋白或不含N端M的相应序列。在某些方面，这样的外源序列编码SEQ ID NO:2的MARCKSL1蛋白。在一些实施方案中，这样的外源序列编码SEQ IDNO:2的MARCKSL1蛋白，其中由外源序列编码的MARCKSL1蛋白不包含N端Met。在一些实施方案中，这样的外源序列编码SEQ ID NO:3的BASP1蛋白或不含N端M的相应序列。在某些方面，这样的外源序列编码SEQ ID NO:3的BASP1蛋白。在一些实施方案中，这样的外源序列编码SEQ ID NO:3的BASP1蛋白，其中由外源序列编码的BASP1蛋白不包含N端Met。

可从用编码一种或多种EV(例如，外来体)内腔蛋白(支架蛋白)的片段的多核苷酸序列转化的细胞中产生内腔工程化的EV(例如，外来体)，所述外来体内腔蛋白包括但不限于(1)富含豆蔻酰化的丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS)；(2)富含豆蔻酰化的丙氨酸的蛋白激酶C底物样蛋白1(MARCKSL1)；和(3)脑酸可溶性蛋白1(BASP1)。

在一些实施方案中，多核苷酸序列编码从天然蛋白质的N端缺少至少5个、10个、50个、100个、200个或300个氨基酸的EV(例如，外来体)内腔蛋白(例如，支架蛋白诸如MARCKS、MARCKSL1或BASP1)的片段。在一些实施方案中，多核苷酸序列编码从天然蛋白质的C端缺少至少5个、10个、50个、100个、200个或300个氨基酸的EV(例如，外来体)内腔蛋白(例如，支架蛋白诸如MARCKS、MARCKSL1或BASP1)的片段。在一些实施方案中，多核苷酸序列编码从天然蛋白质的N端和C端均缺少至少5个、10个、50个、100个、200个或300个氨基酸的EV(例如，外来体)内腔蛋白(例如，支架蛋白诸如MARCKS、MARCKSL1或BASP1)的片段。在一些实施方案中，多核苷酸序列编码缺少天然蛋白质的一个或多个功能或结构结构域的EV(例如，外来体)内腔蛋白(例如，支架蛋白诸如MARCKS、MARCKSL1或BASP1)的片段。

在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:4-109的肽、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)公开的不含N端M的任何支架蛋白序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:4-109的肽或本文(例如，表1)公开的任何支架蛋白序列，其中所述融合蛋白不包含N端Met。在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:13的肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:13的肽，其中融合蛋白不包含N端Met。在一些实施方案中，融合蛋白包含支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，其包含具有序列MGXKLSKKK(SEQ ID NO:117)或GXKLSKKK(SEQ ID NO:425)的肽，其中X是丙氨酸或任何其它氨基酸。在一些实施方案中，融合蛋白包含支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，其包含具有序列GXKLSKKK(SEQ ID NO:425)的肽，其中X是丙氨酸或任何其它氨基酸，并且其中所述支架蛋白例如，外来体内腔蛋白，不包含N端Met。在一些实施方案中，融合蛋白包含支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，其包含具有序列GXKLSKKK(SEQ ID NO:425)的肽，其中X是丙氨酸或任何其它氨基酸，并且其中所述融合蛋白不包含N端Met。在一些实施方案中，融合蛋白包含支架蛋白，所述支架蛋白包含氨基酸序列GXKLSKKK(SEQ ID NO:425)，其中X是丙氨酸或任何其它氨基酸，其中所述支架蛋白不具有在氨基酸序列的N端处的Met，例如，包含MGXKLSKKK(SEQ ID NO:117)。在其它实施方案中，融合蛋白包含支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，其包含氨基酸序列GXKLSKKK(SEQ IDNO:425)，其中所述融合蛋白不包含MGXKLSKKK。在一些实施方案中，融合蛋白包含支架蛋白，所述支架蛋白包含具有序列(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)或(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)的肽，其中每个括号里面的位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任意氨基酸，ξ是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)组成的组的任意氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任意氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在一些实施方案中，融合蛋白包含支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，氨基酸序列(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)，其中所述融合蛋白不包含(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)。在一些实施方案中，融合蛋白包含支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，其包含具有序列(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)或(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)的肽，其中每个括号里面的位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任意氨基酸，X是任意氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任意氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在其它实施方案中，融合蛋白包含支架蛋白，例如外来体内腔蛋白，其包含氨基酸序列(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)，其中所述融合蛋白不包含(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)。

在一些实施方案中，可从用以下序列转化的细胞中产生内腔工程化的EV(例如，外来体)，所述序列编码与一种或多种异源蛋白质融合的EV(例如，外来体)蛋白(例如，支架蛋白例如，外来体内腔蛋白，诸如MARCKS、MARCKSL1或BASP1)或其片段或修饰。在一些实施方案中，将所述一种或多种异源蛋白质与EV(例如，外来体)蛋白(例如，支架蛋白，诸如MARCKS、MARCKSL1或BASP1)或其修饰，特别是其片段或变体的N端融合。在一些实施方案中，将所述一种或多种异源蛋白质与EV(例如，外来体)蛋白(例如，支架蛋白，诸如MARCKS、MARCKSL1或BASP1)或其修饰，特别是其片段或变体的C端融合。在一些实施方案中，将所述一种或多种异源蛋白质与EV(例如，外来体)蛋白(例如，支架蛋白，诸如MARCKS、MARCKSL1或BASP1)或其修饰，特别是其片段或变体的N端和C端融合。在一些实施方案中，一种或多种异源蛋白质是哺乳动物蛋白质。在一些实施方案中，一种或多种异源蛋白质是人蛋白质。

在一些实施方案中，从用编码多肽的序列转化的细胞中产生内腔工程化的EV(例如，外来体)，所述多肽具有与天然EV(例如，外来体)内腔蛋白(支架蛋白)的全长或片段同一或相似的序列，所述内腔蛋白包括但不限于，

(1)富含豆蔻酰化的丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS)；

(2)富含豆蔻酰化的丙氨酸的蛋白激酶C底物样蛋白1(MARCKSL1)；和

(3)脑酸可溶性蛋白1(BASP1)。

在一些实施方案中，所述多肽与天然EV(例如，外来体)内腔蛋白(支架蛋白)的全长或片段具有至少约50％同一性，例如，与SEQ ID NO:1-3或不含N端M的任何相应序列具有50％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与天然EV(例如，外来体)内腔蛋白(支架蛋白)的全长或片段具有至少约55％同一性，例如，与SEQ ID NO:1-3或不含N端M的任何相应序列具有至少约55％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与天然EV(例如，外来体)内腔蛋白(支架蛋白)的全长或片段具有至少约60％同一性，例如，与SEQ ID NO:1-3或不含N端M的任何相应序列具有至少约60％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与天然EV(例如，外来体)内腔蛋白(支架蛋白)的全长或片段具有至少约65％同一性，例如，与SEQ ID NO:1-3或不含N端M的任何相应序列具有至少约65％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与天然EV(例如，外来体)内腔蛋白(支架蛋白)的全长或片段具有至少约70％同一性，例如，与SEQ ID NO:1-3或不含N端M的任何相应序列具有至少约70％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与天然EV(例如，外来体)内腔蛋白(支架蛋白)的全长或片段具有至少约75％同一性，例如，与SEQID NO:1-3或不含N端M的任何相应序列具有至少约75％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与天然EV(例如，外来体)内腔蛋白(支架蛋白)的全长或片段具有至少约80％同一性，例如，与SEQ ID NO:1-3或不含N端M的任何相应序列具有至少约80％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与天然EV(例如，外来体)内腔蛋白(支架蛋白)的全长或片段具有至少约85％同一性，例如，与SEQ ID NO:1-3或不含N端M的任何相应序列具有至少约85％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与天然EV(例如，外来体)内腔蛋白(支架蛋白)的全长或片段具有至少约90％同一性，例如，与SEQ ID NO:1-3或不含N端M的任何相应序列具有至少约90％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与天然EV(例如，外来体)内腔蛋白(支架蛋白)的全长或片段具有至少约95％同一性，例如，与SEQ ID NO:1-3或不含N端M的任何相应序列具有至少约95％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与天然EV(例如，外来体)内腔蛋白(支架蛋白)的全长或片段具有至少约99％同一性，例如，与SEQ ID NO:1-3或不含N端M的任何相应序列具有至少约99％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与天然EV(例如，外来体)内腔蛋白(支架蛋白)的全长或片段具有至少约99.9％同一性，例如，与SEQ ID NO:1-3或不含N端M的任何相应序列具有至少约99.9％同一性。

在一些实施方案中，从细胞产生的内腔工程化的EV(例如，外来体)包含具有与脑酸可溶性蛋白1(BASP1)的片段同一或相似的序列的多肽。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约50％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)所述的不含N端M的任何BASP1序列具有至少约50％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约55％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)所述的不含N端M的任何BASP1序列具有至少约50％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约60％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)所述的不含N端M的任何BASP1序列具有至少约60％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约65％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)所述的不含N端M的任何BASP1序列具有至少约65％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约70％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)所述的不含N端M的任何BASP1序列具有至少约70％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约75％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)所述的不含N端M的任何BASP1序列具有至少约75％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约80％同一性，例如，与SEQ ID NO4-109、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)所述的不含N端M的任何BASP1序列具有至少约80％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约85％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)所述的不含N端M的任何BASP1序列具有至少约85％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约90％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)所述的不含N端M的任何BASP1序列具有至少约90％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约95％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)所述的不含N端M的任何BASP1序列具有至少约95％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约99％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)所述的不含N端M的任何BASP1序列具有至少约99％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约99.9％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)所述的不含N端M的任何BASP1序列具有至少约99.9％同一性。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的片段具有约100％同一性，例如，与4-109、不含N端M的相应序列或本文(例如，表1)所述的不含N端M的任何BASP1序列具有约100％同一性。

在一些实施方案中，从细胞产生的内腔工程化的EV(例如，外来体)包含具有与脑酸可溶性蛋白1(BASP1)的片段同一或相似的序列的多肽，其中所述多肽不包含N端Met。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约50％同一生，例如，与SEQ IDNO:4-109或本文(例如，表1)所述的任何BASP1序列具有至少约50％同一性，其中所述多肽不包含N端Met。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约55％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109或本文(例如，表1)所述的任何BASP1序列具有至少约50％同一性，其中所述多肽不包含N端Met。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约60％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109或本文(例如，表1)所述的任何BASP1序列具有至少约60％同一性，其中所述多肽不包含N端Met。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约65％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109或本文(例如，表1)所述的任何BASP1序列具有至少约65％同一性，其中所述多肽不包含N端Met。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约70％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109或本文(例如，表1)所述的任何BASP1序列具有至少约70％同一性，其中所述多肽不包含N端Met。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约75％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109或本文(例如，表1)所述的任何BASP1序列具有至少约75％同一性，其中所述多肽不包含N端Met。在一些实施方案中，所这多肽与BASP1的全长或片段具有至少约80％同一性，例如，与SEQ ID NO4-109或本文(例如，表1)所述的任何BASP1序列具有至少约80％同一性，其中所述多肽不包含N端Met。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约85％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109或本文(例如，表1)所述的任何BASP1序列具有至少约85％同一性，其中所述多肽不包含N端Met。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约90％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109或本文(例如，表1)所述的任何BASP1序列具有至少约90％同一性，其中所述多肽不包含N端Met。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约95％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109或本文(例如，表1)所述的任何BASP1序列具有至少约95％同一性，其中所述多肽不包含N端Met。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约99％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109或本文(例如，表1)所述的任何BASP1序列具有至少约99％同一性，其中所述多肽不包含N端Met。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的全长或片段具有至少约99.9％同一性，例如，与SEQ ID NO:4-109或本文(例如，表1)所述的任何BASP1序列具有至少约99.9％同一性，其中所述多肽不包含N端Met。在一些实施方案中，所述多肽与BASP1的片段具有约100％同一性，例如，与4-109或本文(例如，表1)所述的任何BASP1序列具有约100％同一性，其中所述多肽不包含N端Met。

VI.制备方法

本公开的EV(例如，外来体)可通过化学合成、重组DNA技术、较大分子的生物化学或酶促片段化、上述技术的组合或通过任何其它方法来产生。在一个实施方案中，本公开提供了将生物活性分子与EV(例如，外来体)缀合的方法。所述方法包括如上所述将生物活性分子连接至EV(例如，外来体)。

在本公开的一些实施方案中，本公开的EV(例如，外来体)可使用如上所述的生产者细胞来制备。因此，本公开提供了制备EV(例如，外来体)的方法，其包括在合适的条件下培养本文公开的生产者细胞以及获得本公开的EV(例如，外来体)。

在其它实施方案中，可以重组产生本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白，并随后将其掺入本公开的EV(例如，外来体)中。在其它实施方案中，仅重组产生支架蛋白的多肽部分。在一些实施方案中，随后例如化学或酶促地修饰重组产生的支架蛋白的多肽部分，以掺入膜锚(例如，N端豆蔻酸)。在一些实施方案中，随后将半重组(即，组合多肽部分的重组产物，然后进行化学或酶促修饰)产生的支架蛋白掺入本公开的EV(例如，外来体)。

在其它实施方案中，可以例如使用固相肽合成通过化学方式产生本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白，并随后将其掺入本公开的EV(例如，外来体)中。在其它实施方案中，仅合成产生支架蛋白的多肽部分。在一些实施方案中，随后例如化学或酶促地修饰合成产生的支架蛋白的多肽部分，以掺入膜锚(例如，N端豆蔻酸)。在一些实施方案中，随后将半合成(即，组合多肽部分的合成产物，然后进行化学或酶促修饰)产生的支架蛋白掺入本公开的EV(例如，外来体)。

在其它实施方案中，可以例如在体外使用诸如网织红细胞系统等无细胞表达产生本公开的支架蛋白例如外来体内腔蛋白，并随后将其掺入本公开的EV(例如，外来体)中。在其它实施方案中，仅支架蛋白的多肽部分是在体外，例如在无细胞系统中产生的。在一些实施方案中，随后例如化学或酶促地修饰在体外，例如在无细胞系统中产生的支架蛋白的多肽部分，以掺入膜锚(例如，N端豆蔻酸)。在一些实施方案中，随后将半体外(即，组合多肽部分的体外产物，然后进行化学或酶促修饰)产生的支架蛋白掺入本公开的EV(例如，外来体)。

在一些实施方案中，本文所述的方法还包括表征在其生产和纯化期间每个收集的级分中所含的EV(例如，外来体)的步骤。在一些实施方案中，可以提取EV(例如，外来体)的内容物以用于研究和表征。在一些实施方案中，分离出EV(例如，外来体)，并通过度量来表征，所述度量包括但不限于大小、形状、形态或分子组成诸如核酸、蛋白质、代谢产物和脂质。

VII.药物组合物和施用方法

本公开还提供了适合于向受试者施用的包含本文所述的EV(例如，外来体)的药物组合物。所述药物组合物通常以适合于向受试者施用的形式包含多种EV(例如，外来体)和药学上可接受的赋形剂或载剂，所述EV包含至少一种有与所述多种EV(例如，外来体)共价或非共价连接的效载荷，例如，生物活性分子。

药学上可接受的赋形剂或载剂部分地由所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法来确定。因此，存在包含多种EV(例如，外来体)的药物组合物的多种合适的制剂。(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.第18版(1990))。药物组合物通常被配制为无菌的，并且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(GMP)规定。在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种化学化合物，诸如例如与本文所述的EV(例如，外来体)共价连接的小分子。

在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种治疗剂或诊断剂以及本文所述的EV(例如，外来体)。在某些实施方案中，将EV(例如，外来体)与一种或多种另外的治疗剂或诊断剂在药学上可接受的载剂中共施用。在一些实施方案中，在施用另外的治疗剂或诊断剂之前施用包含EV(例如，外来体)的药物组合物。在一些实施方案中，在施用另外的治疗剂或诊断剂之后施用包含EV(例如，外来体)的药物组合物。在另外的实施方案中，将包含EV(例如，外来体)的药物组合物与另外的治疗剂或诊断剂同时施用。

本文提供了呈适于向受试者施用的形式的药物组合物，其包含具有期望的纯度的本公开的EV(例如，外来体)和药学上可接受的载剂或赋形剂。药学上可接受的赋形剂或载剂可以部分地由所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法来确定。因此，存在包含多种细胞外囊泡的药物组合物的多种合适制剂。(参见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.第21版(2005))。药物组合物通常被配制为无菌的，并且完全符合美国食品和药物管理局的所有良好生产规范(GMP)规定。

在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种治疗剂或诊断剂以及本文所述的EV(例如，外来体)。在某些实施方案中，将EV(例如，外来体)与一种或多种另外的治疗剂或诊断剂在药学上可接受的载剂中共施用。在一些实施方案中，在施用另外的治疗剂或诊断剂之前施用包含EV(例如，外来体)的药物组合物。在一些实施方案中，在施用另外的治疗剂或诊断剂之后施用包含EV(例如，外来体)的药物组合物。在另外的实施方案中，将包含EV(例如，外来体)的药物组合物与另外的治疗剂或诊断剂同时施用。

可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对接受者(例如，动物或人)是无毒的，并且包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN

载剂或稀释剂的实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。此类介质和化合物用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或化合物与本文所述的细胞外囊泡不相容，否则可考虑将其在组合物中使用。补充治疗剂也可掺入到组合物中。通常，将药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。本公开的EV(例如，外来体)可以通过肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、真皮内、经皮肤、直肠、颅内、腹膜内、鼻内、瘤内、肌内途径或作为吸入剂施用。在某些实施方案中，将包含EV(例如，外来体)的药物组合物例如通过注射静脉内施用。EV(例如，外来体)可以任选地与其它治疗剂组合施用，所述其它治疗剂在治疗EV(例如，外来体)所针对的疾病、病症或疾患方面至少部分有效。

溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，诸如水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌化合物，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的化合物，诸如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱，诸如盐酸或氢氧化钠调节pH。所述制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(如果是水溶性的)或分散体和无菌粉剂。对于静脉内施用，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL

无菌可注射溶液可通过将本公开的EV(例如，外来体)以有效量并在适当的溶剂中根据需要掺入本文列举的成分之一或其组合来制备。通常，通过将EV(例如，外来体)掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述媒介物含有碱性分散介质和任何所需要的其它成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上任何其它所需成分(来自其之前经无菌过滤的溶液)的粉末。EV(例如，外来体)可以以储库注射或植入制剂的形式施用，其可以以允许EV(例如，外来体)的持续释放或脉冲释放的方式配制。

包含本公开的EV(例如，外来体)的组合物的全身性施用也可以是通过经粘膜的方式。对于经粘膜施用，在制剂中使用适于要渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域中通常是已知的，并且包括例如用于经粘膜施用的去垢剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用例如鼻喷雾剂来完成。

在某些实施方案中，将包含本公开的EV(例如，外来体)的药物组合物静脉内施用于可受益于所述药物组合物的受试者。在某些其它实施方案中，例如通过淋巴内注射或通过结内注射(参见例如，Senti等人，PNAS 105(46):17908(2008))，或通过肌内注射，通过皮下施用，通过瘤内注射，通过直接注射到胸腺或肝脏中来将组合物施用于淋巴管系统。

在某些实施方案中，将包含本公开的EV(例如，外来体)的药物组合物以液体悬浮液的形式施用。在某些实施方案中，将药物组合物以能够在施用后形成储库的制剂的形式施用。在某些优选实施方案中，储库将EV(例如，外来体)缓慢释放到循环中，或以储库形式保持。

通常，药学上可接受的组合物被高度纯化为不含污染物，是生物相容的并且无毒，并且适合于向受试者施用。如果水是载剂的成分，则将水高度纯化并处理成不含污染物(例如，内毒素)。

药学上可接受的载剂可以是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和/或矿物油，但不限于此。药物组合物还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、增味剂、乳化剂、悬浮剂和/或防腐剂。

本文所述的药物组合物包含本文所述的EV(例如，外来体)和任选的药物活性剂或治疗剂和/或诊断剂。治疗剂可以是生物剂、小分子剂或核酸剂。诊断剂可以是例如造影剂。

提供了包含药物组合物的剂型，所述药物组合物包含本文所述的EV(例如，外来体)。在一些实施方案中，所述剂型被配制成用于静脉内注射的液体悬浮液。在一些实施方案中，所述剂型被配制成用于瘤内注射的液体悬浮液。

在某些实施方案中，使本公开的EV(例如，外来体)制剂经受辐照，例如X射线、γ射线、β粒子、α粒子、中子、质子、元素核、紫外线，以破坏残余具有复制能力的核酸。

在某些实施方案中，使用超过1kGy、5kGy、10kGy、15kGy、20kGy、25kGy、30kGy、35kGy、40kGy、50kGy、60kGy、70kGy、80kGy、90kGy、100kGy或超过100kGy的辐照剂量对本公开的EV(例如，外来体)制剂进行γ辐照。

在某些实施方案中，使用超过0.1kGy、0.5kGy、1kGy、5kGy、10kGy、15kGy、20kGy、25kGy、30kGy、35kGy、40kGy、50kGy、60kGy、70kGy、80kGy、90kGy、100kGy、200kGy、300kGy、400kGy、500kGy、600kGy、700kGy、800kGy、900kGy、1000kGy、2000kGy、3000kGy、4000kGy、5000kGy、6000kGy、7000kGy、8000kGy、9000kGy、10000kGy或的辐照剂量对本公开的EV(例如，外来体)制剂进行X射线辐照。

本公开的EV(例如，外来体)可以与其它药物同时使用。具体而言，本公开的EV(例如，外来体)可以与诸如激素治疗剂、化学治疗剂、免疫治疗剂、抑制细胞生长因子或细胞生长因子受体的作用的药物等的药物一起使用。

VIII.治疗用途

本公开提供了治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，其包括向所述受试者施用包含本公开的EV(例如外来体)的组合物。本公开也提供了预防或改善有需要的受试者的疾病或疾患的症状的方法，其包括向所述受试者施用包含本公开的EV(例如，外来体)的组合物。本公开还提供了诊断有需要的受试者的疾病或疾患的方法，其包括向所述受试者施用包含本公开的EV(例如，外来体)的组合物。还提供了本公开的EV(例如，外来体)，其用于疗法中，用作药物，用于治疗有需要的受试者的疾病或疾患，用于预防或改善有需要的受试者的疾病或疾患的症状，或者用于诊断有需要的受试者的疾病或疾患。

在一个实施方案中，所述疾病或病症是癌症、炎性疾病、神经变性病症、中枢神经疾病或代谢性疾病。

本公开还提供了预防并且/或者治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用本文公开的EV(例如，外来体)。在一些实施方案中，可用本发明方法治疗的疾病或病症包括癌症、移植物抗宿主疾病(GvHD)、自身免疫性疾病、感染性疾病或纤维化疾病。在一些实施方案中，治疗是预防性的。在其它实施方案中，本公开的EV(例如，外来体)用于诱导免疫反应。在其它实施方案中，本公开的EV(例如，外来体)用于给受试者接种疫苗。在一些实施方案中，所述疾病或病症为癌症。

在一些实施方案中，所述疾病或病症为传染病。在某些实施方案中，所述疾病或病症为致癌病毒。在一些实施方案中，可以用本公开治疗的传染性疾病包括但不限于人γ疱疹病毒4(Epstein Barr病毒)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、巨细胞病毒、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)、HIV-1、HIV-2、冠状病毒(例如，MERS-CoV和SARS CoV)、丝状病毒(例如，马堡和埃博拉病毒)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、疟原虫属的种(例如，间日疟原虫和恶性疟原虫)、基孔肯雅病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人疱疹病毒8、单纯疱疹病毒2(HSV2)、克雷伯菌属某一种(Klebsiella sp.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肠球菌属某一种(Enterococcus sp.)、变形杆菌属某一种(Proteus sp.)、肠杆菌属某一种(Enterobacter sp.)、放线菌属某一种(Actinobacter sp.)、凝固酶-阴性葡萄球菌属(coagulase-negative staphylococci)(CoNS)、支原体属某一种(Mycoplasma sp.)或其组合。

在一些实施方案中，将EV(例如，外来体)静脉内施用至受试者的循环系统。在一些实施方案中，将EV(例如，外来体)在合适的液体中输注以及施用至受试者的静脉中。

在一些实施方案中，将EV(例如，外来体)动脉内施用至受试者的循环系统。在一些实施方案中，将EV(例如，外来体)在合适的液体中输注以及施用至受试者的动脉中。

在一些实施方案中，将EV(例如，外来体)通过鞘内施用向受试者施用。在一些实施方案中，将EV(例如，外来体)通过注射到脊椎管或蛛网膜下腔中来施用，使得其到达脑脊髓液(CSF)。

在一些实施方案中，将EV(例如，外来体)瘤内施用至受试者的一个或多个肿瘤中。

在一些实施方案中，将EV(例如，外来体)通过鼻内施用向受试者施用。在一些实施方案中，可以将EV(例如，外来体)以局部施用或全身施用的形式通过鼻子吹入。在某些实施方案中，将EV(例如，外来体)以鼻喷雾剂的形式施用。

在一些实施方案中，将EV(例如，外来体)通过腹膜内施用向受试者施用。在一些实施方案中，将EV(例如，外来体)注入合适的液体并注射到受试者的腹膜中。在一些实施方案中，腹膜内施用导致EV(例如，外来体)分布到淋巴管中。在一些实施方案中，腹膜内施用导致EV(例如，外来体)分布到胸腺、脾和/或骨髓中。在一些实施方案中，腹膜内施用导致EV(例如，外来体)分布到一个或多个淋巴结中。在一些实施方案中，腹膜内施用导致EV(例如，外来体)分布到子宫颈淋巴结、腹股沟淋巴结、纵隔淋巴结或胸骨淋巴结中的一种或多种中。在一些实施方案中，腹膜内施用导致EV(例如，外来体)分布到胰腺中。

在一些实施方案中，将EV(例如，外来体)通过眼周施用向受试者施用。在一些实施方案中，将EV(例如，外来体)注射到眼周组织中。眼周药物的施用包括结膜下、前筋膜囊下(anterior sub-Tenon’s)、后筋膜囊下(posterior sub-Tenon’s)和眼球后施用途径。

IX.试剂盒

本公开还提供了包含本公开的一种或多种EV(例如，外来体)和任选地使用说明的试剂盒或制品。在一些实施方案中，试剂盒或制品包含本文所述的药物组合物，其包含至少一种本公开的EV(例如，外来体)和使用说明。

在一些实施方案中，试剂盒或制品包含在一个或多个容器中的至少一种本公开的EV(例如，外来体)或含有所述EV(例如，外来体)的药物组合物。本领域技术人员将容易认识到，本公开的EV(例如，外来体)、含有本公开的EV(例如，外来体)的药物组合物或其组合可被容易地掺入已建立的试剂盒形式之一中，所述试剂盒形式在本领域中是公知的。

在一些实施方案中，试剂盒或制品包含(i)EV(例如外来体)，(ii)一种或多种有效载荷，例如生物活性分子，(ii)试剂，其将所述一种或多种有效载荷(例如，生物活性分子)共价附接至所述EV(例如，外来体)，或(iv)其任意组合，以及进行反应以将所述一种或多种有效载荷(例如，生物活性分子)共价附接至EV(例如，外来体)的说明。

在一些实施方案中，试剂盒包含将有效载荷(例如，生物活性分子)与EV(例如，外来体)缀合的试剂，以及进行所述缀合的说明。

除非另外指示，否则本公开的实践将采用在本领域技术人员的技术之内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。文献中详尽地说明了此类技术。参见，例如，Sambrook等人，编辑(1989)Molecular Cloning ALaboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人，编辑(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(Cold Springs HarborLaboratory,NY)；D.N.Glover编辑，(1985)DNA Cloning，第I卷和第II卷；Gait，编辑(1984)Oligonucleotide Synthesis；Mullis等人美国专利第4,683,195号；Hames和Higgins，编辑(1984)Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins，编辑(1984)Transcription AndTranslation；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(Alan R.Liss,Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)A Practical GuideTo Molecular Cloning；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Miller和Calos编辑(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,(ColdSpring Harbor Laboratory)；Wu等人，编辑，Methods In Enzymology，第154卷和第155卷；Mayer和Walker，编辑(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press,London)；Weir和Blackwell，编辑，(1986)Handbook Of ExperimentalImmunology，第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986)；)；Crooke,Antisense drugTechnology:Principles,Strategies and Applications，第2版CRC Press(2007)以及在Ausubel等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley和Sons,Baltimore,Md.)中。

序列

实施例

提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供如何进行和使用本公开的完整公开和描述，并且不意图限制发明人所认为的本公开范围，也不意图代表以下实验为所进行的所有或仅有的实验。已经努力确保关于所使用的数值(例如，用量、温度等)的准确性，但也应考虑一些实验误差和偏差。

除非另外指出，否则份数为重量份，分子量为平均分子量，温度以摄氏度计，并且压力为大气压或接近大气压。可使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；nt，核苷酸等。

除非另外指示，否则本公开的实践将采用在本领域技术人员的能力之内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。文献中详尽地说明了此类技术。参见，例如，T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freemanand Company,1993)；AL.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,currentaddition)；Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编辑，Academic Press,Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences，第21版(Easton,Pennsylvania:MackPublishing Company,2005)；Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)第A卷和第B卷(1992)。

实施例1

鉴定足以装载内腔外来体有效载荷的最小蛋白质序列

为了鉴定促进装载的12个氨基酸的截短与未能促进装载的6个氨基酸的截短之间的最小BASP1氨基酸序列(如上所示)，产生与

BASP1的位置6处的丝氨酸在物种间以及在MARCKS和MARCKSL1中高度保守。为了确定该氨基酸是否是将有效载荷装载到外来体中所需的，用编码BASP1 1-30-

BASP1的前30个氨基酸包含上面鉴定的N端前导序列，其后是富含赖氨酸的氨基酸区段。为了了解MARCKS和MARCKSL1 N端是否可以像BASP1一样装载外来体，用MARCKS和MARCKSL1全长蛋白质或与

MARCKS的氨基酸152-173和MARCKSL1的氨基酸87-110富含赖氨酸，并散布着苯丙氨酸和丝氨酸残基，并且预期是磷酸化位点结构域(PSD)或效应结构域(ED)(图4)。用将MARCKS的氨基酸1-3与PSD结构域融合的质粒构建体(MG-PSD)稳定地转染HEK293SF细胞。在预测的豆蔻酰化位点(MA-PSD)和位置6(K6S和K6A)处产生单个点突变，以确定这些残基在装载外来体中的作用(图5A)。纯化的外来体的蛋白质印迹表明，与BASP1 1-30的阳性对照相比，MG-PSD和MA-PSD均不能高效装载外来体。有趣的是，K6A和K6S突变导致装载的改善，表明位置6处的正电荷阻止了外来体有效载荷的装载，并且MARCKS的PSD可以在功能上与内源性N端序列互补(图5B)。综上所述，这些研究允许鉴定足以将有效载荷加载到外来体中的几个基序(图6)。

最窄的基序，基序1允许不含第一Met的(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO:118)或(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K)(SEQ ID NO:202)的蛋白质序列，其中每个括号里面的字母或字母组是一个氨基酸位置，并且其中另外地位置5不能是带正电荷的氨基酸(K/R/H)，并且位置6不能是带负电荷的氨基酸(D/E)。

基序1的亚基序包括但不限于以下蛋白质序列：

(M)(G)(G)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO：180)、

(G)(G)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO：191)

(M)(G)(A)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO：181)、

(G)(A)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO：192)、

(M)(G)(S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO：182)、

(G)(S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO：193)、

(M)(G)(G/A/S)(K)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO：183)、

(G)(G/A/S)(K)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO：194)、

(M)(G)(G/A/S)(Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO：184)、

(G)(G/A/S)(Q)(L/F/S/Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO：195)、

(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO：185)、

(G)(G/A/S)(K/Q)(L)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO：196)、

(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(F)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO：186)、

(G)(G/A/S)(K/Q)(F)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO：197)、

(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(S)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO：187)、

(G)(G/A/S)(K/Q)(S)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO：198)、

(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO：188)、

(G)(G/A/S)(K/Q)(Q)(S/A)(K)(K) (SEQ ID NO：199)、

(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S)(K)(K) (SEQ ID NO：189)、

(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(S)(K)(K) (SEQ ID NO：200)、

(M)(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(A)(K)(K) (SEQ ID NO：190)和

(G)(G/A/S)(K/Q)(L/F/S/Q)(A)(K)(K) (SEQ ID NO：201)，

其中位置5不能是带正电荷的氨基酸(K/R/H)，并且位置6不能是带负电荷的氨基酸(D/E)。

基序2(一种更广泛的基序)可表示为不含第一Met的(M)(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)或(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)，其中每个括号里面的位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、GlV、Ala、Ser)组成的组的任意氨基酸，ξ是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)组成的组的任意氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任意氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)。关于氨基酸的命名，参见R.Aasland等人，FEBS Letters 513(2002):141-144。

基序3(一种最广泛的基序)可表示为不含第一Met的(M)(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)或(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)，其中每个括号里面的位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任意氨基酸，X是任意氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任意氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任意氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在基序1-3的所有情况下，该序列可被一个氨基酸截短为长度为七个总氨基酸(即，按基序1-3中呈现的顺序由氨基酸1-7组成)。源自基序1、2或3(或这些缺少氨基酸7的基序)中的任一个的任何序列均可用于将有效载荷装载到外来体中，其程度与全长BASP1或BASP1的天然截短序列相同或相当。对氨基酸序列-结构-功能的深入分析为对生产者细胞将生物表达的有效载荷导入外来体的需求提供了新颖的见解。

实施例2

BASP1的N端足以装载不同类别的蛋白质

实施例1中的结果表明，BASP1的N端可以是有用的工程化支架，用于直接从生产者细胞产生内腔装载的外来体。为了检验该假设，产生了稳定的HEK293SF细胞以表达与BASP1的氨基酸1-30或1-10融合的具有密码子优化的全长Cas9蛋白(如Zetsche B,Volz SE,Zhang F.A split-Cas9 architecture for inducible genome editing andtranscription modulation.Nat Biotechnol.2015年2月；33(2):139-42中所述)。如上所述，从细胞培养物中纯化外来体，并使用抗Cas9抗体(Abcam；目录号ab191468，克隆7A9-3A3)通过SDS-PAGE和蛋白质印迹进行分析。如图7A所示，BASP1 1-30和1-10都足以将Cas9装载在外来体中。重组Cas9蛋白用作蛋白质印迹的阳性对照。来自蛋白质印迹实验的重组Cas9和BASP1-Cas9外来体泳道的光密度测定法定量和各种量的的比较揭示，外来体装载了4-5个Cas9分子/外来体(图7B)。与上文所示的GFP实验相比，这种Cas9酶的质量为约160kDa，表示有效载荷大小显著增加。

作为可作为与BASP1的N端的融合物进行装载的有效载荷蛋白的多样性的另一个验证，卵清蛋白以与BASP1的氨基酸1-10的融合物(“BASP1(1-10)-OVA”)的形式在HEK293SF细胞中稳定表达。使用第二选择标记，用相同的质粒和编码与外来体特异性表面糖蛋白PTGFRN融合的三聚体CD40L(“3xCD40L-PTGFRN”)的第二质粒共转染单独的细胞系。从两种转染的细胞培养物中纯化外来体，并通过SDS-PAGE(图8A)和抗卵清蛋白免疫印迹(Abcam；目录号ab17293，克隆6C8)(图8B)进行分析。作为对照，在单独的凝胶中滴定重组卵清蛋白(InvivoGen；目录号vac-pova)。当卵清蛋白作为单个构建体与BASP1的氨基酸1-10融合时，或者当与额外的过表达质粒(3xCD40L-PTGFRN)组合时，卵清蛋白被强有力地装载到外来体中。这一结果表明，可将外来体与内腔有效载荷和与来自单独转录物的同时表面有效载荷(例如，PTGFRN)组合工程化。

另一类可用于治疗性外来体的情形下的蛋白质是抗体和抗体片段。靶向GFP的单链骆驼科纳米抗体(如Caussinus E,Kanca O,Affolter M.Fluorescent fusion proteinknockout mediated by anti-GFP nanobody.Nat Struct Mol Biol.2011年12月11日；19(1):117-21中所述)在HEK293SF细胞中稳定地表达为与BASP1的氨基酸1-10和

实施例3

BASP1的N端可用于将核酸装载在外来体的内腔中

核酸，并且特别是RNA(例如，mRNA、siRNA、miRNA)是一类有吸引力的治疗有效载荷，待被装载在治疗性外来体的内腔中。RNA的外来体装载可以保护RNA在细胞外环境中不被降解，并且装载的外来体可通过额外水平的外来体工程化(例如，靶向构建体的表面表达)被导向某些细胞和/或组织。为了了解是否可以用上述鉴定的EV(例如，外来体)蛋白(或蛋白片段)来产生载有mRNA的外来体，产生了组合工程化的外来体。如图10所示，BASP1的氨基酸1-30表达为与

分离稳定地表达BASP1-MCP和萤光素酶-MS2 mRNA的细胞，并通过RT-qPCR(FWD引物：5’-TGGAGGTGCTCAAAGAGTTG-3’(SEQ ID NO:119)；REV引物：5’-TTGGGCGTGCACTTGAT-3’(S EQ ID NO:120)；探针：5’-/56-FAM/CAGCTTTCC/ZEN/GGGCATT GGCTTC/3IABkFQ/-3’(SEQID NO:121))定量总萤光素酶mRNA。未转染的细胞表达的荧光素酶水平低于所有表达811的细胞，后者表达的荧光素酶水平相当(图12A，上图)。还通过RT-qPCR分析了来自每个稳定细胞系的纯化的外来体。天然外来体没有可检测水平的萤光素酶MS2，而单独表达811的细胞具有可检测但非常低的水平的萤光素酶MS2。重要的是，每种BASP1-MCP融合蛋白都含有更大量的萤光素酶-MS2 mRNA，证明了MCP与MS2之间的结合对于促进m RNA装载到外来体中的重要性(图12A，下图)。各组间相对mRNA的定量表明，所有的BASP1-MCP融合物的富集度约为单独的811的约30-60倍(图12B)。包含二聚体MCP V29I/N55K的BASP1-MCP构建体821经预测对MS2 mRNA具有最大的亲和力，并且在该实验中确实包含最大量的萤光素酶-MS2。这些结果表明，BASP1片段是用于为外来体的内腔装载包括核酸在内的各种有效载荷的强效且通用的支架蛋白。

实施例4

BASP1、MARCKS和MARCKSL1可用于产生表面装饰的外来体

先前实验中的结果表明，MARCKS、MARCKSL1和BASP1的全长和N端区域可用于产生内腔装载的外来体。为了进一步探索这些蛋白质用于外来体工程化的潜力，将MARCKS、MARCKSL1和BASP1的氨基酸1-30或BASP1的氨基酸1-10与表达为同三聚体的CD40L的内源性跨膜区融合。为CD40L的人和小鼠序列制备构建体，因为配体不与另外物种上的同源受体交叉反应(图13)。从用CD40L表达构建体之一稳定转染的HEK293SF细胞中纯化外来体，并将其在小鼠或人B细胞中孵育。通过CD40L ELISA(对于人CD40L的测量，使用R&D Systems，目录号DCDL40，批号P168248；以及对于小鼠CD40L的测量，使用Abcam，目录号ab119517，批号GR3218850-2)定量外来体上的输入CD40L数量，使用B细胞标志物CD19对B细胞进行定量，并通过对CD69阳性的设门细胞的百分比来测量B细胞活化。在物种匹配的培养物中，小鼠(图14A)或人(图14B)的外来体CD40L的剂量滴定曲线显示了基于颗粒对颗粒或者当彼此比较时的构建体之间的相当活性(左图和下表)，以及基于CD40L摩尔的等量重组蛋白之间的相当活性(右图和下表)。当CD40L构建体也作为单体表达时，观察到相当的活性，并且仅比在PTGFRN的N端上表达的三聚体CD40L稍弱，PTGFRN是一种高密度外来体展示支架(参见，例如，国际专利申请第PCT/US2018/048026号)(图14C)。这些结果表明MARCKS、MARCKSL1和BASP1是多样性的、强效的支架，可用于产生用于人和动物应用的各种工程化的外来体。

实施例5

不同细胞类型表达BASP1、MARCKS和/或MARCKSL1

使来自不同的起源组织的细胞系(HEK293，肾；HT1080，结缔组织；K562，骨髓；MDA-MB-231，乳腺；Raji，淋巴母细胞)生长至对数生长期，并转移至补充有耗尽外来体的血清的培养基中约6天，HEK293细胞除外，其生长在化学成分确定的培养基中。将骨髓来源的间充质干细胞(MSC)在3D微载剂上生长5天，并用无血清培养基中补充3天。分离每个细胞系培养物的上清液，并使用上述OPTIPREP

实施例6

过表达BASP1的非人细胞产生内腔工程化的外来体

实施例5中的结果证明许多人来源的细胞天然表达BASP1和另一种新型EV。为了确定BASP1是否可用作通用的外来体支架蛋白，用表达与

***

应当理解，具体实施方式部分，而不是发明内容和摘要部分，旨在用于解释权利要求。发明内容和摘要部分可以阐述一个或多个本发明人所设想的本公开的一个或多个但不是所有的示例性实施方案，因此，并不旨在以任何方式限制本公开和所附权利要求。

上面已经借助于说明指定功能的实现及其关系的功能构建块描述了本公开。为了描述的方便，这些功能构建块的边界在本文中被任意界定。只要适当地执行指定的功能及其关系，就可以界定替代边界。

通过引用并入

本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其它文件出于所有目的据此通过引用以其整体并入本文，其程度就如同每个单独的出版物、专利、专利申请或其它文件出于所有目的被单独指示通过引用并入。

等效案

本公开尤其地提供了用于在EV(例如，外来体)中富集外源蛋白质的包含经修饰的外源蛋白质和肽的EV(例如，外来体)的组合物。本公开还提供了产生富集的EV(例如，外来体)的方法。虽然已经示出和描述了各种具体实施方案，但上述说明不是限制性的。本公开的广度和范围不应受任何上述示例性实施方案的限制，而应仅根据以下权利要求及其等同物来限定。应当理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以进行各种改变。在阅读本说明书后，许多变化对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

本申请要求2018年11月16日提交的国际申请第PCT/US2018/061679号和2019年4月17日提交的美国临时申请第62/835,430号的权益，所述申请通过引用以其整体并入本文。

序列表

<110> 科迪亚克生物科学公司

<120> 工程化的细胞外囊泡及其用途

<130> 4000.041PC01/C-K/BMD

<140> PCT/US2018/061679

<141> 2018-11-16

<150> US 62/835,430

<151> 2019-04-17

<160> 425

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 332

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MARCKS蛋白

<400> 1

Met Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala

1 5 10 15

Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala Ser Ser Pro Ser Lys Ala Asn

20 25 30

Gly Gln Glu Asn Gly His Val Lys Val Asn Gly Asp Ala Ser Pro Ala

35 40 45

Ala Ala Glu Ser Gly Ala Lys Glu Glu Leu Gln Ala Asn Gly Ser Ala

50 55 60

Pro Ala Ala Asp Lys Glu Glu Pro Ala Ala Ala Gly Ser Gly Ala Ala

65 70 75 80

Ser Pro Ser Ala Ala Glu Lys Gly Glu Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro

85 90 95

Glu Ala Gly Ala Ser Pro Val Glu Lys Glu Ala Pro Ala Glu Gly Glu

100 105 110

Ala Ala Glu Pro Gly Ser Pro Thr Ala Ala Glu Gly Glu Ala Ala Ser

115 120 125

Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ser Pro Lys Ala Glu Asp Gly Ala Thr Pro

130 135 140

Ser Pro Ser Asn Glu Thr Pro Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe

145 150 155 160

Lys Lys Ser Phe Lys Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys

165 170 175

Glu Ala Gly Glu Gly Gly Glu Ala Glu Ala Pro Ala Ala Glu Gly Gly

180 185 190

Lys Asp Glu Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Gly

195 200 205

Ala Ala Ser Gly Glu Gln Ala Ala Ala Pro Gly Glu Glu Ala Ala Ala

210 215 220

Gly Glu Glu Gly Ala Ala Gly Gly Asp Pro Gln Glu Ala Lys Pro Gln

225 230 235 240

Glu Ala Ala Val Ala Pro Glu Lys Pro Pro Ala Ser Asp Glu Thr Lys

245 250 255

Ala Ala Glu Glu Pro Ser Lys Val Glu Glu Lys Lys Ala Glu Glu Ala

260 265 270

Gly Ala Ser Ala Ala Ala Cys Glu Ala Pro Ser Ala Ala Gly Pro Gly

275 280 285

Ala Pro Pro Glu Gln Glu Ala Ala Pro Ala Glu Glu Pro Ala Ala Ala

290 295 300

Ala Ala Ser Ser Ala Cys Ala Ala Pro Ser Gln Glu Ala Gln Pro Glu

305 310 315 320

Cys Ser Pro Glu Ala Pro Pro Ala Glu Ala Ala Glu

325 330

<210> 2

<211> 195

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MARCKSL1蛋白

<400> 2

Met Gly Ser Gln Ser Ser Lys Ala Pro Arg Gly Asp Val Thr Ala Glu

1 5 10 15

Glu Ala Ala Gly Ala Ser Pro Ala Lys Ala Asn Gly Gln Glu Asn Gly

20 25 30

His Val Lys Ser Asn Gly Asp Leu Ser Pro Lys Gly Glu Gly Glu Ser

35 40 45

Pro Pro Val Asn Gly Thr Asp Glu Ala Ala Gly Ala Thr Gly Asp Ala

50 55 60

Ile Glu Pro Ala Pro Pro Ser Gln Gly Ala Glu Ala Lys Gly Glu Val

65 70 75 80

Pro Pro Lys Glu Thr Pro Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys

85 90 95

Pro Phe Lys Leu Ser Gly Leu Ser Phe Lys Arg Asn Arg Lys Glu Gly

100 105 110

Gly Gly Asp Ser Ser Ala Ser Ser Pro Thr Glu Glu Glu Gln Glu Gln

115 120 125

Gly Glu Ile Gly Ala Cys Ser Asp Glu Gly Thr Ala Gln Glu Gly Lys

130 135 140

Ala Ala Ala Thr Pro Glu Ser Gln Glu Pro Gln Ala Lys Gly Ala Glu

145 150 155 160

Ala Ser Ala Ala Ser Glu Glu Glu Ala Gly Pro Gln Ala Thr Glu Pro

165 170 175

Ser Thr Pro Ser Gly Pro Glu Ser Gly Pro Thr Pro Ala Ser Ala Glu

180 185 190

Gln Asn Glu

195

<210> 3

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BASP1蛋白

<400> 3

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Thr Glu

20 25 30

Glu Glu Gly Thr Pro Lys Glu Ser Glu Pro Gln Ala Ala Ala Glu Pro

35 40 45

Ala Glu Ala Lys Glu Gly Lys Glu Lys Pro Asp Gln Asp Ala Glu Gly

50 55 60

Lys Ala Glu Glu Lys Glu Gly Glu Lys Asp Ala Ala Ala Ala Lys Glu

65 70 75 80

Glu Ala Pro Lys Ala Glu Pro Glu Lys Thr Glu Gly Ala Ala Glu Ala

85 90 95

Lys Ala Glu Pro Pro Lys Ala Pro Glu Gln Glu Gln Ala Ala Pro Gly

100 105 110

Pro Ala Ala Gly Gly Glu Ala Pro Lys Ala Ala Glu Ala Ala Ala Ala

115 120 125

Pro Ala Glu Ser Ala Ala Pro Ala Ala Gly Glu Glu Pro Ser Lys Glu

130 135 140

Glu Gly Glu Pro Lys Lys Thr Glu Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gln

145 150 155 160

Glu Thr Lys Ser Asp Gly Ala Pro Ala Ser Asp Ser Lys Pro Gly Ser

165 170 175

Ser Glu Ala Ala Pro Ser Ser Lys Glu Thr Pro Ala Ala Thr Glu Ala

180 185 190

Pro Ser Ser Thr Pro Lys Ala Gln Gly Pro Ala Ala Ser Ala Glu Glu

195 200 205

Pro Lys Pro Val Glu Ala Pro Ala Ala Asn Ser Asp Gln Thr Val Thr

210 215 220

Val Lys Glu

225

<210> 4

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BASP1片段

<400> 4

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala

20 25 30

<210> 5

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 5

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu

20 25

<210> 6

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 6

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys

20

<210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 7

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20

<210> 8

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 8

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1 5 10 15

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<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 9

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1 5 10 15

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 10

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1 5 10

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<211> 11

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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1 5 10

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<212> PRT

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<220>

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<212> PRT

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<220>

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<220>

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<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 88

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 97

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 98

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 99

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 100

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 101

Met Gly Ser Lys Gln Ala Lys

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<210> 102

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 102

Met Gly Ser Gln Leu Ser Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 103

Met Gly Ser Gln Leu Ala Lys

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 104

Met Gly Ser Gln Phe Ser Lys

1 5

<210> 105

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 105

Met Gly Ser Gln Phe Ala Lys

1 5

<210> 106

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 106

Met Gly Ser Gln Ser Ser Lys

1 5

<210> 107

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 107

Met Gly Ser Gln Ser Ala Lys

1 5

<210> 108

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 108

Met Gly Ser Gln Gln Ser Lys

1 5

<210> 109

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 109

Met Gly Ser Gln Gln Ala Lys

1 5

<210> 110

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 110

Met Gly Ala Lys Leu Ser Lys Lys Lys

1 5

<210> 111

<211> 167

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 111

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Gly Ser Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly

35 40 45

Ser Gly Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly

50 55 60

Gly Thr Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Ile

65 70 75 80

Ala Glu Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr

85 90 95

Cys Ser Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys

100 105 110

Val Glu Val Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu

115 120 125

Thr Ile Pro Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys

130 135 140

Ala Met Gln Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile

145 150 155 160

Ala Ala Asn Ser Gly Ile Tyr

165

<210> 112

<211> 167

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 112

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Gly Ser Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly

35 40 45

Ser Gly Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly

50 55 60

Gly Thr Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Ile

65 70 75 80

Ala Glu Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr

85 90 95

Cys Ser Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Lys Arg Lys Tyr Thr Ile Lys

100 105 110

Val Glu Val Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu

115 120 125

Thr Ile Pro Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys

130 135 140

Ala Met Gln Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile

145 150 155 160

Ala Ala Asn Ser Gly Ile Tyr

165

<210> 113

<211> 296

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 113

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Gly Ser Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly

35 40 45

Ser Gly Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly

50 55 60

Gly Thr Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Ile

65 70 75 80

Ala Glu Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr

85 90 95

Cys Ser Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys

100 105 110

Val Glu Val Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu

115 120 125

Thr Ile Pro Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys

130 135 140

Ala Met Gln Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile

145 150 155 160

Ala Ala Asn Ser Gly Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

165 170 175

Gly Ser Gly Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn

180 185 190

Gly Gly Thr Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly

195 200 205

Ile Ala Glu Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val

210 215 220

Thr Cys Ser Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile

225 230 235 240

Lys Val Glu Val Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu

245 250 255

Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val

260 265 270

Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala

275 280 285

Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile Tyr

290 295

<210> 114

<211> 296

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 114

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Gly Ser Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly

35 40 45

Ser Gly Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly

50 55 60

Gly Thr Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Ile

65 70 75 80

Ala Glu Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr

85 90 95

Cys Ser Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Lys Arg Lys Tyr Thr Ile Lys

100 105 110

Val Glu Val Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu

115 120 125

Thr Ile Pro Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys

130 135 140

Ala Met Gln Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile

145 150 155 160

Ala Ala Asn Ser Gly Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

165 170 175

Gly Ser Gly Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn

180 185 190

Gly Gly Thr Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly

195 200 205

Ile Ala Glu Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val

210 215 220

Thr Cys Ser Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Lys Arg Lys Tyr Thr Ile

225 230 235 240

Lys Val Glu Val Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu

245 250 255

Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val

260 265 270

Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala

275 280 285

Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile Tyr

290 295

<210> 115

<211> 680

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 115

augaagccca ccgagaacaa cgaagacuuc aacaucgugg ccguggccag caacuucgcg 60

accacggauc ucgaugcuga ccgcgggaag uugcccggca agaagcugcc gcuggaggug 120

cucaaagagu uggaagccaa ugcccggaaa gcuggcugca ccaggggcug ucugaucugc 180

cugucccaca ucaagugcac gcccaagaug aagaaguuca ucccaggacg cugccacacc 240

uacgaaggcg acaaagaguc cgcacagggc ggcauaggcg aggcgaucgu cgacauuccu 300

gagauuccug gguucaagga cuuggagccc uuggagcagu ucaucgcaca ggucgaucug 360

uguguggacu gcacaacugg cugccucaaa gggcuugcca acgugcagug uucugaccug 420

cucaagaagu ggcugccgca acgcugugcg accuuugcca gcaagaucca gggccaggug 480

gacaagauca agggggccgg uggugacuaa ggauccaucg auaagcuuca ucgaaacaug 540

aggaucaccc auaucugcag ucgacaucga aacaugagga ucacccaugu cugcagucga 600

caucgaaaca ugaggaucac ccaugucugc agucgacauc gaaacaugag gaucacccau 660

gucugcaguc gacaucgaaa 680

<210> 116

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可为任意天然存在的氨基酸

<400> 116

Met Gly Xaa Lys Leu Ser Lys Lys Lys

1 5

<210> 117

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可为任意天然存在的氨基酸

<400> 117

Met Gly Xaa Lys Leu Ser Lys Lys Lys

1 5

<210> 118

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = G, A, S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(3)

<223> Xaa = K, Q

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可为任意天然存在的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = L, F, S, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = S, A

<400> 118

Met Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Lys

1 5

<210> 119

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 119

tggaggtgct caaagagttg 20

<210> 120

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 120

ttgggcgtgc acttgat 17

<210> 121

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 121

gggcattggc ttc 13

<210> 122

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 122

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Ala

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly

50 55 60

<210> 123

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 123

Met Ala Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Ala

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly

50 55 60

<210> 124

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 124

Met Gly Ala Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Ala

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly

50 55 60

<210> 125

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 125

Met Ala Ala Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Ala

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly

50 55 60

<210> 126

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 126

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Ser Ala Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val

35 40 45

Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly

50 55

<210> 127

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 127

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp

20 25 30

Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly

35 40 45

Glu Glu Leu Phe Thr Gly

50

<210> 128

<211> 51

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 128

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Glu Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp

20 25 30

Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu

35 40 45

Phe Thr Gly

50

<210> 129

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 129

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp

20 25 30

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly

35 40 45

<210> 130

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 130

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Ser

1 5 10 15

Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly

35 40 45

<210> 131

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 131

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Ser Ala Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly

35 40

<210> 132

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 132

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys

20 25 30

Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly

35

<210> 133

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 133

Met Gly Gly Lys Leu Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys

1 5 10 15

Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu

20 25 30

Leu Phe Thr Gly

35

<210> 134

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 134

Met Gly Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp

1 5 10 15

Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr

20 25 30

Gly

<210> 135

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 135

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Ser Ala

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Ser Val Ser Lys Gly

50

<210> 136

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 136

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Ser Ala Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

Val Ser Lys Gly

35

<210> 137

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 137

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Ser Ala Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val

20 25 30

Ser Lys Gly

35

<210> 138

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 138

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Ser Ala Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser

20 25 30

Lys Gly

<210> 139

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 139

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys

20 25 30

Gly

<210> 140

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 140

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp

1 5 10 15

Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly

20 25 30

<210> 141

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 141

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr

1 5 10 15

Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly

20 25 30

<210> 142

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 142

Met Gly Gly Lys Leu Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys

1 5 10 15

Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly

20 25 30

<210> 143

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 143

Met Gly Gly Lys Leu Asp Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala

20 25 30

<210> 144

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 144

Met Gly Gly Lys Leu Ala Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala

20 25 30

<210> 145

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 145

Met Gly Gly Lys Gln Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala

20 25 30

<210> 146

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 146

Met Gly Ala Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe

1 5 10 15

Lys Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys Glu Ala

20 25 30

<210> 147

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 147

Met Ala Ala Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe

1 5 10 15

Lys Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys Glu Ala

20 25 30

<210> 148

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 148

Met Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe

1 5 10 15

Lys Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys Glu Ala

20 25 30

<210> 149

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 149

Met Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Pro Phe

1 5 10 15

Lys Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys Glu Ala

20 25 30

<210> 150

<211> 153

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 150

Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Ser Ala Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly

20 25 30

Ser Gly Phe Glu Met Asp Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala

35 40 45

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

50 55 60

Phe Pro Val Asn Arg Tyr Ser Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly

65 70 75 80

Lys Glu Arg Glu Trp Val Ala Gly Met Ser Ser Ala Gly Asp Arg Ser

85 90 95

Ser Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp

100 105 110

Ala Arg Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

115 120 125

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Val Asn Val Gly Phe Glu Tyr Trp Gly

130 135 140

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

145 150

<210> 151

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 效应子结构域

<400> 151

Lys Lys Lys Lys

1

<210> 152

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 效应子结构域

<400> 152

Lys Lys Lys Lys Lys

1 5

<210> 153

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 效应子结构域

<400> 153

Arg Arg Arg Arg

1

<210> 154

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 效应子结构域

<400> 154

Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 155

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 效应子结构域

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(4)

<223> Xaa = K, R

<400> 155

Xaa Xaa Xaa Xaa

1

<210> 156

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 效应子结构域

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(5)

<223> Xaa= K, R

<400> 156

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 157

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 157

Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys

1 5

<210> 158

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 158

Gly Ala Lys Leu Ser Lys Lys

1 5

<210> 159

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 159

Gly Gly Lys Gln Ser Lys Lys

1 5

<210> 160

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 160

Gly Gly Lys Leu Ala Lys Lys

1 5

<210> 161

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 162

Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Ser

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 163

Gly Ala Lys Leu Ser Lys Lys Lys

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

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Gly Ala Lys Leu Ser Lys Lys Ser

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 165

Gly Gly Lys Gln Ser Lys Lys Lys

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 166

Gly Gly Lys Gln Ser Lys Lys Ser

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 167

Gly Gly Lys Leu Ala Lys Lys Lys

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 168

Gly Gly Lys Leu Ala Lys Lys Ser

1 5

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<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 169

Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn

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<210> 170

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 170

Gly Ala Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn

1 5 10

<210> 171

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 171

Gly Gly Lys Gln Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn

1 5 10

<210> 172

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 172

Gly Gly Lys Leu Ala Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn

1 5 10

<210> 173

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 173

Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Ser Gly Gly

1 5 10

<210> 174

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 174

Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Ser Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 175

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 175

Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Ser Gly Gly Ser Gly

1 5 10

<210> 176

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 176

Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10

<210> 177

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 177

Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 178

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 178

Gly Gly Lys Leu Ser Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Val

1 5 10

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<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 179

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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Met Gly Gly Xaa Xaa Xaa Lys Lys

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa= K, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa= L, F, S, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa= S, A

<400> 181

Met Gly Ala Xaa Xaa Xaa Lys Lys

1 5

<210> 182

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = K, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = L, F, S, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

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<400> 182

Met Gly Ser Xaa Xaa Xaa Lys Lys

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = G, A, S

<220>

<221> MISC_FEATURE

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa= G, A, S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

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<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa= S, A

<400> 184

Met Gly Xaa Gln Xaa Xaa Lys Lys

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = G, A, S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

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<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = S, A

<400> 185

Met Gly Xaa Xaa Leu Xaa Lys Lys

1 5

<210> 186

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = G, A, S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

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<220>

<221> MISC_FEATURE

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<400> 186

Met Gly Xaa Xaa Phe Xaa Lys Lys

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = G, A, S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

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<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = S, A

<400> 187

Met Gly Xaa Xaa Ser Xaa Lys Lys

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = G, A, S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = K, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa = S, A

<400> 188

Met Gly Xaa Xaa Gln Xaa Lys Lys

1 5

<210> 189

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa= G, A, S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

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<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

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<400> 189

Met Gly Xaa Xaa Xaa Ser Lys Lys

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = G, A, S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

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<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

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Met Gly Xaa Xaa Xaa Ala Lys Lys

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<210> 191

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

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<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = L, F, S, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = S, A

<400> 191

Gly Gly Xaa Xaa Xaa Lys Lys

1 5

<210> 192

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = K, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = L, F, S, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = S, A

<400> 192

Gly Ala Xaa Xaa Xaa Lys Lys

1 5

<210> 193

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = K, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = L, F, S, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = S, A

<400> 193

Gly Ser Xaa Xaa Xaa Lys Lys

1 5

<210> 194

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = G, A, S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

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<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = S, A

<400> 194

Gly Xaa Lys Xaa Xaa Lys Lys

1 5

<210> 195

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = G, A, S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = L, F, S, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = S, A

<400> 195

Gly Xaa Gln Xaa Xaa Lys Lys

1 5

<210> 196

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa= G, A, S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa= K, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa= S, A

<400> 196

Gly Xaa Xaa Leu Xaa Lys Lys

1 5

<210> 197

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = G, A, S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = K, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = S, A

<400> 197

Gly Xaa Xaa Phe Xaa Lys Lys

1 5

<210> 198

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = G, A, S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = K, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = S, A

<400> 198

Gly Xaa Xaa Ser Xaa Lys Lys

1 5

<210> 199

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = G, A, S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = K, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = S, A

<400> 199

Gly Xaa Xaa Gln Xaa Lys Lys

1 5

<210> 200

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = G, A, S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = K, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = L, F, S, Q

<400> 200

Gly Xaa Xaa Xaa Ser Lys Lys

1 5

<210> 201

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = G, A, S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = K, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = L, F, S, Q

<400> 201

Gly Xaa Xaa Xaa Ala Lys Lys

1 5

<210> 202

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = G, A, S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa = K, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = L, F, S, Q

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = S, A

<400> 202

Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Lys

1 5

<210> 203

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> N端结构域

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Gly Gly Lys Leu Ser Lys

1 5

<210> 204

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> N端结构域

<400> 204

Gly Ala Lys Leu Ser Lys

1 5

<210> 205

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> N端结构域

<400> 205

Gly Gly Lys Gln Ser Lys

1 5

<210> 206

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> N端结构域

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Gly Gly Lys Leu Ala Lys

1 5

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> N端结构域

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<223> N端结构域

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<223> N端结构域

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<220>

<223> N端结构域

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Lys Lys Lys Ser Gly Gly

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<220>

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Lys Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Lys Lys Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

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<210> 226

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> N端结构域

<400> 226

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 227

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<210> 228

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 228

Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu

1 5 10 15

Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala

20 25

<210> 229

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 229

Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu

1 5 10 15

Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly

20 25

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 230

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Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

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Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu

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Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 232

Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu

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Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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20

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 234

Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu

1 5 10 15

Lys Ala Lys Glu Lys Asp

20

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 235

Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu

1 5 10 15

Lys Ala Lys Glu Lys

20

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<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 236

Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu

1 5 10 15

Lys Ala Lys Glu

20

<210> 237

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 237

Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu

1 5 10 15

Lys Ala Lys

<210> 238

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 238

Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu

1 5 10 15

Lys Ala

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 239

Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp Glu

1 5 10 15

Lys

<210> 240

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 240

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

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Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp

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<210> 242

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 242

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

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Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

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Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 246

Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys

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<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 247

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

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<210> 248

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 248

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys Glu

20 25

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<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 249

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

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20 25

<210> 250

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 250

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys

20 25

<210> 251

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 251

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn

20 25

<210> 252

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 252

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys

20

<210> 253

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 253

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys

20

<210> 254

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 254

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

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Leu Ser Gly Phe Ser Phe

20

<210> 255

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 255

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

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Leu Ser Gly Phe Ser

20

<210> 256

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 256

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

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Leu Ser Gly Phe

20

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<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 257

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gly

<210> 258

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 258

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu Ser

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 259

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 260

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

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<210> 261

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 261

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe

1 5 10 15

<210> 262

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 262

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys

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<210> 263

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 263

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys

1 5 10

<210> 264

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 264

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser Phe

1 5 10

<210> 265

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 265

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe Ser

1 5 10

<210> 266

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 266

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys Arg Phe

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 268

Gly Ala Lys Lys Ser Lys Lys

1 5

<210> 269

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 269

Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys Glu Ala

20 25

<210> 270

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 270

Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys Glu

20 25

<210> 271

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 271

Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys

20 25

<210> 272

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 272

Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys

20 25

<210> 273

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 273

Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn

20 25

<210> 274

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 274

Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys

20

<210> 275

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 275

Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys

20

<210> 276

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 276

Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gly Phe Ser Phe

20

<210> 277

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 277

Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gly Phe Ser

20

<210> 278

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 278

Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gly Phe

20

<210> 279

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 279

Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu Ser Gly

<210> 280

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 280

Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu Ser

<210> 281

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 281

Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

Leu

<210> 282

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 282

Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys

1 5 10 15

<210> 283

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 283

Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe

1 5 10 15

<210> 284

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 284

Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser

1 5 10

<210> 285

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 285

Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys

1 5 10

<210> 286

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 286

Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys

1 5 10

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<212> PRT

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<220>

<223> 支架蛋白

<400> 287

Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser Phe

1 5 10

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys Arg Phe Ser

1 5 10

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys

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Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys

1 5 10 15

Lys Ser Phe Lys Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys

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Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys

1 5 10 15

Lys Ser Phe Lys Leu Ser Gly Phe Ser Phe

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<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys

1 5 10 15

Lys Ser Phe Lys Leu Ser Gly Phe Ser

20 25

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<211> 24

<212> PRT

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<220>

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Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys

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Lys Ser Phe Lys Leu Ser Gly Phe

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<220>

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Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys

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Lys Ser Phe Lys Leu Ser Gly

20

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Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys

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Lys Ser Phe Lys Leu Ser

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Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys

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Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys

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Lys Ser Phe Lys

20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys

1 5 10 15

Lys Ser Phe

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<220>

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Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys

1 5 10 15

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<220>

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Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys

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Lys

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<220>

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Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe

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<220>

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<220>

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Gly Ala Gln Glu Ser Lys Lys Lys Lys Lys

1 5 10

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys

1 5 10 15

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20 25

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<220>

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Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys

1 5 10 15

Pro Phe Lys Leu Ser Gly Leu Ser Phe Lys Arg Asn

20 25

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<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

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Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys

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<212> PRT

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<220>

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Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys

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Pro Phe Lys Leu Ser Gly Leu Ser Phe Lys

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<212> PRT

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<220>

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<400> 319

Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys

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Pro Phe Lys Leu Ser Gly Leu Ser Phe

20 25

<210> 320

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 320

Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys

1 5 10 15

Pro Phe Lys Leu Ser Gly Leu Ser

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<210> 321

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Pro Phe Lys Leu Ser Gly Leu

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<211> 22

<212> PRT

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20

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 324

Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys

1 5 10 15

Pro Phe Lys Leu

20

<210> 325

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 325

Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys

1 5 10 15

Pro Phe Lys

<210> 326

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 326

Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys

1 5 10 15

Pro Phe

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 327

Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys

1 5 10 15

Pro

<210> 328

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 328

Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys

1 5 10 15

<210> 329

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 329

Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys

1 5 10 15

<210> 330

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 330

Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe

1 5 10

<210> 331

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 331

Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser

1 5 10

<210> 332

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 332

Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe

1 5 10

<210> 333

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 333

Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys

1 5 10

<210> 334

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 334

Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys Lys

1 5 10

<210> 335

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 335

Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys Lys

1 5

<210> 336

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 336

Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys Lys

1 5

<210> 337

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 支架蛋白

<400> 337

Gly Ser Gln Ser Ser Lys Lys

1 5

<210> 338

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 338

Gly Gly Lys Phe Ser Lys Lys

1 5

<210> 339

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 339

Gly Gly Lys Phe Ala Lys Lys

1 5

<210> 340

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 340

Gly Gly Lys Ser Ser Lys Lys

1 5

<210> 341

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 341

Gly Gly Lys Ser Ala Lys Lys

1 5

<210> 342

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 342

Gly Gly Lys Gln Ala Lys Lys

1 5

<210> 343

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 343

Gly Gly Gln Leu Ser Lys Lys

1 5

<210> 344

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 344

Gly Gly Gln Leu Ala Lys Lys

1 5

<210> 345

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 345

Gly Gly Gln Phe Ser Lys Lys

1 5

<210> 346

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 346

Gly Gly Gln Phe Ala Lys Lys

1 5

<210> 347

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 347

Gly Gly Gln Ser Ser Lys Lys

1 5

<210> 348

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 348

Gly Gly Gln Ser Ala Lys Lys

1 5

<210> 349

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 349

Gly Gly Gln Gln Ser Lys Lys

1 5

<210> 350

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 350

Gly Gly Gln Gln Ala Lys Lys

1 5

<210> 351

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 351

Gly Ala Lys Leu Ala Lys Lys

1 5

<210> 352

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 352

Gly Ala Lys Phe Ser Lys Lys

1 5

<210> 353

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 353

Gly Ala Lys Phe Ala Lys Lys

1 5

<210> 354

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 354

Gly Ala Lys Ser Ser Lys Lys

1 5

<210> 355

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 355

Gly Ala Lys Ser Ala Lys Lys

1 5

<210> 356

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 356

Gly Ala Lys Gln Ser Lys Lys

1 5

<210> 357

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 357

Gly Ala Lys Gln Ala Lys Lys

1 5

<210> 358

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 358

Gly Ala Gln Leu Ser Lys Lys

1 5

<210> 359

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 359

Gly Ala Gln Leu Ala Lys Lys

1 5

<210> 360

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 360

Gly Ala Gln Phe Ser Lys Lys

1 5

<210> 361

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 361

Gly Ala Gln Phe Ala Lys Lys

1 5

<210> 362

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 362

Gly Ala Gln Ser Ser Lys Lys

1 5

<210> 363

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 363

Gly Ala Gln Ser Ala Lys Lys

1 5

<210> 364

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 364

Gly Ala Gln Gln Ser Lys Lys

1 5

<210> 365

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 365

Gly Ala Gln Gln Ala Lys Lys

1 5

<210> 366

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 366

Gly Ser Lys Leu Ser Lys Lys

1 5

<210> 367

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 367

Gly Ser Lys Leu Ala Lys Lys

1 5

<210> 368

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 368

Gly Ser Lys Phe Ser Lys Lys

1 5

<210> 369

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 369

Gly Ser Lys Phe Ala Lys Lys

1 5

<210> 370

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 370

Gly Ser Lys Ser Ser Lys Lys

1 5

<210> 371

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 371

Gly Ser Lys Ser Ala Lys Lys

1 5

<210> 372

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 372

Gly Ser Lys Gln Ser Lys Lys

1 5

<210> 373

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 373

Gly Ser Lys Gln Ala Lys Lys

1 5

<210> 374

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 374

Gly Ser Gln Leu Ser Lys Lys

1 5

<210> 375

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 375

Gly Ser Gln Leu Ala Lys Lys

1 5

<210> 376

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 376

Gly Ser Gln Phe Ser Lys Lys

1 5

<210> 377

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 377

Gly Ser Gln Phe Ala Lys Lys

1 5

<210> 378

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 378

Gly Ser Gln Ser Ala Lys Lys

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 379

Gly Ser Gln Gln Ser Lys Lys

1 5

<210> 380

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 380

Gly Ser Gln Gln Ala Lys Lys

1 5

<210> 381

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 381

Gly Gly Lys Phe Ser Lys

1 5

<210> 382

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 382

Gly Gly Lys Phe Ala Lys

1 5

<210> 383

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 383

Gly Gly Lys Ser Ser Lys

1 5

<210> 384

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 384

Gly Gly Lys Ser Ala Lys

1 5

<210> 385

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 385

Gly Gly Lys Gln Ala Lys

1 5

<210> 386

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 386

Gly Gly Gln Leu Ser Lys

1 5

<210> 387

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 387

Gly Gly Gln Leu Ala Lys

1 5

<210> 388

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 388

Gly Gly Gln Phe Ser Lys

1 5

<210> 389

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 389

Gly Gly Gln Phe Ala Lys

1 5

<210> 390

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 390

Gly Gly Gln Ser Ser Lys

1 5

<210> 391

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 391

Gly Gly Gln Ser Ala Lys

1 5

<210> 392

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 392

Gly Gly Gln Gln Ser Lys

1 5

<210> 393

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 393

Gly Gly Gln Gln Ala Lys

1 5

<210> 394

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 394

Gly Ala Lys Leu Ala Lys

1 5

<210> 395

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 395

Gly Ala Lys Phe Ser Lys

1 5

<210> 396

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 396

Gly Ala Lys Phe Ala Lys

1 5

<210> 397

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 397

Gly Ala Lys Ser Ser Lys

1 5

<210> 398

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 398

Gly Ala Lys Ser Ala Lys

1 5

<210> 399

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 399

Gly Ala Lys Gln Ser Lys

1 5

<210> 400

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 400

Gly Ala Lys Gln Ala Lys

1 5

<210> 401

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 401

Gly Ala Gln Leu Ser Lys

1 5

<210> 402

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 402

Gly Ala Gln Leu Ala Lys

1 5

<210> 403

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 403

Gly Ala Gln Phe Ser Lys

1 5

<210> 404

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 404

Gly Ala Gln Phe Ala Lys

1 5

<210> 405

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 405

Gly Ala Gln Ser Ser Lys

1 5

<210> 406

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 406

Gly Ala Gln Ser Ala Lys

1 5

<210> 407

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 407

Gly Ala Gln Gln Ser Lys

1 5

<210> 408

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 408

Gly Ala Gln Gln Ala Lys

1 5

<210> 409

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 409

Gly Ser Lys Leu Ser Lys

1 5

<210> 410

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 410

Gly Ser Lys Leu Ala Lys

1 5

<210> 411

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 411

Gly Ser Lys Phe Ser Lys

1 5

<210> 412

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 412

Gly Ser Lys Phe Ala Lys

1 5

<210> 413

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 413

Gly Ser Lys Ser Ser Lys

1 5

<210> 414

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 414

Gly Ser Lys Ser Ala Lys

1 5

<210> 415

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 415

Gly Ser Lys Gln Ser Lys

1 5

<210> 416

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 416

Gly Ser Lys Gln Ala Lys

1 5

<210> 417

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 417

Gly Ser Gln Leu Ser Lys

1 5

<210> 418

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 418

Gly Ser Gln Leu Ala Lys

1 5

<210> 419

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 419

Gly Ser Gln Phe Ser Lys

1 5

<210> 420

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 420

Gly Ser Gln Phe Ala Lys

1 5

<210> 421

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 421

Gly Ser Gln Ser Ser Lys

1 5

<210> 422

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 422

Gly Ser Gln Ser Ala Lys

1 5

<210> 423

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 423

Gly Ser Gln Gln Ser Lys

1 5

<210> 424

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 424

Gly Ser Gln Gln Ala Lys

1 5

<210> 425

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可为任意天然存在的氨基酸

<400> 425

Gly Xaa Lys Leu Ser Lys Lys Lys

1 5