用于磁微粒免疫层析快速反应方法的单克隆抗体

技术领域

本申请涉及生物领域，更具体的涉及生物检测方面，具体涉及用于磁微粒免疫层析快速反应方法的单克隆抗体。

背景技术

Twist是新近发现的凋亡抑制蛋白，其包括Twist1和Twist2两个组分以二聚体形式发挥作用。其过量表达可能促进细胞表型的恶性转化，可能是某些恶性肿瘤发生、发展的关键因素。最初，Twist被认为是一种在胚胎发育中起关键调控作用的转录因子，广泛参与调控器官生长发育、肿瘤发生、细胞增殖分化等过程…。肿瘤细胞和胚胎干细胞都具有迁移特性，但二者之间是否具有相似性是人们研究的热点。Twist蛋白是进化中的一个保守的转录因子，它可以调节胚胎发育过程中的组织重建，并赋予细胞迁移的能力。越来越多的研究发现，Twist在肿瘤的发生和发展过程中也起到重要的作用。最近的研究表明，Twist作为表皮一间叶细胞转换(EMT)过程中的关键调控因子，对肿瘤的侵袭和转移有重要影响。

研究发现，Twist具有癌基因的特征，能编码凋亡抑制蛋白，Twist表达的显著上调可见于浸润性乳腺癌(小叶癌)、弥散性胃癌等恶性程度高、侵袭性强的肿瘤亚型中，但在正常组织和恶性程度低的癌细胞中并无表达。研究证实，Twist能通过多种途径引起肿瘤的发生抑制分化、阻断p53通路、阻碍n-myc的促凋亡作用和抑制核因子KB/肿瘤坏死因子通路等，从而发挥抗凋亡作用。Twia还可通过Akt途径的正性调控作用抑制凋亡。例如，在Twist沉默后被上调的基因中Gadd45a与p53通路诱导的凋亡以及核因子KB信号通路有关，另有研究发现Twist可以作用于p53依赖性和非依赖性通路以及核因子KB通路来调控凋亡，因此推测Twist有可能通过调节Gadd45a的表达来抑制凋亡促进肿瘤恶化。

Twist蛋白的表达可能对肿瘤的侵袭转移起了促进作用，在临床病理上对Twist蛋白表达的检测可作为乳腺癌临床诊断、分期的新指标，还可能为临床判断预后提供参考价值。研究表明，在乳腺癌中Twist蛋白的高表达可能提示肿瘤细胞侵袭转移能力的提高，预示着肿瘤细胞更容易发生浸润和转移。也有研究结果显示，结肠癌组织中Twist蛋白表达阳性率显著高于切端结肠组织，其表达水平的上调可能是结肠癌细胞获得其生物学特性的原因之一。这表明Twist具有癌基因的特征，它的激活可能是结肠癌发生的关键因素。Twist蛋白与结肠癌的发生有关，其可能成为反映结肠癌的临床指标之一。也有研究结果表明，Twist在甲状腺癌组中阳性表达率100％，且为弥漫性强阳性表达。在甲状腺瘤组中为0，甲状腺良性乳头状病变组中仅为7.0％，因此说明在甲状腺乳头状癌中存在着Twist，其癌变过程中有Twist的参与。因此，诊断Twist蛋白的表达变得尤为重要。

免疫层析试纸检测技术是20世纪80年代初发展起来的一种快速检测技术。其基本原理是将生物分子(抗原或抗体)附上标志物，借助标志物的颜色或光电磁等信号放大效应实现微观免疫反应的宏观可视化或可被检出化，达到检测生物分子的口的。随着其检测及应用需求的提高，新的生物分子标志物的应用研究成为该技术研究的热点之一。纳米颗粒又称为超微颗粒，是指颗粒大小为纳米级(一般在1-100nm之间)粒子。纳米颗粒具有大的比表面积，从而导致其光、热、磁敏感特性和表面稳定性等不同于正常粒子，因而在生命科学等领域具有广阔的应用潜能。

纳米磁性颗粒(magneticnanoparticle,MNs)也被称为超顺磁颗粒，是近年来发展起来的一种新型材料，它结合了磁性粒子和纳米材料的优点，具有粒径小、超顺磁性和比表面积大等特性。MNs本身有着很好的生物相容性，其表面可很容易地包埋生物高分子，如多聚糖，蛋白质等形成核壳式结构。典型的是以磁性材料(主要为四氧化三铁等)为固相载体，在其表面引人活性基团，通过藕联反应与酶、抗体等生物分子结合形成生物标志物。由于MNs又具有特殊的超顺磁性，故标记后的生物分子可在外加磁场作用下产生定向移动。其相应的检测装置为一种超导量子干涉装置，通过用磁信号阅读仪检测试纸上的磁信号，可对生物靶分子进行快速、定量检测，在肿瘤诊断等方面已经显示了较好的应用前景。但是目前，针对Twist蛋白的磁微粒免疫层析快速检测还没有建立。

发明内容

本发明根据现有技术的需求，提供了一种针对Twist蛋白的磁微粒免疫层析快速检测试剂盒。

具体的，所述Twist1蛋白的磁微粒免疫层析快速检测试剂盒含有针对Twist1蛋白的单克隆抗体。

具体的，所述单克隆抗体是Twist7G3单克隆抗体作为磁珠标记抗体和Twist4D1单克隆抗体作为T线抗体。

更进一步的，Twist7G3单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

DLVMTQTAPSVPVTPAESVSISCRSTDVNNKDIEILKLYWFLQRPGQSPQLLIYSDGNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCFFMMDKELSFGSGTKLEIK

Twist7G3单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

VKPGGSLKLSCAASDSLQGHIDMSWVRQTPDKRLEWVAISNSWNDMKYYPDSVKGRFTISRDQDKQTLYLQMSSLKSEDTAMYYCMFAFLINMGRLWGQGTTVTVS

Twist4D1单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：

DLVMTQTAPSVPVTRGESVSISCRSTIEHSIIWHMICLYWFLQRPGQSPQLLIYASNNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCNLPPGPMCHFGSGTKLEIK

Twist4D1单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：

VKPGGSLKLSCAASDDPSMLTCMSWVRQTPDKRLEWVAILISPYWWYYYPDSVKGRFTISRDQDKQTLYLQMSSLKSVDTAMYYCNHMGLAFEAAYWGQGTTVTVS。

更进一步的，所述磁微粒免疫层析快速检测试剂盒的制备方法包括如下步骤：

样品垫的制备：样品垫是经过样品垫处理液(0.5％TritonX-100+0.5％BSA溶于0.01M PBS中，pH7.4)预处理的玻璃纤维素膜。

磁珠标记：取2mg磁珠，用500μl PH5的10mM的MEST(0.05％Tween-20)缓冲液洗涤3次并重悬于500μlMES缓冲液中，加入2.5mg的EDC和NHS，25℃偶联4h。用pH9的5mM的BST(0.05％Tween-20)缓冲液洗涤磁珠2次并重悬于500μlBST缓冲液中，再加入200μg的Twist7G3单抗。20℃偶联过夜，期间在垂直旋转混合仪上不断摇动混匀。用磁力架吸附磁珠洗涤，加入含有3％BSA的BST溶液中，封闭过夜，最后将洗涤后的磁珠重悬于保存液中。保存缓冲液：pH9的5mMBST缓冲液，0.05％Tween-20，0.01％NaN3，0.1％BSA。

结合垫的制备：将制备好的磁珠用移液器取5μl的磁珠点在结合垫上，在20-25℃下通风干燥6h，制成免疫磁珠垫。

选用2mg/ml浓度羊抗小鼠的抗体包被试纸条上的C线作为质控线；选用2mg/ml的Twist4D1单抗包被试纸条上的T线,作为检测线；

磁性免疫层析试纸条的组装：室温下，在PVC板上将制备好的样品垫，结合垫，NC膜及吸水垫按次序搭接(2mm)，在Biodot高速试纸条斩切机上切割成4mm宽的试纸条，存放于密封袋中。

更进一步的，本发明还提供了针对Twist1蛋白的单克隆抗体在制备用于样品中Twist1蛋白检测的磁微粒免疫层析快速检测试剂盒中的用途。

具体的，所述试剂盒中还包含有磁珠标记的结合垫、样品垫以及检测线。

更进一步的，本发明的试剂盒可以用于癌症的检测。

更进一步的，所述癌症是乳腺癌、结肠癌、甲状腺乳头状癌等癌症。

更进一步的，所述癌症是乳腺癌。

有益效果

本发明针对肿瘤中的标志物蛋白Twist1蛋白开发了特异性的单克隆抗体，将所述单克隆抗体制备成为磁微粒免疫层析快速检测试剂盒，所述试剂盒能够快速准确的鉴定样品中的Twist1蛋白的含量，在诊断癌症领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1单抗特异性鉴定结果图

图2磁微粒免疫层析检测样品中Twist1蛋白的含量结果图

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

实施例1针对Twist1蛋白单克隆抗体的制备

免疫原为Twist转录因子1(TWIST1)重组蛋白(品牌Abnova，货号H00007291-Q01)。

TWIST1蛋白100μg以PBS稀释至100ul，取100μl福氏完全佐剂混合，充分乳化后注入10周龄Balb/c小鼠腹腔完成初次免疫，共3只。2周后用100μg抗原(100μl)与等量ISA720佐剂混匀后腹腔注射。2周后，ELISA检测小鼠血清效价，3只小鼠血清效价均达到1:10000以上，选择效价最高的2号小鼠进行加强免疫。融合前3d作腹腔注射(用150μg抗原(150μl)与等量ISA720佐剂混匀后腹腔注射)加强免疫。取脾脏，将小鼠脾脏制成脾细胞悬液。具体步骤如下：取脾脏前先制备阳性血清，方法为取加强免疫过的小鼠，眼球放血；处死小鼠并消毒。将小鼠颈椎脱臼处死，置于250mL盛有医用酒精的烧杯中，移至无菌室，浸泡消毒5min，取出放入培养皿中；取脾脏，打开小鼠腹腔，小心取出脾脏置培养皿中，用DMEM基础培养液反复冲洗，并尽可能去除周围结缔组织；制备脾细胞悬液：将脾脏放到灭好菌的不锈钢网筛上(网筛置于另一只盛有少量DMEM基础培养液的培养皿中)，用灭菌小剪刀剪碎，2mL灭菌玻璃注射器芯研磨，使小鼠脾细胞全部通过网孔，进入培养皿中；将脾细胞悬液从培养皿转移至l0mL离心管中，加DMEM基础培养液定容至8mL左右，混匀，1500r/min离心5min，弃上清；再次加入DMEM基础培养液8mL左右，混匀，1500r/min离心5min，弃上清；用8mLDMEM基础培养液重悬沉淀脾细胞，混匀；台盼蓝染色，计数，备用。

将HAT培养液、DMEM基础培养液和50％PEG4000融合剂于37℃水中预温；取1╳10

取健康的雌性Balb/c小鼠12只，先腹腔注射0.5mL灭菌液体石蜡，1周后，将培养的4株杂交瘤细胞株分别用RPMI-1640完全培养液制备成细胞悬液，台盼蓝染色，细胞计数后，将细胞浓度控制为1╳10

纯化抗体效价的检测(间接ELISA法)：用1.25μg/mL的包被抗原TWIST1蛋白包被酶标板，100μL/孔，置4℃冰箱过夜；取出恢复至室温，倾去包被液，加PBST洗液(0.02％pH7.4，磷酸盐缓冲液加吐温-20)，380μL/孔，洗涤5次，每次3min，拍干；封阻：每孔加300μL封阻液，37℃下孵育lh。取出，待恢复至室温后，倾去封阻液，加PBST洗液380μL/孔，洗涤3次，每次3min，拍干；加抗体：加一定浓度的待检纯化抗体(按1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000、1∶128000倍比稀释)100μL，同时设置空白对照孔(加PBS溶液)和阴性孔(只注射灭菌液体石蜡，未注射杂交瘤细胞株的小鼠腹水为阴性腹水)，37℃孵育1h，洗涤5次，每次3min，拍干；加酶标二抗：按说明书推荐每孔加入100μL1∶10000稀释(PBS液稀释)的HRP酶标记的山羊抗鼠IgG，37℃孵育1h后，洗涤5次，每次3min，拍干；显色：每孔加TMB显色液100μL，37℃保温避光反应15min；终止反应：每孔加50μL2NH

表1纯化抗体的效价

从表1的结果可以看出，四个单抗均具有较高的效价。

采用夹心ELISA设计正交试验筛选纯化的单克隆抗体、确定包被和酶标抗体的最佳配对，用已知的TWIST阳性血清作为对象，进行实验。结果如表2所示。

表2单抗和单抗酶标的配对

从表3的数据可以看出，Twist1A6和Twist5H8、Twist7G3和Twist4D1二组抗体互为配对，这二组抗体在对应抗原上的抗原决定簇不同，导致结合抗原时互不影响。而且，在配对时，Twist1A6做包被抗体，Twist5H8做酶标抗体。Twist7G3做包被抗体，Twist4D1做酶标抗体。

实施例2单抗Twist7G3和Twist4D1性能鉴定

(1)、抗体亚型测定

单抗亚类鉴定按鼠单克隆抗体亚类检测试剂盒说明书进行操作。

通过鼠单克隆抗体亚类检测试剂盒对2个单抗进行检测，结果如图1所示，所检测的Twist7G3为IgG1、Twist4D1均为IgG2a，轻链为κ型。

(2)、亲和力鉴定

采用AffinitySensors公司生产的生物传感器IAsysPlus对单克隆抗体的亲和常数进行测定。羧甲基葡聚糖(carboxymethyldextran,CMD)预处理样品池，在样品池中加入不同浓度的免疫原蛋白,5min后用乙醇胺封闭空余羧基3min。然后用1mol/L甲酸洗去游离及非特异结合之蛋白分子。将包被好免疫原的样品池放入生物传感器,平衡10min。基线(baseline):加入pH7.2,0.01mol/L PBS 50μl,等待5min,作一平稳基线。结合(asso-ciation):吸去PBS,加入45μl PBS和5μl单抗,待单抗结合至饱和时吸去单抗液。解离(dissociation):换50μlPBS,待单抗结合与解离达到平衡。再生(regeneration):换20mmol/LHCl 50μl作用2min以完全洗脱结合的单抗。回复基线:换PBS,再次回到基线,即可开始下1个循环。将每种单抗用PBS稀释为5个不同浓度,依次分别测定各浓度单抗与包被抗原结合、解离速率,并通过随机附送之专用软件FASTfit计算各株单抗的亲和常数。结果如表3所示。

表3抗体的亲和常数

从表5的结果可以看出，Twist7G3和Twist4D1这两个单克隆抗体具有较好的亲和能力，结合能力较好。

采用试剂盒提取2个杂交瘤细胞的总RNA，逆转录合成cDNA。设计引物，扩增重链和轻链，测序，测序结果用软件进行分析，经过序列鉴定，获得了单克隆的轻重链序列，其中：

Twist7G3单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

DLVMTQTAPSVPVTPAESVSISCRSTDVNNKDIEILKLYWFLQRPGQSPQLLIYSDGNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCFFMMDKELSFGSGTKLEIK

Twist7G3单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

VKPGGSLKLSCAASDSLQGHIDMSWVRQTPDKRLEWVAISNSWNDMKYYPDSVKGRFTISRDQDKQTLYLQMSSLKSEDTAMYYCMFAFLINMGRLWGQGTTVTVS

Twist4D1单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：

DLVMTQTAPSVPVTRGESVSISCRSTIEHSIIWHMICLYWFLQRPGQSPQLLIYASNNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCNLPPGPMCHFGSGTKLEIK

Twist4D1单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：

VKPGGSLKLSCAASDDPSMLTCMSWVRQTPDKRLEWVAILISPYWWYYYPDSVKGRFTISRDQDKQTLYLQMSSLKSVDTAMYYCNHMGLAFEAAYWGQGTTVTVS。

实施例3单抗Twist7G3和Twist4D1特异性鉴定

取TWIST1蛋白、TWIST2蛋白、GST标签蛋白、BSA、小鼠乳腺癌细胞株4T1裂解液包被ELISA板，包被用量为1.25μg/mL，100μL/孔，置4℃冰箱过夜；取出恢复至室温，倾去包被液，加PBST洗液(0.02％pH7.4，磷酸盐缓冲液加吐温-20)，380μL/孔，洗涤5次，每次3min，拍干；封阻：每孔加300μL封阻液，37℃下孵育lh。取出，待恢复至室温后，倾去封阻液，加PBST洗液380μL/孔，洗涤3次，每次3min，拍干；加抗体：加待检抗体(按1∶4000)100μL，同时设置空白对照孔(加PBS溶液)和阳性对照抗体(TWIST1单克隆抗体M10，Abnova)，37℃孵育1h，洗涤5次，每次3min，拍干；加酶标二抗：按说明书推荐每孔加入100μL1∶10000稀释(PBS液稀释)的HRP酶标记的山羊抗鼠IgG，37℃孵育1h后，洗涤5次，每次3min，拍干；显色：每孔加TMB显色液100μL，37℃保温避光反应15min；终止反应：每孔加50μL2NH

从图1的结果可以看出，本申请制备的单抗Twist7G3和Twist4D1与阳性对照抗体一样，都具有较好的特异性。同时，从检测的OD值也可以看出，本发明制备的2株单抗Twist7G3和Twist4D1其OD值分别是(1.46±0.03)和(1.39±0.04)，比阳性对照抗体的(1.3±0.02)效果要好。

实施例4磁微粒免疫层析检测方法的建立

样品垫的制备：样品垫是经过样品垫处理液(0.5％TritonX-100+0.5％BSA溶于0.01M PBS中，pH7.4)预处理的玻璃纤维素膜。

磁珠标记：取2mg磁珠，用500μl PH5的10mM的MEST(0.05％Tween-20)缓冲液洗涤3次并重悬于500μlMES缓冲液中，加入2.5mg的EDC和NHS，25℃偶联4h。用pH9的5mM的BST(0.05％Tween-20)缓冲液洗涤磁珠2次并重悬于500μlBST缓冲液中，再加入200μg的Twist7G3单抗。20℃偶联过夜，期间在垂直旋转混合仪上不断摇动混匀。用磁力架吸附磁珠洗涤，加入含有3％BSA的BST溶液中，封闭过夜，最后将洗涤后的磁珠重悬于保存液中。保存缓冲液：pH9的5mMBST缓冲液，0.05％Tween-20，0.01％NaN3，0.1％BSA。

结合垫的制备：将制备好的磁珠用移液器取5μl的磁珠点在结合垫上，在20-25℃下通风干燥6h，制成免疫磁珠垫。

选用2mg/ml浓度羊抗小鼠的抗体包被试纸条上的C线作为质控线；选用2mg/ml的Twist4D1单抗包被试纸条上的T线,作为检测线；

磁性免疫层析试纸条的组装：室温下，在PVC板上将制备好的样品垫，结合垫，NC膜及吸水垫按次序搭接(2mm)，在Biodot高速试纸条斩切机上切割成4mm宽的试纸条，存放于密封袋中。

检测方法：将被检Twist1蛋白用阴性血清梯度稀释和阴性血清对照分别平衡至室温，将试纸条平放，在样品垫上加入100μl被检样品，10min后用磁力检测仪(MICT)检测试纸条特定位置上的磁信号，结果采用上述方法制备纳米磁性颗粒标记的免疫层析试纸条，用于检测阴性血清标本，结果显示阴性血清的磁信号为48.6；将Twist1用阴性血清稀释后，浓度为0.1ng/mL Twist1样品的磁信号为287.2。

随机选取5例临床乳腺癌阳性血清样本，以100ng/mL Twist1为阳性对照，以乳腺良性病变为阴性对照，以PBS为空白对照，分别稀释10倍后检测磁信号。根据样品稀释率和磁信号值，计算样本血清中Twist1的初始浓度。结果如图2所示。

从图2的结果可以看出，在5个病例中均检测到浓度大约为4ng/mL左右的Twist1蛋白浓度，比阴性对照的浓度高大约1倍，而阳性对照的检测浓度对应为(9.94±0.21)ng/mL，具有较好的准确度。

应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。

这样，本领域技术人员将了解在基于本公开时的概念可容易用作设计用于执行本发明的若干目的的其他结构、方法和系统的基础。因此，重要的是权利要求书应被认为是包括此类等效结构至它们不背离本发明的精神和范围的程度。