一种天赐霉素免疫脂质体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫脂质体，具体涉及含有天赐霉素的免疫脂质体、制备方法及其在抗癌中的应用，属于生物医药领域。

背景技术

在乳腺癌患者中，HER2在大约30％的肿瘤中高表达，在这些患者中，HER2高表达与生存率降低和疾病进展时间缩短有关。人类乳腺癌细胞中HER2的高表达会增加其固有的转移潜力，HER2的高表达或异常扩增使乳腺癌细胞更具侵略性，从而更有可能转移到大脑。HER2靶向治疗很有前景，因为它针对的是一种高度特异的乳腺癌生长受体蛋白。现有技术通过将HER2抗体与药物分子连接形成抗体-药物结合物的分子靶向治疗也取得了很好的进展，提高了治疗指数。例如，T-DM1在一项2期试验中显示出治疗携带HER2突变的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的初步活性(ORR，44％)(Tarantino P,Carmagnani Pestana R,Corti C,Modi S,Bardia A,Tolaney SM,Cortes J,Soria JC,Curigliano G.Antibody-drugconjugates:Smart chemotherapy delivery across tumor histologies.CA Cancer JClin.2022Mar；72(2):165-182)。

烯二炔天然产物主要由土壤和海洋微生物产生，是含有共轭炔-烯-炔结构的抗肿瘤活性超强的一类小分子化合物。烯二炔显示出对各种癌细胞系的强烈细胞毒性，包括对临床使用的化学疗法具有抗性的细胞系。然而，由于它们的非选择性细胞毒性，烯二炔本身不适合化疗。事实上，只有不到1％的ADCs能够到达人类肿瘤，其余的可能会引起不必要的毒性。

免疫脂质体有可能将大量的药物分子转移到肿瘤细胞中，通过免疫脂质体传递的药物具有类似于或高于单独药物的抗肿瘤活性。免疫脂质体针对肿瘤细胞的能力克服了传统脂质体的许多局限性，为肿瘤靶向药物输送提供了新的策略。但是相关研究表明，通过免疫脂质体递送药物效果提升的程度不可预期。例如，Michael Chen等人开发了一种抗HER2的特异性抗体，用于将mPEG包被的脂质体多柔比星(Lipo-Dox)转化为免疫脂质体，比较单克隆抗体修饰和未修饰的Lipo-Dox之间的体内治疗效果，显示抗HER2-Lipo-Dox组的肿瘤抑制没有显着改善(Chen M,Sheu MT,Cheng TL,Roffler SR,Lin SY,Chen YJ,Cheng YA,Cheng JJ,Chang HY,Wu TY,Kao AP,Ho YS,Chuang KH.A novel anti-tumor/anti-tumor-associated fibroblast/anti-mPEG tri-specific antibody to maximize theefficacy of mPEGylated nanomedicines against fibroblast-rich solidtumor.Biomater Sci.2021Dec 21；10(1):202-215)。

Yanan Li等人报道了一种HER2修饰的热敏脂质体(免疫脂质体)辅助复合物，通过还原表面的金纳米团簇(GTSL-CYC-HER2)获得一种新型的生物质共振结构载体，评估了原位荷瘤小鼠的抗肿瘤作用，GTSL-CYC-HER2@NIR组与GTSL-CYC@NIR组相比肿瘤体积生长抑制率提高了0.5倍(Li Y,Song W,Hu Y,Xia Y,Li Z,Lu Y,Shen Y."Petal-like"size-tunable gold wrapped immunoliposome to enhance tumor deep penetration formultimodal guided two-step strategy.J Nanobiotechnology.2021Sep27；19(1):293)。

Xiaoyan Lu等人报道了西妥昔单抗与载阿法替尼的脂质体结合以形成免疫脂质体，并在荷瘤小鼠中进行了肿瘤生长实验，LP-CTX组与LP组相比肿瘤体积生长抑制率提高了1倍(Lu X,Liu S,Han M,Yang X,Sun K,Wang H,Mu H,Du Y,Wang A,Ni L,ZhangC.Afatinib-loaded immunoliposomes functionalized with cetuximab:A novelstrategy targeting the epidermal growth factor receptor for treatment of non-small-cell lung cancer.Int J Pharm.2019Apr 5；560:126-135)。

Tao Yang等人在乳腺癌异种移植模型中研究了载有紫杉醇的聚乙二醇化的曲妥珠单抗结合的免疫脂质体(PIL)的抗肿瘤作用。PIL组与PL组相比肿瘤体积生长抑制率提高了1倍(Yang T,Choi MK,Cui FD,Lee SJ,Chung SJ,Shim CK,Kim DD.Antitumor effectof paclitaxel-loaded PEGylated immunoliposomes against human breast cancercells.Pharm Res.2007Dec；24(12):2402-11)。

Josimar O.Eloy等人合成了修饰有曲妥珠单抗的PTX/RAP共载免疫脂质体，并在小鼠异种移植模型中评价抗肿瘤效果，免疫脂质体组与脂质体组相比肿瘤体积生长抑制率提高了2-3倍(Eloy JO,Petrilli R,Chesca DL,Saggioro FP,Lee RJ,MarchettiJM.Anti-HER2 immunoliposomes for co-delivery of paclitaxel and rapamycin forbreast cancer therapy.Eur J Pharm Biopharm.2017Jun；115:159-167)。

黄念等人公开了一种由抗体、脂质原料和中药单体蟾毒灵、蜂毒素自组装的复方中药免疫脂质体，免疫脂质体与游离药物组相比提高不到1倍(一种复方中药免疫脂质体及其制备方法和应用)。

发明内容

本发明旨在提供一种特异性靶向HER2的天赐霉素免疫脂质体、制备方法，及其在抗癌中的应用，所述天赐霉素免疫脂质体在抗肿瘤效果优异的同时，无明显的全身系统性的毒副作用。

为了实现上述目的，本发明的方案如下：

一种天赐霉素免疫脂质体，所述免疫脂质体是以磷脂和胆固醇包覆天赐霉素，并用曲妥珠单抗修饰。

优选的，所述磷脂为天然磷脂和聚乙二醇化的合成磷脂的组合。

优选的，所述天然磷脂为大豆卵磷脂。

优选的，所述聚乙二醇化的合成磷脂包括DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-NHS。

优选的，大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG

优选的，所述曲妥珠单抗为人源化单克隆抗体trastuzumab。

优选的，所述曲妥珠单抗通过与DSPE-PEG

优选的，所述免疫脂质体的粒径为100～200nm。

一种制备免疫脂质体的方法，包括以下步骤：

S1、按重量份，将磷脂、胆固醇和天赐霉素溶解于无水乙醇，形成脂质溶液；

S2、将脂质溶液倒入预热的PBS溶液中，45-60℃下涡旋2-3h，形成脂质体；

S3、加入曲妥珠单抗，混匀，孵育后透析，得到免疫脂质体。

优选的，步骤S3中透析时间为24-48h。

优选的，步骤S3中透析袋的截留分子量为300KD，除去未与脂质体连接的曲妥珠单抗。

优选的，包载药物包括但不限定于任一一种蒽醌骈合型烯二炔药物，包括：天赐霉素及其衍生物(TNM B，TNM C)、洋浦霉素(Yangpumicin(YPM)A)及其衍生物(YPM F，YPM G)。

本发明还要求保护所述天赐霉素免疫脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选的，所述肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、前列腺癌或膀胱癌。

下面对本发明做进一步的解释：

在本发明中，天赐霉素免疫脂质体具有曲妥珠单抗作为靶头的主动靶向脂质体，在体内具有显著的靶向性，不仅可以改善天赐霉素对肿瘤细胞无选择性的缺点，还可以提高天赐霉素的体内抗肿瘤效果，抗肿瘤效果与非靶向制剂具有显著差别。

根据本发明的制备方法，本发明中有80～90％以上的曲妥珠单抗成功连接至免疫脂质体。

本发明将曲妥珠单抗与PEG立体稳定的脂质体共轭而制成的抗HER2免疫脂质体，在治疗HER2高表达的乳腺癌方面显示出良好的效果。具体来说，PEG化可以增加封装药物在血液中的循环时间，而曲妥珠单抗共轭物可以通过促进选择性递送增加封装药物的治疗指数。

本发明还提供了天赐霉素免疫脂质体的体外细胞毒性数据，实验表明，天赐霉素免疫脂质体对肿瘤细胞具有良好的选择性。

本发明还提供了天赐霉素免疫脂质体的细胞摄取实验的数据，实验表明，曲妥珠单抗的偶联增加了免疫脂质体的内化。

本发明还提供了天赐霉素免疫脂质体在小鼠体内对乳腺癌的抗肿瘤效果，实验表明，天赐霉素免疫脂质体表现出比普通脂质体更好的抗肿瘤效果，可作为有效的药物递送策略应用于肿瘤医药领域。

本发明的有益效果是：本发明制备天赐霉素免疫脂质体的制备方法简单，抗肿瘤效果优异。新型天赐霉素免疫脂质体可以改善天赐霉素对肿瘤细胞无选择性的缺点，可以提高天赐霉素的抗肿瘤效果。本发明能为天赐霉素抗肿瘤应用提供新途径，对推进天赐霉素的临床应用具有重要的意义。

附图说明

图1是本发明的天赐霉素免疫脂质体通过SDS-PAGE电泳检测曲妥珠单抗的分子量；

图2是本发明的天赐霉素免疫脂质体的粒径分布图；

图3是游离的天赐霉素TNM A，天赐霉素脂质体TNM A-Lipo和天赐霉素免疫脂质体HER2-TNM A-ILs对SKBR3(A)和MCF-7(B)的体外细胞毒性；

图4是PI-Lipo和HER2-PI-ILs在KPL-4细胞中2和4小时的细胞摄取研究；

图5是游离天赐霉素TNM A，天赐霉素脂质体TNM A-Lipo和天赐霉素免疫脂质体HER2-TNM A-ILs对KPL-4细胞皮下荷瘤的BALB/c裸鼠的体内抗肿瘤活性：TNM A，TNM A-Lipo和HER2-TNM A-ILs给药后裸鼠的重量变化(A)，TNM A，TNM A-Lipo和HER2-TNM A-ILs给药后裸鼠的肿瘤体积变化(B)，TNM A，TNM A-Lipo和HER2-TNM A-ILs给药后裸鼠的肿瘤重量(C)，TNM A，TNM A-Lipo和HER2-TNM A-ILs给药后裸鼠在第10天获得的肿瘤解剖图(D)。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明，仅作为本发明的解释，但绝不是对本发明的限制，本发明的保护内容不局限于以下实施例。本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

天赐霉素免疫脂质体的制备

实验过程：取5mL PBS溶液于西林瓶中，55℃水浴预热，磁力搅拌使PBS形成漩涡。按照摩尔比为56：39：5：1：0.004的比例称取大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG

天赐霉素脂质体的制备方法，包括以下步骤：

S1、取5mL PBS溶液于西林瓶中，在55℃水浴中预热，用磁力搅拌PBS溶液形成涡流。称取大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000和天赐霉素，置于2mL无水乙醇中超声溶解，形成脂质溶液。

S2、快速将油相脂质溶液倒入水相PBS溶液，在55℃下涡旋2小时，形成天赐霉素脂质体，命名为TNM A-Lipo。

实施例2

天赐霉素脂质体上的曲妥珠单抗分子量检测

实验过程：将样品移至新的EP管中，按比例加入4×SDS Loading buffer。15％分离胶进行SDS-PAGE变性电泳。每泳道按相同体积上样，常规电泳。得到的结果如图1所示。

结果表明：游离的曲妥珠单抗在50kD和25kD处有两条条带，分别代表重链CH1和轻链VH。然后，在TNM A-Lipo上没有显示条带，但HER2-TNM A-ILs样品中也出现了50kD和25kD的类似条带，表明曲妥珠单抗通过酰胺键已经成功连接到了DSPE-PEG

实施例3

天赐霉素脂质体的粒径分布测定

实验过程：TNM A-Lipo和HER2-TNM A-ILs的动态尺寸由Zetasizer Nano 90(Malvern)测定。得到的结果如图2所示。

结果表明：TNM A-Lipo和HER2-TNM A-ILs的平均粒径分别为202.8±1.5nm和182.8±2.1nm。与TNM A-Lipo相比，HER2-TNM A-ILs的粒径在被曲妥珠单抗修饰后减少了20nm，这可能是由于抗体连接导致了磷脂双分子层的内陷。

实施例4

天赐霉素脂质体的体外细胞毒性

实验过程：使用CCK-8法测定游离的天赐霉素TNM A，天赐霉素脂质体TNM A-Lipo和天赐霉素免疫脂质体HER2-TNM A-ILs对SKBR3细胞和MCF-7细胞的体外细胞毒性。将MCF-7细胞(5×10

结果表明：SKBR3是一种高表达HER2的人乳腺癌细胞系，MCF-7是低表达HER2的人乳腺癌细胞系。HER2-TNM A-ILs在SKBR3细胞中的细胞毒性显著高于TNM A-Lipo，这表明在TNM A-Lipo表面偶联曲妥珠单抗可提高TNM A在上述细胞中的靶向效率。在SKBR3细胞中，HER2-TNM A-ILs表现出更明显的细胞毒性，其半数最大抑制浓度(IC

实施例5

天赐霉素脂质体的细胞摄取

实验过程：采用碘化丙啶(PI)荧光染料代替TNM A，以同样的方法制备PI-Lipo和HER2-PI-ILs。KPL-4细胞以2×10

结果表明：免疫脂质体的疗效取决于肿瘤细胞的内化能力。KPL-4细胞与PI-Lipo和HER2-PI-ILs在200ng/孔中进行孵育。所有样品在2小时和4小时内孵育。HER2-PI-ILs比PI-Lipo更能进入KPL-4细胞，这表明曲妥珠单抗的偶联促进了免疫脂质体内化。基于KPL-4细胞表面高表达HER2受体，因此，曲妥珠单抗的加入成功地增强了肿瘤细胞对免疫脂质体的内化。

实施例6

天赐霉素免疫脂质体的体内抗乳腺癌活性

实验过程：将6周龄的BALB/c裸鼠适应性喂养5天。取对数生长期的KPL-4细胞用胰酶消化并收集，用PBS溶液洗涤两遍。向BALB/c裸鼠的右腋下皮下注射KPL-4细胞(在50μLPBS和50μL matrigel中5×10

在实验的最后一天，处死所有BALB/c裸鼠，剥离出实体肿瘤，称重并照相记录。分离心，肝，脾，肺，肾、收集血液，取材后观察脏器的大体情况，如表面色泽，硬度，弹性，表面有无变化，有无出血等，然后置于10％中性甲醛固定制备石蜡切片供组织学检查(HE染色、Masson染色)，其余组织放入-80℃冷冻冰箱中保存备用。并将血液用于炎性分析。得到的结果如图5所示。

结果表明：利用KPL-4人乳腺癌皮下异种移植模型，通过静脉注射给药，研究了HER2-TNM A-ILs的治疗效果。我们将TNM A-Lipo(0.02mg/kg)、HER2-TNM A-ILs(0.02mg/kg)用于携带肿瘤的雌性BALB/c裸鼠(n＝5)，然后trastuzumab(10mg/kg)和游离TNM A(0.05mg/kg)作为对照。HER2-TNM A-ILs和HER2-TNM A-ILs+trastuzumab对裸鼠的单剂量治疗明显抑制了肿瘤的生长(图5)。在所有治疗组中没有观察到明显的体重下降，这意味着这些治疗方案的耐受性良好(图5A)。相反，单剂量的游离TNM A、TNM A-Lipo和trastuzumab仅对KPL-4肿瘤有轻微的抑制作用。然而，两个较低剂量的HER2-TNM A-ILs或HER2-TNM A-ILs+trastuzumab可以显著抑制治疗裸鼠的肿瘤生长，而在治疗期间没有体重下降(图5B)。HER2-TNM A-ILs组的肿瘤重量最小，证实了HER2-TNM A-ILs的最佳抗肿瘤效果，且HER2-TNM A-ILs的效果远大于TNM A-Lipo(0.02mg/kg)和trastuzumab(10mg/kg)之和(图5C)。重要的是，TNM A-Lipo和HER2-TNM A-ILs表现出比trastuzumab更强的抗肿瘤活性，因为trastuzumab在给药一次时只表现出弱的肿瘤抑制作用。TNM A-Lipo也只表现出与高剂量游离TNM A相当的抗肿瘤作用(图5B和图5D)。因此，在本发明中，曲妥珠单抗和天赐霉素脂质体表现出了明显的协同效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。