一种发酵生产D-乳酸的方法

技术领域

本发明涉及D-乳酸生产领域，尤其是涉及一种发酵生产D-乳酸的方法。

背景技术

乳酸是世界上公认的三大有机酸之一，用途极其广泛。在食品、酿造、香料、医药、皮革、卷烟、化工和印染等行业均发挥着重要作用。尤其是近年来乳酸的聚合物——聚乳酸作为无毒、可降解的、具有生物相容性的高分子材料，已广泛应用于制造生物可降解塑料、绿色包装材料和药用修复材料等领域，引起了世界的广泛关注，应用前景非常广阔。但是聚乳酸产品的生产成本较高，该问题一直是制约其全面替代传统塑料产品的重要因素。因此，降低聚乳酸的单体乳酸的生产成本，提高生产效率，是目前亟需解决的问题。

现有技术中，微生物发酵法是生产乳酸的主要方法。采用微生物发酵法生产D-乳酸，与化学合成法、酶转化法等相比，具有发酵原料来源广泛、可循环利用等优势，由此，微生物发酵法已成为工业化生产D-乳酸的主要方法。现有的工业化乳酸菌发酵生产乳酸是在厌氧条件下进行的，但是有研究发现适量的氧环境也有助于菌体的生长。杨文革等报道了组合发酵生产D-乳酸的工艺（中国专利CN1952164A），利用乳酸杆菌进行发酵生产D-乳酸，菌株发酵时间25-38小时，产酸量可达75-131g/L乳酸。钱志良等报道了菊糖芽孢乳杆菌以及采用该菌株发酵制备D-乳酸的方法（中国专利CN101974447B），其发酵状态介于厌氧和微氧之间，菌株发酵时间40-50小时，发酵产酸12-14%，糖酸转化率92-94%。但是，前述的D-乳酸生产工艺的缺点是：在发酵过程中需要丰富培养基，微氧控制阶段操作和控制复杂，通风量大，发酵产物中杂酸含量高，需使用氢氧化钙或碳酸钙作为中和剂来控制发酵pH，导致最终的发酵产物是乳酸钙；在后续的分离提取过程中需要加入硫酸，进而产生大量的硫酸钙废弃物，难以有效利用，最终导致生产成本和分离提取成本高；且制得的乳酸的光学纯度偏低，无法达到生产聚乳酸的要求。

进一步的，大肠杆菌具有遗传背景清楚、易于进行基因工程改造、发酵周期较短和营养要求简单等优点，在乳酸生产中扮演着重要角色。但是，目前采用大肠杆菌制备D-乳酸的工业化生产工艺，通常采用氢氧化钙或氢氧化钾作为中和剂。以氢氧化钙作为中和剂，在后续的提取过程中会产生大量难以利用的硫酸钙废弃物；以氢氧化钾为中和剂，成本较高，经济性差，不利于大规模工业化生产。发明人采用氨水为中和剂用于D-乳酸的规模化生产中，但发明人发现，使用氨水作为中和剂虽然可以降低发酵成本，但是随着发酵液中铵离子浓度的升高，会生成乳酸铵，乳酸铵的不断累积会对菌体的生长和代谢产酸的能力产生抑制作用，导致大肠杆菌生长缓慢、生产强度降低，最终导致产酸浓度低、发酵周期长。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种发酵生产D-乳酸的方法，能够有效解决大肠杆菌在发酵过程中，乳酸铵的不断累积对菌体的生长和代谢产酸的能力产生抑制的问题，避免大肠杆菌生长缓慢、生产强度低、产量低的问题；以及厌氧、微氧结合发酵过程中，杂酸含量高的问题；能够在保证D-乳酸光学纯度及收率的同时，有效提高发酵液中糖的转化速率，缩短生产周期，提高D-乳酸产量。

为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：

一种发酵生产D-乳酸的方法，由以下步骤组成：摇瓶培养、种子培养、发酵培养。

所述摇瓶培养，将平板上的大肠杆菌菌体接种于摇瓶培养基中，控制摇瓶培养温度为37℃，摇床频率为200rpm，培养时间为16h，制得摇瓶培养液。

所述摇瓶培养中，摇瓶培养基由以下成分组成，胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，pH值为7.0。

所述种子培养，将摇瓶培养获得的摇瓶培养液按1-2%的接种量接种于种子培养基中，进行厌氧发酵；控制种子培养温度为37℃，转速为200rpm，种子培养压力为0.05Mpa，种子培养过程中保持厌氧，不通入任何空气；种子培养过程中采用氨水控制PH值为7.0，种子培养时间为16h，制得种子培养液。

所述种子培养中，种子培养基由以下成分组成，葡萄糖90g/L，复合调节剂3.5g/L，磷酸二氢铵0.82g/L，磷酸氢二铵2.35g/L，硫酸镁0.25g/L，甜菜碱盐酸盐0.2g/L，六水合氯化铁2.1μg/L，六水合氯化钴0.3μg/L，氯化铜0.2μg/L，钼酸钠0.15μg/L，氯化锌0.25μg/L，氯化锰0.3μg/L，硼酸0.08μg/L，溶剂为水。

所述复合调节剂由以下方法制得，将玉米浆干粉、酵母粉、酵母浸出物、椰子水、海藻酸钠投入至混料机内，120rpm混料20min后，继续投入苏氨酸、蛋氨酸、精氨酸、黄芪多糖，150rpm混料20min后，喷雾干燥，制得复合调节剂。所述复合调节剂中，玉米浆干粉、酵母粉、酵母浸出物、椰子水、海藻酸钠、苏氨酸、蛋氨酸、精氨酸、黄芪多糖的重量份比值为12:4:1:60:0.3:0.08:0.05:0.05:0.5。

所述发酵培养，将种子培养获得的种子培养液按3-4%的接种量接种于发酵培养基中，进行发酵培养；控制发酵培养基中葡萄糖的浓度为150g/L，发酵温度37℃，转速为100rpm，培养压力为0.05Mpa；发酵培养过程中采用阶段式微孔曝气的方式，向发酵罐中持续通入无菌空气；且在发酵培养过程中，采用氨水控制发酵液PH值为7.0；

所述发酵培养中，阶段式微孔曝气包括第一阶段、第二阶段、第三阶段；

所述第一阶段，为发酵培养的0-9h，每分钟通风量与发酵培养基的体积比为0.02:1；

所述第二阶段，为发酵培养的9-18h，每分钟通风量与发酵培养基的体积比为0.05:1；

所述第三阶段，为发酵培养的18h后，每分钟通风量与发酵培养基的体积比为0.03:1；

第三阶段中监测发酵培养液中的葡萄糖含量，当葡萄糖含量为0g/L时，结束发酵培养，制得发酵培养液。

所述发酵培养中，发酵培养基由以下成分组成，葡萄糖150g/L，复合调节剂4.2g/L，磷酸二氢铵0.82g/L，磷酸氢二铵2.35g/L，硫酸镁0.4g/L，甜菜碱盐酸盐0.5g/L，六水合氯化铁2.1μg/L，六水合氯化钴0.3μg/L，氯化铜0.2μg/L，钼酸钠0.15μg/L，氯化锌0.25μg/L，氯化锰0.3μg/L，硼酸0.08μg/L，溶剂为水。所述复合调节剂与种子培养基的复合调节剂相同。

所述发酵培养中，微孔曝气采用盘式空气分布器，并将空气分布器设置于发酵罐底部；无菌空气经进气管输送至盘式空气分布器，通过盘式空气分布器上设置的通气微孔出气为微小气泡，分散至发酵培养基中；所述盘式空气分布器上全部通气微孔的孔面积为进气管横截面圆面积的60%。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）本发明的发酵生产D-乳酸的方法，能够适用于D-乳酸的工业化大规模生产，能够有效解决大肠杆菌在发酵过程中，乳酸铵对菌体的生长和代谢产酸的能力抑制作用，避免大肠杆菌生长缓慢、生产强度低、产量低的问题；以及厌氧、微氧结合发酵过程中，杂酸含量高的问题；能够在保证D-乳酸光学纯度及收率的同时，有效提高发酵液中糖的转化速率，缩短生产周期，提高D-乳酸产量。

（2）本发明的发酵生产D-乳酸的方法，发酵周期为29小时，发酵生产D-乳酸的浓度可达114.7g/L，产酸速率可达3.96g/L·h，杂酸含量降低至0.2g/L；同时，发酵液中D-乳酸的光学纯度为99.95%，收率为97.8%，能够在保证D-乳酸光学纯度及收率的同时，有效提高发酵液中糖的转化速率，缩短生产周期，提高D-乳酸产量；本发明的发酵生产D-乳酸的方法，远低于现有技术的D-乳酸发酵周期（48小时），明显提高发酵效率，并提高D-乳酸产品品质。

（3）本发明的发酵生产D-乳酸的方法，在发酵培养过程中采用阶段式微孔曝气，通过动态调整菌体生长速度，缓解乳酸铵对菌体的生长和代谢产酸的能力抑制作用。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现说明本发明的具体实施方式。

实施例1

一种发酵生产D-乳酸的方法，具体为：

（1）摇瓶培养

取适量平板上的大肠杆菌菌体接种于100ml摇瓶培养基中，在培养温度为37℃，摇床频率为200rpm的培养箱中培养16h，制得摇瓶培养液。

摇瓶培养基：胰蛋白胨 10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，pH=7.0。

本实施例中，所采用的大肠杆菌菌体由中国科学院天津工业生物技术研究所转让获得，大肠杆菌为菌株Dlac-206，分类命名：大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏号CGMCC7679。

（2）种子培养

4L发酵罐中种子培养基体积为2.5L，将摇瓶培养液按1%的接种量接种于种子培养基中进行厌氧发酵，培养温度为37℃，转速为200rpm，罐压维持在0.05Mpa，培养过程中保持厌氧，不通入任何空气。种子培养过程中采用浓度为10%的氨水控制PH值为7.0，培养时间为16h，制得种子培养液。

种子培养基：葡萄糖90g/L，复合调节剂3.5g/L，磷酸二氢铵0.82g/L，磷酸氢二铵2.35g/L，硫酸镁0.25g/L，甜菜碱盐酸盐0.2g/L，六水合氯化铁2.1μg/L，六水合氯化钴0.3μg/L，氯化铜0.2μg/L，钼酸钠0.15μg/L，氯化锌0.25μg/L，氯化锰0.3μg/L，硼酸0.08μg/L，溶剂为水。

复合调节剂，由以下方法制得，将玉米浆干粉、酵母粉、酵母浸出物、椰子水、海藻酸钠投入至混料机内，120rpm混料20min后，继续投入苏氨酸、蛋氨酸、精氨酸、黄芪多糖，150rpm混料20min后，喷雾干燥，制得复合调节剂。

其中，玉米浆干粉、酵母粉、酵母浸出物、椰子水、海藻酸钠、苏氨酸、蛋氨酸、精氨酸、黄芪多糖的重量份比值为12:4:1:60:0.3:0.08:0.05:0.05:0.5。

（3）发酵培养

4L发酵罐中发酵培养基体积为2.5L，将种子培养液按4%的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养基中葡萄糖的浓度为150g/L，发酵温度37℃，转速为100rpm，罐压维持在0.05Mpa。发酵培养过程中采用阶段式微孔曝气的方式，向发酵罐中持续通入无菌空气；且在发酵培养过程中，采用浓度为10%的氨水控制发酵液PH值为7.0。发酵培养18h后，实时监测发酵培养液中的葡萄糖含量，当葡萄糖含量为0g/L时，结束发酵培养，制得发酵培养液。

所述阶段式微孔曝气，包括有以下三个阶段：

①发酵培养的0-9h，每分钟通风量与发酵培养基的体积比为0.02:1；

②发酵培养的9-18h，每分钟通风量与发酵培养基的体积比为0.05:1；

③发酵培养18h后，每分钟通风量与发酵培养基的体积比为0.03:1。

其中，微孔曝气的具体方式为，将盘式空气分布器设置于发酵罐底部，无菌空气经进气管输送至盘式空气分布器，通过盘式空气分布器上部及侧部的通气微孔出气为微小气泡，分散至发酵液中。所述盘式空气分布器上全部通气微孔的孔面积为进气管横截面圆面积的60%。

发酵培养基：葡萄糖150g/L，复合调节剂4.2g/L，磷酸二氢铵0.82g/L，磷酸氢二铵2.35g/L，硫酸镁0.4g/L，甜菜碱盐酸盐0.5g/L，六水合氯化铁2.1μg/L，六水合氯化钴0.3μg/L，氯化铜0.2μg/L，钼酸钠0.15μg/L，氯化锌0.25μg/L，氯化锰0.3μg/L，硼酸0.08μg/L，溶剂为水。

发酵培养基中，采用的复合调节剂与种子培养基的复合调节剂相同。

对比例1

摇瓶培养与种子培养和实施例1相同。

发酵培养修改为：4L发酵罐中发酵培养基体积为2.5L，将种子培养液按4%的接种量接种于发酵培养基中进行厌氧发酵，发酵培养基中葡萄糖的浓度为150g/L，发酵温度37℃，转速为100rpm，罐压维持在0.05Mpa。发酵培养过程中，不通入任何空气。发酵培养过程中采用浓度为10%的氨水控制PH值为7.0。检测发酵培养液中的葡萄糖含量，当葡萄糖含量为0g/L时，结束发酵培养，制得发酵培养液。

对比例2

摇瓶培养与种子培养和实施例1相同。

发酵培养修改为：4L发酵罐中发酵培养基体积为2.5L，将种子培养液按4%的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养基中葡萄糖的浓度为150g/L，发酵温度37℃，转速为200rpm，罐压维持在0.05Mpa。发酵培养过程中，控制每分钟通风量与发酵培养基的体积比为0.1:1，持续通入无菌空气。发酵培养过程中采用浓度为10%的氨水控制PH值为7.0。检测发酵培养液中的葡萄糖含量，当葡萄糖含量为0g/L时，结束发酵培养，制得发酵培养液。

对比例3

摇瓶培养与种子培养和实施例1相同。

发酵培养修改为：4L发酵罐中发酵培养基体积为2.5L，将种子培养液按4%的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养基中葡萄糖的浓度为150g/L，发酵温度37℃、转速为150rpm，罐压维持在0.05Mpa。发酵培养过程中，前12h控制每分钟通风量与发酵培养基体积比为0.1:1，通入无菌空气；12h后停止通入无菌空气进行厌氧发酵。发酵培养过程中采用浓度为10%的氨水控制PH值为7.0。检测发酵培养液中的葡萄糖含量，当葡萄糖含量为0g/L时，结束发酵培养，制得发酵培养液。

对比例4

摇瓶培养和实施例1相同。

种子培养中，种子培养基不使用复合调节剂，其他操作与实施例1相同。

发酵培养中，发酵培养基不使用复合调节剂，其他操作与实施例1相同。

实施例1、对比例1-4发酵培养结束后，分别对制得的发酵培养液进行测定。其中，发酵培养液中的各组分使用安捷伦（Agilent-1260）高效液相色谱仪进行测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度采用伯乐（Biorad）公司的Aminex HPX-87H有机酸分析柱进行测定。乳酸光学纯度分析采用日本Sumika Chemical Analysis Service公司的SUMICHIRALOA-6000手性柱分析进行测定。具体结果如表1所示：

表1 D-乳酸生产结果汇总

可以看出，本发明的发酵生产D-乳酸的方法，通过阶段式微孔曝气，采用种子培养基进行种子培养，采用发酵培养基进行发酵培养，能够有效解决大肠杆菌在发酵过程中，乳酸铵对菌体的生长和代谢产酸的能力抑制作用，避免大肠杆菌生长缓慢、生产强度低、产量低的问题；以及厌氧、微氧结合发酵过程中，杂酸含量高的问题；能够在保证D-乳酸光学纯度及收率的同时，有效提高发酵液中糖的转化速率，缩短生产周期，提高D-乳酸产量。相比于对比例1，本发明的发酵生产D-乳酸的方法有效缩短发酵周期，提高发酵效果，有效制得的发酵液中D-乳酸含量及收率，降低杂酸含量；同时提高产酸速率，保持高的D-乳酸光学纯度。从对比例2的结果可以看出，虽然对比例2发酵周期较短，发酵速度快，产酸速率较高，但D-乳酸含量偏低，杂酸含量高，不利于后续分离提纯，且D-乳酸收率及光学纯度均有一定程度降低；从对比例3的结果可以看出，其发酵周期、D-乳酸含量、杂酸含量、产酸速率、D-乳酸收率及光学纯度均有待进一步提高。相比于对比例2-3，本发明的发酵生产D-乳酸的方法，通过采用阶段式微孔曝气发酵制备D-乳酸，不仅可以提高发酵液中糖的转化速率，提高产酸速率，保证D-乳酸收率和光学纯度指标，有效降低杂酸含量；同时可以提高氧气的利用效率，减少通气量和搅拌频率，发酵过程易于控制，有效降低生产成本，提高生产效益。通过对比例4可以看出，本发明的发酵生产D-乳酸的方法，通过在种子培养和发酵培养中采用复合调节剂，能够有效促进菌体的前期生长，并促进菌体的后期产酸，同时避免菌体前期生长过快对后期产酸的不利影响，进一步提高发酵及产酸速率，缩短发酵周期。

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。