一种亚磷酸二甲酯降解菌及应用

技术领域

本发明涉及到环境微生物领域，特别是一种释放亚磷酸二甲酯中有机磷的微生物及其应用。

背景技术

亚磷酸二甲酯又名二甲基亚磷酸酯(Dimethyl phosphonate，式1)，是一种有机化合物，分子量为110.049，为无色液体，溶于水和多数有机溶剂，水溶液为强酸性，与碱激烈反应并有腐蚀性；与酸类和氧化剂激烈反应。其在农药、助剂、有机合成等领域有着广泛的应用，是有机磷杀虫剂(敌百虫、除草剂草甘膦、稻瘟净、敌敌畏以及杀虫剂氧化乐果等)的重要中间体。亚磷酸二甲酯是一种在水体中新出现的难降解有机磷污染物，2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，亚磷酸二甲酯在3类致癌物清单中。

有机磷毒性对人体的主要危害主要表现为它会与体内的乙酰胆碱酯酶结合，使乙酰胆碱无法被水解，导致人体视力模糊、头疼、眩晕、腹痛、呕吐、胸闷、恶心等，严重会致使全身痉挛、意识模糊、昏迷、肺水肿、大小便失禁、呼吸中枢系统衰竭、死亡等。同时，磷也是水体富营养化的重要污染元素之一。亚磷酸二甲酯作为杀虫剂的重要中间体，广泛存在于农药生产废水中，废水排入会造成总磷超标排放，对环境造成危害废水中会造成总磷超标排放。国家对于有机磷的的排放要求极高：《污水综合排放标准》(GB8978-1996)一级标准有机磷农药(以磷计)不得检出、《化学合成类制药工业水污染物排放标准》(GB21904-2008)一级标准总磷1.0mg/L、《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002)一级A标总磷1.0mg/L。

亚磷酸二甲酯属于难降解有机磷，存在于废水中会造成总磷超标排放，且对普通微生物具有一定的毒害性，导致目前含亚磷酸二甲酯污染物的废水生化效果不明显，为解决现有技术的不足，本项目利用微生物的方法降解亚磷酸二甲酯，使有机磷快速释放，最终以正磷酸根的形式存在，然后利用生化或者物化的方式将其降解，从而实现络合物中磷降解的目的，本项目工艺具有实际应用价值，市场前景广阔。

发明内容

本发明的目的是提供一种既能够耐受高浓度亚磷酸二甲酯同时可快速释放其有机磷的微生物，为解决实际此类有机磷农药污水处理问题提供了一个有效的解决途径。除此之外，本发明提供一种快速培养亚磷酸二甲酯高效降解菌的发酵工艺。

本发明的技术方案为：

一种亚磷酸二甲酯降解菌，分类命名为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)ZC2302-YL，已于2023年07月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.27958。保藏地址：中国北京。

生理学特征为：菌落为圆形，微黄色，表面平坦湿润，菌落内部呈黏液状，直径大约2.0～5.0mm。在琼脂固体平板培养24h出现明显菌落，菌落呈圆形或椭圆形，边缘整齐，不透明，湿润无光泽。菌体细胞形态呈杆状，产生内生孢子，液化明胶，异养好氧型细菌，革兰氏染色阳性。

本发明菌种ZC2302-YL由南京某污水厂的好氧池中污泥筛选得到，能够耐受不超过2g/L高浓度的亚磷酸二甲酯溶液。筛选培养基为以亚磷酸二甲酯为单一有机碳源的培养基，所述的培养基组分为：0.5g/L亚磷酸二甲酯，0.5g/L氮源，2～10g/L无机盐，pH 7.2-7.8之间。培养温度：33-37℃，好氧培养。此外，筛选过程中，定期监测COD、有机磷的浓度，降解完成后及时补加亚磷酸二甲酯，并逐渐提高亚磷酸二甲酯浓度至2g/L。

本发明所提供的这种亚磷酸二甲酯降解菌ZC2302-YL，能够以亚磷酸二甲酯作为唯一碳源进行生长。在实验室曝气处理条件下菌株ZC2302-YL可实现48h之内初始浓度0.5g/L亚磷酸二甲酯降解率达98％。同时我们又验证了菌株ZC2302-YL在含亚磷酸二甲酯废水的实际处理效果，将ZC2302-YL发酵而来的菌剂按10％的体积比加入到含0.5g/L的亚磷酸二甲酯废水中，曝气处理72h后，亚磷酸二甲酯的降解率可达到92％，处理效果十分理想。

本发明提供了一种亚磷酸二甲酯高效降解菌简便快速培养发酵的工艺，其发酵扩培工艺包括活化—转接—扩培等步骤，具体工艺流程如下：

S1活化：从固体平板中挑取亚磷酸二甲酯高效降解菌的单菌落，转接至含亚磷酸二甲酯的单一碳源培养基(体系5mL)中，摇床转速为100-120rpm，30-35℃摇床培养24-48h直至对数期；

S2转接：将流程1活化处于对数期的亚磷酸二甲酯降解菌液按照2～5％的接入量转接至500mL种子罐中进行培养，控制种子罐温度维持在30-35℃、转速保持在100-120rpm，溶氧DO控制在4-6mg/L，培养24-48h；使该菌能够耐受更高的亚磷酸二甲酯浓度，并且能够显著提高亚磷酸二甲酯完全降解速率。

S3扩培：将流程2种子罐培养的亚磷酸二甲酯降解菌液按照2％-5％的接种量转接至10L发酵罐中扩大培养，发酵罐培养基成分与种子罐的相同，各物化参数指标为：温度30-35℃、转速100-120rpm、溶氧4-6mg/L、发酵时间48-72h。发酵结束后，罐体菌液有效活菌数可达10

本发明的菌株能够以亚磷酸二甲酯作为唯一碳源进行生长，优选地，所述的单一碳源培养基组分为：1g/L亚磷酸二甲酯，5g/L氮源，2～10g/L无机盐，pH 7.2-7.8之间。培养温度：33-37℃，好氧培养。

种子罐的培养基成分为(质量比)：亚磷酸二甲酯0.1～0.2％，葡萄糖0.01～0.02％，NH

0.3％，NaHCO

所述的亚磷酸二甲酯高效降解菌的菌剂在降解亚磷酸二甲酯中的应用。

一种降解亚磷酸二甲酯污染物高效降解菌的菌剂，所述菌剂是通过发酵阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)ZC2302-YL，发酵培养液出罐后包装即可得到亚磷酸二甲酯污染物高效降解菌剂。

所述的亚磷酸二甲酯污染物高效降解菌剂在降解亚磷酸二甲酯污染物中的应用。

所述的亚磷酸二甲酯污染物高效降解菌在有机磷工业废水处理中的应用。

将阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)ZC2302-YL进行菌株培养后，加入到含亚磷酸二甲酯待处理废水中降解有机磷。该菌株能够耐受2g/L高浓度的亚磷酸二甲酯废水，降解率高。

将菌种ZC2302-YL培养后加入到待处理的亚磷酸二甲酯废水中，释放其中的有机磷；所述菌种ZC2302-YL培养方法为：挑取单菌落至以亚磷酸二甲酯为单一碳源的培养基中，培养至对数期后转接至种子罐中培养24-48h，最后再接入发酵罐中扩大培养48-72h，得到大量菌富集菌液。

所述亚磷酸二甲酯降解菌在快速形成释放亚磷酸二甲酯中有机磷的微污泥中的应用。

将菌种ZC2302-YL接种到投加有污泥的反应器中，快速扩培，得到释放亚磷酸二甲酯中有机磷的污泥。

优选地，将菌种ZC2302-YL接种到投加有污泥的反应器中，在反应器中投加微量元素Fe、Cu、Mo、Zn、Co、Mn。

所述微量元素质量比为：Fe 0～1g/L,Cu 0～1mg/L，Mo 0～1mg/L，Zn 0～1mg/L、Co 0～1mg/L，Mn 0～1mg/L。

所述菌株的投加量与污泥接种的质量比例在0.1～10％。

反应器从底部装置输送污水，污水的亚磷酸二甲酯的有机磷的浓度100mg/L左右，装置内的温度为33～37℃，pH控制在7.2-7.8。

反应器中加入营养元素，营养元素的比例为：NaHCO

有益效果

本发明菌株可以在项目现场进行扩培，培养后的菌液可在使用现场立即投加使用，节约运输成本和时间成本，并且可以避免长期保持带来的负面影响。

本发明利用亚磷酸二甲酯高效降解菌ZC2302-YL在高浓度含亚磷酸二甲酯的废水中，好氧处理48h后，亚磷酸二甲酯中有机磷释放率可达到92％，处理效果十分理想，操作简单，投入经费小，实用性强。

本发明通过为菌株提供增殖所需的营养物质与空间，实现在项目所在地进行有效菌现场扩培，保证扩培与应用有效连接，保证有效微生物的活菌数，通过本发明方法扩培出的亚磷酸二甲酯降解菌的浓度为每毫升菌液中含菌约50000个，还能够大幅度降低运输成本、时间成本。

附图说明

图1实施例4中菌株ZC2302-YL对亚磷酸二甲酯中的有机磷变化曲线；

图2实施例5中菌株ZC2302-YL对实际亚磷酸二甲酯废水中的有机磷变化曲线；

具体实施方式

以下实施例适用于本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所述的工业废水处理厂活性污泥来源于：江苏某污水处理厂的生化池。

实施例1菌种ZC2302-YL的分离与纯化

(1)驯化富集：取50ml活性污泥加入到含有以亚磷酸二甲酯为主要碳源的基础培养液的1L驯化装置中，活性污泥来自于江苏某污水处理厂的生化池。基础培养液配方为：亚磷酸二甲酯0.5g/L、NH

(2)分离：在无菌条件下，将驯化富集菌液按2％的接种量转接至以1亚磷酸二甲酯为主要碳源的无菌新鲜基础培养液中，基础培养液配方与步骤1相同。33℃摇床培养至对数期，利用稀释涂布平板法将培养菌液稀释涂布于亚磷酸二甲酯为主要碳源的固体分离培养基中，固体分离培养基成分为亚磷酸二甲酯0.5g/L、NH

(3)纯化：在超净工作台中，用接种针挑取亚磷酸二甲酯分离固体培养基中长出的单菌落，利用平板划线法对亚磷酸二甲酯降解菌进一步划线纯化培养，直至长出单菌落。重复3次以上操作，直至平板上长出的菌落形态单一为止，即得到了纯化的亚磷酸二甲酯污染物高效降解菌一株。

实施例2菌株的鉴定

将纯化的菌株送至测序公司(上海凌恩生物科技有限公司)进行16S rRNA基因序列测定，得到的测序结果与GenBank数据库中核酸序列进行对比，同时利用MEGA5.0软件方法构建合理的系统发育树。最终鉴定得到菌株的分类地位。鉴定结果为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)，命名为ZC2302-YL。其主要生理学为：菌落为圆形，微黄色，表面平坦湿润，菌落内部呈黏液状，直径大约2.0～5.0mm。在琼脂固体平板培养24h出现明显菌落，菌落呈圆形或椭圆形，边缘整齐，不透明，湿润无光泽。菌体细胞形态呈杆状，产生内生孢子，液化明胶，异养好氧型细菌，革兰氏染色阳性。

实施例3菌株ZC2302-YL的培养方法

亚磷酸二甲酯释放菌ZC2302-YL的培养方法包括如下步骤：

(1)活化：从固体平板中挑取亚磷酸二甲酯高效降解菌的单菌落，转接至含亚磷酸二甲酯的单一碳源培养基(体系5mL)中，摇床转速为100rpm，33℃摇床培养24-48h直至对数期；所述的单一碳源培养基组分为：0.5g/L亚磷酸二甲酯，5g/L氮源，2～10g/L无机盐，pH7.2-7.8之间。

(2)转接：将流程1活化处于对数期的亚磷酸二甲酯降解菌液按照5％的接入量转接至500mL种子罐中进行培养，控制种子罐温度维持在33℃、转速保持在100rpm，溶氧DO控制在5mg/L，培养48h；及时补加亚磷酸二甲酯，并逐渐提高亚磷酸二甲酯浓度至2g/L，使该菌能够耐受更高的亚磷酸二甲酯浓度，并且能够显著提高亚磷酸二甲酯完全降解速率。种子罐的培养基成分为(质量比)：亚磷酸二甲酯2g/L、葡萄0.2g/L、NH

(3)扩培：将流程2种子罐培养的亚磷酸二甲酯降解菌液按照5％的接种量转接至10L发酵罐中扩大培养，发酵罐培养基成分与种子罐的相同(培养基配方：亚磷酸二甲酯2g/L、葡萄0.2g/L、NH

100rpm、溶氧8mg/L、发酵时间72h。发酵结束后，罐体菌液有效活菌数可达10

实施例4菌种ZC2302-YL对高浓度亚磷酸二甲酯的耐受实验

投入5％亚磷酸二甲酯高效降解菌ZC2302-YL到含有1g/L亚磷酸二甲酯的单一碳源培养罐中(体系1L，总磷/无机磷浓度572mg/L)中降解有机磷，培养罐中其他营养元素包括NH

实施例5菌株ZC2302-YL对亚磷酸二甲酯中有机磷降解实验

挑取本发明中已纯化的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)ZC2302-YL单菌落于含有0.5g/L亚磷酸二甲酯的单一碳源培养基摇瓶中(体系5mL，总磷/无机磷浓度143mg/L)，培养基配方包含：亚磷酸二甲酯0.5g/L、NH

无机磷的浓度的测定方法：钼锑抗分光光度法，具体实验方法，取数支50ml具塞比色管，分别加入0、0.02、0.04、0.12、0.28、0.40、0.60mg/L磷酸盐标准使用液，加水至50ml，向比色管中加入1ml 10％抗坏血酸，混匀。30S后加2ml钼酸盐溶液充分混匀，放置15min显色后，于700nm波长处，用10mm比色皿，以零浓度溶液为参比，测量吸光度。

实施6菌株ZC2302-YL在含亚磷酸二甲酯工业废水中的应用

为了进一步验证本发明所用到的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)ZC2302-YL在实际废水中的应用效果，从某农药企业的生产车间获得了高浓度亚磷酸二甲酯污染物废水。经过测定，废水中总磷浓度约为100mg/L左右。我们将实施例2培养得到的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)ZC2302-YL菌液按10％的接种量直接加入到废水中，调节体系pH在7.2，以满足微生物正常生长的需要。在室温条件下，按0h、12h、24h、48h定时取样监测体系中总磷的变化(图2)。72h后，有机磷浓度已降到1mg/L，有机磷释放为正磷酸根的比率高达99％。以上实验数据表明，阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)ZC2302-YL在实际含亚磷酸二甲酯废水中也具有良好的处理效果，有着广阔的应用前景。

总磷测定方法：过硫酸钾消解法，具体实验方法，取数支50ml具塞比色管，分别加入0、0.02、0.04、0.12、0.28、0.40、0.60mg/L磷酸盐标准使用液，加水至25mL，加过硫酸钾溶液4mL，加塞后管口包一小块纱布并用线扎紧，以免加热时玻璃塞冲出。将具塞刻度管放在大烧杯中，置于灭菌锅中加热(压力1.1kg/cm

实施例7菌株ZC2302-YL快速形成污泥的方法

释放亚磷酸二甲酯中有机磷的降解菌ZC2302-YL快速形成污泥的步骤如下：

(1)向反应器中投加接种污泥，从底部装置输送污水，一次性投加10mg/L亚磷酸二甲酯降解菌，装置内的温度为33℃，转速保持在150rpm，溶氧DO值4mg/L，pH 7.5。

(2)设置停留时间为24h，并加入营养元素及微量元素。

营养元素投加量为：NaHCO

(3)采用一次性投加方式向反应器中添加阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)ZC2302-YL，装置内的温度为33℃，pH控制在7.2。菌株按10％的投加量接种至污泥中，快速扩培，反应器中菌液有效活菌数可达10