表达非洲猪瘟病毒相关抗原蛋白的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒的制备方法与应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体是利用猪繁殖与呼吸综合征病毒天然弱毒株感染性克隆平台构建重组表达非洲猪瘟病毒相关抗原蛋白的嵌合病毒及其应用。

背景技术

非洲猪瘟是一种由非洲猪瘟病毒引起的危害性极大的传染病，可感染家猪和野猪，强毒株具有极高的致死率，且该病传播速度快，传播途径广泛使得对其的防控极为困难，国际动物卫生组织(OIE)将ASFV列为一类法定报告动物疫病。自ASFV爆发以来，已造成了不可估量的经济损失。鉴于ASFV基因组较为庞大，尚无合适的传代细胞系在体外繁殖病毒，病毒感染可诱导免疫抑制并形成持续感染等特性，使用传统技术研制非洲猪瘟疫苗的尝试至今仍没有成功，故目前无防控ASFV的商品化疫苗。

ASFV隶属于DNA病毒目、非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属唯一成员，其全基因组长度约为170-193kb，包括150-167个ORF，编码蛋白质150多种。ASFV主要抗原蛋白P17、P30、P54和P72具有良好免疫原性，能够诱导机体产生中和抗体，且多种蛋白协同免疫可增强疫苗的免疫效果。

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)同样给全球养猪业造成巨大经济损失。临床上主要引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸系统综合征。其病原体猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)为单股正链RNA病毒，属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)。PRRSV是目前已知变异最快的RNA病毒之一，然而，现有商品化疫苗无法提供抵抗新型流行株的良好交叉保护。有效防控ASFV和PRRSV流行株感染所引发的疫情，仍是我国猪病防控的重点和难点。目前缺乏同时有效防控我国ASFV和PRRSV流行株的商品化疫苗问题。

发明内容

本发明针对上述现有技术存在的问题，提供表达非洲猪瘟病毒相关抗原蛋白的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒的制备方法与应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明提供表达非洲猪瘟病毒相关抗原蛋白的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒重组质粒的制备方法，所述方法如下：

步骤S1：ASFV-P30、ASFV-P54、ASFV-P17、ASFV-P72及ASFV-P30-P54基因扩增；

步骤S2：将ASFV-P30、ASFV-P54、ASFV-P17、ASFV-P72及ASFV-P30-P54基因插入并替换rJSTZ1712-12-F3-RFP中间载体质粒中的RFP，分别获得rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P30、rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P54、rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P17、rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P72及rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P30-P54；

步骤S3：将rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P30、rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P54、rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P17、rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P72及rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P30-P54插入到rJSTZ1712-12全长质粒，分别获得rJSTZ1712-12-ASFV-P30、rJSTZ1712-12-ASFV-P54、rJSTZ1712-12-ASFV-P17、rJSTZ1712-12-ASFV-P72及rJSTZ1712-12-ASFV-P30-P54重组质粒。

优选的，rJSTZ1712-12-ASFV-P30重组质粒的构建具体步骤如下：

(1)根据含有非洲猪瘟相关基因的质粒pLenti-CMV-p30序列，使用Primer5.0设计ASFV-P30的特异性扩增引物，并进行PCR扩增；取PCR反应产物，使用琼脂糖凝胶进行电泳，获得ASFV-P30基因；

所述ASFV-P30的特异性扩增引物如下：

所述PCR反应体系为：模板：pLenti-CMV-p30，1μL；引物：ASFV-P30的特异性扩增引物，1μL；试剂：2×PrimeSTAR MAX DNA Polymearse，20μL；水：RNase Free H

(2)用BclⅠ和KpnⅠ对rJSTZ1712-12-F3-RFP中间载体质粒进行双酶切，获得去除RFP片段的rJSTZ712-12-F3线性化载体片段；所述双酶切体系为：模板质粒：rJSTZ1712-12-F3-RFP，20μL；内切酶：BclⅠ，2μL；内切酶：KpnⅠ，2μL；试剂：10×CutSmart Buffer，4μL；水：RNase Free H

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收，使用同源重组的方法将ASFV-P30基因连接到rJSTZ712-12-F3线性化载体上，所述同源重组体系为：插入基因：ASFV-P30，3μL；中间载体：rJSTZ712-12-F3，11μL；试剂：5×CE MultiS Buffer，4μL；水：Exanse MultiS，2μL；

将同源重组产物转化到Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P30扩增引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，使用AscⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定，0.9％琼脂糖凝胶电泳，挑取酶切大小正确的重组质粒rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P30保留；

(3)用AscⅠ和NotⅠ对rJSTZ1712-12和rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P30进行双酶切，获得rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P30；所述双酶切体系为：模板质粒：rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P30，25μL；内切酶：AscⅠ，2μL；内切酶：NotⅠ：2μL；试剂：10×CutSmart Buffer，4μL；水：RNase Free H

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收；胶回收的rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P30按摩尔比为1:8，以T4DNA连接酶连接，转化Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P30扩增引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，然后，通过AscⅠ+HF-NotⅠ内切酶组合对rJSTZ1712-12-ASFV-P30嵌合质粒进行双酶切鉴定及测序鉴定确认序列无误。

优选的，rJSTZ1712-12-ASFV-P54重组质粒的构建具体如下：

(1)根据含有非洲猪瘟相关基因的质粒pLenti-CMV-p54序列，使用Primer5.0设计ASFV-P54的特异性扩增引物，并进行PCR扩增；取PCR反应产物，使用琼脂糖凝胶进行电泳，获得ASFV-P54基因；

所述ASFV-P54的特异性扩增引物如下：

所述PCR反应体系为：模板：pLenti-CMV-p54，1μL；引物：ASFV-P54的特异性扩增引物，1μL；试剂：2×PrimeSTAR MAX DNA Polymearse，20μL；水：RNase Free H

(2)用BclⅠ和KpnⅠ对rJSTZ1712-12-F3-RFP中间载体质粒进行双酶切，获得去除RFP片段的rJSTZ712-12-F3线性化载体片段；所述双酶切体系为：模板质粒：rJSTZ1712-12-F3-RFP，20μL；内切酶：BclⅠ，2μL；内切酶：KpnⅠ，2μL；试剂：10×CutSmart Buffer，4μL；水：RNase Free H

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收，使用同源重组的方法将ASFV-P54基因连接到rJSTZ712-12-F3线性化载体上，所述同源重组体系为：插入基因：ASFV-P54，3μL；中间载体：rJSTZ712-12-F3，11μL；试剂：5×CE MultiS Buffer，4μL；水：Exanse MultiS，2μL；

将同源重组产物转化到Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P54扩增引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，使用AscⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定，0.9％琼脂糖凝胶电泳，挑取酶切大小正确的重组质粒rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P54保留；

(3)用AscⅠ和NotⅠ对rJSTZ1712-12和rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P54进行双酶切，获得rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P54；所述双酶切体系为：模板质粒：rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P54，25μL；内切酶：AscⅠ，2μL；内切酶：NotⅠ：2μL；试剂：10×CutSmart Buffer，4μL；水：RNase Free H

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收；胶回收的rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P54按摩尔比为1:8，以T4DNA连接酶连接，转化Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P54扩增引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，然后，通过AscⅠ+HF-NotⅠ内切酶组合对rJSTZ1712-12-ASFV-P54嵌合质粒进行双酶切鉴定及测序鉴定确认序列无误。

优选的，rJSTZ1712-12-ASFV-P17重组质粒的构建具体如下：

(1)根据含有非洲猪瘟相关基因的质粒PCAGGS-p17序列，使用Primer 5.0设计ASFV-P17的特异性扩增引物，并进行PCR扩增；取PCR反应产物，使用琼脂糖凝胶进行电泳，获得ASFV-P17基因；

所述ASFV-P17的特异性扩增引物如下：

所述PCR反应体系为：模板：PCAGGS-p17，1μL；引物：ASFV-P17的特异性扩增引物，1μL；试剂：2×PrimeSTAR MAX DNA Polymearse，20μL；水：RNase Free H

(2)用BclⅠ和KpnⅠ对rJSTZ1712-12-F3-RFP中间载体质粒进行双酶切，获得去除RFP片段的rJSTZ712-12-F3线性化载体片段；所述双酶切体系为：模板质粒：rJSTZ1712-12-F3-RFP，20μL；内切酶：BclⅠ，2μL；内切酶：KpnⅠ，2μL；试剂：10×CutSmart Buffer，4μL；水：RNase Free H

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收，使用同源重组的方法将ASFV-P17基因连接到rJSTZ712-12-F3线性化载体上，所述同源重组体系为：插入基因：ASFV-P17，3μL；中间载体：rJSTZ712-12-F3，11μL；试剂：5×CE MultiS Buffer，4μL；水：Exanse MultiS，2μL；

将同源重组产物转化到Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P17扩增引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，使用AscⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定，0.9％琼脂糖凝胶电泳，挑取酶切大小正确的重组质粒rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P17保留；

(3)用AscⅠ和NotⅠ对rJSTZ1712-12和rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P17进行双酶切，获得rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P17；所述双酶切体系为：模板质粒：rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P17，25μL；内切酶：AscⅠ，2μL；内切酶：NotⅠ：2μL；试剂：10×CutSmart Buffer，4μL；水：RNase Free H

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收；胶回收的rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P17按摩尔比为1:8，以T4DNA连接酶连接，转化Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P17扩增引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，然后，通过AscⅠ+HF-NotⅠ内切酶组合对rJSTZ1712-12-ASFV-P17嵌合质粒进行双酶切鉴定及测序鉴定确认序列无误。

优选的，rJSTZ1712-12-ASFV-P72重组质粒的构建具体如下：

(1)根据含有非洲猪瘟相关基因的质粒OPT-p72序列，使用Primer 5.0设计ASFV-P72的特异性扩增引物，并进行PCR扩增；取PCR反应产物，使用琼脂糖凝胶进行电泳，获得ASFV-P72基因；

所述ASFV-P72的特异性扩增引物如下：

所述PCR反应体系为：模板：PCAGGS-p72，1μL；引物：ASFV-P72的特异性扩增引物，1μL；试剂：2×PrimeSTAR MAX DNA Polymearse，20μL；水：RNase Free H

(2)用BclⅠ和KpnⅠ对rJSTZ1712-12-F3-RFP中间载体质粒进行双酶切，获得去除RFP片段的rJSTZ712-12-F3线性化载体片段；所述双酶切体系为：模板质粒：rJSTZ1712-12-F3-RFP，20μL；内切酶：BclⅠ，2μL；内切酶：KpnⅠ，2μL；试剂：10×CutSmart Buffer，4μL；水：RNase Free H

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收，使用同源重组的方法将ASFV-P72基因连接到rJSTZ712-12-F3线性化载体上，所述同源重组体系为：插入基因：ASFV-P72，3μL；中间载体：rJSTZ712-12-F3，11μL；试剂：5×CE MultiS Buffer，4μL；水：Exanse MultiS，2μL；

将同源重组产物转化到Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P72扩增引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，使用AscⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定，0.9％琼脂糖凝胶电泳，挑取酶切大小正确的重组质粒rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P72保留；

(3)用AscⅠ和NotⅠ对rJSTZ1712-12和rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P72进行双酶切，获得rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P72；所述双酶切体系为：模板质粒：rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P72，25μL；内切酶：AscⅠ，2μL；内切酶：NotⅠ：2μL；试剂：10×CutSmart Buffer，4μL；水：RNase Free H

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收；胶回收的rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P72按摩尔比为1:8，以T4DNA连接酶连接，转化Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P72扩增引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，然后，通过AscⅠ+HF-NotⅠ内切酶组合对rJSTZ1712-12-ASFV-P72嵌合质粒进行双酶切鉴定及测序鉴定确认序列无误。

优选的，rJSTZ1712-12-ASFV-P30-P54重组质粒的构建具体如下：

(1)首先SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13引物对和SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14引物对以ASFV-P30和ASFV-P54质粒为模板分别以上述相同扩增方法获得P30link和linkP54两个基因片段并进行胶回收，通过SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14引物对以P30link和link P54胶回收产物为模板进行二次扩增获得ASFV-P30-P54基因；扩增引物如下：

二次扩增反应体系为：模板：P30link+linkP54，各1μL；引物：SEQ ID NO：12、SEQID NO：14引物对，1μL；试剂：2×PrimeSTAR MAX DNA Polymearse，20μL；水：RNase FreeH

(2)用BclⅠ和KpnⅠ对rJSTZ1712-12-F3-RFP中间载体质粒进行双酶切，获得去除RFP片段的rJSTZ712-12-F3线性化载体片段；所述双酶切体系为：模板质粒：rJSTZ1712-12-F3-RFP，20μL；内切酶：BclⅠ，2μL；内切酶：KpnⅠ，2μL；试剂：10×CutSmart Buffer，4μL；水：RNase Free H

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收，使用同源重组的方法将ASFV-P30-P54基因连接到rJSTZ712-12-F3线性化载体上，所述同源重组体系为：插入基因：ASFV-P30-P54，3μL；中间载体：rJSTZ712-12-F3，11μL；试剂：5×CE MultiSBuffer，4μL；水：Exanse MultiS，2μL；

将同源重组产物转化到Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P30-P54引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，使用AscⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定，0.9％琼脂糖凝胶电泳，挑取酶切大小正确的重组质粒rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P30-P54保留；

(3)用AscⅠ和NotⅠ对rJSTZ1712-12和rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P30-P54进行双酶切，获得rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P30-P54；所述双酶切体系为：模板质粒：rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P30-P54，25μL；内切酶：AscⅠ，2μL；内切酶：NotⅠ：2μL；试剂：10×CutSmart Buffer，4μL；水：RNase Free H

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收；胶回收的rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P30-P54按摩尔比为1:8，以T4 DNA连接酶连接，转化Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P30-P54引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，然后，通过AscⅠ+HF-NotⅠ内切酶组合对rJSTZ1712-12-ASFV-P30-P54嵌合质粒进行双酶切鉴定及测序鉴定确认序列无误。

第二方面，本发明提供表达非洲猪瘟病毒相关抗原蛋白的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒，嵌合病毒包括rJSTZ1712-12-ASFV-P30、rJSTZ1712-12-ASFV-P54、rJSTZ1712-12-ASFV-P17、rJSTZ1712-12-ASFV-P72及rJSTZ1712-12-ASFV-P30-P54；以rJSTZ1712-12株为活病毒载体，利用同源重组或双酶切连接方法在其ORF1b和ORF2a基因之间插入ASFV-P30、ASFV-P54、ASFV-P72、ASFV-P17、ASFV-P30-P54基因并进行细胞转染拯救获得。其中ASFV-P30与ASFV-P54编码基因序列通过两个丙氨酸(GCAGCA)连接构成二联基因序列ASFV-P30-P54。

第三方面，本发明提供表达非洲猪瘟病毒相关抗原蛋白的猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒在ASF和PRRS疫情防控中的应用。

本发明具有以下有益效果：1、以PRRSV天然弱毒株感染性克隆病毒为活病毒载体，分别重组表达ASFV-P17、ASFV-P30、ASFV-P54、ASFV-P72蛋白的PRRSV嵌合病毒和1株同时重组表达ASFV p30与p54双蛋白的PRRSV嵌合病毒，构建重组表达ASFV重要抗原蛋白的嵌合病毒；2、所构建的嵌合病毒有良好的增殖效力，接种Marc-145传代细胞均可引起细胞病变(CPE)。3、经PRRSV N与非洲猪瘟相关抗原蛋白特异性抗体的间接免疫荧光验证，不同的活载体嵌合重组病毒均可以稳定表达插入的ASFV相应蛋白(ASFV-P17、ASFV-P30、ASFV-P54、ASFV-P72、ASFV-P30-P54)。4、所构建的嵌合病毒可用于研制同时抵抗ASFV和PRRSV流行株的新型基因工程疫苗，减轻多种病原多次免疫压力，为研制ASFV重组PRRSV基因工程活载体疫苗，实现“一针防两病”，有利于我国ASF和PRRS疫情的防控，具有重要科学意义。

附图说明

图1是本发明实施例中rJSTZ1712-12-ASFV-P30、rJSTZ1712-12-ASFV-P54、rJSTZ1712-12-ASFV-P17、rJSTZ1712-12-ASFV-P72重组质粒全长cDNA连接构建示意图；

图2是本发明实施例中rJSTZ1712-12-ASFV-P30-P54重组质粒全长cDNA连接构建示意图；

图3是本发明实施例中ASFV-P30-P54二联基因串联连接构建示意图；

图4是本发明实施例中rJSTZ1712-12-ASFV-P30、rJSTZ1712-12-ASFV-P54、rJSTZ1712-12-ASFV-P17、rJSTZ1712-12-ASFV-P72重组质粒电泳图；

图5是本发明实施例中rJSTZ1712-12-ASFV-P54嵌合病毒感染Marc-145细胞引起的细胞病变图；

图6是本发明实施例中利用针对ASFV的相关蛋白特异性抗体的间接免疫荧光检测法检测拯救的rJSTZ1712-12-ASFV-P30、rJSTZ1712-12-ASFV-P54、rJSTZ1712-12-ASFV-P17、rJSTZ1712-12-ASFV-P72、rJSTZ1712-12-ASFV-P30-P54嵌合病毒结果图；

图7是本发明实施例中利用荧光定量PCR方法检测rJSTZ1712-12-ASFV-P30、rJSTZ1712-12-ASFV-P54、rJSTZ1712-12-ASFV-P17、rJSTZ1712-12-ASFV-P72、rJSTZ1712-12-ASFV-P30-P54嵌合病毒在Marc-145细胞上的动态增殖结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

下列实施例中的常规实验方法，参见Sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)，仪器的使用参照仪器操作说明书。

在本发明的实施例中，毒株与细胞：PRRSV rJSTZ1712-12株(Chen et al.,2021,Veterinary Research,52(1):74.DOI:

在本发明实施例中，质粒、菌株和抗体：pACYC177质粒购自优宝生物，rJSTZ1712-12-F3-RFP、pLenti-CMV-p30、pLenti-CMV-p54、PCAGGS-p17、OPT-p72质粒均保存于本实验室，Trans1-T1感受态细胞购自北京全式金生物有限公司。PRRSV抗N蛋白抗体与ASFV抗ASFV-P30、ASFV-P54、ASFV-P17、ASFV-P72蛋白抗体均保存于本实验室。材料为公众所容易获得。

在本发明实施例中，使用的其他试剂：RNase Free H

实施例1、重组表达ASFV相关抗原基因的PRRSV嵌合病毒基因组全长cDNA克隆构建(rJSTZ1712-12-ASFV-P30)

1.1、ASFV-P30基因扩增

为构建rJSTZ1712-12-ASFV-P30重组质粒(图1)，首先根据含有非洲猪瘟相关基因的质粒pLenti-CMV-p30序列，使用Primer 5.0设计ASFV-P30的特异性扩增引物，引物如表1所示，并进行PCR扩增；取PCR反应产物2μL，使用浓度为0.9％的琼脂糖凝胶进行电泳，获得ASFV-P30基因，其基因片段大小为606bp；

所述PCR反应体系为：模板：pLenti-CMV-p30，1μL；引物：ASFV-P30的特异性扩增引物，1μL；试剂：2×PrimeSTAR MAX DNA Polymearse，20μL；水：RNase Free H

1.2、rJSTZ1712-12-ASFV-P30重组质粒的构建

1.2.1、将ASFV-P30片段插入rJSTZ1712-12-F3-RFP质粒

用BclⅠ和KpnⅠ对rJSTZ1712-12-F3-RFP中间载体质粒进行双酶切，获得去除RFP片段的rJSTZ712-12-F3线性化载体片段；所述双酶切体系为：模板质粒：rJSTZ1712-12-F3-RFP，20μL；内切酶：BclⅠ，2μL；内切酶：KpnⅠ，2μL；试剂：10×CutSmart Buffer，4μL；水：RNase Free H

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收，使用同源重组的方法将ASFV-P30基因连接到rJSTZ712-12-F3线性化载体上，所述同源重组体系为：插入基因：ASFV-P30，3μL；中间载体：rJSTZ712-12-F3，11μL；试剂：5×CE MultiS Buffer，4μL；水：Exanse MultiS，2μL；

将同源重组产物转化到Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P30扩增引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，使用AscⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定，0.9％琼脂糖凝胶电泳，挑取酶切大小正确的重组质粒rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P30保留。

1.2.2、将rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P30片段插入到rJSTZ1712-12全长质粒

用AscⅠ和NotⅠ对rJSTZ1712-12和rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P30进行双酶切，获得rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P30；所述双酶切体系为：模板质粒：rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P30，25μL；内切酶：AscⅠ，2μL；内切酶：NotⅠ：2μL；试剂：10×CutSmart Buffer，4μL；水：RNase Free H

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收；胶回收的rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P30按摩尔比为1:8，以T4DNA连接酶连接，转化Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P30扩增引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，然后，通过AscⅠ+HF-NotⅠ内切酶组合对rJSTZ1712-12-ASFV-P30嵌合质粒进行双酶切鉴定及测序鉴定确认序列无误，完成rJSTZ1712-12-ASFV-P30重组质粒的构建(图4)。

实施例2、重组表达ASFV相关抗原基因的PRRSV嵌合病毒基因组全长cDNA克隆构建与拯救(rJSTZ1712-12-ASFV-P54)

2.1、ASFV-P54基因扩增

为构建rJSTZ1712-12-ASFV-P54重组质粒(图1)，首先根据含有非洲猪瘟相关基因的质粒pLenti-CMV-p54序列，使用Primer 5.0设计ASFV-P54的特异性扩增引物，引物如表2所示，并进行PCR扩增，PCR扩增体系如表6所示，PCR扩增程序如表8所示；取PCR反应产物2μL，使用浓度为0.9％的琼脂糖凝胶进行电泳，获得ASFV-P54基因，其基因片段大小为555bp。

2.2、rJSTZ1712-12-ASFV-P54重组质粒的构建

2.2.1、将ASFV-P54片段插入rJSTZ1712-12-F3-RFP质粒

用BclⅠ和KpnⅠ对rJSTZ1712-12-F3-RFP中间载体质粒进行双酶切，获得去除RFP片段的rJSTZ712-12-F3线性化载体片段。双酶切体系详见表9。反应条件：37℃水浴2h；

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收，使用同源重组的方法将ASFV-P54基因连接到rJSTZ712-12-F3线性化载体上，所述同源重组体系如表10所示；

将同源重组产物转化到Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P54扩增引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，使用AscⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定，0.9％琼脂糖凝胶电泳，挑取酶切大小正确的重组质粒rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P54保留。

2.2.2、rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P54片段插入到rJSTZ1712-12全长质粒

用AscⅠ和NotⅠ对rJSTZ1712-12和rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P54进行双酶切，获得rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P54；所述双酶切体系如表11所示，反应条件为：37℃水浴2h；

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收；胶回收的rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P54按摩尔比为1:8，以T4DNA连接酶连接，转化Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P54扩增引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，然后，通过AscⅠ+HF-NotⅠ内切酶组合对rJSTZ1712-12-ASFV-P54嵌合质粒进行双酶切鉴定及测序鉴定确认序列无误，完成rJSTZ1712-12-ASFV-P54重组质粒的构建(图4)。

实施例3、重组表达ASFV相关抗原基因的PRRSV嵌合病毒基因组全长cDNA克隆构建(rJSTZ1712-12-ASFV-P17)

3.1、ASFV-P17基因扩增

为构建rJSTZ1712-12-ASFV-P17重组质粒(图1)，首先根据含有非洲猪瘟相关基因的质粒PCAGGS-p17序列，使用Primer 5.0设计ASFV-P17的特异性扩增引物，引物如表3所示，并进行PCR扩增；取PCR反应产物2μL，使用浓度为0.9％的琼脂糖凝胶进行电泳，获得ASFV-P17基因，其基因片段大小为354bp；所述PCR反应体系为：模板：PCAGGS-p17，1μL；引物：ASFV-P17的特异性扩增引物，1μL；试剂：2×PrimeSTAR MAX DNA Polymearse，20μL；水：RNase Free H

3.2、rJSTZ1712-12-ASFV-P17重组质粒的构建

3.2.1、将ASFV-P17片段插入rJSTZ1712-12-F3-RFP质粒

用BclⅠ和KpnⅠ对rJSTZ1712-12-F3-RFP中间载体质粒进行双酶切，获得去除RFP片段的rJSTZ712-12-F3线性化载体片段；所述双酶切体系为：模板质粒：rJSTZ1712-12-F3-RFP，20μL；内切酶：BclⅠ，2μL；内切酶：KpnⅠ，2μL；试剂：10×CutSmart Buffer，4μL；水：RNase Free H

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收，使用同源重组的方法将ASFV-P17基因连接到rJSTZ712-12-F3线性化载体上，所述同源重组体系为：插入基因：ASFV-P17，3μL；中间载体：rJSTZ712-12-F3，11μL；试剂：5×CE MultiS Buffer，4μL；水：Exanse MultiS，2μL；

将同源重组产物转化到Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P17扩增引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，使用AscⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定，0.9％琼脂糖凝胶电泳，挑取酶切大小正确的重组质粒rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P17保留。

3.2.2、rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P17片段插入到rJSTZ1712-12全长质粒

用AscⅠ和NotⅠ对rJSTZ1712-12和rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P17进行双酶切，获得rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P17；所述双酶切体系为：模板质粒：rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P17，25μL；内切酶：AscⅠ，2μL；内切酶：NotⅠ：2μL；试剂：10×CutSmart Buffer，4μL；水：RNase Free H

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收；胶回收的rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P17按摩尔比为1:8，以T4DNA连接酶连接，转化Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P17扩增引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，然后，通过AscⅠ+HF-NotⅠ内切酶组合对rJSTZ1712-12-ASFV-P17嵌合质粒进行双酶切鉴定及测序鉴定确认序列无误，完成rJSTZ1712-12-ASFV-P17重组质粒的构建(图4)。

实施例4、重组表达ASFV相关抗原基因的PRRSV嵌合病毒基因组全长cDNA克隆构建(rJSTZ1712-12-ASFV-P72)

4.1、ASFV-P72基因扩增

为构建rJSTZ1712-12-ASFV-P72重组质粒(图1)，首先根据含有非洲猪瘟相关基因的质粒OPT-p72序列，使用Primer 5.0设计ASFV-P72的特异性扩增引物，引物如表4所示，并进行PCR扩增；取PCR反应产物2μL，使用浓度为0.9％琼脂糖凝胶进行电泳，获得ASFV-P72基因，其基因片段大小为1941bp；所述PCR反应体系为：模板：PCAGGS-p72，1μL；引物：ASFV-P72的特异性扩增引物，1μL；试剂：2×PrimeSTAR MAX DNA Polymearse，20μL；水：RNase FreeH

4.2、rJSTZ1712-12-ASFV-P72重组质粒的构建

4.2.1、将ASFV-P72片段插入rJSTZ1712-12-F3-RFP质粒

用BclⅠ和KpnⅠ对rJSTZ1712-12-F3-RFP中间载体质粒进行双酶切，获得去除RFP片段的rJSTZ712-12-F3线性化载体片段；所述双酶切体系为：模板质粒：rJSTZ1712-12-F3-RFP，20μL；内切酶：BclⅠ，2μL；内切酶：KpnⅠ，2μL；试剂：10×CutSmart Buffer，4μL；水：RNase Free H

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收，使用同源重组的方法将ASFV-P72基因连接到rJSTZ712-12-F3线性化载体上，所述同源重组体系为：插入基因：ASFV-P72，3μL；中间载体：rJSTZ712-12-F3，11μL；试剂：5×CE MultiS Buffer，4μL；水：Exanse MultiS，2μL；

将同源重组产物转化到Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P72扩增引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，使用AscⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定，0.9％琼脂糖凝胶电泳，挑取酶切大小正确的重组质粒rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P72保留。

4.2.2、rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P72片段插入到rJSTZ1712-12全长质粒

用AscⅠ和NotⅠ对rJSTZ1712-12和rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P72进行双酶切，获得rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P72；所述双酶切体系为：模板质粒：rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P72，25μL；内切酶：AscⅠ，2μL；内切酶：NotⅠ：2μL；试剂：10×CutSmart Buffer，4μL；水：RNase Free H

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收；胶回收的rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P72按摩尔比为1:8，以T4DNA连接酶连接，转化Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P72扩增引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，然后，通过AscⅠ+HF-NotⅠ内切酶组合对rJSTZ1712-12-ASFV-P72嵌合质粒进行双酶切鉴定及测序鉴定确认序列无误，完成rJSTZ1712-12-ASFV-P72重组质粒的构建(图4)。

实施例5、重组表达ASFV相关抗原基因的PRRSV嵌合病毒基因组全长cDNA克隆构建(rJSTZ1712-12-ASFV-P30-P54)

5.1、ASFV-P30-P54基因扩增

为构建rJSTZ1712-12-ASFV-P30-P54重组质粒(图2)，首先通过SEQ ID NO：11、SEQID NO：13引物对和SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14引物对以ASFV-P30和ASFV-P54质粒为模板分别扩增获得P30link和linkP54两个基因片段并进行胶回收(扩增反应体系与程序与二次扩增相同)，通过SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14引物对以P30link和link P54胶回收产物为模板进行二次扩增获得ASFV-P30-P54基因，扩增引物如表5所示，二次扩增反应体系如表7所示，二次扩增程序如表8所示。

5.2、rJSTZ1712-12-ASFV-P30-P54重组质粒的构建

5.2.1、将ASFV-P30-P54片段插入rJSTZ1712-12-F3-RFP质粒

用BclⅠ和KpnⅠ对rJSTZ1712-12-F3-RFP中间载体质粒进行双酶切，获得去除RFP片段的rJSTZ712-12-F3线性化载体片段；所述双酶切体系为：模板质粒：rJSTZ1712-12-F3-RFP，20μL；内切酶：BclⅠ，2μL；内切酶：KpnⅠ；2μL；试剂：10×CutSmart Buffer，4μL；水：RNase Free H

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收，使用同源重组的方法将ASFV-P30-P54基因连接到rJSTZ712-12-F3线性化载体上，所述同源重组体系为：插入基因：ASFV-P30-P54，3μL；中间载体：rJSTZ712-12-F3，11μL；试剂：5×CE MultiSBuffer，4μL；水：Exanse MultiS，2μL；

将同源重组产物转化到Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P30-P54扩增引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，使用AscⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定，0.9％琼脂糖凝胶电泳，挑取酶切大小正确的重组质粒rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P30-P54保留。

5.2.2、rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P30-P54片段插入到rJSTZ1712-12全长质粒

用AscⅠ和NotⅠ对rJSTZ1712-12和rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P30-P54进行双酶切，获得rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P30-P54；所述双酶切体系为：模板质粒：rJSTZ1712-12-F3-ASFV-P30-P54，25μL；内切酶：AscⅠ，2μL；内切酶：NotⅠ：2μL；试剂：10×CutSmart Buffer，4μL；水：RNase Free H

利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切条带，切下目的条带进行凝胶回收；胶回收的rJSTZ1712-12-F1+F2线性化载体和片段F3-ASFV-P30-P54按摩尔比为1:8，以T4 DNA连接酶连接，转化Trans1-T1感受态细胞，挑取独立的菌落进行纯培养，使用ASFV-P30-P54扩增引物进行菌液PCR检测；选取PCR阳性菌过夜增菌培养，提取质粒DNA，然后，通过AscⅠ+HF-NotⅠ内切酶组合对rJSTZ1712-12-ASFV-P30-P54嵌合质粒进行双酶切鉴定及测序鉴定确认序列无误，完成rJSTZ1712-12-ASFV-P30-P54重组质粒的构建(图4)。

表1、扩增ASFV-P30基因引物表

表2、扩增ASFV-P54基因引物表

表3、扩增ASFV-P17基因引物表

表4、扩增ASFV-P72基因引物表

表5、扩增ASFV-P30-P54基因引物表

表6、扩增ASFV相关基因反应体系表(以ASFV-P54为例)

表7、扩增ASFV-P30-P54基因反应体系表

表8、ASFV基因扩增程序(以ASFV-p54为例)

表9、rJSTZ1712-12-F3-RFP质粒双酶切反应体系

表10、同源重组体系

表11、重组质粒双酶切体系(以ASFV-P54为例)

实施例6、rJSTZ1712-12-ASFV嵌合病毒拯救(以rJSTZ1712-12-ASFV-p54为例)

预先使用含10％FBS的DMEM培养基将BHK-21细胞按2.5×10

首先在一个EP管中配置质粒预混液：重组质粒500ng,P3000 1μL,DMEM 25μL；在另一个EP管中配置Lip3000预混液：Lip3000 1.5μL,DMEM 25μL；最后将上述两步获得的预混液混合，室温静置15min,加入待转染的细胞。

预先使用含10％FBS的DMEM培养基将Marc-145细胞按2×10

细胞转染后36-48h,将整个培养板冻于－80℃,反复冻融两次后取全部细胞悬液，10,000×g离心1min。取全部上清加入Marc-145细胞，继续培养，每天观察细胞情况。如图5所示，拯救病毒接种Marc-145后72h后可见细胞出现皱缩、聚集、脱落等CPE现象，而阴性对照组细胞无明显CPE产生。表明所拯救嵌合病毒具有良好的体外复制效力。如图6所示，取第3代拯救病毒接种Marc-145,72hpi后使用ASFV抗P30、P54、P17、P72单抗作为一抗进行IFA检测，可见ASFV蛋白呈特异性红色(绿色)荧光，阴性对照组无荧光产生，再次证实嵌合病毒均拯救成活且插入的非洲猪瘟相关抗原蛋白成功表达。

实施例7、非洲猪瘟嵌合活载体病毒与亲本毒rJSTZ1712-12的增值特性比对

预先使用含10％FBS的DMEM培养基将Marc-145细胞按1×10

取rJSTZ1712-12、rJSTZ1712-12-ASFV-P30、rJSTZ1712-12-ASFV-P54、rJSTZ1712-12-ASFV-P72、rJSTZ1712-12-ASFV-P17和rJSTZ1712-12-ASFV-P30-P54第3代病毒液各200TCID

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。