盐酸地尔硫卓在制备抗猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的药物中的应用

技术领域

本发明属于化药技术领域，涉及防治猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductive andrespiratory syndrome virus,PRRSV)感染的药物，具体涉及盐酸地尔硫卓在制备抗PRRSV药物中的应用。

背景技术

猪呼吸与繁殖障碍综合征(又称蓝耳病)是一种由猪呼吸与繁殖障碍病毒(PRRSV)引起的高度接触性传染病。该病以母猪流产、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪呼吸困难、败血症、高死亡率为主要特征。该病可通过接触、空气、精液、胎盘等传播，长期危害猪生产，给养猪产业造成巨大的经济损失。目前，PRRS主要以持续感染、继发感染为主要特征，暂无特效药物治疗。

PRRSV粒子呈球形，迄今发现有7种结构蛋白，分别是N蛋白(核衣壳蛋白)、M蛋白、GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5蛋白。PRRSV毒株主要分为欧洲型(PRRSV-1)和美洲型(PRRSV-2)，当前我国流行的主要为美洲型毒株，欧洲毒株也有少量存在。PRRSV有严格的宿主专一性，猪是其主要靶动物，且PRRSV专嗜于猪的肺泡巨噬细胞(PAM)。不同年龄、品种和性别的猪均能感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的小猪最易感；该病毒感染猪导致免疫抑制，且易继发感染其他病原，对防控带来很大难度。

盐酸地尔硫卓，英文名：DiltiazemHCL。CAS号：33286-22-5；分子式：C

发明内容

本发明要解决的技术问题是提出盐酸地尔硫卓在制备抗猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒(PRRSV)的药物中的应用。

所述盐酸地尔硫卓的分子式为：

优选的，所述猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒包括PRRSV-Ⅰ和PRRSV-Ⅱ2种亚型。

优选的，所述PRRSV-Ⅰ亚型包括GZ11-G1和P3303毒株，所述PRRSV-Ⅱ亚型包括SD16、VR-2332、JXA1、CH-1a和NADC-like毒株。盐酸地尔硫卓对上述多种毒株均具有抑制作用，表明盐酸地尔硫卓具有广谱抗PRRSV感染的特点。

优选的，所述盐酸地尔硫可卓显著抑制PRRSV的复制。

优选的，所述盐酸地尔硫卓在PRRSV复制的多个阶段抑制基因的表达。

进一步优选的，盐酸地尔硫卓可在Pre、Co、Post等不同阶段均降低PRRSV N蛋白的表达水平。

优选的，所述盐酸地尔硫卓对PRRSV易感细胞(如MARC-145、PK-15

优选的，所述盐酸地尔硫卓可以显著降低PRRSV在猪体内的复制和肺组织损伤。

优选的，所述药物的剂型包括口服制剂或注射剂。

优选的，所述口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液或混悬剂。

优选的，所述注射剂包括水针剂、粉针剂或输液剂。

将盐酸地尔硫卓制备成上述各种制剂时可根据需要添加各种辅助剂料。

本发明化合物可以制成普通制剂、也可以制成缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。

本发明的另一目的是保护一种抗猪呼吸与繁殖障碍病毒的药物组合物，所述药物组合物中包括盐酸地尔硫卓。

本发明具有如下有益效果：

1)本发明首次发现盐酸地尔硫卓对PRRSV的抑制作用，可以作为PRRSV的一种抑制剂。

2)本发明进一步发现盐酸地尔硫卓在体外和体内不同层面系统均可显著抑制PRRSV的复制，而且盐酸地尔硫卓对PRRSV的多个亚型和毒株具有广谱的抑制作用。

3)本发明发现盐酸地尔硫卓可作为防治PRRSV感染的药物有效成分，对PRRSV临床用药提供有价值的理论依据和参考。

附图说明

图1为盐酸地尔硫卓在PRRSV易感细胞的毒性试验测试结果。

图2为盐酸地尔硫卓抑制PRRSV SD16毒株感染多种易感细胞，借助qPCR和WesternBlot在转录及蛋白水平检测N的表达。

图3为盐酸地尔硫卓对PRRSV-1型不同毒株N基因转录(A)及蛋白表达(B)的作用结果。

图4为盐酸地尔硫卓对PRRSV-2型不同毒株N基因转录(A)及蛋白表达(B)的作用结果。

图5为盐酸地尔硫卓不同处理方法与PRRSV感染的试验示意图。

图6为盐酸地尔硫卓在病毒复制的不同阶段抑制PRRSV的复制。

图7为盐酸地尔硫卓显著降低PRRSV SD16在猪体血液拷贝数。

图8为盐酸地尔硫卓显著降低PRRSV SD16感染导致的肺脏损伤。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

实施例1

盐酸地尔硫卓对PRRSV易感细胞的毒性试验

将猴肾细胞MARC-145、猪肾细胞PK-15

细胞活力(％)＝[A1-A2]/[A3-A2]×100％

A1试验组：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光值

A2空白对照：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光值

A3阴性对照：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光值

结果如图1所示，不同浓度的盐酸地尔硫卓对易感细胞的活力无显著的影响，且100μM为盐酸地尔硫卓的最大安全质量浓度。

实施例2

盐酸地尔硫卓对PRRSV复制的抑制作用

1.qPCR和Western blot方法分析PRRSV N基因表达

将MARC-145、PK-15

2.盐酸地尔硫卓具有广谱抗PRRSV感染作用

将MARC-145、PK-15

3.确定盐酸地尔硫卓影响PRRSV复制周期试验

参见图5，为进一步探究盐酸地尔硫卓影响PRRSV感染的机制，将MARC-145细胞接种于12孔板(1×10

实施例3

盐酸地尔硫卓在体内抗PRRSV感染试验

将12只PRRSV阴性的小猪随机分为3组，4只/组。设置盐酸地尔硫卓药物处理组(6mg/kg)、PRRSV感染对照组和阴性对照组(DMEM处理组)。药物处理组经口服给药24小时后，除阴性对照组外，其余2组小猪经滴鼻感染PRRSV SD16(3×10

总之，本发明以钙离子通道为药物靶点，寻找抗PRRSV感染的有效药物成分。通过用盐酸地尔硫卓处理PRRSV易感细胞(MARC-145，PK-15

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。