利用吸收滤光器进行相衬成像的角度可变照明

技术领域

本发明的各种示例总体上涉及一种包括显微镜和至少一个计算单元的系统。在本案中，显微镜包括照明模块，该照明模块被配置为用来自多个照明方向的光照射样本物体。可以借助于计算单元执行数字后处理，以获得具有定制对比度的结果图像。本发明尤其涉及布置在显微镜的成像光学单元中的吸收滤光器的使用。

背景技术

在样本物体的光学成像中，通常可能值得生成样本物体的所谓相衬图像。在相衬图像中，至少一些图像对比度是由穿过被成像的样本物体的光的相移引起的。特别地，这使得那些没有引起振幅衰减或仅引起较小振幅衰减但引起显著相移的样本物体能够以相对较高的对比度成像；通常，这样的样本物体也称为相位物体。在显微镜中作为样本物体的生物样本通常可能引起比电磁场振幅变化相对更大的相位变化。

已知存在各种相衬成像技术，例如暗场照明、斜射照明、微分干涉对比(DIC)或Zernike相衬法。

上述这样的技术具有各种缺点或局限性。通常，可能需要在所谓的成像光学单元的区域中在样本与检测器之间提供附加的光学元件，以便于相衬成像。这可能会导致结构上的限制。此外，可能存在应用上的限制：举例来说，通过提供附加的光学元件可能使荧光成像更加困难。

还已知可以借助于所谓的角度可变照明来获得相衬的技术。在本案中，与本披露相关联的角度可变照明旨在表示一种技术，在这种技术中，可以在整个区域上以不同的照明几何形状、即特别是从不同的照明方向来照射样本物体。照明几何形状是通过一个或多个照明方向实施的。

在DE 10 2014 112 242 A1中披露了可以借助于角度可变照明来获得具有相衬的图像的技术的第一示例。还参见：Tian、Lei和Laura Waller。“3D intensity and phaseimaging from light field measurements in an LED array microscope[通过LED阵列显微镜中的光场测量获得的3D强度和相位成像]。”optica 2.2(2015):104-111。但是，这些技术具有一定的局限性。举例来说，已经观察到，在这些技术中，如果检测器数值孔径大于照明数值孔径，则相衬强度降低。然而，另一方面，在与高分辨率成像相关联的情况下，如果使用较大的检测器数值孔径，则可能是值得的。

发明内容

因此，需要改进的相衬成像技术。特别地，需要消除至少一些上述缺点和局限性的相衬成像技术。

这个目的通过独立专利权利要求的特征来实现。从属专利权利要求的特征限定了实施例。

在一个示例中，一种系统包括显微镜。该显微镜具有照明模块、样本固持器和检测器。该显微镜还具有布置在该检测器与该样本固持器之间的成像光学单元。另外，该系统还包括至少一个计算单元。在本案中，该至少一个计算单元被配置为控制该照明模块，以便利用来自多个照明方向的光照射样本物体。另外，该至少一个计算单元还被配置为控制该检测器，以便捕获图像。在本案中，这些图像各自对应于该多个照明方向之一。该系统还包括吸收滤光器。该吸收滤光器布置在该成像光学单元中。该吸收滤光器具有位置相关吸收率。

这些照明方向可以实施不同的照明几何形状。在本案中，可以在各自情况下通过一个或多个照明方向形成照明几何形状。

这样的技术也可以相应地称为角度可变照明，因为不同的照明几何形状在各自情况下被用于样本物体或样本固持器的整个区域照明。

由于使用不同的照明方向或不同的照明几何形状，对应的图像可以具有不同的对比度。特别地，在相位物体的情况下，图像可以具有不同的对比度。然后可以通过组合这些图像来生成具有相衬的结果图像。

作为示例，在这种情况下，该至少一个计算单元还可以被配置为将这些图像彼此组合以获得结果图像。该结果图像可以具有相衬。在本案中，取决于组合的类型，可以获得不同的相衬，例如包括非量化相衬或相位梯度对比度。尤其在以下文件中披露了对应的技术：DE 10 2014 112 242 A1和DE 10 2017 108 873 A1。

通过使用吸收滤光器可以获得特别高的图像质量。例如，在一些示例中，可以形成特别强烈的相衬，如例如相位梯度对比度。这意味着，即使通过样本物体的很小的相位偏移也可以为结果图像中的相衬带来很大的值。吸收滤光器的使用可以另外使得能够以灵活的方式确定成像光学单元的检测器数值孔径的尺寸。特别地，可以使用相对较大的检测器数值孔径。特别地，可以将检测器数值孔径选择为大于照明模块的照明数值孔径。在本案中，使用较大的检测器数值孔径可以为所捕获的图像以及因此还为结果图像带来高质量。

一种方法包括控制显微镜的照明模块，以便用来自多个照明方向的光照射该显微镜的样本固持器上的样本物体。该方法另外包括控制该显微镜的检测器，以便捕获各自对应于该多个照明方向之一的图像。具有位置相关吸收率的吸收滤光器布置在该显微镜的成像光学单元中。

一种计算机程序或计算机程序产品或计算机可读存储介质，包括程序代码。该程序代码可以由计算单元执行以便执行一种方法。该方法包括控制显微镜的照明模块，以便利用来自多个照明方向的光照射该显微镜的样本固持器上的样本物体。该方法另外包括控制该显微镜的检测器，以便捕获各自对应于该多个照明方向之一的图像。具有位置相关吸收率的吸收滤光器布置在该显微镜的成像光学单元中。

附图说明

图1示意性地展示了根据各种示例的系统，该系统包括显微镜和计算单元。

图2是一个示例性方法的流程图。

图3示意性地展示了显微镜的被配置用于角度可变照明的示例性照明模块。

图4示意性地展示了根据各种示例可以与角度可变照明相关联地使用的照明几何形状。

图5示意性地展示了根据各种示例的不引起相位偏移的样本物体的角度可变照明。

图6示意性地展示了根据各种示例的引起相位偏移的样本物体的角度可变照明。

图7示意性地展示了根据各种示例的引起相位偏移的样本物体的角度可变照明，其中在图7中，检测器数值孔径大于照明数值孔径。

图8示意性地展示了根据各种示例的引起相位偏移的样本物体的角度可变照明，其中在图8中，检测器数值孔径大于照明数值孔径，并且其中，在显微镜的成像光学单元中使用了吸收滤光器。

图9示意性地展示了根据各种示例的吸收滤光器的吸收率的分布曲线。

图10示意性地展示了根据各种示例的吸收滤光器的吸收率的分布曲线。

具体实施方式

结合以下对示例性实施例的描述，上文描述的本发明的特性、特征和优点以及实现其的方式将变得更清楚且更清晰明白，这些示例性实施例结合附图进行更详细地解释。

在附图中，相同的附图标记表示相同或相似的要素。附图是本发明的各种实施例的示意性表示。图中展示的要素不一定按真实比例展示。而是，将图中展示的各种要素呈现成使得它们的功能和一般目的对于本领域技术人员来说是易懂的。图中所示的功能单元和要素之间的连接和联接也可以被实施为间接连接或联接。可以以有线或无线的方式来实施连接或联接。功能单元可以被实施为硬件、软件、或硬件与软件的组合。

下面描述用于借助于显微镜捕获图像的技术。在本案中，显微镜包括照明模块、样本固持器、成像光学单元和检测器。

下面描述用于确定具有定制对比度的结果图像的技术。举例来说，结果图像可以以一定相衬对相位物体成像。在本案中，相衬不必一定定量地形成，而是通常也可以定性地形成。这意味着对比度不必一对一地再现样本物体的相位。在一些示例中，例如可以使用相位梯度对比度，即，对比度可以指示相位变化。

本文描述的技术可以通过对样本物体的一个或多个图像进行数字后处理来确定结果图像。例如，样本物体的一个或多个图像可能是自身不具有相衬的强度图像。

样本物体的一个或多个图像可以与不同的照明几何形状相关联。这意味着可以在用对应的照明几何形状来照射样本物体的同时，在各自情况下用检测器来捕获一个或多个图像。这也称为角度可变照明。

例如，不同的照明几何形状可以与不同的照明方向相关联。可以通过时分多路复用或频分多路复用来将不同的照明几何形状或相关联的不同图像彼此分离。通过不同的极化进行分离也是可能的。照明几何形状可以具有方向相关性。例如，照明几何形状可以沿着一个或多个空间方向具有照度梯度。举例来说，照度可以沿着空间方向以阶梯方式变化，例如在零与有限值之间或在两个不同的有限值之间以阶梯方式变化。

举例来说，样本物体可以包括相位物体，例如细胞或细胞培养物等。样本物体可能是先验未知的；即，样本固持器可以固定不同的样本物体。样本物体对于所使用的光也可能是不透明的。取决于样本物体的类型，可能值得使用反射光几何形状或透射光几何形状来操作照明模块和检测器。

根据各种示例，使用布置在显微镜的成像光学单元中的吸收滤光器，以便增加相衬的强度。为此，吸收滤光器具有位置相关吸收率，该吸收率随垂直于显微镜光轴的侧向位置而变化。

图1展示了示例性光学系统90。举例来说，光学系统90可以包括显微镜100，例如使用透射光几何形状或者使用反射光几何形状的光学显微镜。

借助于显微镜100，可以以放大的方式表示固定在样本固持器113上的测量物体或样本物体的小结构。

为此，显微镜100包括照明模块111。照明模块111可以被配置为在各自情况下以不同的照明几何形状在整个区域上照射样本固持器113。

整个区域照明可以是指在样本物体或样本固持器113的区域中照度没有明显变化。这将本文所述的技术与具有照明图案的结构化照明区分开。

照明模块111具有照明数值孔径。照明数值孔径限定了可以从其将光辐射到样本物体上的区域。

另外，显微镜100包括成像光学单元112(有时也称为物镜或检测器光学单元)，该成像光学单元被配置为对检测器114的检测器区域上的测量物体生成图像。成像光学单元112的检测器数值孔径可以例如取决于所使用的照明几何形状来促进明场成像和/或暗场成像。

在图1的示例中，照明模块111被配置为促进对测量物体的角度可变照明。这意味着可以通过照明模块111来实现用于照射测量物体的光的不同照明几何形状。不同的照明几何形状可以各自包括一个或多个反射的照明方向或照明角度。

在此，在本文描述的各种示例中，用于提供不同照明几何形状的不同硬件实施方式是可能的。举例来说，照明模块111可以包括被配置为局部地修改和/或生成光的多个可调光源(在图1中未展示这些光源)。

光学系统90的计算单元115可以控制照明模块111或光源。举例来说，计算单元115可以被实施为微处理器或微控制器。可替代地或附加地，计算单元115可以包括例如FPGA或ASIC。可替代地或附加地，计算单元115还可以控制或读取样本固持器113、成像光学单元112和/或检测器114。计算单元115还可以结合对借助于检测器114捕获的图像的数字后处理来执行计算操作。

在一些示例中，计算单元115可以被集成到显微镜100的壳体中。然而，在其他示例中，计算单元115也可以相对于显微镜100设置在外部。举例来说，计算单元115可以由在PC上执行的对应计算机程序来实施。

图2是一个示例性方法的流程图。例如，根据图2的方法可以由图1的计算单元115执行。根据图2的方法使得可以通过使用角度可变照明来生成具有相衬的结果图像。

首先，在框9001中，控制照明模块111，使得生成多个照明几何形状。这意味着例如可以相继接通和关断发光二极管矩阵中不同的发光二极管。发光二极管矩阵中的多个发光二极管也可以同时接通，以便以此方式借助于来自多个照明方向的同时照明来实施照明几何形状。举例来说，可以实施半空间照明，其中，半空间的所有发光二极管都被接通或关断。

然后，框9002涉及控制检测器114以便捕获多个图像。在这种情况下，以同步的方式实施框9001中的控制照明模块111和框9002中的控制检测器114，使得所捕获的各种图像各自被分配给对应的照明几何形状或分配给形成相应照明几何形状的一个或多个对应的照明方向。可以使用时分多路复用或波分多路复用或偏振分割多路复用。

在可选框9003中，然后将在框9002中捕获的图像彼此组合以便以此方式获得结果图像。所述结果图像具有改善的对比度，例如相衬。

在框9003中，可以使用各种各样的技术来将捕获的图像彼此组合。相衬可能会根据组合(例如具有或不具有归一化、或者具有或不具有绝对值形成等)而变化。例如在以下文件中描述了对应的技术：DE 10 2014 112 242 A1和DE 10 2017 108 873 A1。

可选地，在框9003中，还可以将图像处理技术例如应用于各个捕获的图像和/或结果图像。图像处理技术的示例包括：背景归一化；噪声抑制；频率滤波；频率操纵；等。

在束路径中使用吸收滤光器尤其使得可以获得在相位的所有相关的空间频率上特别均匀地形成的相衬。这将在下文更详细地说明。

图3展示了照明模块111的示例性实施方式。图3是照明模块111的图示，该照明模块在X轴和Y轴所跨的侧向平面中垂直于光轴309而延伸。

从图3可以明显看出，照明模块111包括发光二极管121-1、121-2的矩阵(尽管其他实施方式也是可能的)。在本案中，发光二极管121-1布置在成像光学单元112的检测器数值孔径319内，而发光二极管121-2布置在成像光学单元112的检测器数值孔径319外。这意味着，特别地，明场成像以及暗场成像都可以借助于照明模块111来实现。

在本文所述的各种示例中，检测器数值孔径319可以足够大，以使得所有发光二极管都可以布置在成像光学单元112的检测器数值孔径319内。在这种情况下，无法进行暗场成像。

图4图示了与照明模块111的不同发光二极管121-1、121-2的单独操作相关联的方面。图4是沿图3的轴线X-X’的剖视图。

在图4的示例中，借助于对以箭头标记的发光二极管121-1的隔离接通来实现照明几何形状700。结果，从与标记的发光二极管121-1相对于光轴309的相对布置相对应的特定照明方向在整个区域上照射样本物体。然而，通常，每个照明几何形状也可以接通一个以上的发光二极管121-1、121-2，使得对应的照明几何形状由多个照明方向组成。也可以使用广阔的照明区域。在本案中，不同的照明几何形状可以具有至少部分地不同的照明方向。

结合图5至图7，下面描述了用于生成具有相衬的结果图像的角度可变照明的运作。

这里，图5展示了布置在样本平面302中的样本物体390的照明的各方面，其中样本物体390不引起入射光的相位偏移。

在图5中，照明模块111的照明数值孔径301被示意性地展示为视场光阑(此外，焦距确定照明数值孔径；但是，为了简明起见，在图5中未单独表示焦距)。还展示了限定照明孔径301的出射光瞳的直径305。直径305与焦距一起限定了数值孔径。

在图5中，使用了两个照明几何形状701(实线)和702(虚线)。还展示了对应的中央照明方向381、382。照明几何形状701的光从上半空间入射到样本物体390上；并且照明几何形状702的光从下半空间入射到样本物体390上。照明几何形状701、702的示例性实施方式可以例如借助于具有发光二极管121-1、121-2的矩阵的照明模块111来实现，其中，与照明几何形状701相关联地，中心线上方的所有发光二极管121-1、121-2被接通，并且其中，与照明几何形状702相关联地，中心线下方的所有发光二极管121-1、121-2被接通(还参见图3，其中对应的中心线由点划线表示)。

在图5的示例中，成像光学单元112包括透镜对311、312，其中，在透镜311、312之间限定了共轭平面(光瞳面)。在图5中还展示了成像光学单元112的入射光瞳的直径315，所述入射光瞳限定了检测器数值孔径319(另外，检测器数值孔径319还由成像光学单元112的焦距确定，但是为了简明起见，在图5中未展示焦距)。

在图5的最右边展示了光聚焦在其上的检测器平面321。此外，图5还展示了光轴309(主光线)(图5中的点划线)。

由于图5中的样本物体390是振幅物体并且不会引起入射光的相位偏移，所以在穿过样本物体390时光的方向也没有变化。这在图6中的场景中是不同的。

图6展示了样本物体390的照明的各方面。在本案中，图6中的示例原则上对应于图5中的示例。然而，在图6中的示例中，相位物体被用作样本物体390。在图6的示例中，该样本物体导致光背离光轴309向上偏转。因此，并非所有的光都可以通过检测器数值孔径319。特别地，与照明几何形状702相关联的一部分光(以箭头标记)没有被成像到检测器平面321上，因为这部分光不位于检测器数值孔径319内。相比之下，与照明几何形状701相关联的所有光都可以聚焦到检测器平面321上。

因此，在与照明几何形状701、702相关联的图像之间存在不对称性。该模型定性地解释了通过将对应于照明几何形状701、702的图像组合而获得的结果图像中的相衬的存在。组合可以通过加法或差异形成来实现。

对于较小的相位梯度，对应于照明几何形状701、702的图像之间的差异等于或近似等于零：这是因为来自两个照明半部(图6的顶部和底部)的光尽管由于(小的)相位梯度而发生了移位，但仍可以通过该系统，而不会受到阻碍并射在检测器上。这尤其适用于检测器数值孔径319相对较大并且因此来自这两个照明半部的光位于检测器数值孔径319内的情况。这个发现结合图7来解释。

图7展示了样本物体390的照明的各方面。在本案中，图7中的示例在原理上对应于图6的示例。然而，在图7的示例中，与图6中的示例相比，使用了扩大的检测器数值孔径319。特别地，在图7中的示例中，检测器数值孔径319(其由比直径305更大的直径315示意性地展示)大于照明数值孔径301。

在如图7所示的这样的场景中，照明几何形状702的所有光也到达检测器平面321(尤其参见在图7和图6中以箭头标记的光线)。

图7定性地解释了为什么根据参考实施方式，检测器数值孔径319的尺寸必须相对较小，尤其是相对于照明数值孔径301而言。下面给出了对使得可以使用大的检测器数值孔径319而不会失去也获得具有相衬的结果图像的可能性的技术的描述。使用大的检测器数值孔径319原则上使得可以以高分辨率捕获图像。

图8展示了样本物体390的照明的各方面。在本案中，图8中的示例在原理上对应于图7中的示例。特别地，同样在图8中的示例中，如上面已经结合图7解释的，与检测器孔径319相关联的入射光瞳的直径315大于与照明孔径301相关联的出射光瞳的直径305。这旨在示意性地展示检测器数值孔径319可以大于照明数值孔径301(其中，这种考虑顾及了照明的焦距和检测器光学器件的焦距，出于简化的原因，在图8中未表示这些焦距)。

在图8中的示例中，提供了吸收滤光器800，其被布置在成像光学单元112中并且具有位置相关吸收率(位置相关吸收率在图8中由吸收滤光器800的沿X方向定向的非实线展示)。

通过使用这种具有吸收率的位置相关性的吸收滤光器800可以实现的是，由于样本物体390在成像光学单元112的光瞳面的区域中的相位偏移而与光轴309相距较大侧向距离的光被更大程度地吸收。这进而使得，通过组合对应于不同照明几何形状701、702的不同图像，即使使用了大的检测器数值孔径319，也可以获得具有相衬的结果图像。

通过适当地确定吸收率的位置相关性的大小，同样可以实现的是，即使对于更少的不同照明几何形状(例如通过使用紧挨在一起的发光二极管121-1、121-2来实施照明几何形状)，也可以获得增强的相衬。

下面结合图9和图10描述了与吸收滤光器800的吸收率的位置相关性相关联的细节。

图9和图10展示了与吸收滤光器800相关联的各方面。特别地，图9和图10展示了吸收滤光器的吸收率810的位置相关性。

在图9和图10的示例中，相对于光轴309(即，在侧向方向上，在图5至图8中的X方向上)的距离越大，吸收率810取的值就越大。在本案中，吸收率810在图9中的示例性实施方式中具有阶梯状的径向分布曲线；并且在图10中的实施方式中具有渐变的径向分布曲线。

吸收率810的位置相关性可以在(X轴和Y轴所跨的)侧向平面中相对于光轴390以旋转对称的方式体现。但是，非旋转对称的实施例也是可能的：在图9和图10的示例中，具体地，展示了吸收率810的单调分布曲线。在一些示例中，吸收率810也可以体现为局部非单调的(例如，沿着X轴或沿着Y轴)，只要该区域上的积分保持单调即可。这里始终要成立的是，照明几何形状的(在XY平面中，垂直于光轴309)区域上的光的积分随着相对于光轴309的距离变大而单调减小。

吸收率810可以作为相对于光轴309的距离的函数而单调增加。

吸收率810的位置相关性的这种实施例使得可以实现与光轴309的侧向距离越大光线的衰减就越大的效果(如以上结合图5至图8所描述的)，并且因此实现结果图像中的相衬的增强。

图9和图10中的示例另外还展示了邻近光轴309的内部区域801，以及以在侧向方向上偏移的方式围绕内部区域801的外部区域802。外部区域802中的吸收率810大于内部区域801中的吸收率。在这种情况下，在各种测试中观察到，外部区域802中的吸收率810与内部区域801中的吸收率810之间的相对较大差异可能是值得的。例如，内部区域801中的吸收率810可能不大于10％，并且外部区域中的吸收率可能>50％。由此可以实现的是，穿过成像光学单元112(并且特别是穿过光轴309附近的光瞳面)的光没有被衰减或者没有显著衰减，结果是图像具有强的信号。另一方面，通过将外部区域802中的吸收率810的大小确定为大于0％(例如在10％至50％的范围内)，可以实现的是，结果图像具有相衬，但是同时也具有高分辨率。

举例来说，在将外部区域802中的吸收率810的大小确定为在10％至20％的范围内的情况下，也可以与荧光成像组合(在这种情况下通常具有相对较低的光强度)。过高的吸收率可通过分辨率降低的趋势来调节。

在光瞳面中，与光轴309相距较大距离的光线对应于高空间频率。由于如上确定大小的吸收率810导致的高空间频率的有限阻尼，各种所捕获图像的总质量没有受到限制，或者没有受到明显限制。

图9和图10还另外分别展示了直径305和直径315。这使得可以指定对吸收率810的位置相关性的相对定量大小确定。从图9和图10可以明显看出，例如，内部区域801的直径的大小近似等于直径305的大小。通常，内部区域801的直径可以在照明模块111的直径305的80％至120％的范围内，可选地在80％至100％的范围内。此外，结合图9和图10，还可以看出，内部区域801和外部区域802的直径均小于直径315。

如上所述，这使得可以使照明模块111的照明数值孔径301的尺寸小于成像光学单元112的检测器数值孔径319的尺寸；同时尽管如此，仍然可以获得具有相衬的结果图像。

总之，上面已经给出了对使得可以在照明期间借助于角度可变照明来传输甚至很小的相位信息(例如，相位梯度信息)的技术的描述。由此可以通过各个图像的组合来获得具有特别高的相衬的结果图像。在本文所述的各种技术中，这是通过使对应于不同照明几何形状的两个图像之间的差异在不等于零的相位梯度的小偏转的情况下就已经最大化来实现的。这尤其是通过使相位物体的背离光轴的光线衰减来实现的。为此目的，使用减小所述光线的光强度的吸收滤光器。吸收滤光器可以是例如渐变式滤光器或以阶梯方式体现的吸收滤光器。即使对于小的相位偏移，吸收滤光器的使用也导致差异不等于0。这些差异(至少是分段的)与相位的梯度成比例。

不言而喻，上述本发明的实施例和方面的特征可以彼此组合。特别地，在不脱离本发明的范围的情况下，这些特征不仅可以以所描述的组合方式使用，而且还可以以其他组合方式使用或独自使用。

举例来说，上面已经给出了对将所捕获的(原始)图像组合以获得结果图像的技术的描述。在本案中，通常可以对所捕获的图像进行后处理，例如通过在频域中应用滤光器。可以取决于所使用的吸收滤光器来选择这些数字滤光器。这是基于这样的见解：在滤光器的吸收率弱的情况下，只能弱地传输低空间频率或小相位梯度。然后可以使用(数字)频率滤光器，其放大一个或多个原始图像和/或结果图像的与衰减区域相对应的频率范围。举例来说，可以将该频率范围乘以某个因子，而该范围之外的所有频率都保持不变。

其他传统的图像处理技术也将适用。