一种硫酸软骨素的含量测定方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种硫酸软骨素的含量测定方法。

背景技术

硫酸软骨素(chondroitiulfate，CS)是由D-葡糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖以β-1,4-糖苷键连接而成的重复二糖单位组成的多糖，是一种具有天然活性的酸性粘多糖类物质，广泛的存在于动物的软骨和结缔组织中。CS具有调节血脂、抗肿瘤、抗衰老、治疗关节炎、防治冠心病等多种疗效，并且不良反应少。此外，CS被广泛应用于食品及化妆品中，还具有改善口感、润滑度、吸湿性等作用。因此，测定CS的含量对于保健食品和药品原料以及成品销售的品质控制具有非常重要的意义。

目前，测定CS含量的常用方法有分光光度法、高效液相法和电化学分析法等。其中，高效液相法主要是将多糖分解后进入色谱柱利用各组分间极性差异的性质进行分离后检测，该方法测定对象单一，无杂质干扰，灵敏度高，适用性广。

例如，中国专利CN107941963A公开了一种增加骨密度食品中硫酸软骨素的含量测定方法：将样品与乙腈振荡使其分散均匀，加入水超声溶解，补加水定容，乙腈-戊烷磺酸钠溶液作为流动相，进行高效液相色谱检测，其中，乙腈-戊烷磺酸钠溶液由0.87g戊烷磺酸钠溶解于500mL乙腈-水溶液(乙腈：水体积比＝5～10：95～90)得到，流动相比例为乙腈：戊烷磺酸钠溶液体积比＝4.75～5.25：95.25～94.75，乙腈-水溶液按照乙腈：水体积比为5～10：95～90的比例配制，硫酸软骨素钠的最低检测限为1.61ng，待测样品品中含有0.13％以上的硫酸软骨素钠才可检出，检测灵敏度不够高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种硫酸软骨素的含量测定方法，本发明提供的方法能实现快硫酸软骨素的速准确测定，硫酸软骨素的检出限低，方法灵敏度高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种硫酸软骨素的含量测定方法，包括以下步骤：

将待测样品与水混合，进行超声提取后第一离心分离，得到水提取液；

将所述水提取液进行微孔滤膜过滤，得到待测样品液；

将所述待测样品液进行高效液相色谱检测，根据得到的待测样品液谱图和预定的标准曲线得到硫酸软骨素含量检测结果，所述标准曲线为硫酸软骨素钠标准品的浓度与峰面积的标准曲线；

所述高效液相色谱检测的条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相体系包括流动相A和流动相B，所述流动相A为戊烷磺酸钠水溶液，所述流动相B为乙腈，所述流动相体系中流动相A的体积分数为2％。

优选的，所述待测样品包括奶粉和/或固体饮料；

所述待测样品与水的固液比为50.4mg：1mL。

优选的，所述超声提取的功率为250W，频率为50Hz，时间为5min。

优选的，所述第一离心分离的转速为10000r/min，时间为10～15min。

优选的，所述微孔滤膜过滤包括：将所述水提取液置于微孔滤膜上，第二离心分离，将得到的上清液过0.2μm滤膜，得到待测样品液。

优选的，所述微孔滤膜的截流分子量为3000Da。

优选的，所述第二离心分离的转速为10000r/min，时间为10～15min

优选的，所述超声提取和超声混合的功率独立地为250W，频率独立地为50Hz，时间独立地为5min。

优选的，所述高效液相色谱检测的柱温为34～36℃，检测波长为192nm，进样量为10μL，流动相流速为0.8mL/min。

优选的，所述戊烷磺酸钠水溶液的浓度为1.71～1.74g/L。

本发明提供了一种硫酸软骨素的含量测定方法，本发明采用超声水提取和微孔滤膜过滤对样品进行前处理，除杂效果好，大大降低了基质效应，然后进行高效液相色谱检测，硫酸软骨素的峰形好且与其他杂质的分离度高，硫酸软骨素含量检测结果与样品中硫酸软骨素含量的偏差小，检测结果准确性高，检出限低，稳定性强，可以作为检测硫酸软骨素含量符合药典规定的有效方法。而且，本发明提供的检测方法操作简单，以水为提取剂，成本低，绿色环保。

附图说明

图1为硫酸软骨素的线性范围考察结果图；

图2为CN107941963A提供的方法得到的待测样品液的高效液相色谱图；

图3为水提醇沉得到的待测样品液的高效液相色谱图；

图4为酶解得到的待测样品液的高效液相色谱图；

图5为酶解-沉淀得到的待测样品液的高效液相色谱图；

图6为水提醇沉得到的待测样品液的高效液相色谱图；

图7为超声水提-大孔树脂洗脱得到的待测样品液的高效液相色谱图；

图8为超声水提-聚酰胺树脂洗脱得到的待测样品液的高效液相色谱图；

图9为超声水提-微孔滤膜过滤得到的待测样品液的高效液相色谱图；

图10为流动相为乙腈:戊烷磺酸钠溶液体积比＝10:90的高效液相色谱图；

图11为流动相为乙腈:戊烷磺酸钠溶液体积比＝8:92的高效液相色谱图；

图12为流动相为乙腈:戊烷磺酸钠溶液体积比＝6:94的高效液相色谱图；

图13为流动相为乙腈:戊烷磺酸钠溶液体积比＝4:96的高效液相色谱图；

图14为流动相为乙腈:戊烷磺酸钠溶液体积比＝2:98的高效液相色谱图；

图15为对比例1的高效液相色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种硫酸软骨素的含量测定方法，包括以下步骤：

将待测样品与水混合，进行超声提取后第一离心分离，得到水提取液；

将所述水提取液进行微孔滤膜过滤，得到待测样品液；

将所述待测样品液进行高效液相色谱检测，根据得到的待测样品液谱图和预定的标准曲线得到硫酸软骨素含量检测结果，所述标准曲线为硫酸软骨素钠标准品的浓度与峰面积的标准曲线；

所述高效液相色谱检测的条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相体系包括流动相A和流动相B，所述流动相A为戊烷磺酸钠水溶液，所述流动相B为乙腈，所述流动相体系中流动相A的体积分数为2％。

如无特殊说明，本发明采用的原料均为市售商品。

本发明将待测样品与水混合，进行超声提取后第一离心分离，得到水提取液。

在本发明中，所述待测样品优选包括奶粉和/或固体饮料，所述奶粉优选包括氨糖软骨素奶粉，更优选包括氨糖软骨素胶原蛋白VD钙奶粉；本发明对于所述固体饮料没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的含有硫酸软骨素的固体饮料即可。在本发明中，所述待测样品与水的固液比优选为50.4mg：1mL。

在本发明中，所述超声提取的温度优选为室温；所述超声提取的功率优选为250W；所述超声提取的频率优选为50Hz；所述超声提取的时间优选为20min。

在本发明中，所述第一离心分离的转速优选为10000r/min，所述第一离心分离的时间优选为10～15min，更优选为10～12min；所述第一离心分离得到的上清液为水提取液。

得到水提取液后，本发明将所述水提取液进行微孔滤膜过滤，得到待测样品液。

在本发明中，所述微孔滤膜过滤优选包括：将所述水提取液置于微孔滤膜上，第二离心分离，将得到的上清液过0.2μm滤膜，得到待测样品液。在本发明中，所述微孔滤膜的截流分子量优选为3000Da。在本发明中，所述第二离心分离的转速独立地优选为10000r/min，所述第二离心分离的时间优选为10～15min，更优选为10～12min。

得到待测样品液后，本发明将所述待测样品液进行高效液相色谱检测，根据得到的待测样品液谱图和预定的标准曲线得到硫酸软骨素含量检测结果，所述标准曲线为硫酸软骨素钠标准品的浓度与峰面积的标准曲线。

在本发明中，所述高效液相色谱检测的条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，优选为NUCLEODURC18(极性小分子封尾)；流动相体系包括流动相A和流动相B，所述流动相A为戊烷磺酸钠水溶液，所述戊烷磺酸钠水溶液的浓度优选为1.71～1.74g/L，更优选为1.72～1.74g/L；所述流动相B为乙腈，所述流动相体系中流动相A的体积分数为2％；柱温优选为34～36℃，更优选为35℃；检测器优选为紫外检测器，检测波长优选为192nm，进样量优选为10μL，所述流动相的流速优选为0.8mL/min。

在本发明中，所述标准曲线的绘制方法优选包括以下步骤：将硫酸软骨素钠标准品工作液进行高效液相色谱检测，得到硫酸软骨素钠标准品的色谱图，以硫酸软骨素钠标准品工作液的浓度为横坐标，以硫酸软骨素钠标准品的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归计算，得到线性回归方程。在本发明中，所述硫酸软骨素钠标准品工作液的浓度优选为0.05096～0.5096mg/mL。在本发明中，所述线性回归方程优选为Y＝10146X+50583，相关系数R

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

仪器与材料：安捷伦1100高效液相色谱仪，配紫外检测器。KQ5200DB数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。CP225D型10万分之一分析天平：德国SARTORIUSAG公司。JD60-4万分之一分析天平：沈阳龙腾电子有限公司。滤膜：聚四氟乙烯膜(PTFE)，0.2μm。大孔树脂：LS-806B大孔树脂。聚酰胺：分析纯。

试剂与试药：水：GB/T 6682规定的一级水。乙腈：色谱级，批号：021902，MREDA。戊烷磺酸钠：纯度≥99.5％。乙醇：优级纯。

待测样品：康乐享牌氨糖软骨素胶原蛋白VD钙奶粉：批号20230301、20230302、20230303，由北京姿美堂生物技术股份有限公司提供。

标准品：硫酸软骨素钠：批号：140792-202003，中国食品药品检定研究院提供。

高效液相色谱检测条件：色谱柱为NNCLEODURC18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相A为以戊烷磺酸钠溶液(1.74g/L)，流动相B为乙腈，等度洗脱，等度洗脱，流动相体系中乙腈:戊烷磺酸钠溶液体积比＝2:98，流动相流速为0.8mL/min，柱温为35℃，紫外检测器，检测波长为192nm，进样量为10μL。

实施例1

(1)线性范围试验

称取硫酸软骨素钠标准品25.48mg于25mL容量瓶中，加水超声溶解，然后加水定容至刻度，得到标准品储备液。

量取标准品储备液5mL于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，得到标准品使用液(作为标准品工作液6)。

依次量取标准品储备液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，得到标准品工作液(记为标准品工作液1～标准品工作液5)。

精密量取上述标准品工作液1～标准品工作液6各10μL，分别注入液相色谱仪，进行高效液相色谱检测，记录色谱图，测定峰面积，以硫酸软骨素钠标准品的浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，按照线性回归计算，线性范围试验结果如图1和表1所示：

表1线性范围试验结果

由图1和表1可知，线性关系相关系数R

(2)样品前处理方法考察

(2.1)CN107941963A提供的方法：GB/T20365-2006《硫酸软骨素和盐酸氨基葡萄糖含量测定》的提取方法，将1.26g康乐享牌氨糖软骨素胶原蛋白VD钙奶粉样品于105℃下干燥4h，然后取25mg干燥样品，置于100mL容量瓶中，加入10ml乙腈，振荡使其分散均匀，再加入水适量，用超声波使溶解，超声20min，并用水定容至刻度，摇匀。液相色谱仪测定前，样品溶液用0.2μm的聚四氟乙烯膜(PTFE)滤膜过滤，得到待测样品液。

(2.2)水提醇沉：将1.26g康乐享牌氨糖软骨素胶原蛋白VD钙奶粉样品加入水在25mL容量瓶定容，摇匀，在10000r/min条件下离心10min，在所得上清液中加入乙醇至乙醇体积分数为70％，进行醇沉，弃去下清液，所得上清液为待测样品。

(2.3)酶解：将1.26g康乐享牌氨糖软骨素胶原蛋白VD钙奶粉样品使用8mL中性蛋白酶在pH＝7的磷酸盐缓冲液中酶解2h，转移至10mL容量瓶中，用水定容，得到待测样品液。

(2.4)酶解-沉淀：将1.26g康乐享牌氨糖软骨素胶原蛋白VD钙奶粉样品使用8mL中性蛋白酶在pH＝7的磷酸盐缓冲液中酶解2h，将所得酶解液转移至25mL容量瓶中，用70v/v％乙醇定容，得到待测样品液。

(2.5)水提醇沉：在1.26g康乐享牌氨糖软骨素胶原蛋白VD钙奶粉样品中加入适量水溶解，在所得水解液中加入乙醇至乙醇体积分数为70％，进行醇沉，弃去下清液，所得上清液为待测样品液。

(2.6)超声水提-大孔树脂洗脱：将1.26g康乐享牌氨糖软骨素胶原蛋白VD钙奶粉样品与25mL水在室温、250W、50Hz条件下超声提取20min，在10000r/min条件下离心10min，所得上清液为水提取液；将水提取液用大孔树脂洗脱(洗脱剂为70v/v％乙醇水溶液)，所得洗脱液为待测样品液。

(2.7)超声水提-聚酰胺树脂洗脱：将1.26g康乐享牌氨糖软骨素胶原蛋白VD钙奶粉样品与25mL水在室温、250W、50Hz条件下超声提取20min，在10000r/min条件下离心10min，所得上清液为水提取液；将水提取液用聚酰胺树脂洗脱(洗脱剂为70v/v％乙醇水溶液)，，所得洗脱液为待测样品液。

(2.8)超声水提-微孔滤膜过滤：将1.26g康乐享牌氨糖软骨素胶原蛋白VD钙奶粉样品与25mL水在室温、250W、50Hz条件下超声提取20min，在10000r/min条件下离心10min，取上清液(即水提取液)1mL置于微孔滤膜(3000Da)上，在10000r/min条件下离心10min，取上清液过0.2μm滤膜，得到待测样品液。

将各个待测样品液分别注入液相色谱仪，进行高效液相色谱检测，记录色谱图，不同前处理方法得到的待测样品液的高效液相色谱图2～9所示，待测样品液中硫酸软骨素含量的检测结果以及峰形及分离度结果如表2所示，其中，图2按照CN107941963A方法得到的待测样品液的高效液相色谱图，图3为水提醇沉得到的待测样品液的高效液相色谱图，图4为酶解得到的待测样品液的高效液相色谱图，图5为酶解-沉淀得到的待测样品液的高效液相色谱图，图6为水提醇沉得到的待测样品液的高效液相色谱图，图7为超声水提-大孔树脂洗脱得到的待测样品液的高效液相色谱图，图8为超声水提-聚酰胺树脂洗脱得到的待测样品液的高效液相色谱图，图9为超声水提-微孔滤膜过滤得到的待测样品液的高效液相色谱图。

表2样品前处理方法的考察结果

由表2和图2～9可知，按照GB/T 20365-2006《硫酸软骨素和盐酸氨基葡萄糖含量测定》中的提取方法处理样品进样测定，无法达到基线分离、不能准确定量，因此对提取方法进行优化。而本发明对前处理条件进行优化后，采用超声水提提取后微孔滤膜离心除杂，峰形、分离度高。

(3)流动相优化

为了改善峰形，提高测定结果的准确性，对GB/T20365-2006《硫酸软骨素和盐酸氨基葡萄糖含量的测定液相色谱法》规定的方法中的流动相进行优化，流动相如表3所示，不同流动相的高效液相色谱图如图10～14所示，其中，图10为流动相为乙腈:戊烷磺酸钠溶液体积比＝10:90的高效液相色谱图，图11为流动相为乙腈:戊烷磺酸钠溶液体积比＝8:92的高效液相色谱图，图12为流动相为乙腈:戊烷磺酸钠溶液体积比＝6:94的高效液相色谱图，图13为流动相为乙腈:戊烷磺酸钠溶液体积比＝4:96的高效液相色谱图，图14为流动相为乙腈:戊烷磺酸钠溶液体积比＝2:98的高效液相色谱图。

表3不同流动相的试验结果

由表3和图10～14可知，根据不同流动相色谱条件下硫酸软骨素峰形及分离度，确定当流动相为乙腈:戊烷磺酸钠溶液体积比＝2:98为流动相，其他色谱条件不变，色谱峰形、分离度最好。

(4)检出限和定量限

将浓度为100.29μg/mL的硫酸软骨素溶液进一步加水稀释为浓度为2.0058μg/mL、1.50435μg/mL的溶液，分别进行高效液相色谱检测，记录信号强度与噪音强度的比值，将3倍信噪比(S/N＝3)的浓度作为检出限，将10信噪比(即S/N＝10)的浓度作为定量限，硫酸软骨素的检出限为0.2μg/mL，即本品中含有0.1％的硫酸软骨素即可检出。定量下限为1.5μg/mL，即本品中含有0.01％的硫酸软骨素钠即可检出。说明，本发明提供的方法，硫酸软骨素钠的灵敏度较高，能够满足其含量测定的需要。

(5)准确度试验(加样回收率)

称取6份康乐享牌氨糖软骨素胶原蛋白VD钙奶粉样品(每一份奶粉中硫酸软骨素钠的含有量见表4)，每份约1.26g，各加入硫酸软骨素钠标准品(每一份奶粉中硫酸软骨素的加入量见表4)，按照步骤(2.8)中超声水提-微孔滤膜过滤方法进行前处理，得到加标待测样品液；将所述加标待测样品液进行高效液相色谱检测(每个样品各2针)，代入所得线性回归方程，按照式(1)计算硫酸软骨素的加样回收率，结果见表4。

表4回收率测定结果(n＝6)

由表4可知，平均回收率为99.95％，RSD为2.76％，说明本发明提供的检测方法的准确度在规定的线性范围内，准确度高。

(6)稳定性试验

称取康乐享牌氨糖软骨素胶原蛋白VD钙奶粉1.26g左右(称样量见表5)，按照步骤(2.8)中超声水提-微孔滤膜过滤方法进行前处理，得到供试品溶液；将所述供试品溶液分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h和12h采集进行高效液相色谱检测，记录峰面积，计算其RSD为0.82％，说明，本发明提供的前处理方法进行前处理后，供试品溶液在12h稳定性良好。

(7)重复性试验

供试品溶液的配制：将1.26g康乐享牌氨糖软骨素胶原蛋白VD钙奶粉样品溶解在25mL水中，在室温、250W、50Hz条件下超声提取20min，在10000r/min条件下离心10min，取上清液(即水提取液)1mL置于微孔滤膜(3000Da)上，在10000r/min条件下离心10min，取上清液过0.2μm滤膜，得到供试品溶液，共配制6份供试品溶液。

分别将所述标准品溶液和供试品溶液进行高效液相色谱检测，记录峰面积，计算其RSD，重复性试验结果如表5所示。

表5供试品溶液重复性试验结果

由表5可知，供试品溶液进样精密度良好，峰面积RSD均≤3.7％，说明本发明提供的检测方法重复性良好。

(8)精密度试验

采用不同型号的高效液相色谱仪、同类型的不同编号色谱柱重新进行重复性试验，结果如表6～7所示，供试品溶液进样精密度良好，峰面积RSD均≤2.81％。

按照步骤(7)的方法配制6份供试品溶液，采用不同的高效液相色谱仪(分别为岛津仪器(苏州)有限公司生产和株式会社岛津制作所日本京都)重新进行重复性试验，连续进样6次，计算结果硫酸软骨素含量，结果如表6所示：

表6精密度测定结果(n＝6)

由表6可知，康乐享牌氨糖软骨素胶原蛋白VD钙奶粉中硫酸软骨素的平均值(n＝6)分别2.03g/100g，RSD为0.81％。

将表6的精密度测定结果与表5的重复性试验数据合并计算RSD，见表7：

表7精密度试验结果(n＝12)

由表7可知，本发明提供的检测方法精密度良好。

(9)耐用性实验

分别调整柱温和柱流速,柱温调整范围为34℃±5℃，柱流速调整范围为0.8±0.08mL/min，将优化后的前处理得样品进行高效液相色谱检测。实验结果表明，硫酸软骨素和盐酸氨基葡萄糖在柱温和柱流速调整的条件下，峰面积的RSD值最小为0.8％，最大为3.7％，均满足GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》要求，耐用性良好。

对比例1

以康乐享牌氨糖软骨素胶原蛋白VD钙奶粉为待测样品，按照CN107941963A实施例2的2.17样品含量测定对待测样品进行前处理和高效液相色谱检测，高效液相色谱图如图15所示，计算得到硫酸软骨素含量为1.6g/100g。

由图15可知，CN107941963A公开的检测方法的色谱峰分离度差，且测定硫酸软骨素含量测定偏高，方法误差较大。

综上，本发明选择康乐享牌氨糖软骨素胶原蛋白VD钙奶粉，其中含有大量的CS，除此之外还含有其他食品成分，测定时会有较大干扰。本发明建立了高效液相法测定硫酸软骨素含量的方法，并通过线性范围试验、准确度试验(加样回收率)、标准品溶液稳定性、供试品溶液稳定性、重复性、中间精密度、耐用性试验了进行系统的方法学验证，结果表明，本发明提供的硫酸软骨素的含量测定方法，能够快速、准确、有效的检测出硫酸软骨素含量，且检测结果精密度高、重现性好、稳定性好、回收率高、测定结果准确，有利于快速、便捷、及时、准确地反映奶粉产品的质量(硫酸软骨素含量)，实现奶粉质量可控。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。