一种用于皮肤组织解离的混合酶及其制备方法、解离试剂盒、解离方法

技术领域

本发明涉及单细胞测序技术领域，具体涉及一种专门用于皮肤组织解离的混合酶及其制备方法；此外本发明还涉及一种用于皮肤组织解离的解离试剂盒及解离方法。

背景技术

细胞是构成人体组织和器官的基本单位，在以往的研究中，大部分基因检测技术的方法是从对细胞集合性的研究，其得到的实验结果反映的是细胞群体中信号表达的平均水平，其实是针对细胞群体而产生的整体表征或者只是代表了细胞群体中在数量上占优势的细胞信息，从而忽略了单个细胞所特有的细胞异质性；然而已有大量的研究发现，在同种器官或组织中的相同类型的细胞也具有显著的异质性，并且每个细胞都具有各自独特的表达模式，细胞与细胞之间所蕴含的信息和表达水平千差万别；因此，使用细胞群体表达出的均值来进行描述的方法是不准确的，很可能会丢失或错误提示一些关键的表达信息；此外，传统的高通量测序的研究方法，难以应用在对自然界中难培养的微生物的研究、罕见循环肿瘤细胞的转录组分析、胚胎发生最早期的分化特征研究、肿瘤的非均质性和微进化研究等精确程度较高的研究领域；随着细胞分选和测序技术的进步，单细胞测序技术便应运而生并发展迅速，目前已是一大研究热点。

新一代测序技术单细胞测序技术（single-cell sequencing，SCS）是一种在单个细胞的水平上对基因组或转录组进行高通量测序并进行分析的一项新的测序技术；单细胞测序技术与传统的高通量测序相比较而言，其不但可以快速确定成千上万个细胞的精确基因表达模式，分析出相同表型的细胞的遗传信息，还可以获得珍贵样本的重要信息，具有极其广阔的应用前景，目前已应用于肿瘤、发育生物学、神经生物学、临床诊断、免疫性疾病、宏基因组学及微生态、生殖健康、新药研发等多个领域，《Science》杂志曾将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首；单细胞测序技术大致可以分为四类：单细胞全基因组测序、单细胞转录组测序、表观遗传测序、三维基因组测序，这四种测序类型也各具优势和特点，可以从不同维度、不同层面获得处于不同阶段的细胞特征性信息；单细胞测序技术在流程上包括：单细胞悬液的制备、单细胞分离和文库制备、测序、数据分析及可视化解读。

在任何单细胞研究中，单细胞悬液的制备过程都是极其关键的，此步也是单细胞测序技术首先需要解决的问题；细胞聚集导致成团率高，或者细胞死亡率高的样本，以及一些特殊样本容易出现的细胞碎片多等的情况都会影响最终的数据质量，导致科学研究者的错误解读；因此，对于特定的目标组织有其适合的最优实验方案；将组织裂解成单细胞悬液，传统方法一般有机械分离法和酶解法，悬液制备的难点主要有：如何保证解离下来的细胞具有高活性、如何保证细胞悬液结团少、如何保证最终上机的细胞没有碎片或有极少碎片；因此，对于不同的组织类型研究者们都会先优化出最佳的解离条件，特别是对于批间差异比较大的样本，其酶解时间和酶液的配比尤为重要，需要多次优化形成，在整个单细胞测序技术中是个性化比较强的一步。

皮肤是人体最大的器官，发挥了保护、维持体温、新陈代谢、感觉、免疫、信号传递等重要功能，人体表皮细胞在皮肤组织修复、伤口愈合、皮肤老化、相关肿瘤的发生等当面发挥了重要作用，是人们进行日常活动的基本保障，随着再生医学的发展和进步，临床上和科研领域中越来越多的研究者以皮肤作为实验对象以更好的服务临床和科学研究，如人真皮结缔组织中最常见的细胞——成纤维细胞，是目前皮肤组织工程应用最为广泛的子细胞，其可以合成胶原蛋白、弹性蛋白和细胞外基质，构成皮肤组织的结构框架，并在创伤愈合过程中起到关键作用，对于成纤维细胞的研究，可以了解其功能、细胞信号传导、纤维发生、创伤修复、皮肤老化等细胞机制的重要载体。此外，随着神经内分泌学研究的进展，神经源性炎症如银屑病近年来得到不少关注，人们发现Merkel细胞与大脑中枢有着密切联系，并早已注意到Merkel细胞可能在银屑病中起到神经内分泌调节的作用， Merkel细胞位于表皮基底层，且与神经末梢紧密相连。单细胞测序技术可以在单细胞水平对基因表达情况进行分析，是研究皮肤生理功能及疾病状态的一种新的重要手段，目前单细胞RNA测序在皮肤疾病领域的研究应用刚刚起步，因此在皮肤相关领域使用单细胞测序技术的研究较少；如Joost等研究者利用单细胞测序技术研究了小鼠正常皮肤表皮的结构和组成，对小鼠毛囊间和毛囊的表皮细胞进行了测序，并根据细胞群标志性基因区分出25种不同的细胞群，另外还发现在不同空间位置的表皮干细胞有共同的基底-表皮基因表达模式，这一研究显示出了单细胞测序技术在识别皮肤角质形成细胞亚群上的强大能力；Cheng等人利用单细胞RNA测序技术分析出人体不同部位的表皮角质形成细胞的基因特征、银屑病皮损角质形成细胞基因表达的变化，该研究揭示了正常人包皮、头皮和躯干部位的表皮，以及银屑病患者的表皮细胞基因的表达状态，为基底层角质形成细胞执行不同分化程序的能力、免疫细胞向银屑病皮损部位的募集过程等研究课题奠定了十分重要的基础；Kobayashi等研究人员对表皮、真皮及皮下组织的固有淋巴样细胞进行了单细胞RNA测序，这为研究皮肤稀有的免疫细胞提供了技术可能，他们还进一步探究了皮肤免疫细胞与皮脂腺、 共生菌群的关系，该研究为皮肤免疫细胞如何调节皮肤稳态提供了新的思路；此外，单细胞RNA测序技术也是研究肿瘤细胞异质性、肿瘤微环境组成等课题的强有力工具， 如Tirosh等人通过单细胞测序技术从黑色素瘤患者的肿瘤组织中发现恶性肿瘤细胞的聚类显示出肿瘤细胞间与细胞周期、空间环境、耐药性相关的异质性，他们还对肿瘤内的非恶性细胞进行了聚类分析，通过解析肿瘤微环境发现在肿瘤微环境中存在多种T细胞抑制性受体基因的表达，且抑制性受体基因的表达和T细胞活化的状态相关度较高，该实验表明黑素瘤中存在共刺激分子激活的T细胞衰竭机制，可以作为免疫治疗的靶点，研究结果对黑素瘤的分型和肿瘤的精准治疗具有重要的指导意义； 因此，利用单细胞测序技术，不仅可以定义皮肤组织中的细胞亚群，如角质形成细胞、成纤维细胞、树突细胞及T细胞等；还可以找到炎症性疾病及自身免疫性皮肤疾病，如银屑病、红斑狼疮、特应性皮炎等发病过程中的关键靶细胞，从而发现可能与对应疾病发展有关的免疫细胞亚群；对于皮肤肿瘤类疾病，如基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等，该技术可以助力研究者识别新的肿瘤亚型和细胞，免疫治疗提供可能的靶点线索，单细胞测序在肿瘤亚群及微环境的研究中发挥着强有力的作用；皮肤组织往往带有较多毛发且难以去除，现有的解离方法不能高效适当地处理得到大量皮肤单细胞，从而阻碍了利用单细胞测序技术对皮肤细胞进行检测和分析；

目前皮肤组织常见的解离成单细胞的方法主要有胰蛋白酶消化法、中性蛋白酶＋胶原酶消化法两种：胰蛋白酶（Trypsin）存在于很多脊椎动物的消化系统中，具有水解消化蛋白质的功能，对于组织和细胞来说，胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解，从而达到使细胞分散的作用，且不同的组织或细胞对胰蛋白酶的作用反应不同，在使用胰蛋白酶进行解离时应把握好浓度、时间和温度，防止消化过度而对细胞造成损伤；有研究发现，胰蛋白酶具有较强的细胞毒性，并且往往是由于对其的消化时间难以把控引起的，如若消化时间过长，细胞会被严重损伤，而如果消化时间过短，就很难破坏掉细胞间的连接而导致细胞未分散开来、成团率较高；胶原酶（Collagenase）即胶原蛋白水解酶，它可以特异地水解胶原蛋白的肽键，并且不损伤其他蛋白质和组织，胶原酶常用于科学实验中哺乳动物细胞的分离，胶原酶的消化作用主要是针对细胞间质，所以其比较适合消化解离纤维性组织、上皮组织、癌样本的组织等，当遇到消化的目的组织较硬、内含较多结缔组织或胶原蛋白成分时，用胰蛋白酶进行消化水解的效果可能会比较差，这时可以选用胶原酶进行细胞解离；在分型上，胶原酶可以分为六种：I、II、III、IV、V型和肝细胞专用胶原酶，因此要根据目标消化组织的类型来准确选择胶原酶的类型；中性蛋白酶属于一种内切酶，是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而来，在适宜的温度和酸碱度下，中性蛋白酶可以将大分子蛋白质水解为氨基酸，它适用于各种动植物蛋白的水解；消化中用到的终止液一般都为含10%胎牛血清的DMEM（High）培养基。

胰蛋白酶消化法是将皮肤组织置于0.25%胰酶中，37℃条件下震荡消化1h左右或4℃过夜消化，但实践中采用胰蛋白酶消化的效果显示所获得的的细胞活率较低，因此此法消化得到的单细胞悬液很可能不符合单细胞测序的上机要求。

中性蛋白酶＋胶原酶消化的方法是将处理好的皮肤组织置于0.5%的中性蛋白酶中4℃消化过夜，次日再往其中加入0.1%的II型胶原酶，37℃条件下震荡消化3h，而后终止消化，此法往往耗时较长而导致整个实验成本大大提高，且影响细胞活性和上机效率。

单细胞测序技术中对单细胞悬液的上机要求较为严格：1、细胞活率需大于85%，因为死亡或受损的细胞会将核酸释放到细胞悬液中，这些核酸将在后续的实验步骤中保留下来，会影响实验结果；2、细胞单个不成团且细胞形态好、碎片少背景干净，为较好的保证最终结果，制备的单细胞悬液中红细胞比率、碎片率、结团率都需低于4%；3、细胞浓度达到300~1200个/μL，合适的浓度也至关重要，细胞总数要在5~10万个，上样量不够或过多都将影响最终数据质量。

中国发明专利申请CN201911094195.X公开了一种脂肪组织的单细胞悬液的制备方法，但其不适用于皮肤组织，皮肤组织往往带有较多毛发且组织致密坚硬而难以处理，我们将该专利申请公开的混合酶用于皮肤组织，发现细胞活率较低，且消化时间长，成本高。

综上所述，实体组织单细胞悬液的制备目前还缺乏成熟通用的解决办法，不同组织所适用的方法也不尽相同，甚至同一组织所采用的方法也可能不同，酶消化法处理组织时要根据不同组织类型选择相应的酶及作用条件，且酶消化法受酶的种类、浓度、消化时间的影响对细胞的活性影响较大。皮肤组织往往带有较多毛发且组织致密坚硬而难以处理，现有的解离方法不能高效适当地处理得到大量皮肤单细胞，目前很多消化方法所使用的酶的种类多、时间长，从而导致试剂成本和人力成本提高，因此寻求一种更快速高效且适用于单细胞测序技术的皮肤组织单细胞解离方法十分必要。

目前尚没有可以高效解离皮肤组织而得到大量可供后续研究的皮肤单细胞悬液的解离混合酶与解离试剂盒。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种用于皮肤组织解离的混合酶，使用的酶的种类较少，消化时间较短，从而大大降低了试剂成本和时间成本，提高了实验效率，得到的最优条件和配比适用于皮肤组织的高效解离；

本发明要解决的技术问题之二是提供一种用于皮肤组织解离的混合酶的制备方法；

本发明要解决的技术问题之三是提供一种用于皮肤组织解离的解离试剂盒；其能高效、快速、稳定地获得单细胞数量多、活性好、碎片少、成团率低的单细胞悬液，可应用于皮肤组织的单细胞解离过程，获得的单细胞悬液可进一步适用于单细胞测序、流式筛选等研究，为皮肤样本的单细胞研究提供了良好工具。

本发明要解决的技术问题之四是提供一种使用解离试剂盒的皮肤组织解离方法；

本发明要解决的技术问题之五是提供所述混合酶在制备用于皮肤组织解离的解离试剂盒中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：

第一方面，本发明提供一种用于皮肤组织解离的混合酶，其中，所述混合酶由胶原酶II（CollagenaseII，简称C酶）、胰蛋白酶（Trypsin，简称T酶）、脱氧核糖核酸酶I（DNaseI，简称D酶）组成，在具体使用时，所述胶原酶可使用Collagenase from Clostridiumhistolyticum Type II（C）,C6885-100MG,Sigma；胰蛋白酶可使用Trypsin EDTA SolutionA（0.25%）(T) , 03-050-1BCS,BI；脱氧核糖核酸酶I可使用DNaseI from bovine pancreas(D), 11284932001,Sigma。其中，

所述胶原酶II（COLLAGENASE II）的浓度为2-4mg/mL；

所述胰蛋白酶（TRYPSIN）的浓度为1-3mg/mL；

所述脱氧核糖核酸酶I（DNASEI）的浓度为0.01-0.05mg/mL。

作为本发明优选的技术方案，上述的一种用于皮肤组织解离的混合酶，其中，

所述胶原酶II的浓度为3.25mg/mL；

所述胰蛋白酶的浓度为2.5mg/mL；

所述脱氧核糖核酸酶I的浓度为0.02mg/mL。

第二方面，本发明提供一种用于皮肤组织解离的解离试剂盒，其中，所述解离试剂盒包含第一方面所述的混合酶。

作为本发明优选的技术方案，上述的一种用于皮肤组织解离的解离试剂盒，其中，所述解离试剂盒还包含缓冲液。

作为本发明优选的技术方案，上述的一种用于皮肤组织解离的解离试剂盒，其中，所述缓冲液为以下中的一种或多种缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D、缓冲液E；

所述缓冲液A为平衡盐溶液或无机盐溶液；

所述缓冲液B为含10%胎牛血清的DME/F12培养基（即DME/F12+10%FBS）；

所述缓冲液C为含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（即Phosphate Buffered Saline+2% FBS）；

所述缓冲液D为含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基（即Roswell Park MemorialInstitute 1640+10%FBS）；

所述缓冲液E为1×红细胞裂解液（即1×RBC Lysis Buffer）。

第三方面，本发明提供如第一方面所述混合酶的制备方法，其中，包含以下步骤：

步骤A1：将所述胶原酶II（COLLAGENASE II）加入所述胰蛋白酶（TRYPSIN）中进行溶解，得到混合母液；

步骤A2：将所述脱氧核糖核酸酶I（DNASEI）加入所述混合母液中溶解，得到混合酶。

作为本发明优选的技术方案，上述混合酶的制备方法，其中，所述脱氧核糖核酸酶I（DNASEI）的配置方法包含以下步骤：

步骤B1：将无菌双氧水加入冻干酶中进行溶解重悬，制成工作浓度为10 mg/ml的母液；

步骤B2：将缓冲液加入所述母液中进行稀释，得到所述脱氧核糖核酸酶I（DNASEI），所述脱氧核糖核酸酶I（DNASEI）的工作浓度为0.01-0.05mg/mL。

第四方面，本发明提供一种使用上述解离试剂盒的皮肤组织解离方法，其中，包含在无菌环境下操作的以下步骤：

步骤C1：获取皮肤样本并放置于组织保存液中；

步骤C2：取出皮肤样本并使用缓冲液A进行冲洗；

步骤C3：取适量（优选为0.5g）冲洗后的皮肤样本放在培养皿中，并加入缓冲液C对组织进行预处理；

步骤C4：向培养皿中加入缓冲液B浸润皮肤样本后切碎皮肤样本获得皮肤组织；

步骤C5：将皮肤组织转移至装有所述混合酶的离心管中，将离心管置于水浴锅中进行消化；

步骤C6：将缓冲液B加入离心管中进行消化终止，同时将消化剩余的组织放入新的对应浓度的混合酶中，继续消化30-50min；

步骤C7：将消化终止后离心管内的溶液用细胞筛进行过滤，去除杂质与未完全消化的皮肤组织后继续离心，弃上清；

步骤C8：在离心管中加入缓冲液E后离心，弃上清，加入缓冲液C重悬细胞沉淀后离心，弃上清，得到皮肤组织的单细胞悬液；

步骤C9：对皮肤组织的单细胞悬液进行观察并计数，计算活率。

作为优选的技术方案，上述的皮肤组织解离方法，其中，步骤C5中消化的条件为在37℃水浴锅中消化30min；步骤C6中，将缓冲液B加入离心管中进行消化终止，同时将消化剩余的组织放入新的对应浓度的混合酶中，继续消化40min，消化结束后按上述方法消化终止。

作为优选的技术方案，上述的皮肤组织解离方法，其中，步骤C1中获取的皮肤样本在组织保存液中的保存温度为4℃，所述保存液为单细胞测序组织保存液；

步骤C4中使用消毒灭菌后的刀片、镊子切碎皮肤样本；

步骤C7中采用30μm细胞筛进行过滤，离心的条件为1500rpm离心10min；

步骤C8中第一次离心的条件为1000rpm离心5min，第二次离心的条件为300rpm离心5min；

步骤C9中使用光学显微镜观察细胞形态，使用细胞计数仪进行计数。

上述的皮肤组织解离方法，其中，步骤C5中消化的条件为在37℃水浴锅中消化30min，每10min轻轻吹打一次。

第五方面，本发明提供了所述混合酶在制备用于皮肤组织解离的解离试剂盒中的应用，且所用的酶种类更少更高效、消化时间更短、成本更低。

胰蛋白酶（Trypsin）是蛋白酶的一种，存在于很多脊椎动物的消化系统中，具有水解消化蛋白质的功能，在胰脏中其作为酶的前体——胰蛋白酶原而被合成，在小肠中被肠激酶激活而成为成熟的胰蛋白酶，其是肽链内切酶，能够将多肽链中的赖氨酸和精氨酸的羧基侧切断；胰蛋白酶不仅具有消化酶的作用，还能够限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它前体物质，从而起到活化作用，在单细胞技术服务中，对于组织和细胞来说，胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解，从而达到使细胞分散的作用，且不同的组织或细胞对胰蛋白酶的作用反应不同，在使用胰蛋白酶进行解离时应把握好浓度、时间和温度，防止消化过度而对细胞造成损伤，有研究发现，胰蛋白酶具有较强的细胞毒性，并且往往是由于对其的消化时间难以把控引起的，如若消化时间过长，细胞会被严重损伤，而如果消化时间过短，就很难破坏掉细胞间的连接而导致细胞未分散开来、成团率较高。

胶原酶（Collagenase）即胶原蛋白水解酶，它可以在生理PH和温度条件下特异地水解胶原蛋白的肽键，同时也不损伤其他蛋白质和组织，胶原酶常用于科学实验中哺乳动物细胞的分离，按胶原酶存在的方式可分为人体内源性胶原酶和药用胶原酶两类，前者是指人体自身所具有的胶原酶，例如存在于牙龈、触膜等上皮组织和关节滑膜、椎间盘内；后者是指采用生物制药的高新技术手段从溶组织梭状芽孢杆菌的发酵液中提取、纯化并精制而得到的胶原酶，由于胶原酶的消化作用主要是针对细胞间质，所以其比较适合消化解离纤维性组织、上皮组织、癌样本的组织等，当遇到消化的目的组织较硬、内含较多结缔组织或胶原蛋白成分时，用胰蛋白酶进行消化水解的效果可能会比较差，这时可以选用胶原酶进行细胞解离；在分型上，胶原酶可以分为六种：I、II、III、IV、V型和肝细胞专用胶原酶，因此要根据目标消化组织的类型来准确选择胶原酶的类型；中性蛋白酶属于一种内切酶，是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而来，在适宜的温度和酸碱度下，中性蛋白酶可以将大分子蛋白质水解为氨基酸，它适用于各种动植物蛋白的水解，该酶对于裸皮作用较强，常用于皮革脱毛、软化、羊毛丝绸脱胶、奶制品等加工领域。

组织消化过程中，胰蛋白酶是被广泛应用的消化剂，在常用的胰蛋白酶中，由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用取决于细胞类型、酶活、酶浓度、消化条件和时间等，总体来说，胰蛋白酶的作用较强，容易对细胞尤其是平滑肌细胞造成损伤，要注意配比和消化细节。胶原酶对胶原蛋白有很强的消化作用，比较适用于消化纤维性高的组织、上皮组织、癌组织等，其对细胞间质有较好的消化解离作用，而对细胞本身影响不大，可以使细胞与胶原成分脱离而不受伤害，胶原酶的分离效果比较温和。

依据上述本发明一种解离用混合酶及其制备方法、解离试剂盒、解离方法提供的技术方案具有以下技术效果：

本发明提供一种用于皮肤组织解离的混合酶，从众多酶类中选出胶原酶II、胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶I三种酶组合制成混合酶，在机械法的基础上使用混合酶进行消化制备皮肤组织的单细胞悬液，在优化出最适配比和消化时间等条件后，得到比较符合单细胞测序上机标准的细胞悬液，通过观察单细胞悬液的细胞形态、统计细胞数量、检测细胞活性、对死细胞数和细胞碎片、细胞团块等进行计算，得出细胞活率、单细胞悬液的浓度等关键数据，结果表明大大降低了时间成本，提高了细胞活率和实验效率，得到的最优条件和配比适用于皮肤组织的高效解离；

解离试剂盒能高效、快速、稳定地获得单细胞数量多、活性好、碎片少、成团率低的单细胞悬液，可应用于皮肤组织的单细胞解离过程，获得的单细胞悬液可进一步适用于单细胞测序、流式筛选等研究，本发明筛选优化的混合酶及浓度更具有针对性和高效性，相比广谱好几种胶原酶结合使用的方法更节约成本和时间，本发明为一直很难解离的皮肤组织样本的单细胞相关研究提供了良好的工具。

相比中国发明专利申请CN201911094195.X公开了一种脂肪组织的单细胞悬液的制备方法，本发明混合酶存在如下区别：1）解离对象不同：本发明混合酶的解离对象是皮肤组织；而CN201911094195.X的解离对象是脂肪组织。2）混合酶的组成不同：本发明混合酶由胶原酶II、胰蛋白酶和脱氧核糖核酸酶I三种酶组成；而CN201911094195.X的复合酶解液含有中性蛋白酶、胶原蛋白酶I、胶原蛋白酶II、胶原蛋白酶Ⅳ、胰蛋白酶和DNAse这6种酶。3）混合酶的浓度不同。本发明中所述胶原酶II的浓度为2-4mg/mL；所述胰蛋白酶的浓度为1-3mg/mL；所述脱氧核糖核酸酶I的浓度为0.01-0.05mg/mL；而对比文件1中，所述复合酶中，胶原蛋白酶I 的工作浓度为200-400u/mL或1 .0～2 .0mg/mL；胶原蛋白酶II的工作浓度为100-200u/mL或 0 .5～1 .0mg/mL；胶原蛋白酶IV的工作浓度为50-200u/mL或0 .25～1.0mg/mL；中性蛋白酶的 工作浓度为0 .25～0 .5mg/mL；胰蛋白酶的工作浓度为0 .25～0.5mg/mL；DNAse的工作浓度为 5-20u/mL或0 .01～0 .02mg/mL。本发明与CN201911094195.X相比，使用的酶的种类较少，消化时间较短，从而大大降低了试剂成本和时间成本，提高了实验效率，达到了CN201911094195.X所预料不到的技术效果，具有创造性。

附图说明

图1为本发明实施例5中细胞台盼蓝染色镜下图片；

图2为本发明实施例5中细胞荧光染色镜下图片；

图3为本发明实施例5中细胞明场图片；

图4为本发明实施例5中细胞荧光图片。

具体实施方式

为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

以下实施例和对比例涉及的酶和试剂有：

C酶（Collagenase from Clostridium histolyticum Type II（C）,C6885-100MG,Sigma）；

T酶（Trypsin EDTA Solution A（0.25%）(T), 03-050-1BCS,BI）；

D酶 (DNaseI from bovine pancreas(D), 11284932001,Sigma)；

Co酶（Collagenase from Clostridium histolyticum TypeI（Co）,C0130-100MG,Sigma）（I型胶原酶）；

Di酶（DispaseI（Di）, 4942086001,sigma）（中性蛋白酶）；

缓冲液A（BufferA）：平衡盐溶液（Hank′s）或无机盐溶液；

缓冲液B（BufferB）：含10%胎牛血清的DME/F12培养基（DME/F12+10%FBS）；

缓冲液C（BufferC）：含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS+2%FBS）；

缓冲液D（BufferD）： 10%胎牛血清的RPMI 1640培养基（Roswell Park MemorialInstitute 1640+10%FBS）；

缓冲液E（BufferE）：1×红细胞裂解液（1×RBC Lysis Buffer）（00-4333-57，Thermo）。

实施例1.（C酶+T酶+D酶、消化时间未优化的）

⑴酶的配制：

C酶：实施例1中C酶的工作浓度为3.25mg/mL；

T酶：实施例1中的T酶浓度为2.5mg/mL，无需稀释操作；

D酶：用无菌的双蒸水对冻干酶进行溶解重悬，配制成母液（10 mg/ml），再用缓冲液A（BufferA）进行进一步稀释，使实施例1中D酶的工作浓度为0.02mg/mL；

混合酶的配制：用浓度为2.5mg/mL 的T酶对C酶进行溶解，使其终浓度为3.25mg/mL，再将配制好的D酶加入其中，并使其工作浓度为0.02mg/mL。

⑵取材：获取皮肤样本，置于组织保存液中（伯优单细胞测序组织保存液，货号：21903-10），可以暂放在4℃冰箱中待处理；

⑶冲洗：将组织从保存液中取出，用缓冲液A（BufferA）缓冲液进行冲洗，以去除残留保存液；

⑷称重：称取0.5g的样本组织于6cm培养皿中，并加入缓冲液C对组织进行预处理；

⑸切碎组织：在安全柜内进行无菌操作，往培养皿中加入3mL 缓冲液B（BufferB），浸润称取的皮肤组织，用消毒灭菌后的刀片和镊子快速将样本切碎，切至肉眼观察无明显块状组织即可；

⑹组织消化：将切碎的组织转移至装有5mL消化液（C酶+T酶+D酶）的50mL离心管中，离心管置于37℃水浴锅中消化1h左右；

⑺终止消化：向装有消化液的离心管中加入终止培养基缓冲液B（BufferB）终止消化；

⑻滤网过筛：终止消化后的溶液用30μm细胞筛进行过滤，以去除杂质和未完全消化的组织，1500rpm离心10min，弃上清，

⑼裂红及清洗：往细胞沉淀中加入3mL缓冲液E（BufferE），1000rpm离心5min后弃上清，使用缓冲液C（BufferC）重悬细胞沉淀，再300rpm离心5min，弃上清；

⑽细胞观察及计数：用缓冲液C（BufferC）重悬细胞沉淀，得到皮肤组织的单细胞悬液，光学显微镜下观察细胞形态，使用细胞计数仪进行计数并得到活率。

对比例1.（消化时间与实施例1相同，Co酶+T酶+D酶，作为混合酶与实施例1形成对比）

⑴酶的配制：

Co酶：对比例1中Co酶的工作浓度为3.25mg/mL；

T酶：对比例1中的T酶浓度为2.5mg/mL，无需稀释操作；

D酶：用无菌的双蒸水对冻干酶进行溶解重悬，配制成母液（10 mg/ml），再用缓冲液A（BufferA）进行进一步稀释，使对比例1中D酶的工作浓度为0.02mg/mL；

混合酶的配制：用浓度为2.5mg/mL 的T酶对Co酶进行溶解，使其终浓度为3.25mg/mL，再将配制好的D酶加入其中，并使其工作浓度为0.02mg/mL。

⑵取材：获取皮肤样本，置于组织保存液中，可以暂放在4℃冰箱中待处理；

⑶冲洗：将组织从保存液中取出，用缓冲液A（BufferA）缓冲液进行冲洗，以去除残留保存液；

⑷称重：称取0.5的样本组织于6cm培养皿中，并用缓冲液C对组织进行预处理；

⑸切碎组织：在安全柜内进行无菌操作，往培养皿中加入3mL 缓冲液B（BufferB），浸润称取的皮肤组织，用消毒灭菌后的刀片和镊子快速将样本切碎，切至肉眼观察无明显块状组织即可；

⑹组织消化：将切碎的组织转移至装有5mL消化液（Co酶+T酶+D酶）的50mL离心管中，离心管置于37℃水浴锅中消化1h左右；

⑺终止消化：像装有消化液的离心管中加入终止培养基缓冲液B（BufferB）终止消化；

⑻滤网过筛：终止消化后的溶液用30μm细胞筛进行过滤，以去除杂质和未完全消化的组织，1500rpm离心10min，弃上清，

⑼裂红及清洗：往细胞沉淀中加入3mL缓冲液E（BufferE），1000rpm离心5min后弃上清，使用缓冲液C（BufferC）重悬细胞沉淀，再300rpm离心5min，弃上清；

⑽细胞观察及计数：用缓冲液C（BufferC）重悬细胞沉淀，得到皮肤组织的单细胞悬液，光学显微镜下观察细胞形态，使用细胞计数仪进行计数并得到活率。

实施例2.（C酶+T酶+D酶，消化时间已优化）

⑴酶的配制：

C酶：实施例2中C酶的工作浓度为3.25mg/mL；

T酶：实施例2中的T酶浓度为2.5mg/mL，无需稀释操作；

D酶：用无菌的双蒸水对冻干酶进行溶解重悬，配制成母液（10 mg/ml），再用缓冲液A（BufferA）进行进一步稀释，使实施例2中D酶的工作浓度为0.02mg/mL；

混合酶的配制：用浓度为2.5mg/mL 的T酶对C酶进行溶解，使其终浓度为3.25mg/mL，再将配制好的D酶加入其中，并使其工作浓度为0.02mg/mL。

⑵取材：获取皮肤样本，置于组织保存液中（伯优单细胞测序组织保存液，货号：21903-10），可以暂放在4℃冰箱中待处理

⑶冲洗：将组织从保存液中取出，用缓冲液A（BufferA）缓冲液进行冲洗，以去除残留保存液；

⑷称重：称取0.5g的样本组织于6cm培养皿中, 并加入缓冲液C对组织进行预处理；

⑸切碎组织：在安全柜内进行无菌操作，往培养皿中加入3mL 缓冲液B（BufferB），浸润称取的皮肤组织，用消毒灭菌后的刀片和镊子快速将样本切碎，切至肉眼观察无明显块状组织即可；

⑹组织消化：将切碎的组织转移至装有5mL消化液（C酶+T酶+D酶）的50mL离心管中，离心管置于37℃水浴锅中消化30min（每10min吹打一次）；

⑺终止消化：向装有消化液的离心管中加入终止培养基缓冲液B（BufferB）终止消化，与此同时将消化剩余的组织放入5mL新的对应浓度的消化液中，继续消化40min（视样本情况可延长或缩短消化时间），消化结束后终止方法同上；

⑻滤网过筛：终止消化后的溶液用30μm细胞筛进行过滤，以去除杂质和未完全消化的组织，1500rpm离心10min，弃上清，

⑼裂红及清洗：往细胞沉淀中加入3mL缓冲液E（BufferE），1000rpm离心5min后弃上清，使用缓冲液C（BufferC）重悬细胞沉淀，再300rpm离心5min，弃上清；

⑽细胞观察及计数：用缓冲液C（BufferC）重悬细胞沉淀，得到皮肤组织的单细胞悬液，光学显微镜下观察细胞形态，使用细胞计数仪进行计数并得到活率。

对比例2.（C酶+T酶+D酶与实施例2相同、消化时间的处理上与实施例2形成对比）

⑴酶的配制：

C酶：对比例2中C酶的工作浓度为3.25mg/mL；

T酶：对比例2中的T酶浓度为2.5mg/mL，无需稀释操作；

D酶：用无菌的双蒸水对冻干酶进行溶解重悬，配制成母液（10 mg/ml），再用缓冲液A（BufferA）进行进一步稀释，使对比例2中D酶的工作浓度为0.02mg/mL；

混合酶的配制：用浓度为2.5mg/mL 的T酶对C酶进行溶解，使其终浓度为3.25mg/mL，再将配制好的D酶加入其中，并使其工作浓度为0.02mg/mL。

⑵取材：获取皮肤样本，置于组织保存液中（伯优单细胞测序组织保存液，货号：21903-10），可以暂放在4℃冰箱中待处理

⑶冲洗：将组织从保存液中取出，用缓冲液A（BufferA）缓冲液进行冲洗，以去除残留保存液；

⑷称重：称取0.5g的样本组织于6cm培养皿中, 并加入缓冲液C对组织进行预处理；

⑸切碎组织：在安全柜内进行无菌操作，往培养皿中加入3mL 缓冲液B（BufferB），浸润称取的皮肤组织，用消毒灭菌后的刀片和镊子快速将样本切碎，切至肉眼观察无明显块状组织即可；

⑹组织消化：将切碎的组织转移至装有5mL消化液（C酶+T酶+D酶）的50mL离心管中，离心管置于37℃水浴锅中消化30min（每10min吹打一次）；

⑺终止消化：像装有消化液的离心管中加入终止培养基缓冲液B（BufferB）终止消化；

⑻滤网过筛：终止消化后的溶液用30μm细胞筛进行过滤，以去除杂质和未完全消化的组织，1500rpm离心10min，弃上清，

⑼裂红及清洗：往细胞沉淀中加入3mL缓冲液E（BufferE），1000rpm离心5min后弃上清，使用缓冲液C（BufferC）重悬细胞沉淀，再300rpm离心5min，弃上清；

⑽细胞观察及计数：用缓冲液C（BufferC）重悬细胞沉淀，得到皮肤组织的单细胞悬液，光学显微镜下观察细胞形态，使用细胞计数仪进行计数并得到活率。

对比例3.（现有的方法，与实施例2的方法进行对比）

⑴酶的配制：

Co酶：对比例3中Co酶的终浓度为1mg/mL；

Di酶：对比例3中Di酶终浓度为4mg/mL；

混合酶的配制：用缓冲液A（BufferA）对Co酶进行溶解，使其终浓度为1mg/mL，再用对比例3中的Co酶溶液对Di酶进行溶解，并使其工作浓度为4mg/mL。

⑵取材：获取皮肤样本，置于组织保存液中（伯优单细胞测序组织保存液，货号：21903-10），可以暂放在4℃冰箱中待处理

⑶冲洗：将组织从保存液中取出，用缓冲液A（BufferA）缓冲液进行冲洗，以去除残留保存液；

⑷称重：称取0.5g的样本组织于6cm培养皿中, 并加入缓冲液C对组织进行预处理；

⑸切碎组织：在安全柜内进行无菌操作，往培养皿中加入3mL 缓冲液B（BufferB），浸润称取的皮肤组织，用消毒灭菌后的刀片和镊子快速将样本切碎，切至肉眼观察无明显块状组织即可；

⑹组织消化：将切碎的组织转移至装有5mL消化液（Co酶+Di酶）的50mL离心管中，4℃过夜消化；

⑺终止消化：向装有消化液的离心管中加入终止培养基缓冲液B（BufferB）终止消化；

⑻滤网过筛：终止消化后的溶液用30μm细胞筛进行过滤，以去除杂质和未完全消化的组织，1500rpm离心10min，弃上清，

⑼裂红及清洗：往细胞沉淀中加入3mL缓冲液E（BufferE），1000rpm离心5min后弃上清，使用缓冲液C（BufferC）重悬细胞沉淀，再300rpm离心5min，弃上清；

⑽细胞观察及计数：用缓冲液C（BufferC）重悬细胞沉淀，得到皮肤组织的单细胞悬液，光学显微镜下观察细胞形态，使用细胞计数仪进行计数并得到活率。

对比例4.（单一酶T酶的方法，与实施例2形成对比）

⑴酶的配制：

T酶：对比例4中的T酶终浓度为2.5mg/mL，无需稀释操作

⑵取材：获取皮肤样本，置于组织保存液中（伯优单细胞测序组织保存液，货号：21903-10），可以暂放在4℃冰箱中待处理

⑶冲洗：将组织从保存液中取出，用缓冲液A（BufferA）缓冲液进行冲洗，以去除残留保存液；

⑷称重：称取0.5g的样本组织于6cm培养皿中, 并加入缓冲液C对组织进行预处理；

⑸切碎组织：在安全柜内进行无菌操作，往培养皿中加入3mL 缓冲液B（BufferB），浸润称取的皮肤组织，用消毒灭菌后的刀片和镊子快速将样本切碎，切至肉眼观察无明显块状组织即可；

⑹组织消化：将切碎的组织转移至装有5mL消化液（T酶）的50mL离心管中，离心管置于37℃水浴锅中消化30min（每10min吹打一次）；

⑺终止消化：向装有消化液的离心管中加入终止培养基缓冲液B（BufferB）终止消化，与此同时将消化剩余的组织放入5mL新的对应浓度的消化液中，继续消化40min（视样本情况可延长或缩短消化时间），消化结束后终止方法同上；

⑻滤网过筛：终止消化后的溶液用30μm细胞筛进行过滤，以去除杂质和未完全消化的组织，1500rpm离心10min，弃上清，

⑼裂红及清洗：往细胞沉淀中加入3mL缓冲液E（BufferE），1000rpm离心5min后弃上清，使用缓冲液C（BufferC）重悬细胞沉淀，再300rpm离心5min，弃上清；

⑽细胞观察及计数：用缓冲液C（BufferC）重悬细胞沉淀，得到皮肤组织的单细胞悬液，光学显微镜下观察细胞形态，使用细胞计数仪进行计数并得到活率。

对比例5.（单一酶C酶的方法，与实施例2形成对比）

⑴酶的配制：

C酶：对比例5中的C酶终浓度为3.25mg/mL，使用缓冲液D（BufferD）进行溶解

⑵取材：获取皮肤样本，置于组织保存液中（伯优单细胞测序组织保存液，货号：21903-10），可以暂放在4℃冰箱中待处理；

⑶冲洗：将组织从保存液中取出，用缓冲液A（BufferA）缓冲液进行冲洗，以去除残留保存液；

⑷称重：称取0.5g的样本组织于6cm培养皿中, 并加入缓冲液C对组织进行预处理；

⑸切碎组织：在安全柜内进行无菌操作，往培养皿中加入3mL 缓冲液B（BufferB），浸润称取的皮肤组织，用消毒灭菌后的刀片和镊子快速将样本切碎，切至肉眼观察无明显块状组织即可；

⑹组织消化：将切碎的组织转移至装有5mL消化液（C酶）的50mL离心管中，离心管置于37℃水浴锅中消化30min（每10min吹打一次）；

⑺终止消化：向装有消化液的离心管中加入终止培养基缓冲液B（BufferB）终止消化，与此同时将消化剩余的组织放入5mL新的对应浓度的消化液中，继续消化40min（视样本情况可延长或缩短消化时间），消化结束后终止方法同上；

⑻滤网过筛：终止消化后的溶液用30μm细胞筛进行过滤，以去除杂质和未完全消化的组织，1500rpm离心10min，弃上清，

⑼裂红及清洗：往细胞沉淀中加入3mL缓冲液E（BufferE），1000rpm离心5min后弃上清，使用缓冲液C（BufferC）重悬细胞沉淀，再300rpm离心5min，弃上清；

⑽细胞观察及计数：用缓冲液C（BufferC）重悬细胞沉淀，得到皮肤组织的单细胞悬液，光学显微镜下观察细胞形态，使用细胞计数仪进行计数并得到活率。

实施例3.

⑴酶的配制：

C酶：实施例3中C酶的工作浓度为2mg/mL；

T酶：实施例3中的T酶浓度为1mg/mL，无需稀释操作；

D酶：用无菌的双蒸水对冻干酶进行溶解重悬，配制成母液（10 mg/ml），再用缓冲液A（BufferA）进行进一步稀释，使实施例3中D酶的工作浓度为0.01mg/mL；

混合酶的配制：用浓度为1mg/mL 的T酶对C酶进行溶解，使其终浓度为2mg/mL，再将配制好的D酶加入其中，并使其工作浓度为0.01mg/mL。

⑵取材：获取皮肤样本，置于组织保存液中（伯优单细胞测序组织保存液，货号：21903-10），可以暂放在4℃冰箱中待处理

⑶冲洗：将组织从保存液中取出，用缓冲液A（BufferA）缓冲液进行冲洗，以去除残留保存液；

⑷称重：称取0.5g的样本组织于6cm培养皿中, 并加入缓冲液C对组织进行预处理；

⑸切碎组织：在安全柜内进行无菌操作，往培养皿中加入3mL 缓冲液B（BufferB），浸润称取的皮肤组织，用消毒灭菌后的刀片和镊子快速将样本切碎，切至肉眼观察无明显块状组织即可；

⑹组织消化：将切碎的组织转移至装有5mL消化液（C酶+T酶+D酶）的50mL离心管中，离心管置于37℃水浴锅中消化30min（每10min吹打一次）；

⑺终止消化：向装有消化液的离心管中加入终止培养基缓冲液B（BufferB）终止消化，与此同时将消化剩余的组织放入5mL新的对应浓度的消化液中，继续消化40min（视样本情况可延长或缩短消化时间），消化结束后终止方法同上；

⑻滤网过筛：终止消化后的溶液用30μm细胞筛进行过滤，以去除杂质和未完全消化的组织，1500rpm离心10min，弃上清，

⑼裂红及清洗：往细胞沉淀中加入3mL缓冲液E（BufferE），1000rpm离心5min后弃上清，使用缓冲液C（BufferC）重悬细胞沉淀，再300rpm离心5min，弃上清；

⑽细胞观察及计数：用缓冲液C（BufferC）重悬细胞沉淀，得到皮肤组织的单细胞悬液，光学显微镜下观察细胞形态，使用细胞计数仪进行计数并得到活率。

实施例4.

⑴酶的配制：

C酶：实施例4中C酶的工作浓度为4mg/mL；

T酶：实施例4中的T酶浓度为3mg/mL，无需稀释操作；

D酶：用无菌的双蒸水对冻干酶进行溶解重悬，配制成母液（10 mg/ml），再用缓冲液A（BufferA）进行进一步稀释，使实施例4中D酶的工作浓度为0.05mg/mL；

混合酶的配制：用浓度为3mg/mL 的T酶对C酶进行溶解，使其终浓度为4mg/mL，再将配制好的D酶加入其中，并使其工作浓度为0.05mg/mL。

⑵取材：获取皮肤样本，置于组织保存液中（伯优单细胞测序组织保存液，货号：21903-10），可以暂放在4℃冰箱中待处理

⑶冲洗：将组织从保存液中取出，用缓冲液A（BufferA）缓冲液进行冲洗，以去除残留保存液；

⑷称重：称取0.5g的样本组织于6cm培养皿中, 并加入缓冲液C对组织进行预处理；

⑸切碎组织：在安全柜内进行无菌操作，往培养皿中加入3mL 缓冲液B（BufferB），浸润称取的皮肤组织，用消毒灭菌后的刀片和镊子快速将样本切碎，切至肉眼观察无明显块状组织即可；

⑹组织消化：将切碎的组织转移至装有5mL消化液（C酶+T酶+D酶）的50mL离心管中，离心管置于37℃水浴锅中消化30min（每10min吹打一次）；

⑺终止消化：向装有消化液的离心管中加入终止培养基缓冲液B（BufferB）终止消化，与此同时将消化剩余的组织放入5mL新的对应浓度的消化液中，继续消化40min（视样本情况可延长或缩短消化时间），消化结束后终止方法同上；

⑻滤网过筛：终止消化后的溶液用30μm细胞筛进行过滤，以去除杂质和未完全消化的组织，1500rpm离心10min，弃上清，

⑼裂红及清洗：往细胞沉淀中加入3mL缓冲液E（BufferE），1000rpm离心5min后弃上清，使用缓冲液C（BufferC）重悬细胞沉淀，再300rpm离心5min，弃上清；

⑽细胞观察及计数：用缓冲液C（BufferC）重悬细胞沉淀，得到皮肤组织的单细胞悬液，光学显微镜下观察细胞形态，使用细胞计数仪进行计数并得到活率。

表1为以上实施例和对比例中方法及结果对比：

表1

表1对比结果显示：使用本发明的混合酶消化得到的细胞活率高于单一酶，消化条件为37℃、30min+40min时得到的单细胞总数最多(细胞数量远远超过其他实施例和对比例，即实施例2效果最佳，达到了预料不到的技术效果)。

依据上述实验结果，本发明探索了单一酶和混合酶的消化效果、并对混合酶的组分配比进行了可行性比较，经过对各种消化法获得的单细胞悬液的数据结果进行对比，筛选优化出C酶+T酶+D酶为最优酶组合，且确立了消化条件为37℃、30min+40min时可得到最多的细胞数、较高的细胞活性，本发明同时也大大节省了试剂成本、时间成本，可为后续的单细胞上机检测实验提供有利的单细胞悬液样本。

实施例5.（举一实际应用案例）

⑴酶的配制：

C酶：用T酶对C酶进行溶解配制，实施例1中C酶的终浓度为3.25mg/mL

T酶：实施例1中的T酶终浓度为2.5mg/mL，无需稀释操作

D酶：用无菌的双蒸水对冻干酶进行溶解重悬，配制成母液（10 mg/ml），再用Buffer A进行进一步稀释，使实施例3中D酶的工作浓度为0.02mg/mL

混合酶的配制：用浓度为2.5mg/mL 的T酶对C酶进行溶解，使其终浓度为3.25mg/mL，再将配制好的D酶加入其中，并使其工作浓度为0.02mg/mL。

⑵取材：获得一例皮炎患者的皮肤组织样本和一例正常皮肤组织样本，样本存放在组织保存液中（伯优单细胞测序组织保存液，货号：21903-10）；

⑶冲洗：将组织从保存液中取出，用Buffer B缓冲液进行冲洗，以去除残留保存液；

⑷称重：称取0.5g的样本组织于6cm培养皿中；

⑸切碎组织：在安全柜内进行无菌操作，往培养皿中加入3mL Buffer B，浸润称取的皮肤组织，用消毒灭菌后的刀片和镊子快速将样本切碎，切至肉眼观察无明显块状组织即可；

⑹组织消化：将切碎的组织转移至装有5mL消化液（C酶+T酶+D酶）的50mL离心管中，离心管置于37℃水浴锅中消化30min（每10min吹打一次）；

⑺终止消化：向装有消化液的离心管中加入终止培养基Buffer B终止消化，与此同时将消化剩余的组织放入5mL新的对应浓度的消化液中，继续消化40min（视样本情况可延长或缩短消化时间），消化结束后终止方法同上；

⑻滤网过筛：终止消化后的溶液用30μm细胞筛进行过滤，以去除杂质和未完全消化的组织，1500rpm离心10min，弃上清，

⑼裂红及清洗：往细胞沉淀中加入3mLBufferE，1000rpm离心5min后弃上清，使用Buffer C重悬细胞沉淀，再300rpm离心5min，弃上清；

⑽细胞观察及计数：用Buffer C重悬细胞沉淀，得到皮肤组织的单细胞悬液，光学显微镜下观察细胞形态（见图1、图2、图3和图4），使用细胞计数仪进行计数并得到活率。

表2为实施例3单细胞悬液制备相关数据：

表2

如图1-图4、表2的实验结果显示，细胞活率达标（91%）、细胞形态好、无成团、视野中有明显表皮细胞、背景干净，单细胞悬液制备结果较好。

以上对发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，发明并不局限于上述特定实施方式，其中未尽详细描述的设备和结构应该理解为用本领域中的普通方式予以实施；本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改做出若干简单推演、变形或替换，这并不影响发明的实质内容。