微生物混合物、从其衍生的分子、及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年8月8日提交的标题为“微生物混合物、从其衍生的分子、及其使用方法”的美国临时专利申请号62/715,875的优先权的权益，其内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明属于微生物学领域。

背景技术

鉴于细菌对现有抗生素的抗药性的扩散，对于通过可替代的细菌杀灭或抑制机制起作用的新型抗菌剂存在持续而迫切的需求。有希望的策略最近集中在干扰细菌的通讯途径，也称为“群体感应(细胞密度感受，quorum sensing)”(QS)。QS细菌释放称为“自诱导物(autoinducer)”的化学分子，自诱导物在许多情况下影响邻近细菌细胞中的基因表达，从而通过细菌-细菌信号传导促进种群调控。革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌都使用群体感应通讯回路来调节各种生理活动。通过群体感应调节的过程包括毒力、感受态、结合、抗生素产生、运动性和生物膜形成。通常，革兰氏阴性细菌使用酰化的高丝氨酸内酯(AHL)作为自诱导物，且革兰氏阳性细菌使用加工的寡肽(DPD)。另外，表明细菌自诱导物也激活宿主生物体的特定生物学反应的数据正在增加。

识别和使用干扰和/或破坏致病细菌的群体感应途径并因此阻断其毒力的物质非常重要。相关方法旨在开发激活表现出有益健康特性的细菌的通讯途径的化合物。通过类似分子对QS的抑制可提供常规抗生素的替代方法，其中显著优点是更不易产生抗性发展。

发明内容

本发明涉及如用于减少生物膜产生的包含色醇和/或4-乙基-苯酚(4-Ethyl-Phenol)的衍生物的组合物。本发明进一步涉及包含酵母马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和至少一种益生菌微生物的微生物混合物及其用途。

根据一个方面，提供了组合物，其包含：(1)色醇衍生物；和(2)4-乙基-苯酚衍生物；以及至少一种药学上可接受的载体，其中色醇衍生物和4-乙基-苯酚衍生物的比例为10：1至1：10w/w的比例。

根据另一方面，提供了微生物混合物，其包括：(1)马克斯克鲁维酵母；和(2)至少一种益生菌微生物，其中微生物混合物包含至少3％的马克斯克鲁维酵母。

根据另一方面，提供了治疗需要其的受试者中的疾病的方法，所述疾病选自：炎性疾病、传染性疾病、和淀粉样聚集体相关疾病(amyloid aggregates-related disease)，方法包括：向受试者施用治疗有效量的药物组合物，药物组合物包含以下中的任意一种：选自色醇衍生物和4-乙基-苯酚衍生物的至少一种分子、以及本文公开的微生物混合物。

在一些实施方式中，色醇衍生物和4-乙基-苯酚衍生物各自以至少1μM的浓度存在于组合物内。

在一些实施方式中，色醇衍生物在组合物内的浓度为至少0.1μM。

在一些实施方式中，色醇衍生物和4-乙基-苯酚衍生物的w/w比例范围为2：1(w/w)至1：2(w/w)。

在一些实施方式中，色醇衍生物是色醇醋酸酯(Tryptophol acetate)。

在一些实施方式中，4-乙基-苯酚衍生物选自：酪醇醋酸酯(Tyrosol acetate)、多巴胺HCl和咖啡酸。

在一些实施方式中，组合物进一步包含马克斯克鲁维酵母；和至少一种益生菌微生物。

在一些实施方式中，组合物用于降低微生物活性、治疗炎性疾病和淀粉样聚集体相关疾病中的任意一种。

在一些实施方式中，益生菌微生物是益生菌细菌。

在一些实施方式中，益生菌细菌选自乳酸杆菌属(Lactobacillus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、乳球菌属(Lactococcus)和明串珠菌属(Leuconostoc)。

在一些实施方式中，将混合物悬浮在培养基中。

在一些实施方式中，培养基是乳。

在一些实施方式中，混合物是开菲(酸乳酒，kefir)。

在一些实施方式中，混合物进一步包含色醇衍生物、4-乙基-苯酚衍生物、或其组合。

在一些实施方式中，色醇衍生物和4-乙基-苯酚衍生物是由马克斯克鲁维酵母产生的。

在一些实施方式中，微生物混合物用于食品中。

在一些实施方式中，微生物混合物用于降低微生物活性、治疗炎性疾病和淀粉样聚集体相关疾病中的任何一种。

在一些实施方式中，传染性疾病包括微生物的负载、自其衍生的生物膜、或两者。

在一些实施方式中，微生物选自：病毒、真菌、寄生虫、酵母、细菌和原生动物。

在一些实施方式中，真菌属于选自以下的属：葡萄孢属(Botrytis)、青霉菌属(Penicillium)、和核盘菌属(Sclerotinia)。

在一些实施方式中，细菌属于选自以下的属：弧菌属(Vibrio)、沙门菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和假单胞菌属(Pseudomonas)。

在一些实施方式中，组合物具有0.1-500μM的最大半抑制浓度(IC

在一些实施方式中，受试者患有选自以下的至少一种疾病：炎性疾病、传染性疾病和淀粉样相关的疾病。

在一些实施方式中，炎性疾病是炎症性肠病。

在一些实施方式中，炎症性肠病是溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。

在一些实施方式中，淀粉样聚集体相关疾病是神经退行性疾病。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实施方式的实践或测试中，但是下面描述了示例性的方法和/或材料。在有冲突的情况下，以专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例仅是示例性的，并非意图是限制性的。

通过下文给出的详细描述，本发明的进一步的实施方式和适用范围将变得显而易见。但是，应该理解，详细说明和具体实例虽然指示了本发明的优选实施方式，但是仅是通过示例的给出，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将变得明显的。

附图说明

图1A-1C是益生菌酸奶中微生物混合物的鉴定。(1A)是基于One Codex数据平台中应用微生物基因组学的BLAST比较得出的益生菌酸奶中微生物的分布饼图。(1B)和(1C)分别是单一培养物和来自益生菌酸奶中马克斯克鲁维酵母的光学显微镜图像。

图2A-2E描述了益生菌酸奶中微生物亚种群的部分。(2A)是种群R5的自发荧光强度vs.BF细节强度(19,539个事件)。可以看到不同的亚种群R3、R6和R7(包括其它复合亚种群R8)。(2B-2E)是显微照片，分别显示了种群R3、R6、R7和R8的细胞。

图3A-3B是(3A)乳提取物和(3B)益生菌酸奶的液相色谱-质谱(LC-MS)色谱图。对应于质量180和203的两个分子(以下称为“180”分子和“203”分子)仅存在于益生菌酸奶中并被包围。

图4A-4B是(4A)马克斯克鲁维酵母菌培养基和(4B)马克斯克鲁维酵母菌粗品的LC-MS色谱图。180和203分子仅存在于马克斯克鲁维酵母粗品中并被包围。

图5A-5B是分离(5A)180分子和(5B)203分子后的马克斯克鲁维酵母粗提物级分的LC-MS色谱图。

图6A-6C显示了合成的酪醇醋酸酯的重量和结构分析。(6A和6B)是质量为180的分子的LC-MS(orbitrap)色谱图。(6A)是保留时间谱图，而(6B)是m/z谱图。(6C)是具有峰分布的酪醇醋酸酯的1H NMR光谱图：δ2.04(3H，s),2.87(2H，t，J＝7.0Hz)，4.28(2H，t，J＝7.0Hz),6.70(2H，ddd，J＝8.2，2.4，0.5Hz),6.95(2H，ddd，J＝8.2，1.0，0.5Hz)。

图7A-7C显示了合成的色醇醋酸酯的重量和结构分析。(7A和7B)是质量为203的分子的LC-MS(orbitrap)色谱图。(7A)是保留时间谱图，而(7B)是m/z谱图。(7C)是具有峰值分布的色醇醋酸酯的1H NMR光谱图：δ2.05(3H，s),3.08(2H，t，J＝5.2Hz),4.40(2H，t，J＝5.2Hz),6.93-7.12(2H，6.98(ddd，J＝8.0，7.8，1.2Hz),7.07(ddd，J＝8.0，7.8，1.6Hz)),7.30-7.36(2H，7.33(dddd，J＝8.0，1.2，0.5，0.5Hz),7.32(t，J＝0.5Hz)),7.62(1H，dddd，J＝8.0，1.6，0.5，0.5Hz)。

图8A-8E是垂直柱状图，其显示了在合成色醇醋酸酯存在下，对群体感应(QS)抑制或激活的生物发光筛选。使用缺少编码自诱导物的基因的突变细菌进行了测定。也用生物发光报告质粒克隆了细菌。N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)用于以下细菌的激活(激动剂)或抑制(拮抗剂)：根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，其响应C8自诱导物(AI)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)响应CAI1自诱导物，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)RhlA响应C4 AI和铜绿假单胞菌LasR响应C12 AI。(8A)显示色醇醋酸酯抑制了根癌农杆菌中的QS。(8B)显示色醇醋酸酯对铜绿假单胞菌(LasR)中的QS具有低抑制作用。(8C-8D)显示在霍乱弧菌中，低容量的色醇醋酸酯激活QS，且高容量的色醇醋酸酯抑制QS，其中IC

图9是垂直柱状图，其显示在霍乱弧菌中，低容量的酪醇醋酸酯激活QS且高容量的酪醇醋酸酯完全抑制QS，其中IC

图10是合成色醇醋酸酯的校准曲线，用于定量益生菌酸奶粗提取物中分泌的物质，其显示了益生菌酸奶中的浓度为213μM(在800ml的批次中测量)。

图11A-11B是共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像，其描述了在不存在(11A，用1％DMSO作为对照)或存在(11B，20μM)色醇醋酸酯的情况下的铜绿假单胞菌。没有观察到对生物膜形成的影响。

图12A-12B是CLSM图像，其描述了在不存在(12A，用1％DMSO作为对照)或存在(12B，50μM)色醇醋酸酯的情况下的沙门菌属。观察到对生物膜形成的显著影响。

图13A-13B是CLSM图像，其描述了在不存在(13A，用1％DMSO作为对照)或存在(13B，50μM)色醇醋酸酯的情况下的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。观察到了对生物膜形成的显著影响。

图14A-14D是描述益生菌酸奶对真菌生长的生物活性的图像。益生菌酸奶在马铃薯葡萄糖琼脂平板上抑制核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的生长长达(14A-14B)12天或(14C-14D)19天。显示了包含益生菌酸奶提取物(14B和14D)的抑制平板和显示核盘菌生长的对照平板(14A和14C)。

图15A-15B是描述益生菌酸奶提取物对真菌生长的生物活性的图像。(15A)在对照平板上生长的葡萄孢属真菌；(15B)接种后22天记录的，接种于补充益生菌酸奶提取物的平板上的抑制的葡萄孢属真菌。

图16A-16B是描述益生菌酸奶提取物对真菌生长的生物活性的图像。(16A)在对照平板上生长的青霉菌属真菌；(16B)接种后22天记录的，接种于补充益生菌酸奶提取物的平板上的抑制的青霉菌属真菌。

图17A-17B是显示色醇醋酸酯和酪醇醋酸酯对霍乱弧菌中QS的激活的协同作用的图。(17A)是显示以1：1的比例一起施用的色醇醋酸酯和酪醇醋酸酯的组合物的作用的图，其中IC

图18A-18H是CLSM图像，其描述了在突变的MM920霍乱弧菌菌株(ΔCqsA ΔluxQ)中检查到的色醇醋酸酯和酪醇醋酸酯的组合物的生物膜调节活性。霍乱弧菌CqsA突变生物膜(18A和18E)比单独添加自诱导物(其促进群体感应，因此破坏生物膜形成)产生的相应生物膜(18B和18F)厚得多且致密得多。色醇醋酸酯和酪醇醋酸酯(18D和18H)，特别是这三种化合物(18C和18G)一起在破坏正常生物膜生长方面表现出显著的协同作用——导致了不同的生物膜形态。上排包括顶部图像，而下排包括其相应的3D图像。

图19是垂直柱状图，其显示了在不存在(0，用1％(v/v)DMSO作为对照)或以不同浓度的色醇醋酸酯(25、50、100和200μM)存在时霍乱弧菌毒素的定量。

图20是垂直柱状图，其显示了在不存在或存在粗制开菲提取物的情况下的细胞活力测定。结果证实了粗制的开菲提取物没有不利地影响细菌细胞的生长。

图21A-21D是图像和垂直柱状图，其显示了浓度为100μM的酪醇醋酸酯对霍乱弧菌的影响。(21A)使用IMARIS软件从共聚焦z-堆叠获得了代表性的生物膜形成。比例尺，50μm。(21B)通过使用VC1菌株(野生型)和生物测定菌株MM920的结晶紫测定获得了定量生物膜容量。(21C)通过RT-qPCR评估的酪醇醋酸酯对野生型菌株中QS基因表达的影响。(21D)通过GM1-ELISA对霍乱毒素的定量。

图22A-22D是垂直柱状图，其显示了益生菌酸奶生物质粗提取物的群体感应作用。(22A-22C)通过酸奶生物质粗提物对霍乱弧菌(22A)、根癌农杆菌(22B)和哈氏弧菌(Vibrioharveyi)(22C)报道菌株生物发光的QS抑制/激活。(22D)静态抗生物膜活性。图显示了在不存在或存在益生菌酸奶(例如开菲)粗提物的情况下，三种不同的野生型细菌(金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)和铜绿假单胞菌)产生的生物膜容量。数据是平均值±SD。n＝3。P值：*P<0.12，**P<0.0l，***P<0.002。

图23A-23C是显微照片和垂直柱状图，其显示了色醇醋酸酯对霍乱弧菌的作用。(23Ai-23Av)是使用IMARIS软件从共焦z-堆叠获得的生物膜形成的代表性图像。比例尺，50μm。(23Ai)霍乱弧菌VC1(WT)的生物膜基材；(23Aii)霍乱弧菌VC1在100μM色醇醋酸酯的存在下；(23Aiii)单独的霍乱弧菌MM920；(23Aiv)具有900nM CAI-1的霍乱弧菌MM920；和(23Av)霍乱弧菌MM920，其具有900nM CAI-1，并且在100μM色醇醋酸酯的存在下。(23Avi)柱状图，其显示了与23Ai-23Av中所示的生物膜相对应的每单位面积生物膜容量的量。(23B)垂直柱状图，其表明通过在微量滴定板中在不同浓度的色醇醋酸酯(0、12.5、25、50、100和200μM)下进行结晶紫染色获得的霍乱弧菌定量生物膜容量。误差条表示4次测量的标准偏差。*P<0.001，**P<0.0001，***P<0.000001vs.对照。(23C)通过定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)评估的垂直柱状图，其显示色醇醋酸酯对野生型菌株中QS基因表达的影响。基因表达水平的相对量度被定义为QS途径中基因(hapR、vpsT、hapA、aphA和ctxA，将其标准化为不受处理影响的参照管家基因)的cDNA的拷贝数。误差条表示4次测量的标准偏差。*P<0.001，**P<0.0001vs.未经处理的细菌。

图24A-24B是垂直柱状图，其显示了本文公开的益生菌酸奶和在其中鉴定的分子减少了鼠炎症性肠病(IBD)模型中的体重减轻。(24A)显示实验重复编号2，和(24B)显示实验重复编号3。体重减轻被计算为与实验开始前体重相比的百分比变化。与DSS+W相比，在Y+DSS+Y；DSS+Y和DSS+Mole之间观察到了体重减轻的重要结果(在25μM或50μM下)。另外，在接受商业酸奶(Yc+DSS+Yc或DSS+Yc)的组中没有显著的体重减轻作用。组：对照+W——常规食物-无葡聚糖硫酸钠(DSS)；DDS+W——常规食物；对照+Y——测试食物(酸奶)-无DSS；DSS+Y——测试食物(酸奶)；对照+mole——分子测试项目(口服，酪醇醋酸酯和色醇醋酸酯)，终浓度25μM或50μM)-无DSS；DSS+mole——分子测试项目(口服，酪醇醋酸酯和色醇醋酸酯)，终浓度为25μM或50μM)；对照+Yc——测试食物(商业酸奶)-无DSS；DSS+Yc——测试食物(商业酸奶)；Y+DSS+Y——在DSS之前和之后早期施用酸奶；和Yc+DSS+Yc——在DSS之前和之后早期施用商业酸奶。在(24A)中*P<0.000003，**P<0.001。在(24B)中*P<0.00005，**P<0.05。

图25A-25D是示例、图像和垂直柱状图，其显示了本文公开的益生菌酸奶和在其中鉴定的分子减少了鼠IBD模型中的结肠缩短。(25A)鼠大肠肠道的示例，包括：盲肠、近端结肠、中结肠、远端结肠、直肠和肛门。(25B)DSS治疗7天后的结肠长度。从所进行的6个实验中选择一个作为代表性图像。(25C)显示了实验重复编号2第10天的测量值，(25D)显示了实验重复编号3第10天的测量值。在实验终点测量了从直肠到盲肠的结肠长度。与用DSS处理并在DSS之前用本文公开的益生菌酸奶(Y+DSS+Y)喂养的小鼠的结肠相比，在用DSS(DSS+W)处理的小鼠中观察到了结肠的缩短。此外，在用本文公开的益生菌酸奶中鉴定的分子(50μM)治疗的小鼠中观察到了在统计学上显著减少的结肠长度的缩短。*P＜0.05。实验组如图24中所示。

图26A-26B是垂直柱状图，其显示了本文公开的益生菌酸奶和其中鉴定的分子对实验重复2(26A)和实验重复3(26B)中确定的疾病活性指数(DAI)的影响。基于测量的粪便稠度和粪便中的血液确定DAI。每隔一天记录一次临床体征。结果显示在重复2(26A)中在DSS(Y+DSS+Y)之前用酸奶治疗的小鼠的临床评分显著降低，并且在重复3(26B)中本文公开的益生菌酸奶中鉴定的分子浓度为50μM(DSS+Molec)。实验组如在图24-25中所示。

图27A-27D是结肠组织学切片的显微照片。(27A)在所有DSS处理的小鼠中均显示出了严重的组织损伤，其中肠壁中隐窝细胞的丢失以及炎性细胞向结肠中浸润。(27B)在DSS之前用酸奶(Y+DSS+Y)喂养的小鼠的结肠中，组织结构得以保留，只有极少的炎症和结肠组织修复的初始迹象(圈出的)。(27C)在DSS(DSS+Y)后用本文公开的益生菌酸奶喂养的小鼠结肠的切片。(27D)是对照结肠(例如健康结肠)。

图28A-28K是描绘在应用本文公开的益生菌酸奶之后利什曼病溃疡愈合的图像。在常规治疗未能改善溃疡的愈合(包括使用ESRACAIN进行局部麻醉后的PENTOSTAM注射和SALIKAREN的局部施用)后，局部施用益生菌酸奶(一天两次，例如，上午和晚上)。在开始施用益生菌酸奶后，(28A、28G)第0天、(28B、28H)第1天、(28C、28I)第2天、(28D)第4天、(28J)第5天、(28E)第6天、(28F)第11天和(28K)第14天。从第11天和第14天开始，皮肤利什曼病的加速愈合明显(分别为图28F和28K)。

图29A-29E是显示在施用本文公开的益生菌酸奶后伤口愈合的图像。在第0天(29A和29C)感染的伤口明显。在(29A)中，需要缝线用于切口的融合，但由于自受伤以来已超过24小时，因此未进行切口的融合，因此局部施用了本文公开的益生菌酸奶，且在四天后伤口愈合(29B)。在已经开始施用益生菌酸奶后两天，新组织的生长明显(29D)。开始施用益生菌酸奶后的第0天(29E)、第4天(29B)、第2天(29D)和第7天(29E)。

图30A-30B是垂直柱状图，其显示了由本文公开的益生菌酸奶中鉴定的分子诱导的抗炎作用。在色醇醋酸酯和4-乙基-苯酚衍生物(例如酪醇醋酸酯、多巴胺HCl和咖啡酸)的存在下，通过巨噬细胞产生的IL-6(30A)和IL-1α(30B)细胞因子显著减少。脂多糖(LPS)。

图31是显示硫黄素T(ThT)测定法的结果的图，该测定法检查了从本文公开的益生菌酸奶(例如开菲)提取的分子的混合物和色醇醋酸酯对淀粉样β(αβ1-42)原纤维形成的影响。结果显示，从本文公开的益生菌酸奶(例如开菲)中提取的分子和不同浓度的色醇醋酸酯都降低了αβ1-42的原纤维形成。Mix——从酸奶中提取的分子混合物；OM-色醇醋酸酯。

图32A-32B是显示在不存在或存在色醇醋酸酯的情况下αβ1-42原纤维形成的图。(32A)表面等离子体共振(SPR)图，显示了如下的原纤维形成程度：仅30μMαβ1-42(L1A1-2-淀粉样B蛋白)、30μMαβ1-42悬浮在PBS(L1A3-4-bf)中；或30μMαβ1-42在50μM色醇醋酸酯(L1A5-6-淀粉样B蛋白+203)的存在下。(32B)SPR的图，其显示在几种色醇醋酸酯浓度(6μM、12μM、25μM、100μM和200μM)存在下30μMαβ1-42的原纤维形成程度。

图33A-33D是透射电子显微镜(TEM)的显微照片。将αβ1-42在37℃下单独(33A)、或在5μl的本文公开的益生菌酸奶粗提取物(33B)、25μM的色醇醋酸酯(33C)、或50μM的色醇醋酸酯存在下温育24hr(33D)。

具体实施方式

在一些实施方式中，本发明涉及选自色醇和/或4-乙基-苯酚的衍生物的抗菌分子、包含它们的组合物和装置、以及其使用方法(包括但不限于抑制生物膜形成)。

在一些实施方式中，本发明涉及通过向受试者施用治疗有效量的药物组合物，治疗需要其的受试者中选自以下的疾病的方法：炎性疾病、传染性疾病、和淀粉样聚集体相关疾病，药物组合物包含以下中的任意一种：色醇衍生物、4-乙基-苯酚衍生物中的至少一种、和微生物混合物，微生物混合物包含：马克斯克鲁维酵母；和至少一种益生菌微生物，其中微生物混合物中至少3％的细胞是马克斯克鲁维酵母。

在一些实施方式中，本发明涉及抑制或减少淀粉样(例如淀粉样β蛋白)聚集体的方法，方法包括使表面或细胞与有效量的以下中的任意一种接触：色醇衍生物、4-乙基-苯酚衍生物，和本文所述的微生物混合物。在一些实施方式中，淀粉样聚集包括淀粉样原纤维形成、淀粉样寡聚、或其组合。

在一些实施方式中，减少基于有机物的污染物的负载包括抑制或减少淀粉状蛋白。

如本文所用，术语“淀粉样聚集体”和“淀粉样聚集”是指淀粉样蛋白的聚集体或团块，其再折叠成允许多个拷贝聚集的构象，从而产生聚集体、原纤维、寡聚体或其任何组合。淀粉状蛋白中表征的蛋白质类型对本领域普通技术人员而言将是明显的。在一些实施方式中，淀粉状蛋白包含β淀粉状蛋白。

在一些实施方式中，本发明的任何一种分子或本发明的微生物混合物(例如开菲)具有以下中的任意一项：抗微生物活性、抗炎活性和抗淀粉样聚集活性。

如本文所用，术语“抗淀粉样聚集活性”是指防止或减少淀粉样二聚化、淀粉样寡聚、淀粉样聚集、淀粉样沉降、淀粉样解折叠、淀粉样非天然折叠或其任何组合的能力。

如本文所用，术语“抗微生物活性”是指抑制、预防、减少或延迟在表面上或在潮湿环境中的细菌生长、真菌生长、生物膜形成、淀粉样聚集(例如淀粉样β蛋白)，或根除在悬浮液中的活细菌细胞或其孢子、真菌细胞或病毒的能力。在一些实施方式中，抑制或减少或延迟微生物负载的形成是指抑制或减少微生物的生长、通过微生物的生物膜产生、淀粉状蛋白(例如淀粉样β蛋白)的产生或聚集、和/或根除微生物的现有种群的部分或全部。

如本文所用，术语“抗炎”是指抑制、预防、减少或延迟身体的炎症反应的能力，包括细胞因子的产生、分泌或两者，免疫细胞引发、归巢、激活、募集、或其任何组合。在一些实施方式中，炎症反应包括自体炎症应答。

本发明部分基于以下发现：色醇和/或4-乙基苯酚的衍生物(例如分别为色醇醋酸酯和酪醇醋酸酯)改变微生物的群体感应(细菌和真菌)以及减少生物膜产生和真菌生长。使用从本文所述的微生物培养物中获得的色醇和/或酪醇衍生物以及合成的色醇和/或酪醇衍生物，证明了抗生物膜作用以及抗炎和抗淀粉样聚集作用。

如本文所用，术语“本发明的化合物或分子”是指具有抗微生物活性、抗炎活性和抗淀粉样聚集活性中的任意一种的如下文所述的任何色醇衍生物或4-乙基-苯酚衍生物。

色醇衍生物

在一些实施方式中，本发明的色醇衍生物具有以下结构：

其中“R

“n”是碳链，其包含：一个、两个、三个或四个碳；以及

“m”选自：甲基(CH

在一些实施方式中，色醇衍生物是色醇醋酸酯。

色醇醋酸酯在本领域中已知具有以下结构：

4-乙基苯酚衍生物

在一些实施方式中，本发明的4-乙基-苯酚衍生物具有以下结构：

其中每个R独立地选自：羟基、氢、甲基(CH

“n”、“m”为1到4，

R

X选自：羧酸衍生物、烷基和氢。

在一些实施方式中，本发明的4-乙基-苯酚衍生物具有以下结构：

在一些实施方式中，每个R独立地选自：羟基和氢。

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，4-乙基-苯酚衍生物是由下式表示的多巴胺衍生物：

或由下式表示的多巴胺衍生物：

在一些实施方式中，多巴胺衍生物由下式表示：

或由下式表示：

在一些实施方式中，X为氢。

在一些实施方式中，4-乙基-苯酚衍生物是多巴胺或其盐。

在一些实施方式中，本发明的4-乙基-苯酚衍生物具有以下结构：

其中：每个R独立地选自：羟基和氢；和X选自羧酸衍生物、烷基和氢。

在一些实施方式中，X是

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，R

在一些实施方式中，4-乙基-苯酚是酪醇醋酸酯的衍生物。

酪醇醋酸酯在本领域中已知具有以下结构：

在一些实施方式中，4-乙基-苯酚衍生物是具有以下结构的咖啡酸的衍生物：

“n”、“m”为1至4，

X选自：羧酸衍生物、烷基和氢。

在一些实施方式中，每个R独立地选自：羟基和氢。

在一些实施方式中，

在一些实施方式中，X选自：羧酸衍生物和氢。

在一些实施方式中，咖啡酸的衍生物具有以下结构：

在一些实施方式中，咖啡酸的衍生物具有以下结构：

在一些实施方式中，R选自：氢、-OH和烷基。

在一些实施方式中，咖啡酸的衍生物具有以下结构：

如本文所用，术语“羧酸衍生物”涵盖羧基、酰胺、羰基、酸酐、碳酸酯和氨基甲酸酯。

如本文所用，术语“衍生物”涵盖通过化学反应由相似化合物产生的具有抗微生物活性的任何化合物，或通过一个或多个原子的取代而由另一化合物产生的任何化合物。在一些实施方式中，衍生物包括结构类似物。

在一些实施方式中，本发明的化合物通过对色醇或4-乙基-苯酚的任何化学修饰而获得，只要其具有抗微生物活性。在一些实施方式中，通过添加选自乙酰化、甲基化、磷酸化、酰胺化或其它中的至少一种化学基团，对色醇或4-乙基-苯酚进行化学修饰。在一些实施方式中，化学修饰包括取代。在一些实施方式中，修饰包括向色醇或4-乙基-苯酚添加醋酸酯基团。在一些实施方式中，色醇醋酸酯或酪醇醋酸酯进一步包含至少一个如上所述的化学基团。

如本文所用，本发明的化合物不包含色醇或酪醇。

在一些实施方式中，所公开的发明涉及这样的组合物，其包含选自以下的至少一种分子：色醇衍生物和4-乙基-苯酚衍生物、以及至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。

在一些实施方式中，组合物包含色醇醋酸酯、或酪醇醋酸酯、或其任何组合、以及至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。

在一些实施方式中，本发明的化合物是化学合成或生物合成的。生物合成的方法在本领域内是众所周知的，并且可以包括但不限于：细胞培养中的产生或酶促无细胞的产生。在一些实施方式中，使用包含马克斯克鲁维酵母的细胞培养物生物合成本发明的化合物。在一些实施方式中，包含马克斯克鲁维酵母的培养物是单一培养物或多培养物。在一些实施方式中，本发明的化合物由马克斯克鲁维酵母生物合成。在一些实施方式中，根据本发明的方法，由马克斯克鲁维酵母生物合成色醇醋酸酯或酪醇醋酸酯。

微生物混合物

在一些实施方式中，本发明涉及包含微生物混合物的组合物。在一些实施方式中，组合物包含益生菌微生物。在一些实施方式中，益生菌微生物包括酵母。在一些实施方式中，公开的发明的混合物内的大多数微生物是益生菌酵母。在一些实施方式中，公开的发明的益生菌酵母是马克斯克鲁维酵母。

在一个实施方式中，马克斯克鲁维酵母是马克斯克鲁维酵母菌株HA 63[NRRL Y-8281，CBS 712]。

如本文所用，术语“益生菌”是指促进生长的任何物质和/或微生物，特别是具有有益特性的微生物(例如，肠道菌群)的生长。

在一些实施方式中，根据混合物总DNA中微生物DNA的部分来定量本发明混合物内的微生物含量(％)。在一些实施方式中，DNA定量直接基于提取的DNA的量。在一些实施方式中，DNA定量进一步包括酶促反应，包括但不限于限制、连接、扩增、测序或其任何组合。在一些实施方式中，DNA定量基于下一代测序。在一些实施方式中，DNA定量基于微生物特异性DNA读数的量与微生物混合物的DNA读数的总数相比的比。

在一些实施方式中，本发明混合物内的微生物含量包括每体积混合物培养物的微生物细胞数(例如菌落形成单位[CFU])。在一些实施方式中，本发明的混合物内的微生物含量包括与混合物中的细胞总数相比的微生物的细胞数。在一些实施方式中，本发明混合物内的微生物含量包括微生物的CFU。

在一些实施方式中，至少1％、至少3％、至少5％、至少7％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或至少70％的微生物混合物中的细胞是马克斯克鲁维酵母细胞。在一些实施方式中，1-4％、2-5％、4-7％、6-11％、10-16％、15-22％、20-32％、30-35％、32-40％、38-48％、45-55％、50-60％或55-75％、60-80％、65-90％或80-100％的微生物混合物中的细胞是马克斯克鲁维酵母细胞。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

在一些实施方式中，公开的发明的组合物包含至少一种益生菌细菌。在一个实施方式中，益生菌细菌选自乳酸杆菌属。在一个实施方式中，益生菌细菌选自丙酸杆菌属。在一个实施方式中，益生菌细菌选自该属。在一个实施方式中，益生菌细菌选自乳球菌属。在一个实施方式中，益生菌细菌选自明串珠菌属。在一些实施方式中，至少一种益生菌细菌是至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种益生菌细菌。在一些实施方式中，至多30％、至多25％、至多20％、至多15％、至多10％、至多5％或至多1％的微生物混合物中细胞是益生菌细菌。在一些实施方式中，1-5％、4-10％、8-18％、12-20％、17-25％或22-30％的微生物混合物中的细胞是益生菌细菌。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

在一些实施方式中，公开的发明的微生物混合物进一步包含其它类型的微生物。在一个实施方式中，其它微生物不是益生菌微生物，如酵母或细菌。在一些实施方式中，至多15％、至多13％、至多11％、至多10％、至多9％、至多7％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、或至多1％的微生物混合物中的细胞属于除益生菌酵母和至少一种益生菌细菌之外的微生物类型。在一些实施方式中，除了益生菌酵母和至少一种益生菌细菌之外，微生物混合物不包含其它类型的微生物。

在一些实施方式中，微生物混合物被悬浮在培养基中。在一些实施方式中，微生物混合物在培养基中生长。在一些实施方式中，培养基是适合于微生物混合物的生长和维持的细胞培养基。在一个实施方式中，细胞培养基(如乳)被优化用于微生物生长。

如本文所用，“细胞培养基”是指能够使细胞增殖的任何培养基、液体或固体。细胞培养基是本领域已知的，并且可以根据要生长的细胞的类型进行选择。例如，用于生长细胞的细胞培养基是卢里亚-贝尔塔尼(Luria-Bertani)液体培养基(broth)(LB；Miller液体培养基)。在一些实施方式中，微生物混合物在有效条件下培养，其允许增加来自培养微生物混合物的产量。增加产量的非限制性实例包括但不限于，增加的基因表达、蛋白质产生和分泌、分子的生物合成、增殖和其它。在一些实施方式中，有效的培养条件包括但不限于，允许用于增加产量的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。在一个实施方式中，有效培养基是指其中培养微生物混合物以产生本发明化合物的任何培养基。在一些实施方式中，细胞培养基一般包括具有可同化的的碳、氮和磷酸盐源，以及适当的盐、矿物质、金属和其它营养物(如维生素)的水性溶液。在一些实施方式中，本发明的微生物混合物可以在常规发酵生物反应器、摇瓶、测试管、微量滴定皿和培养皿中培养。在一些实施方式中，在适于益生菌微生物(如酵母或细菌)的温度、pH和氧含量下进行培养。在一些实施方式中，培养条件在本领域普通技术人员的专业知识范围内。培养本发明的微生物混合物的工艺的非限制性实例包括将微生物混合物在乳中在28℃下培养约24小时。

在一个实施方式中，培养工艺包括将微生物混合物培养12-16小时、14-18小时、12-24小时、16-24小时、18-28小时、10-20小时、22-36小时的时期。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

在一个实施方式中，培养工艺包括在20-26℃、24-28℃、22-34℃、26-34℃、28-38℃、20-30℃、32-46℃的温度下培养微生物混合物。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

在一些实施方式中，本发明的微生物混合物在乳中培养。在一些实施方式中，在乳中培养的微生物混合物产生发酵的乳产品。在一些实施方式中，发酵乳产品选自：酸奶、益生菌酸奶或开菲。

在一些实施方式中，本发明的发酵乳产品包含微生物混合物、色醇衍生物或酪醇衍生物或其任何组合。

在一些实施方式中，本发明的发酵乳产品用于人类食品消费。在一些实施方式中，本发明的发酵乳产品作为每日消费的部分被受试者消费。在一个实施方式中，发酵乳产品作为饮食消费的部分被受试者消费。在一些实施方式中，发酵乳产品可以用于治疗皮肤损伤。在一些实施方式中，发酵乳产品被局部施用于受试者。

在一些实施方式中，本发明提供了用于产生或获得本文公开的微生物混合物的方法。在一些实施方式中，方法包括如本文所述培养马克斯克鲁维酵母。在一些实施方式中，方法进一步包括确定获得或产生本文公开的微生物混合物的步骤。在一些实施方式中，确定包括确定混合物中至少3％的细胞是马克斯克鲁维酵母。在一些实施方式中，确定包括确定产生了色醇衍生物或4-乙基-苯酚衍生物。在一些实施方式中，确定包括确定产生色醇衍生物和4-乙基-苯酚衍生物。在一些实施方式中，确定包括确定混合物中至少3％的细胞是马克斯克鲁维酵母，并且以足够的量产生色醇衍生物或4-乙基-苯酚衍生物。在一些实施方式中，确定包括确定混合物中至少3％的细胞是马克斯克鲁维酵母，并且以足够的量产生色醇衍生物和4-乙基-苯酚衍生物。如本文所用，足够的量包括如本文所述的治疗有效量(如具有或引起抗炎反应、抗微生物活性、抗淀粉样聚集活性、或其组合)。

使用方法和组合物

根据一些实施方式，提供了治疗需要其的受试者中选自以下的疾病的方法：炎性疾病、传染性疾病和淀粉样聚集体相关疾病，方法包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物，药物组合物包含以下中的任意一种：选自色醇衍生物和4-乙基-苯酚衍生物的至少一种分子、以及本文公开的微生物混合物。

在一些实施方式中，传染性疾病包括基于有机物的污染物。在一些实施方式中，基于有机物的污染物包括生物膜。

在一些实施方式中，基于有机物的污染物包括淀粉样聚集(例如淀粉样β蛋白)。

如本文所用，术语“有机物”是指以下中的任意一种：含碳的化合物、从生物体产生或衍生的物质、器官和生物体。

在一些实施方式中，接触是施用。在一些实施方式中，接触是掺入。在一些实施方式中，接触是对受试者施用。在一些实施方式中，接触是掺入到表面。在一些实施方式中，接触是接触细胞。在一些实施方式中，细胞是单细胞微生物。在一些实施方式中，细胞是受试者的细胞。在一些实施方式中，细胞是神经系统的细胞。在一些实施方式中，神经系统的细胞是神经元细胞。

在一些实施方式中，基于有机物的污染物在表面、制品、细胞或受试者上或其内。在一些实施方式中，受试者包括细胞。在一些实施方式中，细胞是内源性细胞或外源性细胞。

在一些实施方式中，提供了治疗需要其的受试者中生物膜相关的传染性疾病或其症状的方法，方法包括向受试者施用治疗有效量的药物组合物，药物组合物包含选自色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物的至少一种分子、或本文公开的微生物混合物、以及至少一种药学上可接受的载体。

如本文所用，“基于有机物的污染物相关的传染性疾病”是指由于微生物的负载增加和/或生物膜或生物淤积的形成而导致的受试者的任何疾病或病症。在一些实施方式中，诱导基于有机物的污染物相关的传染性疾病的生物体选自：细菌、病毒、真菌或寄生虫。

传染性疾病症状的非限制性实例包括但不限于发烧、腹泻、疲劳、肌肉酸痛和咳嗽。

传染性疾病的非限制性实例包括尿路感染、胃肠道感染、肠炎、沙门氏菌病、腹泻、非结核性分枝杆菌感染、军团病、医院获得性肺炎、皮肤感染、霍乱、脓毒性休克、牙周炎、感染、炎症性肠病、溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩氏病和鼻窦炎。在一些实施方式中，感染引起选自以下的状况：菌血症、皮肤感染、新生儿感染、肺炎、心内膜炎、骨髓炎、中毒性休克综合症、皮肤烫伤综合症、和食物中毒。

如本文所用，术语“受试者”是指动物，更特别地是指非人类哺乳动物和人类生物体。非人类动物受试者还可以包括动物的产前形式(如例如，胚胎或胎儿)。非人类动物的非限制性实例包括：马、牛、骆驼、山羊、绵羊、狗、猫、非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠和猪。在一个实施方式中，受试者是人。人类受试者也可能包括胎儿。

如本文所用，疾病、病症或状况的术语“治疗(“treatment”或“treating”)”涵盖其至少一种症状的减轻、其严重性的降低、或其进展的抑制。治疗不一定意味着疾病、病症或状况完全治愈。为了成为有效的治疗方法，本文中有用的组合物仅需要降低疾病、病症或状况的严重性、降低与之相关联的症状的严重性、或提供对患者或受试者的生活质量的改善。

如本文所用，疾病、病症或状况的术语“预防”涵盖疾病、病症或状况的发作的延迟、预防、阻抑或抑制。如根据当前描述的主题所使用的，术语“预防(prevention)”涉及预防(prophylaxis)的过程，其中在疾病/病症过程的诱发或发作之前，使受试者暴露于当前描述的肽。当个体具有指示对待预防的疾病/病症的发生为易患病体质的遗传谱系时，可以这样做。例如，对于个体——其祖先对某些类型，例如炎症性的病症显示出易患病体质，这可能是正确的。术语“阻抑”用于描述其中疾病/病症过程已经开始但尚未实现该病症的明显症状的情况。因此，个体的细胞可能患有疾病/病症，但是尚未在临床上认识到该疾病/病症的外部迹象。在任一情况下，术语“预防(prophylaxis)”都可以被应用于涵盖预防(prevention)和阻抑两者。相反，术语“治疗”是指活性剂的临床的应用，以对抗在患者中已经实现临床表现的已经存在的状况。

如本文所用，术语“状况”包括与正常的解剖学的和生理的偏差，其构成活体动物或其部分之一的正常状态的损害，其中断或改变了身体功能的执行。

在一些实施方式中，本文公开的组合物涉及杀死活组织中或制品上或制品中的微生物或减少制品上或制品中微生物的形成。

在一些实施方式中，本发明涉及抑制或减少在制品上或制品内的基于有机物的污染物的负载的形成的方法，包括在制品上和/或制品内掺入或涂覆包含选自色醇衍生物和4-乙基苯酚衍生物的至少一种分子、或本文公开的微生物混合物、以及可接受的载体的组合物。

在一些实施方式中，基于有机物的污染物的负载是在制品中和/或在制品上的微生物的负载、和/或生物膜或生物淤积的形成。在一些实施方式中，微生物选自：病毒、真菌、寄生虫、酵母、细菌和原生动物。

根据一些实施方式，方法包括治疗或减轻需要其的受试者中基于有机物的污染物相关传染性疾病或其症状，包括向该受试者施用以下任意一项：本发明的化合物或包含其的药物组合物；或本文所公开的微生物混合物、或包含其的发酵乳产品。

在一些实施方式中，提供了包含有效量的本发明的化合物、或本发明的微生物混合物的组合物在制备用于治疗、减轻、减少或预防需要其的受试者中基于有机物的污染物相关传染性疾病或其症状的药物中的用途。在一些实施方式中，发明提供了包含有效量的一种或多种分子中或其任何衍生物、或本文所公开的微生物混合物的组合物在制备用于治疗需要其的受试者中的传染性疾病或其症状的药物中的用途。

在一个实施方式中，将本发明的化合物或本发明的微生物混合物提供给受试者本身。在一个实施方式中，将本发明的化合物中的一种或多种提供给受试者本身。在一个实施方式中，将本发明的化合物或本发明的微生物混合物作为药物组合物的部分提供给受试者，其中将其与药学上可接受的载体混合。在一个实施方式中，将本发明的化合物中的一种或多种作为药物组合物的部分提供给受试者，其中将它们与药学上可接受的载体混合。

如本文所用，术语“群体感应(QS)”是指响应细胞种群密度动态而修饰基因表达途径的系统。在一些实施方式中，本发明的分子或其任何衍生物被用于抑制QS的方法中。本领域已知的任何方法都可用于评估分子对QS的影响。用于QS检查的非限制性实例包括基于缺乏活性自体诱导基因并进一步用包含荧光报道基因的DNA载体克隆的工程细菌的生物发光测定法的使用。

如本文所用，术语“生物膜”是指彼此粘附的一组微生物，其被包埋在包含DNA、蛋白质和多糖的自产生且自分泌的细胞外聚合物内。在一些实施方式中，生物膜粘附到活宿主的表面上。在一个实施方式中，生物膜粘附于非生物(非生命，non-living)表面。在一些实施方式中，QS活性与生物膜形成的水平相关。

在一些实施方式中，与对照相比，本发明的组合物、发酵乳产品或方法中的任何一种改变QS活性至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少100％、或它们之间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，与对照相比，改变QS活性为改变1-5％、3-6％、4-10％、8-20％、15-30％、28-40％、35-50％、45-60％、50-70％、65-80％、70-90％、或90-100％。在一些实施方式中，与对照相比，改变QS活性为至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、或至少10倍。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

在一些实施方式中，与对照相比，本发明的组合物、发酵乳产品或方法中的任何一种降低生物膜产生至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％，至少40％、至少50％、至少60％、至少70％，至少80％，至少90％、或至少100％、或者它们之间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，与对照相比，生物膜产生降低了1-5％、3-6％、4-10％、8-20％、15-30％、28-40％、35-50％、45-60％、50-70％、65-80％、70-90％、或90-100％。在一些实施方式中，与对照相比，生物膜产生减少了至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、或至少10倍、或其间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

在一个实施方式中，对照是非发酵乳产品。在一个实施方式中，与所公开的发明的微生物混合物相比，对照是具有不同的微生物混合物的发酵乳产品。在一个实施方式中，对照是不含马克斯克鲁维酵母的发酵或非发酵乳产品。在一个实施方式中，对照是包含微生物混合物的发酵的或未发酵的乳产品，所述微生物混合物包含2％或更少的马克斯克鲁维酵母。在一个实施方式中，对照是包含微生物混合物的发酵或未发酵的乳产品，所述微生物混合物包含灭活的马克斯克鲁维酵母。灭活的非限制性实例是热灭活。在一些实施方式中，对照包含如上公开的酪醇、或色醇、或其任何组合。在一些实施方式中，对照不包含酪氨醇衍生物、或色醇衍生物、或其组合。

在一些实施方式中，本发明涉及包含有效量的本发明化合物作为活性成分以及可接受的载体和/或稀释剂的组合物。在一些实施方式中，本发明涉及包含有效量的色醇醋酸酯、酪醇醋酸酯、多巴胺HCl、咖啡酸、或其任何组合作为活性成分的组合物。在一些实施方式中，可接受的载体有利于将活性成分掺入或涂覆基材。

在一些实施方式中，组合物进一步包含基材。在一些实施方式中，将包含以下至少一种：色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物，的组合物掺入到至少一部分基材中和/或至少一部分基材上。

在一些实施方式中，本发明涉及组合物，组合物包含基材，所述基材在其至少一部分中和/或在其至少一部分上掺入了以下的至少一种：色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物。

如本文所用，术语“其部分”是指例如固体或半固体基材的表面或其部分，和/或其主体或其部分；或液体、凝胶、泡沫和其它非固体基材的容量或其部分。

如本文所述，具有广泛不同化学性质的基材可以被成功地利用以在其上掺入(例如沉积在其表面上)以下中的至少一种：色醇衍生物或4-乙基苯酚、或包含其的组合物。术语“成功地利用”是指结果，其含义为：(i)以下中的至少一种：色醇衍生物或酪醇衍生物、或包含其的组合物，成功地在基材表面上形成了均匀且均相的涂层；和(ii)所得的涂层赋予基材表面持久的期望性能(例如，抗微生物性能)。

因此，根据本发明的一些实施方式可用的基材可以是硬的(刚性的)或软的、固体的、半固体的、或液体的基材，并且可以采取泡沫、溶液、乳剂、乳液、凝胶、乳霜或其任何混合物的形式。

根据本发明的一些实施方式可用的基材可具有例如无机或有机表面，包括但不限于，玻璃表面；瓷表面；陶瓷表面；硅或有机硅表面、金属表面(例如不锈钢)；云母、聚合物表面(如例如，塑料表面)、橡胶表面、纸、木材、聚合物、金属、碳、生物聚合物、硅矿物(岩石或玻璃)、表面、羊毛、丝绸、棉、大麻、皮革、毛皮、羽毛、皮肤(生皮、皮毛或毛发)表面、塑料表面、以及包含或由聚合物制成的表面(聚合物如但不限于聚丙烯(PP)、聚碳酸酯(PC)、聚乙烯(PET)、高密度聚乙烯(HDPE)、低密度聚乙烯(LDPE)、聚酯(PE)、未增塑的聚氯乙烯(PVC)和含氟聚合物(包括但不限于聚四氟乙烯(PTFE，

可替代地，其它部分或整个基材由上述材料制成。

在一些实施方式中，如本文所述，掺入以下中的至少一种：色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物、或包含其的组合物，的基材是制品的一部分或形成制品的一部分。

根据一些实施方式，制品(例如，制成的制品)包含将色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物或包含其的组合物中的至少一种掺入到其至少一部分中和/或其至少一部分上的基材。

制品可以是可得益于色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物的抗微生物和/或抗生物膜形成活性的任何制品。

制品的非限制性实例包括但不限于，医疗设备、有机废物处理设备、流体设备、农业设备、包装、密封制品、燃料容器、水和冷却系统设备以及建筑元件。

如本文所述，可以掺入以下中的至少一种：色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物或包含其的组合物的装置的非限制性实例有利地包括管材、泵、排水管或废水管、螺旋板(screwplate)和类似物。

制品的非限制性实例包括但不限于用于水处理系统(如用于容纳和/或运输和/或处理水性介质或水)、设备、容器、过滤器、管子、溶液和气体以及类似物中的元件。

制品的非限制性实例包括但不限于有机废物处理系统(如用于容纳和/或处置和/或运输和/或处理有机废物)、设备、容器、过滤器、管子、溶液以及气体和类似物中的元件。

在一些实施方式中，本发明涉及药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的化合物或本发明的微生物混合物作为活性成分、以及药学上可接受的载体和/或稀释剂。在一些实施方式中，本发明涉及药物组合物，其包含治疗有效量的色醇醋酸酯、或酪醇醋酸酯或其任何组合作为活性成分。在一些实施方式中，药学上可接受的载体有利于本发明化合物向生物体的施用。例如，术语“药学上可接受的”可以意指由联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其它普遍认可的药典中列出，用于动物、且尤其是人类。

在一些实施方式中，所公开的发明涉及用于改变致病活性、微生物生长、微生物活性、改变炎症反应、改变淀粉样聚集、或其任何组合的组合物。如本文所定义，“改变”涵盖取决于期望结果的增加或减少。在一些实施方式中，致病活性包括微生物活性。在一些实施方式中，微生物活性包括选自以下中的任何活性：增殖、抗生素抗性、细胞通讯或群体感应、生物膜产生、淀粉样聚集、原纤维形成或寡聚、或其任何组合，毒素产生或分泌、或其组合。微生物活性可以使用任何已知方法来测定，非限制性实例包括但不限于分光光度法、使用选择性基材的耐药性测定、生物发光测定、液相色谱法和质谱测定法或其它，其中一些在本文以下示例，并且所有这些都是本领域普通技术人员众所周知的。

在一些实施方式中，所公开的发明涉及用于治疗炎性疾病、传染性疾病、淀粉样聚集相关疾病、或其组合的方法。

如本文所用，术语“淀粉样聚集相关疾病”涵盖包含涉及淀粉状蛋白作为疾病发病机理或病理生理学的部分的任何致病性状况。在一些实施方式中，淀粉样相关疾病包括以下中的任意一种：升高的淀粉样聚集、升高的淀粉样产生速率、升高的淀粉样原纤维形成速率、升高的淀粉样寡聚速率、淀粉样诱导的毒性、淀粉样诱导的细胞凋亡、淀粉样诱导的细胞死亡、和其任何组合。

在一些实施方式中，淀粉样聚集相关疾病是神经退行性疾病。如本文所用，神经退行性疾病还可包括神经肌肉退行性疾病。非限制性实例包括自主神经病、霍纳综合征、多系统萎缩、单纯性自主神经衰竭、谵妄、痴呆、阿尔茨海默氏病、慢性创伤性脑病、额颞叶痴呆、路易体痴呆、帕金森病、多发性硬化症、视神经脊髓炎、亨廷顿舞蹈病、进行性核上性麻痹、神经眼科和颅神经障碍、神经性肌强直、僵人综合征、格林-巴利综合征(GBS)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、遗传性神经病、遗传性压力易感性周围神经病(HNPP)、肌萎缩侧索硬化(ALS)和其它运动神经元疾病(MND)、重症肌无力、神经根障碍、髓核突出、周围神经病变、单神经病、多发性单神经病、多神经病、臂丛和腰骶丛障碍、脊髓性肌萎缩症(SMAs)、胸廓出口受压综合症(TOS)、克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD)、格斯特曼-施特劳斯纳-舍因克病(GSS)、癫痫发作、脊髓障碍和中风。

在一些实施方式中，改变为至少5％、至少15％、至少25％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％、或它们之间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，改变为改变1-5％、7-15％、10-25％、20-40％、35-50％、45-65％、55-75％、70-85％、80-90％、87-95％、或92-100％。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

在一些实施方式中，减少是减少至少5％、至少15％、至少25％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％、或它们之间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，减少是减少1-5％、7-15％、10-25％、20-40％、35-50％、45-65％、55-75％、70-85％、80-90％、87-95％、或92-100％。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

术语“减少”和“抑制”在本文中可互换使用。

在一些实施方式中，增强是增强至少5％、至少15％、至少25％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％、或它们之间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，增强是增强1-5％、7-15％、10-25％、20-40％、35-50％、45-65％、55-75％、70-85％、80-90％、87-95％、或92-100％。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

在一些实施方式中，本文所述的组合物包含比例为1：15至15：1w/w的色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物。在一些实施方式中，本文所述的组合物包含比例为1：14至14：1w/w的色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物。在一些实施方式中，本文所述的组合物包含比例为1：13至13：1w/w的色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物。在一些实施方式中，本文所述的组合物包含比例为1：12至12：1w/w的色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物。在一些实施方式中，本文所述的组合物包含比例为1：11至11：1w/w的色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物。在一些实施方式中，本文所述的组合物包含比例为1：10至10：1w/w的色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物。在一些实施方式中，本文所述的组合物包含比例为1：9至9：1w/w的色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物。在一些实施方式中，本文所述的组合物包含比例为1：8至8：1w/w的色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物。在一些实施方式中，本文所述的组合物包含比例为1：7至7：1w/w的色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物。在一些实施方式中，本文所述的组合物包含比例为1：6至6：1w/w的色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物。在一些实施方式中，本文所述的组合物包含比例为1：5至5：1w/w的色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物。在一些实施方式中，本文所述的组合物包含比例为1：4至4：1w/w的色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物。在一些实施方式中，本文所述的组合物包含比例为1：3至3：1w/w的色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物。在一些实施方式中，本文所述的组合物包含比例为1：2至2：1w/w的色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物。在一些实施方式中，本文所述的组合物包含比例为1：1至1：1w/w的色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

在一些实施方式中，在组合物内，色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物以至少1μM、至少2μM、至少5μM、至少10μM、至少15μM、至少20μM、至少30μM、至少40μM、至少50μM、至少75μM、至少100μM、至少150μM、至少200μM、至少225μM或至少350μM、或它们之间的任何值和范围的浓度存在。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，在组合物内，色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物以1-10μM、5-20μM、10-30μM、20-40μM、25-50μM、30-60μM、40-70μM、50-80μM、65-90μM、70-100μM、80-110μM、90-120μM、110-160μM、150-275μM或250-500μM的浓度存在。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

在一些实施方式中，组合物或微生物混合物包含色醇衍生物和4-乙基苯酚衍生物中的每一种，在组合物内，色醇衍生物和4-乙基苯酚衍生物的每一种的浓度为至少50nM、至少100nM、至少1μM、至少2μM、至少5μM、至少10μM、至少15μM、至少20μM、至少30μM、至少40μM、至少50μM、至少75μM、至少100μM、至少150μM、至少200μM、至少225μM、或至少350μM、或它们之间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，组合物或微生物混合物包含色胺醇衍生物和4-乙基苯酚衍生物中的每一种，在组合物内，色胺醇衍生物和4-乙基苯酚衍生物的每一种的浓度为10-50nM、40-100nM、75-500nM、450-900nM、0.75-1.5μM、1-10μM、5-20μM、10-30μM、20-40μM、25-50μM、30-60μM、40-70μM、50-80μM、65-90μM、70-100μM、80-110μM、90-120μM、110-160μM、150-275μM、或250-500μM。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。

如本文所定义，术语“最大半抑制浓度(IC

如本文所用，术语“载体”是指与活性化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。这样的载体可以是无菌液体(如水基的和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油和类似物)、聚乙二醇、甘油、丙烯乙二醇或其它合成溶剂。

水可以用作载体，如当活性化合物被在静脉内施用的药物组合物包含时。盐溶液以及水性葡萄糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇和类似物。如果需要，组合物还可含有少量的湿润剂或乳化剂、或pH缓冲剂(如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐)。还预想了抗菌剂(如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯)；抗氧化剂(如抗坏血酸或亚硫酸氢钠)；和用于调节张力的试剂(如氯化钠或葡萄糖)。载体可总共占本文提出的组合物重量的约0.1％至约99.99999％。

本发明的实施方式涉及以单位剂型存在并通过药学领域公知的任何方法制备的本发明的分子或其衍生物。在一个实施方式中，单位剂型为片剂、胶囊剂、锭剂、糯米纸囊剂、贴剂、安瓿、小瓶或预填充注射器的形式。

另外，可以任选地采用体外测定法以帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量还将取决于施用途径以及疾病或病症的性质，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可以从体外或体内动物模型测试生物测定或系统得出的剂量反应曲线中推断。

在一个实施方式中，本发明的组合物以药物组合物的形式施用，该药物组合物包含本发明的活性成分(例如，色醇衍生物或4-乙基苯酚衍生物)中的至少一种以及药学上可接受的载体或稀释剂。在另一个实施方式中，本发明的组合物可以以任何常规的口服、肠胃外或透皮剂型单独或一起施用。

如本文所用，术语“施用(“administering”、“administration”)”和类似术语是指在合理的医学实践中以提供治疗效果的方式将含有活性剂的组合物递送至受试者的任何方法。

在一些实施方式中，包含本发明的化合物、或其任何衍生物或组合、或本发明的微生物混合物的药物组合物是经由口服(即肠内)、直肠、阴道、局部、鼻、眼、经皮、皮下、肌内、腹膜内或静脉内施用途径施用的。药物组合物的施用途径将取决于要治疗的疾病或病症。合适的施用途径包括但不限于，肠胃外注射，例如，皮内、静脉内、肌肉内、病变内、皮下、鞘内和本领域已知的任何其它注射方式。另外，可能期望通过任何合适的途径(包括心室内和鞘内注射)引入本发明的药物组合物；可以通过例如附接到贮存器的心室内导管来促进心室内注射。也可以例如通过使用吸入器或喷雾器来进行肺部施用。

对于局部应用，本发明的化合物、或其任何衍生物或组合、或本发明的微生物混合物可以与药学上可接受的载体组合，从而基于期望的活性来递送有效剂量。载体可以是例如但不限于软膏、乳霜、凝胶、糊剂、泡沫、气雾剂、栓剂、垫或凝胶棒的形式。

对于口服应用，药物组合物可以是片剂或胶囊剂的形式，其可以含有以下成分或类似性质的化合物中的任何：粘合剂(如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂(如淀粉或乳糖)；崩解剂(如藻酸、Primogel或玉米淀粉)；润滑剂(如硬脂酸镁)；或助流剂(如胶体二氧化硅)。当剂量单位形式是胶囊时，除上述类型的材料外，它还可以含有液体载体(如脂肪油)。另外，剂量单位形式可以含有改变剂量单位的物理形式的各种其它材料，例如糖、紫胶或其它肠溶剂的包衣。本发明的片剂可以进一步被膜包衣。在一些实施方式中，药物组合物的口服应用可以是可饮用液体的形式。在一些实施方式中，药物组合物的口服应用可以是可食用产品的形式。口服载体的非限制性实例包括但不限于：乳、酸奶、益生菌酸奶、开菲、发酵乳或其它。

为了肠胃外施用的目的，可以使用在芝麻油或花生油中或在丙二醇水溶液中的溶液，以及相应的水溶性盐的无菌水溶液。如果需要，可以适当地缓冲这样的水溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖致使液体稀释剂等渗。这些水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内注射目的。

组合物还包括将活性物质掺入聚合化合物(如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等)的颗粒制剂之中或之上、或掺入脂质体、微乳剂、胶束、单层或多层囊泡、红细胞血影、或球状体中。这样的组合物将影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率、和体内清除速率。

在一个实施方式中，本发明提供了组合制剂。在一个实施方式中，“组合制剂”具体定义了“部分的套组(kit of parts)”，其意义是，可以独立地或通过使用具有区别量的组合搭档的不同固定组合(即，同时地、并发地、单独地或顺序地)给药上面定义的组合搭档。在一些实施方式中，然后部分的套组中的部分可以被例如同时或按时间顺序错开施用，即对于部分的套组中的任何部分在不同时间点且具有相等或不同的时间间隔。在一些实施方式中，可以在组合制剂中施用组合搭档的总量的比例。在一个实施方式中，可以改变组合制剂，例如，以便应付待治疗的患者亚群的需求或单个患者的需求，其不同需求可以由本领域技术人员可以容易地确定的特定疾病、疾病的严重性、年龄，性别或体重引起。

在一个实施方式中，将认识到，本发明的分子、或其任何衍生物或组合、或本发明的微生物混合物，可以与其它活性剂一起提供给个体，以实现与使用每种试剂自身治疗相比改善的治疗效果。在另一个实施方式中，针对与组合疗法相关的不良副作用采取措施(例如，补充剂的剂量和选择)。

在一个实施方式中，取决于待治疗状况的严重性和反应性，剂量可以是单次或多次施用，治疗过程持续数天至数周或直到影响治愈或疾病状态的减轻得以实现。

在一些实施方式中，以治疗安全和有效量施用本发明的组合物。如本文所用，术语“安全和有效量”是指足以产生期望的治疗反应而没有与以目前描述方式使用时的合理益处/风险比相当的不适当的不良副作用(如毒性、刺激性或过敏反应)的组分的量。在另一个实施方式中，分子或其任何衍生物或组合的治疗有效量是体内可测量的预期生物学效应所必需的本文提及的分子的量。实际的施用量以及施用的速率和时间过程将取决于所治疗状况的性质和严重程度。治疗处方，例如决定剂量、时机等，在全科医生或专科医生的责任范围内，并且通常要考虑待治疗的病症、个体患者的状况、递送部位、施用方法和医生已知的其它因素。可以在Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.,(2005)中找到技术和方案的实例。在一些实施方式中，有效量或剂量的制备可以最初从体外测定估计。在一个实施方式中，可以在动物模型中形成剂量，并且这种信息可以用于更准确地确定对人有用的剂量。

在一个实施方式中，本文所述活性成分的毒性和治疗功效可以通过体外、细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定。在一个实施方式中，从这些体外和细胞培养测定法和动物研究中获得的数据可用于形成一系列用于人的剂量。在一个实施方式中，剂量根据所采用的剂型和所利用的施用途径而变化。在一个实施方式中，个体医师可以根据患者的状况选择确切的制剂、施用途径和剂量。[参见，例如，Fingl,et al.,(1975)"ThePharmacological Basis of Therapeutics",Ch.1p.1]。

含有本发明的分子、或其任何衍生物或组合、或本发明的微生物混合物作为活性成分的药物组合物可以根据常规的药物化合技术来制备。参见例如，Remington'sPharmaceutical Sciences,18

在一个实施方式中，制备包括在相容的药物载体中配制的包括本发明的制剂的组合物，将其放置在适当的容器中，并标记用于治疗所说明的状况。

在一个实施方式中，本发明的组合物存在于包装或分配器装置(如FDA批准的试剂盒，其含有一种或多种含有活性成分的单位剂型)中。在一个实施方式中，包装例如包括金属或塑料箔，如泡罩包装。在一个实施方式中，包装或分配器装置附有施用说明。在一个实施方式中，包装或分配器适应与容器相关联的通知，其形式由管制药品的制造、使用或销售的政府机构规定，该通知反映了该机构对组合物或人类或兽医施用的形式的批准。在一个实施方式中，这种通知是美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)批准的用于处方药的标签或批准的产品插页的标签。

除非另外表明，否则本文所述的任何浓度范围、百分比范围或比例范围应理解为包括该范围内的任何整数及其分数的浓度、百分比或比例(如整数的十分之一和百分之一)。

除非另外表明，否则本文所叙述的涉及任何物理特征(如聚合物亚基、尺寸或厚度)的任何数值范围，应理解为包括所叙述的范围内的任何整数。

在讨论中，除非另有说明，否则修饰本发明的实施方式的一个或多个特征的条件或关系特性的形容词如“基本上”和“约”应理解为意指条件或特性被定义为在可接受的公差(其对于意图应用的实施方式的操作是可接受的)内。除非另外表明，否则说明书和权利要求书中的单词“或”被认为是包含性的“或”而不是排他性的“或”，并且表明其所结合的项中的至少一个或任何组合。

应当理解，如上文和本文其它地方所使用的术语“一个(“a”和“an”)”是指所列举的部件中的“一个或多个”。对于本领域的普通技术人员将清楚的是，除非另外具体说明，否则单数的使用包括复数。因此，在本申请中，术语“一个”和“至少一个”可互换使用。

为了更好地理解本教导，并且绝不限制教导的范围，除非另外表明，否则在说明书和权利要求书中使用的表示量、百分比或比例的所有数字和其它数值应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非另外表明，在以下说明书和所附权利要求书中提出的数值参数是近似值，其可根据寻求获得的期望性质而变化。至少，每个数字参数至少应根据报告的有效位数和应用普通舍入技术来解释。

在本申请的说明书和权利要求书中，动词“包含(comprise)”、“包括(include)”和“具有(have)”及其同根词中的每一个用于表明动词的一个或多个宾语不一定是动词的一个或多个主语的部件、元件或部分的完整列表。

如本文所使用的其它术语意在由其在本领域中的公知的含义来定义。

通过检查以下实例，本发明的其它目的、优点和新颖特征对于本领域普通技术人员将变得明显，而这些实例并非意图在进行限制。此外，如上文中所描述的和如以下权利要求部分所要求的本发明的各种实施方式和方面中的每一个在以下实例中都找到实验支持。

应当理解，为了清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反地，为简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何适当的子组合或在本发明的任何其它所描述的实施方式中适当地提供。在各种实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是那些实施方式的基本特征，除非该实施方式在没有这些元素的情况下是不可操作的。

实施例

通常，本文所用的命名法和本发明中所用的实验室程序包括分子、生化、微生物学和重组DNA技术。文献中对这些技术进行了详尽的解释。参见，例如，"Molecular Cloning:Alaboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols in MolecularBiology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,"CurrentProtocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren et al.(eds.)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中陈述的方法论；"Cell Biology:A LaboratoryHandbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"Culture of Animal Cells-AManual of Basic Technique"by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),Third Edition；"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994)；Stiteset al.(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"Strategies for Protein Purificationand Characterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；所有这些都通过引用并入到本文中。本文档通篇提供了其它一般参考。

材料和方法

益生菌酸奶(例如开菲)的样品和培养

将五十(50)gr的开菲颗粒接种在含有800ml的巴氏杀菌牛乳(TARA，以色列)的1000ml烧瓶中，并用无菌纱布覆盖。随后将混合物在28℃下培养24h。随后将益生菌酸奶过滤以从发酵乳中分离颗粒。将发酵乳中培养的微生物进行了序列分析。

根据制造商的说明，使用

成像流式细胞仪

将益生菌酸奶(例如，开菲)用水1：10稀释，并通过ImageStreamX Mk II(AmnisCorporation，Seattle，WA，USA)进行了分析。使用(亮视场)BF的缺省掩模来识别焦点中的微生物并绘制梯度均方根(root mean square)(RMS)。根据从细菌细胞中(而不是从真菌细胞中)检测到的红外线(IR)吸光度强度进行群体分析。为了计算计数值的目的，将自定义掩模应用于自动荧光通道上的真菌细胞。然后根据仪器计算出的强度值，将微生物划分为亚种群。

益生菌酸奶来源的有机分子的提取

将产生的益生菌酸奶(例如开菲)以4,000rpm离心10min以分离沉淀物和上清液。然后将五百(500)ml的上清液移至分液漏斗，并与500ml的醋酸乙酯混合。将有机相与上清液分离，并移至圆底烧瓶中以蒸发所有溶剂，直到获得固体残余物，固体残余物含有来自益生菌酸奶的有机分子。

提取的有机分子的生物活性

用缺少编码相关自诱导物(AI)的核苷酸序列的突变细菌进行生物发光测定。此外，用生物发光报道质粒克隆细菌，以便在群体感应基因表达发生时测量其发光强度。使用九十六(96)孔微量滴定板测定以评估以下细菌——根癌农杆菌(其响应于C8自体诱导剂)、以及霍乱弧菌和哈氏弧菌(两者响应于(S)-4,5-二羟基-2,3-戊二酮(DPD)自诱导物以进行通讯)——的AI激活(激动剂)或抑制(拮抗剂)。

根癌农杆菌A136 pCF218 pMV26培养物在补充有25μg/ml卡那霉素和4.5μg/ml四环素的Luria-Bertani液体培养基(LB；Miller's液体培养基)中在28-30℃下生长24h。哈氏弧菌和霍乱弧菌均在补充有四环素的LB肉汤(broth，培养基)(Lennox)中在30℃下生长24h。用新鲜的LB培养基将过夜培养物稀释至0.05的吸光度密度(OD

马克斯克鲁维酵母来源的有机分子的提取

将马克斯克鲁维酵母菌株HA 63[NRRL Y-8281，CBS 712]培养在300ml的酵母和麦芽LB中，并在28℃下生长24h，并在100rpm下搅拌。将培养物以4,000rpm离心10min，并收集上清液。然后将上清液移至分液漏斗中，并与等体积的醋酸乙酯混合用于萃取。将混合物振荡10min，将有机相转移至新试管，并将萃取重复3次。接下来，将提取物蒸发以除去所有液体，以及最后在冻干机上干燥以避免水的存在。

液相色谱-质谱(LC-MS)

将马克斯克鲁维酵母粗提物注射到LC-MS中，以鉴定源自酵母的代谢产物。将马克斯克鲁维酵母粗提物的色谱图与中等粗提物的色谱图进行比较，以鉴定与马克斯克鲁维酵母代谢特别相关的分子。分子分子量是通过使用带有正离子模式的静态纳米喷雾的LTQ XLOrbitrap(带有PDA和QDA检测器的Waters Acquity QDA)通过MS确定的。

合成分子的抗生物膜活性(203)

为了静态生物膜测定，将铜绿假单胞菌(PA01)、沙门菌属和金黄色葡萄球菌菌株的过夜培养物在新鲜LB培养基中以1：10稀释，该LB培养基含有终浓度为20或50μM的合成分子(203)、或DMSO(上至1％)作为对照。生物膜在非振荡条件下在37℃下在96孔板(ThermoScientific，Rochester，NY，美国)中生长。通过使用

合成的色醇醋酸酯和酪醇醋酸酯的生物膜调节活性

在这项研究中使用的各种致病性指示菌株是霍乱弧菌菌株MM920(ACqsA AluxQ)、哈氏弧菌菌株MM30(LuxS，Tn5)。为了启动生物膜形成，在不存在霍乱弧菌自诱导物1(CAI1)的情况下生长细菌。此外，细菌在以下的存在下生长：900nM CAI1(霍乱弧菌MM920)、900nMCAI1、200μM色醇醋酸酯和200μM酪醇醋酸酯、以及200μM色醇醋酸酯和200μM酪醇醋酸酯。

提供了肠炎沙门氏菌。金黄色葡萄球菌IV组菌株RN8242。将铜绿假单胞菌PA01、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌菌株在LB液体培养基中在37℃下温育24h。

生物膜在96孔板(Thermo Scientific，Rochester，NY，美国)中在振荡条件下在30℃下生长。如上所述可见，合成分子的使用不影响细胞生长。将染色的细胞用PBS洗涤两次。生物膜图像由CLSM(Plan-Apochromat 20x/0.8M27，Zeiss LSM880，德国)拍摄。

抗真菌活性

使用三种类型的真菌(菌核病菌属(Sclerotinia)、灰霉病菌属(Botrytis)和青霉属(Penicillium))估计抗真菌活性。在马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中生长真菌，从平板(在其上发现了真菌)上取一块琼脂放入含有30ml PDB的Falcon中并在22℃下温育直至其产生菌丝体。真菌悬浮液用新鲜PDB 1：1稀释，并与75μl溶于DMSO的益生菌酸奶(例如开菲)粗提物或与DMSO为对照(更新样品)在22℃下一起温育约48小时。48小时后，过滤真菌悬浮液，且将10μl的滤液转移到含有1.5％(v/v)益生菌酸奶粗提物或DMSO(作为对照)的马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar)(PDA)板的中心。

色醇醋酸酯和酪醇醋酸酯的化学合成

将高香草醇(homovanillyl alcohol)(1mmol)溶于3ml二氯甲烷(DCM)中，然后将1.2mmol的乙酰氯加入到反应混合物中，并在室温下允许搅拌24h，直到基材消失。反应完成后，在真空条件下蒸发DCM，且混合物用醋酸乙酯溶解，并用NaCl的饱和溶液洗涤。用醋酸乙酯(3×50mL)萃取水相，并用50mL饱和NaCl洗涤，以及然后在硫酸镁上干燥。通过快速色谱法(flash chromatography)在硅胶上纯化，使用EtOAc-己烷(2：1)洗脱，得到酪醇醋酸酯(2％，18mg)。Rf 0.43(30％EtOAc-70％己烷)；通过LC-MS和1H NMR验证。

将3-(2-羟乙基)吲哚(3-(2-Hydroxyethyl)indole)(3.224gr，20mmol)溶解在40mL吡啶中，并滴加2,648μL(28mmol)醋酸酐，并允许在室温下搅拌15h。将溶液倒入160mLH

群体感应活性的确定

如Brenier等人(2008)所述，测量了开菲生物质粗提物分子对以下细菌——根癌农杆菌A136、霍乱弧菌MM920和哈氏弧菌MM30——的影响。用新鲜的LB培养基将过夜培养物稀释至0.05的吸光度密度(OD

开菲生物质粗提物分子的生物膜调节活性

将铜绿假单胞菌PA01、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌菌株在37℃下温育24h。将细菌悬浮液用新鲜LB以1：10稀释，并与开菲生物质粗提物分子或与DMSO作为对照(更新样品)一起温育3h。在所有培养物中，DMSO浓度均上至1％(v/v)。将200μl的具有酸奶提取物或具有DMSO作为对照的液体培养基混合物置于96孔板(Thermo Scientific，Rochester，NY，美国)的每个孔中。向每个合适的孔加入2μl更新样品。板在37℃下温育24hr。温育后，样品用PBS洗涤3次。为了可视化活细胞，使用

合成的色醇醋酸酯和酪醇醋酸酯的生物膜调节活性

为了进行静态生物膜测定，将霍乱弧菌菌株MM920的过夜培养物在新鲜LB培养基中以1：10稀释，该培养基含有每种色醇醋酸酯和酪醇醋酸酯的终浓度为100μM或DMSO(上至1％)作为对照。发明人分析了两种类型的样品。一种不存在霍乱弧菌自诱导物(CAI-1)，而另一种存在900nM CAI-1。生物膜在非振荡条件下在37℃下在96孔板(Thermo Scientific，Rochester，NY，美国)中生长。通过使用

核磁共振(NMR)

使用Bruker Avance DPX500仪器(500MHz)在室温(RT)下记录

定量实时PCR(RT-PCR)分析

按照制造商的说明(包括制造商描述的柱上DNase I消化)，使用RNA ProtectBacteria试剂和

GM1酶联免疫吸附测定(ELISA)——霍乱毒素检测测定

通过以下程序接种GM1(单唾液酸四己糖神经节苷脂(monosialotetrahexosylganglioside))并将其固定在96孔白色/透明底部微量滴定板(Greiner)微量滴定板上：用PBS稀释GM1原液(2mg/mL在PBS中)(最终浓度为10μg/mL)。将200μL的GM1溶液添加到每个孔，并在不振荡的情况下在37℃下温育4-16小时。用PBS(×3)洗涤板。将牛血清白蛋白(BSA)溶解在PBS(终浓度4mg/mL)中，并将200μL的BSA-PBS添加到每个孔，并在不振荡的情况下，37℃下温育至少4小时。用PBS(×3)洗涤板，并保存在冰箱中直至使用。带有受试化合物(浓度均为100μM的色醇醋酸酯和酪醇醋酸酯)的VC1野生型菌株以及仅具有细菌的对照生长并通气温育，并在LB培养基中在30℃下振荡过夜。将培养物在5,000rcf下离心(spinned-down)5min，并取上清液，并用BSA-PBS 4mg/mL溶液以1：2稀释。将200μL稀释的上清液一式六份添加到每个GM1涂覆的孔中，并将板在37℃下温和振荡温育至少30min。同时，将兔抗毒素血清(RSA)原液用BSA-PBS以1：999稀释。用PBS(×3)洗涤板，将200μL RSA溶液添加到每个孔，并将板在37℃下温和振荡温育至少30min。同时，用BSA-PBS将山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)H&L碱性磷酸酶原液(1mg/mL在DDW中)以1：1,499稀释。用PBS(×3)洗涤板，将200μL的IgG溶液添加到每个孔，并将板在37℃下温和振荡温育至少30min。同时，通过制备两种原液来制备鲁米诺工作溶液。通过添加0.1mL在DMSO中的鲁米诺250mM、44μL在DMSO中的香豆酸90mM，1mL1M pH＝8.5的tris-HCl和DDW直至最终体积为10ml来制备原液A。通过添加6.4μl 30％的过氧化氢、1ml 1M pH＝8.5的tris-HCl和DDW直至最终体积为10ml制备原液B。用PBS(×3)洗涤板，并迅速混合等体积的原液A和B，制成鲁米诺工作溶液。将100μL的鲁米诺工作溶液添加到每个孔，将板振荡1.5-2min，并使用微量滴定板读数器(Varioskan Flash，Thermo)测量发光。将发光值相对于对照归一化。

巨噬细胞收集

使用先前所述的方案(Zhang等，2008)收获腹膜巨噬细胞。从收集72h前已经接受2.5ml的3％Brewer巯基醋酸盐液体培养基(Sigma，UK)的腹膜内施用的WT小鼠中收获诱出性巨噬细胞(elicited macrophage)。

体外LPS刺激

腹膜巨噬细胞(5×10

细胞因子ELISA

通过ELISA测量腹膜渗出液和LPS刺激的培养上清液中的IL-1α和IL-6水平。为了检测细胞因子，按照制造商的说明使用了R&D ELISA试剂盒(目录编号分别为MLA00和DY406)。使用纯化的IL-1α或IL-6的系列稀释液以15ng/ml的浓度开始构建标准曲线。

硫黄素T(ThT)测定

在Biotek Synergy H1读板器上使用96孔黑色板在37℃下进行ThT荧光测量。在不同浓度的色醇醋酸酯的不存在或存在情况下，对含有30μM淀粉样β[αβ(1-42)]蛋白的样品进行测量。将120-μL聚集反应的等分试样与10μM ThT在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中混合。在λ激发(λex)＝440且λ发射(λem)＝485nm下，每30min测量荧光强度，持续24hr。

表面纤溶酶共振(SPR)

在不存在或存在不同浓度的色醇醋酸酯的情况下，使用含有30μMαβ(1-42)的样品测试了具有寡聚体A11抗体(抗淀粉样寡聚体构象特异性抗体)的SPR传感器芯片。

透射电子显微镜(TEM)

在不存在或存在不同浓度的色醇醋酸酯的情况下，在37℃下温育24hr后，制备含有30μMαβ(1-42)的样品的TEM网格。

实施例1

益生菌酸奶(例如开菲)中的微生物的鉴定

发明人发现益生菌酸奶中的主要细菌种类是马乳酒样乳杆菌(Lactobacilluskefiranofaciens)、乳酸杆菌属、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、丙酸杆菌属和肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。还有许多其它属存在在益生菌酸奶中；然而，它们一般代表小于0.5％的微生物区系。在测序分析中的显著发现且与其它已报道的益生菌酸奶(如开菲)不同的是，鉴定了益生菌酵母马克斯克鲁维酵母，发现它是公开的益生菌酸奶中的优势种(59.04％)(图1A)。发现益生菌酸奶中该酵母的形态与其单一培养物形态相似(图1B和1C)。

实施例2

益生菌酸奶(例如开菲)中微生物亚种群的组成

如下表中总结的，发明人获得了种群R5的自发荧光强度与BF细节强度的散点图(19539个事件；图2A)。在图(图2A)上可以看到不同的亚种群R3、R6和R7，以及其它复合亚种群(R8)。为不同的门选择的不同颜色对应于在图的外围显示的图像集。R3(橙色点；图2A)是被定义为细菌细胞的种群(86.1％；图2B)，R6(浅蓝色圆点；图2A)是被定义为真菌细胞的种群(4.94％；图2C)以及R7(浅黄色点；图2A)是被定义为真菌和细菌聚集的种群(7.58％；图2D)。R8(褐红色点；图2A)种群是较大的聚集体(图2E)，因此被定义为R7的亚种群。

实施例3

粗提物的表征和质谱(MS)分析

将马克斯克鲁维酵母单一培养物粗提物注射到LC-MS，以鉴定源自酵母代谢的分子。将粗提物的色谱图与中等粗提物进行比较，以检查哪些分子与马克斯克鲁维酵母的代谢特异性地相连。仅在马克斯克鲁维酵母粗提物色谱图(图4B)中而不是在培养基提取物色谱图(图4A)中鉴定出两种分子，其中保留时间(RT)为11.68和13.84min。分子量分别通过MS确定，且180和203的m/z峰占优势。此外，在包含马克斯克鲁维酵母的益生菌酸奶(例如开菲)的粗提液的LC-MS色谱图中观察到两个峰(图3B)。在用于发酵产生益生菌酸奶的乳的提取物中没有观察到这些峰(图3A)。

实施例4

色醇醋酸酯和酪醇醋酸酯的合成与表征

本发明人已经从马克斯克鲁维酵母粗提物中分离出两种质量分别为180和203的分子，这已通过LC-MS验证(图5)。此后，发明人化学合成了两种分子，分别使用LC-MS和1HNMR对重量和结构分析进行了验证(图6和7)。

实施例5

酸奶粗提分子对QS系统的影响

通过对单独的诱导物生物发光信号进行归一化计算QS激活活性。包含203分子的粗提取物激活了根癌农杆菌(图8A)和铜绿假单胞菌(图8B)中的QS。在霍乱弧菌中，低容量的粗提203分子激活QS，而高容量的粗提203分子抑制QS(图8C和8D)。在霍乱弧菌中，低容量的180分子激活QS，而高容量的180分子完全抑制QS(图9)，其中IC

实施例6

益生菌酸奶(例如开菲)对真菌生长的影响

进一步检查了益生菌酸奶对真菌存活的影响。将益生菌酸奶补充到培养了真菌核盘菌的马铃薯葡萄糖琼脂平板上。在补充了益生菌酸奶的琼脂平板上培养的核盘菌显示可被抑制长达12天(图14A)或19天(图14B)。接种后长达22天，在葡萄孢属(图15)和青霉菌属(图16)中观察到了相似的抑制作用，但程度较低。

实施例7

合成色醇醋酸酯分子影响生物膜的产生

发明人检查了合成的色醇醋酸酯对几种类型的细菌形成生物膜的影响。当以20μM提供时，色醇醋酸酯似乎不影响铜绿假单胞菌中生物膜的形成(图11)。相反，50μM的色醇醋酸酯对沙门菌属(图12)和金黄色葡萄球菌(图13)中的生物膜形成有显著影响。

实施例8

酪醇醋酸酯和色醇醋酸酯对霍乱弧菌中QS的协同作用

观察到色醇醋酸酯和酪醇醋酸酯对霍乱弧菌中QS激活的协同作用(图17)。以1：1的比例一起施用的色醇醋酸酯和酪醇醋酸酯的组合物具有11.6±0.9μM的IC

另外，在突变的MM920霍乱弧菌菌株(ΔCqsA ΔluxQ)中检查了色醇醋酸酯和酪醇醋酸酯的各种组合。突变的霍乱弧菌产生的生物膜(图18A和18E)比单独添加自诱导物(其促进了群体感应，因此破坏了生物膜的形成)时产生的相应生物膜(图18B和18F)要厚得多和致密得多。色醇醋酸酯和酪醇醋酸酯(图18D和18H)，且特别是这三种化合物在一起(图18C和18G)在正常生物膜生长的破坏中表现出显著的协同作用——导致了不同的生物膜形态。

实施例9

合成的色醇醋酸酯减少了霍乱弧菌毒素的负载

发明人然后检查了合成的色醇醋酸酯是否影响霍乱弧菌毒素的产生水平。确实，发现合成的色醇醋酸酯以剂量依赖的方式降低霍乱弧菌毒素水平(图19)。

实施例10

合成酪醇醋酸酯分子影响生物膜的产生

发明人检查了合成的酪醇醋酸酯对霍乱弧菌的作用。发现酪醇醋酸酯抑制霍乱弧菌的生物膜和毒素产生。进一步，已显示酪醇醋酸酯影响QS相关基因的表达(图21)。

实施例11

益生菌酸奶(例如开菲)对细菌生长和生物膜产生的影响

进一步检查了益生菌酸奶对细菌生长的作用。开菲粗提取物干扰所检查的所有三种细菌菌株的QS途径。如果霍乱弧菌MM920突变体缺乏合成其CAI-1自诱导物的能力，则开菲粗提物具有显著的群体感应抑制(QSI)作用，因为开菲粗提物稀释度与反映在该菌株中的QS抑制的生物发光衰减之间的直接相关是明显的(图22A)。进一步，已显示开菲提取物对根癌农杆菌A136具有浓度依赖性QSI效应，其中QS途径是由3-氧代-辛基(3-oxo-octanyl)自诱导物诱导的(图22B)。有趣地，利用DPD自诱导物的哈氏弧菌MM30生物发光测定结果似乎显示开菲粗提物在所有稀释度下均诱导了群体感应激活(QSA)效应(图22C)。随着生物发光测定证明开菲提取物中的物质影响不同细菌的QS途径(抑制或激活)(图22A-22C)，发明人进一步研究了开菲提取物是否影响由致病细菌组装的生物膜基质的形成。实际上，已经显示开菲粗提物显著抑制重要的致病细菌铜绿假单胞菌、肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生物膜产生(图22D)。具体地，结果显示，当细菌与开菲提取物共温育时，通过对生物膜层的三维共聚焦显微镜图像进行图像分析，与未经处理的细菌相比，计算出的每种细菌的生物膜容量减少了约30％至40％(图22D)。重要地，细胞生存力测定证实，开菲粗提取物不对细菌细胞的增殖和生存力产生不利影响(图20)，因此指出细胞间通讯的破坏是导致开菲减少生物膜形成的可能因素。

实施例12

色醇醋酸酯对霍乱弧菌生物膜的影响

发明人使用缺乏编码QS自诱导物CAI-1的寡核苷酸序列的发光霍乱弧菌报告菌株MM920，检查了色醇醋酸酯对霍乱弧菌生物膜——霍乱弧菌增殖和致病性的关键组成部分——的影响。

霍乱弧菌VC1 WT的生物膜基质(图23Ai和23Aii)，以及霍乱弧菌MM920突变体的生物膜基质(图23Aiii和23Aiv)在具有或不具有色醇醋酸酯的生长培养基中生长24小时，并使用

通过应用定量结晶紫(CV)测定进行的生物膜容量分析(图23B中描绘)证实了在图23A中的荧光显微镜检查结果，提供了色醇醋酸酯抑制QS的其它证据。确实，考虑到在高细胞密度下QS的激活导致生物膜形成减少的事实，添加色醇醋酸酯后记录的增加的生物膜容量支持了在霍乱弧菌中的QS途径的直接抑制。

为了鉴定可能潜在地受色醇醋酸酯调节的基因，发明人进行了实时定量PCR(RT-qPCR)分析，评估在高细胞密度条件下霍乱弧菌VC1 WT的基因表达(图23C)。RT-qPCR结果提供浓度为100μM的色醇醋酸酯对基因表达途径(特别是与QS、生物膜和毒力调节相关的基因)的影响显著的证据，这说明了该化合物诱导的表型改变(图23A-23B)。具体地，RT-qPCR数据揭示由于色醇醋酸酯hapR的显著下调(图23C)。由于hapR抑制发生在低细胞密度条件下，因此这一结果是显著的；确实，通过hapR下调模拟低细胞密度可能解释了霍乱弧菌与色醇醋酸酯温育时观察到的增强的生物膜生成(图23A-23B)。色醇醋酸酯对vpsT的显著上调证实了这一解释(图23C)，该基因(这是生物膜形成所需的)的表达在低细胞密度条件下被增强。此外，色醇醋酸酯也导致hapA(受hapR调控的下游基因)的表达降低(图23C)。hapA的抑制实际上可以指出本文公开的益生菌酸奶(例如开菲)的潜在治疗益处，因为hapA与霍乱弧菌诱导的多种致病作用(如液体产生和腹泻)相关。重要地，预期通过色醇醋酸酯模仿用于霍乱弧菌的低细胞密度促进遗传级联，从而导致增强的毒力。的确，RT-qPCR实验证明与霍乱弧菌毒素产生有关的aphA的上调(图23C)。然而，令人惊讶的是，RT-qPCR分析揭示ctxA——在aphA诱导的毒力级联下游的毒力诱导基因——实际上被色醇醋酸酯显著抑制(图23C)。为了评估此结果的表型方面，发明人进行了测量并显示酪醇醋酸酯以剂量依赖的方式降低了霍乱弧菌的毒素产生(图19)。

实施例13

益生菌酸奶(例如开菲)用于治疗炎症性肠病

实验概要：

研究持续时间(每个周期)：10天；组大小：n＝4或6；组数＝10；动物：研究开始时6-8周大的雄性黑小鼠；模型：通过在饮用水中补充2.5％(w/v)的葡聚糖硫酸钠(DSS)在小鼠中诱发结肠炎/克罗恩氏病。每天更换DSS-水，持续7天。

治疗：

测试项目：益生菌酸奶、或两种分子(色醇醋酸酯和酪醇醋酸酯)的混合物(终浓度为25μM(重复2)或50μM(重复3))，如下所述通过口服途径(管饲法)递送，从第1天到第7天每天一次。

表1-鼠IBD模型中的测试项目检查概要

贯穿实验的检查：

发病率和死亡率——每天一次；临床体征——每隔一天；体重——在第一天和此后每隔一天；直肠出血和大便一致性评分(如下表2中表明)——在第一天(第0天或基线)和第7天。

终止：

出血用于细胞因子；临床评分(根据表2)；在第10天处死动物，且切下、测量并称重结肠；将结肠固定在10％的福尔马林缓冲液中，并将结肠远侧解剖区域石蜡包埋进行组织学检查。组织学样品用苏木精和伊红染色以进行组织病理学分析，并根据肠壁中隐窝细胞的丢失和炎性细胞向结肠中的浸润进行评分。

表2-临床评分

发明人显示，本文公开的益生菌酸奶和在其中鉴定的分子在鼠炎症性肠病(IBD)模型中减少了体重减轻。与DSS+W相比，在用Y+DSS+Y；DSS+Y和DSS+Mole(在25μM或50μM时)处理的小鼠中，观察到显著减少的体重减轻(图24)。另外，在接受商业酸奶(Yc+DSS+Yc或DSS+Yc)的组中没有显著的体重减轻作用。

发明人显示，本文公开的益生菌酸奶和在其中鉴定的分子减少了鼠IBD模型中的结肠缩短(图25)。在实验终点从直肠到盲肠测量结肠长度。与用DSS处理并在DSS(Y+DSS+Y)之前用本文公开的益生菌酸奶喂养的小鼠结肠相比，在用DSS处理的小鼠(DSS+W)中观察到结肠的缩短。此外，在用本文公开的益生菌酸奶中鉴定的分子(50μM)治疗的小鼠中观察到在统计学上显著减少的结肠长度的缩短。

发明人进一步检查了本文公开的益生菌酸奶和在其中鉴定的分子对疾病活性指数(DAI)的影响。结果显示，在DSS之前用酸奶(Y+DSS+Y；图26A)、或用在本文公开的益生菌酸奶中鉴定的分子以50μM的浓度(DSS+Molec；图26B)治疗的小鼠中的临床评分均显著降低。

结肠组织病理学切片揭示，在所有DSS治疗的小鼠中，严重的组织损伤伴随着肠壁中隐窝细胞的丢失以及炎性细胞向结肠中的浸润(图27A)。在DSS(Y+DSS+Y)之前喂食酸奶的小鼠结肠中，组织结构被保留，其中仅有极小的炎症和结肠组织修复的初始迹象(圈出；图27B)。

实施例14

在皮肤溃疡治疗中益生菌酸奶(例如开菲)的施用

发明人显示，利什曼病溃疡可以使用本文公开的益生菌酸奶来治疗。简而言之，在应用酸乳酪混合物之后观察到愈合，其中在三个月的常规治疗(其未能帮助患者)后应用。常规治疗包括用ESRACAIN注射进行局部麻醉后的PENTOSTAM注射。此外，由于涂抹浓密，患者涂了SALIKAREN。在酸奶治疗中，患者在其全部溃疡上都应用了益生菌酸奶，并每天(早上和晚上)用绷带包扎溃疡两次。结果显示治疗11-14天后皮肤利什曼病的加速愈合(图28)。

此外，在需要缝线用于切口的融合的情况下，由于由于自受伤以来已超过24小时而没有进行缝合，因此应用了益生菌酸奶，并且早在初次应用后的四天就伤口愈合明显(图29)。

实施例15

色醇醋酸酯和酪醇醋酸酯的抗炎活性

发明人显示在色醇醋酸酯、酪醇醋酸酯、或两者存在的情况下进行培养的巨噬细胞中两种促炎细胞因子IL-1α和IL-6的产生均显著降低(图30)。其它4-乙基苯酚衍生物、多巴胺HCl和咖啡酸显示出类似的结果。

实施例16

色醇醋酸酯的抗神经退行性活性

发明人在常见的体外神经退行性模型中检查了包含色醇醋酸酯的组合物的活性。从本文公开的益生菌酸奶中提取的分子混合物和色醇醋酸酯都显示在温育12小时后有效减少淀粉样β原纤维形成(图31)。进一步，已显示色醇醋酸酯对淀粉样β的抑制作用呈剂量依赖性(图32)。

发明人进一步检查了本文公开的益生菌酸奶的粗提取物或色醇醋酸酯在24hr的温育期后对淀粉样β原纤维形成的作用。在本文公开的益生菌酸奶的粗提物存在下，原纤维形成被完全抑制(图33B)。在色醇醋酸酯的存在下，原纤维也以剂量依赖的方式被显著抑制(图33C-33D)。

尽管已经在本文中示例和描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在会想到许多修改、替换、改变和等同物。因此，应当理解，所附权利要求书意在涵盖落入本发明的真实精神内的所有这样的修改和改变。

序列表

<110> 本-古里安大学B.G.内盖夫技术和应用公司

<120> 微生物混合物、从其衍生的分子、及其使用方法

<130> BGU-P-071-PCT

<150> 62/715,875

<151> 2018-08-08

<160> 8

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 1

ctggcggcat tggtcaagcc c 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

acccggtgtg acaggcgcaa 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 3

cgcagtattc agatgctggt g 21

<210> 4

<211> 21

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<210> 5

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<210> 7

<211> 24

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<213> 人工序列

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<400> 7

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

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