一种羌活胜湿汤标准煎液的制备方法及其指纹图谱

技术领域

本发明属于中药复方领域，具体涉及一种羌活胜湿汤标准煎液的制备方法及其指纹图谱。

背景技术

经典名方是中药方剂的杰出代表，是中医药的精华，也是历代中医经验的总结。传统的 药用方法多为煎煮法，但传统的煎煮方法主要考虑煎煮器具、前处理方法、煎煮时间等因素， 且参数比较模糊，缺乏相应的科学依据作为指导。另外，中药复方所含成分复杂，特别是经 配伍煎煮后会发生成分的变化，这也给复方的质量控制带来了很多困难，只用单个或几个成 分作为指标进行质量控制不能全面反映复方多组分、多靶点的用药特点。中药指纹图谱是一 种综合的，可量化的鉴定手段，可以全面反映药材的质量，能同时对多种成分进行分析，适 合复方模糊性、整体性的特点，在复方的质量控制中有广泛的应用。

羌活胜湿汤为国家中医药管理局2018年首批公布的100个古代经典名方之一，出自金元 四大家李东垣的《内外伤辨惑论》。原文记载：羌活、独活各一钱，藁本、防风、甘草(炙)、 川芎各五分，蔓荆子三分，上口父咀，都作一服，水二盏，煎至一盏，去渣，大温服，空心食 用。羌活胜湿汤由羌活、独活、藁本、防风、甘草(炙)、川芎、蔓荆子七味药材组方而成，临床上主要用于治疗类风湿性关节炎、偏头痛、肩周炎、感冒等风湿邪气痹阻的疾病，疗效显著。为了实现羌活胜湿汤煎煮过程的规范化，并能综合控制其质量，我们提出了一种羌活胜湿汤标准煎液的制备方法及其指纹图谱。

发明内容

本发明提供了一种羌活胜湿汤标准煎液的制备方法及其指纹图谱，包括以下步骤：

1.标准煎液的制备：取羌活，独活，炙甘草，川芎，藁本，防风，蔓荆子，分别粉碎为一定粒度后，按比例混合。加入一定体积的蒸馏水，浸泡半小时，先武火煮沸，再转为文火煎煮一定时间。煎煮完毕后，趁热过滤，离心，即得标准煎液。以出膏量、升麻素苷提取量、甘草酸铵提取量综合加权评分为评价指标，采用正交试验，考察加水量、煎煮时间、煎煮次数三个因素对煎煮过程的影响，获得最佳煎煮工艺，并进行工艺验证；

2.指纹图谱供试品溶液的制备：不同批次的羌活胜湿汤分别煎煮得标准煎液，各冻干得 粉末，加入一定浓度的甲醇水溶液溶解，配制成一定浓度的供试品溶液，过膜，备用；

3.对照品溶液的制备：精密称取升麻素苷、阿魏酸、甘草酸铵、蔓荆子黄素、羌活醇、 蛇床子素、异欧前胡素对照品适量，加入一定浓度的甲醇水溶液溶解，定容至10mL，过微 孔滤膜，得对照品混合物溶液；

4.指纹图谱的测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，进 行测定，即得各批次羌活胜湿汤和对照品溶液的色谱图；

5.指纹图谱的构建：将不同批次羌活胜湿汤色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价软 件(2012版)，选择各批次色谱图中均含有的色谱峰作为共有峰，生成羌活胜湿汤对照指纹图谱， 计算各共有峰的相对保留时间，评价各批次羌活胜湿汤图谱的相似度。

所述的步骤1中，羌活，独活，炙甘草，川芎，藁本，防风，蔓荆子药材的重量比为6：6：3：3：3：3：1.8，各药材粉碎粒度为粗粉或最粗粉。

所述的步骤1中，综合加权评分中，出膏量占20％，升麻素苷提取量占40％，甘草酸铵 提取量占40％。

所述的步骤1中，正交试验中，加水量的三个水平设置为1：10、1：15和1：20，煎煮时间的三个水平设置为5分钟、10分钟和15分钟，煎煮次数的三个水平设置为1次、2次和 3次。

所述的步骤1中，最佳煎煮工艺为加20倍量的水，煎煮3次，每次10分钟。

所述的步骤2中，所用的甲醇水溶液体积分数为30％-80％，供试品溶液浓度为2-10 mg/mL。

所述的步骤3中，所用的甲醇水溶液体积分数为30％-70％，各标准品浓度为50-200 μg/mL。

所述的步骤4中，建立羌活胜湿汤指纹图谱的色谱条件为：色谱柱为AgilentZorbax Extend C18柱(4.6×250mm，5μm)；检测波长为254nm；流速为1.0mL/min；柱温为25℃；进样 量为20μL；流动相为0.1％磷酸水(A)和乙腈(B)进行梯度洗脱；梯度洗脱程序为：0～10 min，15～20％B；10～15min，20～35％B；15～25min，35～40％B；25～35min，40～65％B； 35～40min，65～70％B；40～45min，70～100％B。

所述的步骤5中，构建的羌活胜湿汤指纹图谱含有20个共有峰，以峰10为参照峰，各 共有峰的相对保留时间依次为：峰1：0.288-0.292；峰2：0.318-0.321；峰3：0.463-0.466； 峰4：0.496-0.500；峰5：0.553-0.559；峰6：0.575-0.579；峰7：0.634-0.637；峰8：0.742-0.747； 峰9：0.874-0.883；峰10：1；峰11：1.059-1.063；峰12：1.112-1.117；峰13：1.250-1.255； 峰14：1.341-1.351；峰15：1.382-1.391；峰16：1.415-1.426；峰17：1.468-1.480；峰18：1.628-1.636； 峰19：1.693-1.707；峰20：1.757-1.772。

所述的步骤5中，共有峰中包括七个特征峰，峰2为升麻素苷、峰5为阿魏酸、峰12为甘草酸铵、峰15为蔓荆子黄素、峰18为羌活醇、峰19为蛇床子素、峰20为异欧前胡素。 甘草酸铵、峰15为蔓荆子黄素、峰18为羌活醇、峰19为蛇床子素、峰20为异欧前胡素。

本发明的有益效果是：

(1本发明提供的羌活胜湿汤标准煎液的制备方法，可获得较高的出膏率和药材中活性 成分的提取率，且方法稳定可靠。

(2)本发明基于羌活胜湿汤标准煎液建立的HPLC指纹图谱可全面反映羌活胜湿汤的化 学成分信息和整体性特征，包含了大部分药理活性成分，为羌活胜湿汤的质量控制提供了依 据。

(3)本发明建立的指纹图谱方法操作简便、耗时短、精确度高、准确性好、重复性好， 易于实现。

附图说明

图1为本发明一种实施例的羌活胜湿汤样品色谱图(1-20：20个共有峰；2.升麻素苷 5. 阿魏酸 12.甘草酸铵 15.蔓荆子黄素 18.羌活醇 19.蛇床子素 20.异欧前胡素)

图2为本发明一种实施例的13批羌活胜湿汤指纹图谱叠加图

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅局限于下述的实施方式。

实施例

1.羌活胜湿汤标准煎液的制备工艺

以出膏量、升麻素苷、甘草酸铵提取量综合加权评分为评价指标，采用L

升麻素苷、甘草酸铵对照品标准曲线的绘制：精密称取升麻素苷、甘草酸铵对照品适量， 加入70％甲醇溶液配成一系列浓度的溶液，过0.22μm微孔滤膜，注入液相色谱仪。色谱条 件如下：色谱柱为Agilent Zorbax Extend C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相为0.02％磷 酸水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如下：0～10min，20％～30％B；10～25min，30％～50％ B。检测波长设为254nm，流速为1.0mL·min

正交试验优化制备工艺：以加水量、煎煮时间、煎煮次数为3个考察因素，每个因素设 定3个水平(因素水平表见表1)，按L9(3

表1因素水平设计表

表2正交试验表

表3方差分析

注：F

由表2和表3可知，三个因素对羌活胜湿汤煎煮效率的影响顺序为：煎煮次数>加水量> 煎煮时间，按综合评分后得到的最佳煎煮工艺为A

最佳工艺验证试验：按照最佳煎煮工艺进行煎煮，进行3次平行实验，测得的出膏量平 均为11.48g，升麻素苷的含量为9.85mg，甘草酸铵含量为104.16mg，综合评分为47.90， 说明该煎煮工艺稳定可靠，重复性较好。

2.羌活胜湿汤标准煎液指纹图谱的建立

供试品溶液的制备：将13批羌活胜湿汤样品按照最佳煎煮工艺进行制备，冻干成粉末。 精密称取冻干粉末41.2mg，置于10mL容量瓶，加入70％甲醇水溶液溶解，超声溶解，过 0.22μm微孔滤膜，即得。

对照品溶液的制备：称取升麻素苷、阿魏酸、甘草酸铵、蔓荆子黄素、羌活醇、蛇床子 素、异欧前胡素对照品各1.5mg左右，加入70％甲醇定容至10mL，过0.22μm微孔滤膜， 即得。

指纹图谱的测定：精密吸取13批羌活胜湿汤供试品溶液和混合对照品溶液入高效液相色 谱仪，进行测定，记录色谱图，得到13个批次的羌活胜湿汤和混合对照品色谱图。色谱条件 为：色谱柱为Agilent Zorbax Extend C18柱(4.6×250mm，5μm)；波长为254nm；洗脱流速 为1.0mL/min；柱温为25℃；进样量为20μL；流动相为0.1％磷酸水(A)和乙腈(B)梯度洗脱：0～10min，15～20％B；10～15min，20～35％B；15～25min，35～40％B；25～35min，40～65％B；35～40min，65～70％B；40～45min，70～100％B。

指纹图谱的构建：将13个批次的羌活胜湿汤供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度 评价系统(2012版)，选择所有批次样品均有的20个色谱峰作为共有峰，用平均数法，经多 点校正和自动匹配后，产生羌活胜湿汤的对照图谱，供试品和13批羌活胜湿汤的指纹图谱叠 加图分别见图1和图2。通过对照品指认了其中的七个色谱峰，峰2为升麻素苷、峰5为阿 魏酸、峰12为甘草酸铵、峰15为蔓荆子黄素、峰18为羌活醇、峰19为蛇床子素、峰20为 异欧前胡素。以峰10为参照峰，各共有峰的相对保留时间依次为：峰1：0.288-0.292；峰2： 0.318-0.321；峰3：0.463-0.466；峰4：0.496-0.500；峰5：0.553-0.559；峰6：0.575-0.579； 峰7：0.634-0.637；峰8：0.742-0.747；峰9：0.874-0.883；峰10：1；峰11：1.059-1.063；峰 12：1.112-1.117；峰13：1.250-1.255；峰14：1.341-1.351；峰15：1.382-1.391；峰16：1.415-1.423； 峰17：1.468-1.480；峰18：1.628-1.636；峰19：1.693-1.707；峰20：1.757-1.768。各共有峰 相对保留时间RSD在0.10-0.44％之间，说明共有峰出峰时间较稳定。

相似度评价：使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对13个批次的羌活胜 湿汤进行相似度评价，结果见表4，相似度均大于0.93，说明13批样品一致性较好。

表4 13批羌活胜湿汤指纹图谱相似度评价结果