一种胶原蛋白肽镁螯合物的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种胶原蛋白肽镁螯合物的制备方法及其应用。

背景技术

活性氧（ROS）和活性氮（RNS）是在人体内能够发挥重要作用的自由基，参与细胞内信号传递和宿主防御入侵病原体等。在人体正常生理状态下，自由基的产生与消除处于动态平衡状态。当机体受到外界因素影响或处于病理状态时，体内自由基的动态平衡可能就会被打破，过多的活性氧自由基和氮自由基对人体内的多种细胞组分如蛋白质、DNA和脂质等造成氧化损伤，进而可能引发多种疾病，如心脏病、阿兹海默症、动脉硬化、糖尿病和癌症等。同时，细胞内自由基的过度积累也会导致生物体内骨形成和骨吸收的失衡，最终导致骨质疏松的发生。

考虑到现有合成抗氧化剂（BHT，BHA和TBHQ等）和抗骨质疏松药比如双磷酸盐、降钙素和甲状类激素等的安全性问题，胶原蛋白肽及其金属离子螯合物受到了越来越多的关注。人们可以通过膳食性功能肽的摄入来预防或治疗自由基所引起的骨质疏松。

镁是人体内重要的金属元素，是多种酶的辅助因子，可激活和催化体内多种酶系统，在细胞能量代谢、细胞凋亡、DNA和蛋白质合成过程中扮演重要角色。有研究表明，镁缺乏可引起炎症反应，导致白细胞和巨噬细胞的活化，炎症细胞因子和急性C反应蛋白的释放以及自由基的过度产生。

胶原肽中丰富的氨基酸为金属离子螯合提供了诸多可选择的活性位点。多肽与金属离子的结合是基于配体表面电子供体（肽）和一个或多个电子受体（金属离子）的相互作用，能够通过配位键起到稳定结构作用。多肽-金属离子螯合物不仅能够促进对矿物元素的吸收，还促进了一些其他如抗菌、抗癌和抗炎等生物活性的改善。

发明内容

为了克服上述问题，本发明提供了一种胶原蛋白肽镁螯合物的制备方法及其应用，通过复合酶解制备得到牛骨胶原蛋白肽并通过镁离子螯合制备得到了胶原蛋白肽镁螯合物。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种胶原蛋白肽镁螯合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：牛骨胶原肽的制备

取一定量脱脂脱钙后的牛骨颗粒并加入去离子水，调节溶液pH值，加入蛋白酶，进行酶解，然后通过沸水浴灭酶处理，过滤透析、冷冻干燥后制备得到牛骨胶原肽；

步骤二：牛骨胶原蛋白肽镁螯合物的制备

将步骤一制备得到的牛骨胶原肽以一定浓度溶解，加入一定量无机镁盐，调节溶液pH，调节反应温度和反应时间进行反应，反应结束后得到螯合反应溶液；将上述螯合反应溶液加入无水乙醇静置，离心，收集沉淀并冷冻干燥，制得牛骨胶原蛋白肽镁螯合物。

进一步，步骤一中所述牛骨颗粒与去离子水的比例优选为1:4，溶液pH值为6.5-8.0。

进一步，步骤一中所述蛋白酶为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的加入质量比例为1:1-2:1，蛋白酶的加酶量为牛骨颗粒质量的0.5-2.0%，所述灭酶处理的时间为15min；步骤一中进行酶解的温度为55-70 ℃，进行酶解时间的时间为1-3h。

进一步，所述步骤一中制备得到的牛骨胶原肽的过滤透析过程为：通过过滤棉过滤，然后经200 Da透析袋去除反应过程中因调节pH所引入的离子，通过旋转蒸发仪浓缩，旋蒸温度60℃；之后进行冷冻干燥，冷冻干燥时条件为冷肼-60℃，干燥仓10℃，制得所述牛骨胶原肽。

进一步，所述步骤二中所选用的无机镁盐可为氯化镁、硝酸镁和硫酸镁中的一种；所述牛骨胶原肽的溶解浓度10-50 mg/mL。

进一步，在步骤二螯合反应溶液制备的过程中，所述无机镁盐加入量按牛骨胶原肽与镁质量比5:1-25:1（wt%），此处镁质量按镁盐中的镁离子质量进行计算，体系的pH值调整到6.0-8.0，反应时间为0.5-2.0 h，反应温度为50-60 ℃。

进一步，步骤二中所述将螯合反应溶液加入无水乙醇静置条件为在室温下，静置4-5 h。

进一步，步骤二中将反应结束后的螯合反应溶液与无水乙醇按体积比为1:5-1:9添加，离心条件为在10000 rpm条件下，离心10 min，然后收集沉淀、通过旋转蒸发仪浓缩，旋蒸温度60℃；之后进行冷冻干燥，冷冻干燥时条件为冷肼-60℃，干燥仓10℃，制得牛骨胶原肽镁螯合物。

本发明还保护上述制备方法制得的胶原蛋白肽镁螯合物。

上述制备方法制得的胶原蛋白肽镁螯合物在药物或保健品或化妆品或医疗器械中的应用。

该胶原蛋白肽镁螯合物的制备方法具有以下有益效果：

（1） 本发明胶原蛋白肽镁螯合物的制备方法通过简捷、低成本的操作工艺，有效提高了胶原肽的抗氧化活性和促成骨细胞活性，避免了传统药物治疗所带来的副作用。

（2） 本发明胶原蛋白肽镁螯合物的制备方法得到的胶原蛋白肽镁螯合物能够对骨质疏松的预防与治疗起到积极效果。

（3）本发明胶原蛋白肽镁螯合物的制备方法能够为新型肽镁螯合物产品的开发与利用提供新思路。

（4）利用本发明胶原蛋白肽镁螯合物的制备方法制备得到的胶原蛋白肽镁螯合物如果应用到本领域相关的药物或保健品或化妆品或医疗器械中，可以起到更优异的抗氧化和促成骨细胞活性的效果。

附图说明

图1：本发明实施例1-实施例3为制备得到的牛骨胶原肽与胶原蛋白肽镁螯合物对MC3T3-E1成骨细胞活性的效果对比图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明做进一步说明：

实施例1

步骤一：牛骨胶原肽的制备

取一定量脱脂脱钙后的牛骨按料液比为1:4加入去离子水，调节溶液pH为8.0，分别按牛骨质量的1.0%和0.75%加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，60 ℃进行酶解2 h，然后通过沸水浴灭酶处理15 min，过滤透析即通过过滤棉过滤，然后经200 Da透析袋去除反应过程中因调节pH所引入的离子、通过旋转蒸发仪浓缩，旋蒸温度60℃；之后进行冷冻干燥，冷冻干燥时条件为冷肼-60℃，干燥仓10℃，后制备得到牛骨胶原肽P。

步骤二：牛骨胶原蛋白肽镁螯合物的制备

将制备得到的牛骨胶原肽以25mg/ml浓度溶解，按牛骨胶原肽与镁质量比10:1（wt%）加入氯化镁，此处镁质量按镁盐中的镁离子质量进行计算，且之后实施例中均按照此标准计算。调节溶液的pH为6.5，在60 ℃下反应0.5 h，反应结束后，与无水乙醇按体积比1:9（v/v）在室温下静置4 h，10000 rpm离心10 min，收集沉淀、通过旋转蒸发仪浓缩，旋蒸温度60℃；之后进行冷冻干燥，冷冻干燥时条件为冷肼-60℃，干燥仓10℃，制得牛骨胶原蛋白肽镁螯合物P-MgC。

实施例2

步骤一：牛骨胶原肽的制备

取一定量脱脂脱钙后的牛骨按料液比为1:4加入去离子水，调节溶液pH为8.0，分别按牛骨质量的0.75%和0.75%加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，60 ℃进行酶解2 h，然后通过沸水浴灭酶处理15 min，过滤透析即通过过滤棉过滤，然后经200 Da透析袋去除反应过程中因调节pH所引入的离子、通过旋转蒸发仪浓缩，旋蒸温度60℃；之后进行冷冻干燥，冷冻干燥时条件为冷肼-60℃，干燥仓10℃，后制备得到牛骨胶原肽P。

步骤二：牛骨胶原蛋白肽镁螯合物的制备

将制备得到的牛骨胶原肽以25mg/ml浓度溶解，按牛骨胶原肽与镁质量比15:1（wt%）加入硝酸镁，调节溶液的pH为7.0，在50℃下反应1 h，反应结束后，与无水乙醇按体积比1:9（v/v）在室温下静置4 h，10000 rpm离心10 min，收集沉淀、通过旋转蒸发仪浓缩，旋蒸温度60℃；之后进行冷冻干燥，冷冻干燥时条件为冷肼-60℃，干燥仓10℃，制得牛骨胶原蛋白肽镁螯合物P-MgN。

实施例3

步骤一：牛骨胶原肽的制备

取一定量脱脂脱钙后的牛骨按料液比为1:4加入去离子水，调节溶液pH为8.0，分别按牛骨质量的1.0 %和0.5%加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，60℃进行酶解2 h，然后通过沸水浴灭酶处理15 min，过滤透析即通过过滤棉过滤，然后经200 Da透析袋去除反应过程中因调节pH所引入的离子、通过旋转蒸发仪浓缩，旋蒸温度60℃；之后进行冷冻干燥，冷冻干燥时条件为冷肼-60℃，干燥仓10℃，后制备得到牛骨胶原肽P。

步骤二：牛骨胶原蛋白肽镁螯合物的制备

将制备得到的牛骨胶原肽以25mg/ml浓度溶解，按牛骨胶原肽与镁质量比20:1（wt%）加入硫酸镁，调节溶液的pH为7.0，在60 ℃下反应1 h，反应结束后，与无水乙醇按体积比1:9（v/v）在室温下静置4 h，10000 rpm离心10 min，收集沉淀、通过旋转蒸发仪浓缩，旋蒸温度60℃；之后进行冷冻干燥，冷冻干燥时条件为冷肼-60℃，干燥仓10℃，制得牛骨胶原蛋白肽镁螯合物P-MgS。

实施例1-3所制备的牛骨胶原肽在镁离子螯合前后对DPPH和ABTS自由基的清除率列于表1中。

表1

附图1则给出了本发明实施例1-实施例3制备得到的胶原蛋白肽镁螯合物P-MgC、P-MgN、P-MgS与牛骨胶原肽P的促成骨细胞活性的效果对比情况。

从表1和图1中可以看出，所制备的胶原蛋白肽镁螯合物的抗氧化活性和促成骨细胞活性均表现出不同程度的提高。

实施例4

步骤一：牛骨胶原肽的制备

取一定量脱脂脱钙后的牛骨按料液比为1:4加入去离子水，调节溶液pH为6.5，分别按牛骨质量的1.0 %和0.5%加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，55℃进行酶解3 h，然后通过沸水浴灭酶处理15 min，过滤透析即通过过滤棉过滤，然后经200 Da透析袋去除反应过程中因调节pH所引入的离子、通过旋转蒸发仪浓缩，旋蒸温度60℃；之后进行冷冻干燥，冷冻干燥时条件为冷肼-60℃，干燥仓10℃，后制备得到牛骨胶原肽P。

步骤二：牛骨胶原蛋白肽镁螯合物的制备

将制备得到的牛骨胶原肽以10mg/ml浓度溶解，按牛骨胶原肽与镁质量比5:1（wt%）加入硫酸镁，调节溶液的pH为6.0，在60 ℃下反应1 h，反应结束后，与无水乙醇按体积比1:5（v/v）在室温下静置4 h，10000 rpm离心10 min，收集沉淀、通过旋转蒸发仪浓缩，旋蒸温度60℃；之后进行冷冻干燥，冷冻干燥时条件为冷肼-60℃，干燥仓10℃，制得牛骨胶原蛋白肽镁螯合物。所制备的胶原蛋白肽镁螯合物的抗氧化活性和促成骨细胞活性均有较大程度的提高。

实施例5

步骤一：牛骨胶原肽的制备

取一定量脱脂脱钙后的牛骨按料液比为1:4加入去离子水，调节溶液pH为7.0，分别按牛骨质量的1.0 %和0. 75%加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，65℃进行酶解2 h，然后通过沸水浴灭酶处理15 min，过滤透析即通过过滤棉过滤，然后经200 Da透析袋去除反应过程中因调节pH所引入的离子、通过旋转蒸发仪浓缩，旋蒸温度60℃；之后进行冷冻干燥，冷冻干燥时条件为冷肼-60℃，干燥仓10℃，后制备得到牛骨胶原肽P。

步骤二：牛骨胶原蛋白肽镁螯合物的制备

将制备得到的牛骨胶原肽以30mg/ml浓度溶解，按牛骨胶原肽与镁质量比10:1（wt%）加入硫酸镁，调节溶液的pH为7.0，在60 ℃下反应1.5 h，反应结束后，与无水乙醇按体积比1:7（v/v）在室温下静置5 h，10000 rpm离心10 min，收集沉淀、通过旋转蒸发仪浓缩，旋蒸温度60℃；之后进行冷冻干燥，冷冻干燥时条件为冷肼-60℃，干燥仓10℃，制得牛骨胶原蛋白肽镁螯合物。所制备的胶原蛋白肽镁螯合物的抗氧化活性和促成骨细胞活性均有较大程度的提高。

实施例6

步骤一：牛骨胶原肽的制备

取一定量脱脂脱钙后的牛骨按料液比为1:4加入去离子水，调节溶液pH为8.0，分别按牛骨质量的0.75 %和0.75%加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，70℃进行酶解1 h，然后通过沸水浴灭酶处理15 min，过滤透析即通过过滤棉过滤，然后经200 Da透析袋去除反应过程中因调节pH所引入的离子、通过旋转蒸发仪浓缩，旋蒸温度60℃；之后进行冷冻干燥，冷冻干燥时条件为冷肼-60℃，干燥仓10℃，后制备得到牛骨胶原肽P。

步骤二：牛骨胶原蛋白肽镁螯合物的制备

将制备得到的牛骨胶原肽以50mg/ml浓度溶解，按牛骨胶原肽与镁质量比25:1（wt%）加入硫酸镁，调节溶液的pH为8.0，在60 ℃下反应2 h，反应结束后，与无水乙醇按体积比1:8（v/v）在室温下静置5 h，10000 rpm离心10 min，收集沉淀、通过旋转蒸发仪浓缩，旋蒸温度60℃；之后进行冷冻干燥，冷冻干燥时条件为冷肼-60℃，干燥仓10℃，制得牛骨胶原蛋白肽镁螯合物。所制备的胶原蛋白肽镁螯合物的抗氧化活性和促成骨细胞活性均有较大程度的提高。

本发明胶原蛋白肽镁螯合物的制备方法通过简捷、低成本的操作工艺，有效提高了胶原肽的抗氧化活性和促成骨细胞活性，避免了传统药物治疗所带来的副作用。

本发明胶原蛋白肽镁螯合物的制备方法得到的胶原蛋白肽镁螯合物能够对骨质疏松的预防与治疗起到积极效果。

本发明胶原蛋白肽镁螯合物的制备方法能够为新型肽镁螯合物产品的开发与利用提供新思路。

利用本发明胶原蛋白肽镁螯合物的制备方法制备得到的胶原蛋白肽镁螯合物如果应用到本领域相关的药物或保健品或化妆品或医疗器械中，可以起到更优异的抗氧化和促成骨细胞活性的效果。

上面结合附图和实施例对本发明进行了示例性的描述，显然本发明的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。