一种半乳糖苷酶荧光探针化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种半乳糖苷酶荧光探针化合物及其制备方法和应用。

背景技术

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)作为糖苷水解酶由4个亚基四聚体组成，该酶在食品工业、基因工程、酶工程、蛋白质工程、生物医学等方面发挥着重要作用。近年来，β-半乳糖苷酶开始广泛应用于医药领域，β-半乳糖苷酶作为一种关键酶，被用作细胞衰老和原发性卵巢癌生物标志物。例如，转移性卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR3相对于正常人类细胞表现出更高水平的β-半乳糖苷酶，对该酶的检测有助于卵巢癌的早期诊断。此外，β-半乳糖苷酶常被用作研究生物系统中基因表达和调控的报告酶，特别是对于大肠杆菌β-半乳糖苷酶，它具有很好的特征并由LacZ基因编码。

为了监测体外和在体的β-半乳糖苷酶，研究人员致力于开发实现高选择性、高灵敏度的化学和生物检测技术。目前，一些研究人员采用了不同的方法来有效检测β-半乳糖苷酶，比较常用的检测方法，如比色法、电化学、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和正电子发射断层扫描(PET)成像可用于检测β-半乳糖苷酶。然而，这些方法各有优缺点，甚至有些缺点非常明显，如MR、正电子发射断层扫描和单光子发射计算机断层扫描等方法受到成本高、操作繁琐、灵敏度低和对β-半乳糖苷酶监测准确性差的影响，不能实现对生物系统中β-半乳糖苷酶的实时原位无损检测。荧光探针通过糖苷键将半乳糖与荧光团链接，糖苷键作为β-半乳糖苷酶的识别键，当糖苷键断裂荧光团表现出荧光开启的性质用于识别β-半乳糖苷酶。因其高灵敏度、实时成像、高分辨率及无创实时监测等优势，为活细胞和生物体中的动态生物过程可视化提供了一种强大的方法，使得在生物组织中不经分离可以直接进行测定，因此深受研究者们的青睐。然而现有关于半乳糖苷酶荧光探针普遍存在制备困难、选择性低、背景信号干扰严重、荧光团光稳定性差等缺点。因此，开发具有合成制备简单、成本低廉、抗干扰能力强、具有良好响应性的半乳糖苷酶荧光探针用于生物样品中β-半乳糖苷酶的测定意义重大。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的主要目的在于提供一种具有良好的生物安全性，能够有效提高生物标志物检测灵敏性的半乳糖苷酶荧光探针化合物。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种半乳糖苷酶荧光探针化合物，具有式Ⅰ所示的结构

本发明的目的在于还提供前述半乳糖苷酶荧光探针化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)在氮气保护下，将2-羟基-1-萘甲醛和2-氨基苯硫酚在乙醇中混合，氮气保护下加热回流，反应8-12小时，原料反应完全后得到中间体；中间体与2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌(DDQ)在甲苯中加热回流，反应4-8小时，得到具有荧光发光功能的式Ⅲ化合物的粗产物；

(2)将式Ⅲ化合物与碳酸铯和无水硫酸钠加入无水乙腈中混合均匀后，再加入四乙酰基-α-D-溴代半乳糖，在氮气保护下室温反应16-20小时，原料反应完全后处理纯化得到式Ⅱ化合物；

(3)将上述式Ⅱ化合物溶于含10％(质量百分数)甲醇钠的甲醇溶液，氮气保护下室温反应0.5-1.5小时，原料反应完全后处理纯化，得到半乳糖苷酶荧光探针化合物I，其反应式为：

进一步，步骤(2)中所述处理纯化过程为：原料反应完全后减压旋干去除溶剂，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，搅拌分层，水层继续用乙酸乙酯萃取，合并有机层减压旋干去除溶剂后再经层析柱纯化。

进一步，步骤(3)中所述处理纯化过程为：原料反应完全后减压旋干去除溶剂再经层析柱纯化。

在某些具体实施例中，所述2-羟基-1-萘甲醛和2-氨基苯硫酚的摩尔比为1：1～1.1。

在某些具体实施例中，所述式Ⅲ化合物、四乙酰基-α-D-溴代半乳糖、碳酸铯和无水硫酸钠的摩尔比为1:1-1.1:2:2。

本发明的目的在于还提供了前述半乳糖苷酶荧光探针化合物或前述制备方法制得的半乳糖苷酶荧光探针化合物在制备生物成像、疾病诊断的试剂和/或探针中的应用。

本发明的目的在于还提供了前述半乳糖苷酶荧光探针化合物或前述制备方法制得的半乳糖苷酶荧光探针化合物在制备衰老、肿瘤相关疾病中的药物和/或成像探针中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

1)本发明所提供的半乳糖苷酶荧光探针化合物，其通过糖苷键遇β-半乳糖苷酶发生断键，得到荧光团式Ⅲ化合物(分子量277)，进而达到检测β-半乳糖苷酶的作用，该作用原理的发现为新型半乳糖苷酶荧光探针化合物的制备和产业化生产提供了技术路线和理论指导；且该半乳糖苷酶荧光探针化合物具有良好的生物安全性，半乳糖苷酶荧光探针在较低浓度(10μM)实现对β-半乳糖苷酶(3U/mL)响应荧光发光，荧光强度较空白溶液增强6倍，有效提高生物标志物检测灵敏性；

2)本发明所提供的半乳糖苷酶荧光探针化合物的制备方法，具有合成方法简单，反应条件温和，后处理操作方便等技术特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是本发明制备的半乳糖苷酶荧光探针化合物的合成路线图；

图2是半乳糖苷酶荧光探针化合物的核磁共振氢谱(

图3是半乳糖苷酶荧光探针化合物的质谱图谱(MS)；

图4是半乳糖苷酶荧光探针化合物的紫外吸收光谱(UV)图；

图5是半乳糖苷酶荧光探针化合物的405nm激发波长荧光光谱(PL)图；

图6是半乳糖苷酶荧光探针与β-半乳糖苷酶孵育后产物的质谱图谱(MS)；

图7是不同浓度半乳糖苷酶荧光探针化合物在PC12细胞中的荧光共聚焦成像图；

图8是不同浓度半乳糖苷酶荧光探针化合物在RAW264.7细胞中的荧光共聚焦成像图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

当以范围、优选范围、或者优选的数值上限以及下限的形式表述某个量、浓度或其它值或参数的时候，应当理解相当于具体揭示了通过将任意一对范围上限或优选数值与任意范围下限或优选数值结合起来的任何范围，而不考虑该范围是否具体揭示。除非另外指出，本文所列出的数值范围值在包括范围的端点，和该范围之内的所有整数和分数。

除非另外说明，本文中所有的百分比、份数、比值等均是按重量计。

本文的材料、方法和实施例均是示例性的，并且除非特别说明，不应理解为限制性的。

实施例1半乳糖苷酶荧光探针化合物的制备

如图1所示，本发明提供一种半乳糖苷酶荧光探针化合物的制备方法为，将式Ⅲ化合物与四乙酰基-α-D-溴代半乳糖在碳酸铯和无水硫酸钠在无水乙腈当中反应得到半乳糖苷酶荧光探针化合物，该化合物为式Ⅰ所示结构。具体为：

(1)式Ⅲ化合物的制备：氮气保护下，将2-羟基-1-萘甲醛(1mmol)和2-氨基苯硫酚(1.05mmol)在无水乙醇(10mL)中混合，加热回流，反应10小时，或用薄层色谱板监测反应进程，待原料反应完全后停止反应；待反应液温度降至室温所得席夫碱结构中间体；中间体在乙醇中重结晶，过滤收集得到淡黄色固体直接用于下步氧化反应，与氧化剂2，3-二氯-5，6-二氰对苯醌(1.5mmol)在甲苯中加热回流，反应4小时，得到式Ⅲ化合物的粗产物；浓缩得到式Ⅲ化合物的粗产物，再通过硅胶色谱柱提纯，即得式Ⅲ化合物；

(2)式Ⅱ化合物的制备：式Ⅲ化合物(1mmol)与四乙酰基-α-D-溴代半乳糖(1.05mmol)、碳酸铯(2mmol)和无水硫酸钠(2mmol)溶于无水乙腈当中，氮气保护下室温反应18小时，原料反应完全后浓缩得到化合物Ⅱ的粗产物；通过减压旋干去除溶剂，加入饱和食盐水和乙酸乙酯，搅拌分层，水层继续用乙酸乙酯萃取，合并有机层减压旋干去除溶剂,通过硅胶色谱柱提纯，用乙酸乙酯/正己烷(体积比1/10)洗脱得到式Ⅱ化合物，收率82％；

(3)半乳糖苷酶荧光探针化合物的制备：将式Ⅱ化合物(0.4mmol)与含10％甲醇钠的甲醇溶液5mL混合，氮气保护下室温反应1小时，原料反应完全后浓缩得到半乳糖苷酶的荧光探针I化合物的粗产物，通过减压旋干去除溶剂后再经硅胶色谱柱提纯，用甲醇/二氯甲烷(体积比1/10)洗脱得到式I化合物，收率20％。

本申请对制备所得的化合物进行物质鉴定，其氢核磁共振

结合上述化合物的

实施例2半乳糖苷酶荧光探针化合物的光学性质

1)半乳糖苷酶荧光探针化合物紫外可见吸收光谱性质研究

半乳糖苷酶荧光探针化合物溶于无水二甲基亚砜(DMSO)中配制成1mM标准溶液。取一定量的上述半乳糖苷酶荧光探针化合物标准溶液加入去离子水配置成10μM的水溶液备用。用紫外可见光谱仪测定半乳糖苷酶荧光探针化合物(10μM)的吸光度如图4所示；由图4可知，吸收范围主要集中在290nm-350nm之间。

2)半乳糖苷酶荧光探针化合物荧光发射光谱性质

将半乳糖苷酶荧光探针化合物溶于无水二甲基亚砜(DMSO)中配制成1mM标准溶液。取一定量的上述半乳糖苷酶荧光探针化合物标准溶液加入去离子水配置成10μM的水溶液备用。用荧光光谱仪测定405nm激发波长处半乳糖苷酶荧光探针化合物(10μM)的荧光发射光谱(如图5)；半乳糖苷酶荧光探针化合物水溶液(10μM)与β-半乳糖苷酶(3U/mL)作用，快速测定混合溶液加入β-半乳糖苷酶后405nm激发波长的荧光发射光谱如图5所示。由图5可见，在含有半乳糖苷酶荧光探针化合物的溶液中加入β-半乳糖苷酶后用荧光光谱仪测定的荧光强度达60，而未加β-半乳糖苷酶溶液荧光强度较弱(约10)。加入β-半乳糖苷酶溶液的荧光强度较空白溶液增强约6倍，表明糖苷键断裂后产生荧光响应，而未加β-半乳糖苷酶未见明显荧光发射。

实施例3半乳糖苷酶荧光探针化合物作用机制研究

将半乳糖苷酶荧光探针化合物溶于无水二甲基亚砜(DMSO)中配制成1mM标准溶液。取一定量的上述半乳糖苷酶荧光探针化合物标准溶液加入去离子水配置成10μM的水溶液备用。取一定量的半乳糖苷酶荧光探针化合物水溶液(10μM)与过β-半乳糖苷酶(3U/mL)作用，用质谱仪测定混合溶液中分子量，分析半乳糖苷酶荧光探针化合物与β-半乳糖苷酶混合后分子量变化，阐明相关作用机制如图6所示。由图6可见，在含有半乳糖苷酶荧光探针化合物(分子量439)的溶液中加入β-半乳糖苷酶后，糖苷键遇β-半乳糖苷酶发生断键，得到荧光团式Ⅲ化合物(分子量277)，表明半乳糖苷酶荧光探针化合物具有β-半乳糖苷酶响应性。

实施例4半乳糖苷酶荧光探针化合物在PC12细胞成像研究

将PC12细胞接种于无菌12孔板中(内置无菌圆形爬片)，每孔含1mL的DMEM完全培养基，在细胞孵箱中孵育12小时。分别设空白对照组，探针+β-半乳糖苷酶组。其中空白对照组孵育1小时；探针+β-半乳糖苷酶组细胞与β-半乳糖苷酶(3U/mL)孵育1小时。吸弃培养基，空白对照组加入含半乳糖苷酶荧光探针化合物(10μM)的完全培养基孵育30min；探针+β-半乳糖苷酶组细胞加入含半乳糖苷酶荧光探针化合物(5、10、20μM)的完全培养基孵育30min；取出上述各组爬片，用激光共聚焦显微成像(Ex＝405nm,Em＝500-540nm)，测试结果如图7所示。由图7可见，探针在检测外源性β-半乳糖苷酶过程中随着半乳糖苷酶荧光探针化合物浓度增加荧光信号随着探针浓度增加而增加，呈现出正相关，结果表明半乳糖苷酶荧光探针化合物能够检测PC12细胞中外源性β-半乳糖苷酶。

实施例5半乳糖苷酶荧光探针化合物在RAW264.7细胞成像研究

将RAW264.7细胞接种于无菌12孔板中(内置无菌圆形爬片)，每孔含1mL的DMEM完全培养基，在细胞孵箱中孵育12小时。分别设空白对照组，探针+β-半乳糖苷酶组。其中空白对照组孵育1小时；探针+β-半乳糖苷酶组细胞与β-半乳糖苷酶(3U/mL)孵育1小时。吸弃培养基，空白对照组加入含半乳糖苷酶荧光探针化合物(10μM)的完全培养基孵育30min；探针+β-半乳糖苷酶组细胞加入含半乳糖苷酶荧光探针化合物(5、10、20μM)的完全培养基孵育30min；取出上述各组爬片，用激光共聚焦显微成像(Ex＝405nm,Em＝500-540nm)，测试结果如图8所示。由图8可见，不同浓度半乳糖苷酶荧光探针化合物与含外源性β-半乳糖苷酶RAW264.7细胞孵育后均有显著的荧光产生，能够实现对β-半乳糖苷酶的检测。

本申请所提供的半乳糖苷酶荧光探针化合物可用于制备生物成像、疾病诊断的试剂和/或探针中；以及用于制备衰老、肿瘤相关疾病中的药物和/或成像探针中。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。