一种利用HPLC检测土壤和水中4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的方法

技术领域

本发明属于土壤和水体环境检测领域，具体涉及一种利用HPLC检测土壤和水中4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的方法。

背景技术

利伐沙班是一种高选择性，直接抑制因子Ⅹa的口服药物，其在临床治疗中应用于预防和治疗接受择期髋或膝关节置换手术的成年人的静脉血栓栓塞，预防非瓣膜性房颤患者的中风和全身性栓塞。

4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮，其分子式为C10H10N2O4，CAS号为446292-04-2。4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮常作为利伐沙班的中间体，是一种重要的有机合成原料，在工业中具有广泛的应用。但4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮具有一定的环境污染性，如果排污处理不到位，则容易对周边的土壤和水体环境产生污染。为了检测判断4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮对土壤和水体环境的影响情况，保障其生产、应用和排放安全，需要对其建立一种专属性强、有效准确的检测方法。目前，4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的相关研究较少，其定性定量检测方法未见报道。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种高效、准确的检测方法，用于土壤和水体中4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的定性和定量检测。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种利用HPLC检测土壤和水中4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的方法，包括以下步骤：

S1：土壤样品溶液的制备：采集待测土壤样品，依次进行干燥、研磨、过筛；称取10g处理好的土壤样品于250mL锥形瓶中，加入49.0mL乙腈和1.0mL甲酸至锥形瓶中，超声处理10～20min，静置后取上清液用0.22μm滤膜过滤，滤液即为待测土壤样品溶液。

S2：水体样品溶液的制备：吸取10mL待测水体样品于比色管中，加入足量NaCl，再加入10mL乙腈提取，用力振荡，待乙腈分层后，取出上清液，加入适量Na2SO4除去多余水分，静置后取上清液用0.22μm滤膜过滤，滤液即为待测水体样品溶液。

S3：标准溶液的制备：精密称取0.10016g 4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮标样于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容刻度，摇匀，配制成4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮浓度为1000.10mg/L标准储备液；吸取适量标准储备液，用乙腈稀释配制成浓度不同的标准工作溶液即得。

S4：绘制标准曲线：取适量步骤S3中的标准储备液，用乙腈稀释成系列浓度为10.0μg/L、20.0μg/L、40.0μg/L、60.0μg/L、80.0μg/L、100.0μg/L、200.0μg/L、400.0μg/L的标准工作溶液进行HPLC测定，以系列标准工作溶液的浓度为横坐标，4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。

S5：测定：吸取上述土壤样品溶液、水体样品溶液、标准工作溶液注入高效液相色谱仪中进行测定，根据外标法计算样品中4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的含量。

优选地，所述步骤S1中，干燥方式为风干或真空冷冻干燥。

优选地，所述步骤S1中，超声处理时间为15min。

HPLC的仪器操作条件为：色谱柱：Shim-pack GIST C18,250×4.6mm，5μm；进样量：20～40μL；流速：0.5～1.5mL/min；流动相：以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B，所述流动相A和流动相B的体积比为30：70；柱温：35～45℃；检测波长：290～300nm。

优选地，所述进样量为25～35μL。

进一步优选地，所述进样量为30μL。

优选地，所述流速为0.8～1.2mL/min。

进一步优选地，所述流速为1.0mL/min。

优选地，所述柱温为40℃。

优选地，所述检测波长为296nm。

本发明具有以下优点：

1、按本发明方法学验证试验结果表明：4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的进样浓度在10.0μg/L～400.0μg/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为y＝62.33x-24.72，线性相关系数R

2、本发明检出限为6.42μg/L，定量限为17.60μg/L，灵敏度高，能很好地检测出土壤和水体中4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的含量。

3、本发明克服了现有4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮检测技术领域的空白，提供了一种可靠、有效的4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的定性定量检测方法，本发明为4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮生产、应用中的质量控制提供了技术参考，本发明的方法对4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮排放地的土壤和水体环境保护具有重要意义。

附图说明

图1为4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的校正曲线图；

图2为4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮标线典型图谱(40.0μg/L)；

图3为4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮重复性典型图谱(80.0μg/L)；

图4为4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮检出限典型图谱(10.0μg/L)；

图5为4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮定量限典型图谱(20.0μg/L)；

图6为土壤中4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮添加回收率典型图谱(空白对照)；

图7为土壤中4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮添加回收率典型图谱(10.0mg/L)；

图8为土壤中4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮添加回收率典型图谱(100.0mg/L)；

图9为水中4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮添加回收率典型图谱(空白对照)；

图10为水中4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮添加回收率典型图谱(10.0mg/L)；

图11为水中4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮添加回收率典型图谱(100.0mg/L)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本实施例所用的原料和设备均为本技术领域常规市购的原料和设备。

以下各实施例、实验例中涉及的仪器以及试剂包括但不限于：

1、主要仪器设备

(1)高效液相色谱仪：岛津LC2030C 3D Plus，PDA检测器；

(2)电子天平：梅特勒-托利多(中国)有限公司，XSE205DU；

(3)电子天平：梅特勒-托利多(中国)有限公司，MS1602S/01；

(4)超声仪、容量瓶、移液器等常用仪器。

2、主要试剂

(1)4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮标样，纯度为99.85％；

(2)磷酸：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

(3)乙腈：色谱纯，ANPEL Inc.；

(4)氯化钠：分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；

(5)甲酸：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；

(5)无水硫酸钠：分析纯，成都市科龙化工试剂厂。

3、试验样品

3.1待测土壤样品

本试验使用土壤是由农业农村部购买的浙江省绍兴市水稻土T2020002。土壤经风干后过1.0mm筛网，室温避光保存备用。

待测土壤样品的制备步骤为：称取10g上述水稻土于250mL锥形瓶中，向其中加入0.1mL经乙腈稀释配置成浓度为10.0mg/L的4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮标准工作溶液，旋涡混匀，即得浓度为0.1mg/kg的待测土壤样品。

3.2待测水体样品

本试验使用UP水为环境水体代表，UP水来自本实验室自来水，经超纯水机制备后取用，UP水的电阻率为18.2MΩ×cm。

待测水体样品的制备步骤为：吸取0.2mL经乙腈稀释配置成浓度为10.0mg/L的4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮标准工作溶液于100mL容量瓶中，用UP水定容，即得浓度为20μg/L的待测水体样品。

实施例1：

S1：土壤样品溶液的制备：采集待测土壤样品，依次进行风干、研磨、过筛；称取10g处理好的土壤样品于250mL锥形瓶中，加入49.0mL乙腈和1.0mL甲酸至锥形瓶中，超声处理15min，静置后取上清液用0.22μm滤膜过滤，滤液即为待测土壤样品溶液；

S2：水体样品溶液的制备：吸取10mL待测水体样品于比色管中，加入足量NaCl，再加入10mL乙腈提取，用力振荡，待乙腈分层后，取出上清液，加入适量Na

S3：标准溶液的制备：精密称取0.10016g 4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮标样于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容刻度，摇匀，配制成4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮浓度为1000.10mg/L标准储备液；吸取适量标准储备液，用乙腈稀释配制成浓度不同的标准工作溶液即得；

S4：绘制标准曲线：取适量步骤S3中的标准储备液，用乙腈稀释成系列浓度为10.0μg/L、20.0μg/L、40.0μg/L、60.0μg/L、80.0μg/L、100.0μg/L、200.0μg/L、400.0μg/L的标准工作溶液进行HPLC测定，以系列标准工作溶液的浓度为横坐标，4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；

S5：测定：吸取上述土壤样品溶液、水体样品溶液、标准工作溶液注入高效液相色谱仪中进行测定，根据外标法计算样品中4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的含量。

HPLC的仪器操作条件为：

色谱柱：Shim-pack GIST C18,250×4.6mm，5μm；

进样量：30μL；

流速：1.0mL/min；

流动相：以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B，所述流动相A和流动相B的体积比为30：70；

柱温：40℃；

检测波长：296nm。

实施例2：

S1：土壤样品溶液的制备：采集待测土壤样品，依次进行真空冷冻干燥、研磨、过筛；称取10g处理好的土壤样品于250mL锥形瓶中，加入49.0mL乙腈和1.0mL甲酸至锥形瓶中，超声处理10min，静置后取上清液用0.22μm滤膜过滤，滤液即为待测土壤样品溶液；

S2：水体样品溶液的制备：吸取10mL待测水体样品于比色管中，加入足量NaCl，再加入10mL乙腈提取，用力振荡，待乙腈分层后，取出上清液，加入适量Na

S3：标准溶液的制备：精密称取0.10016g 4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮标样于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容刻度，摇匀，配制成4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮浓度为1000.10mg/L标准储备液；吸取适量标准储备液，用乙腈稀释配制成浓度不同的标准工作溶液即得；

S4：绘制标准曲线：取适量步骤S3中的标准储备液，用乙腈稀释成系列浓度为10.0μg/L、20.0μg/L、40.0μg/L、60.0μg/L、80.0μg/L、100.0μg/L、200.0μg/L、400.0μg/L的标准工作溶液进行HPLC测定，以系列标准工作溶液的浓度为横坐标，4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；

S5：测定：吸取上述土壤样品溶液、水体样品溶液、标准工作溶液注入高效液相色谱仪中进行测定，根据外标法计算样品中4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的含量。

HPLC的仪器操作条件为：

色谱柱：Shim-pack GIST C18,250×4.6mm，5μm；

进样量：20μL；

流速：0.5mL/min；

流动相：以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B，所述流动相A和流动相B的体积比为30：70；

柱温：35℃；

检测波长：290nm。

实施例3：

S1：土壤样品溶液的制备：采集待测土壤样品，依次进行风干、研磨、过筛；称取10g处理好的土壤样品于250mL锥形瓶中，加入49.0mL乙腈和1.0mL甲酸至锥形瓶中，超声处理12min，静置后取上清液用0.22μm滤膜过滤，滤液即为待测土壤样品溶液；

S2：水体样品溶液的制备：吸取10mL待测水体样品于比色管中，加入足量NaCl，再加入10mL乙腈提取，用力振荡，待乙腈分层后，取出上清液，加入适量Na

S3：标准溶液的制备：精密称取0.10016g 4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮标样于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容刻度，摇匀，配制成4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮浓度为1000.10mg/L标准储备液；吸取适量标准储备液，用乙腈稀释配制成浓度不同的标准工作溶液即得；

S4：绘制标准曲线：取适量步骤S3中的标准储备液，用乙腈稀释成系列浓度为10.0μg/L、20.0μg/L、40.0μg/L、60.0μg/L、80.0μg/L、100.0μg/L、200.0μg/L、400.0μg/L的标准工作溶液进行HPLC测定，以系列标准工作溶液的浓度为横坐标，4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；

S5：测定：吸取上述土壤样品溶液、水体样品溶液、标准工作溶液注入高效液相色谱仪中进行测定，根据外标法计算样品中4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的含量。

HPLC的仪器操作条件为：

色谱柱：Shim-pack GIST C18,250×4.6mm，5μm；

进样量：25μL；

流速：0.8mL/min；

流动相：以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B，所述流动相A和流动相B的体积比为30：70；

柱温：38℃；

检测波长：294nm。

实施例4：

S1：土壤样品溶液的制备：采集待测土壤样品，依次进行风干、研磨、过筛；称取10g处理好的土壤样品于250mL锥形瓶中，加入49.0mL乙腈和1.0mL甲酸至锥形瓶中，超声处理18min，静置后取上清液用0.22μm滤膜过滤，滤液即为待测土壤样品溶液；

S2：水体样品溶液的制备：吸取10mL待测水体样品于比色管中，加入足量NaCl，再加入10mL乙腈提取，用力振荡，待乙腈分层后，取出上清液，加入适量Na

S3：标准溶液的制备：精密称取0.10016g 4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮标样于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容刻度，摇匀，配制成4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮浓度为1000.10mg/L标准储备液；吸取适量标准储备液，用乙腈稀释配制成浓度不同的标准工作溶液即得；

S4：绘制标准曲线：取适量步骤S3中的标准储备液，用乙腈稀释成系列浓度为10.0μg/L、20.0μg/L、40.0μg/L、60.0μg/L、80.0μg/L、100.0μg/L、200.0μg/L、400.0μg/L的标准工作溶液进行HPLC测定，以系列标准工作溶液的浓度为横坐标，4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；

S5：测定：吸取上述土壤样品溶液、水体样品溶液、标准工作溶液注入高效液相色谱仪中进行测定，根据外标法计算样品中4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的含量。

HPLC的仪器操作条件为：

色谱柱：Shim-pack GIST C18,250×4.6mm，5μm；

进样量：35μL；

流速：1.2mL/min；

流动相：以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B，所述流动相A和流动相B的体积比为30：70；

柱温：42℃；

检测波长：298nm。

实施例5：

S1：土壤样品溶液的制备：采集待测土壤样品，依次进行风干、研磨、过筛；称取10g处理好的土壤样品于250mL锥形瓶中，加入49.0mL乙腈和1.0mL甲酸至锥形瓶中，超声处理20min，静置后取上清液用0.22μm滤膜过滤，滤液即为待测土壤样品溶液；

S2：水体样品溶液的制备：吸取10mL待测水体样品于比色管中，加入足量NaCl，再加入10mL乙腈提取，用力振荡，待乙腈分层后，取出上清液，加入适量Na

S3：标准溶液的制备：精密称取0.10016g 4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮标样于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容刻度，摇匀，配制成4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮浓度为1000.10mg/L标准储备液；吸取适量标准储备液，用乙腈稀释配制成浓度不同的标准工作溶液即得；

S4：绘制标准曲线：取适量步骤S3中的标准储备液，用乙腈稀释成系列浓度为10.0μg/L、20.0μg/L、40.0μg/L、60.0μg/L、80.0μg/L、100.0μg/L、200.0μg/L、400.0μg/L的标准工作溶液进行HPLC测定，以系列标准工作溶液的浓度为横坐标，4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；

S5：测定：吸取上述土壤样品溶液、水体样品溶液、标准工作溶液注入高效液相色谱仪中进行测定，根据外标法计算样品中4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的含量。

HPLC的仪器操作条件为：

色谱柱：Shim-pack GIST C18,250×4.6mm，5μm；

进样量：40μL；

流速：1.5mL/min；

流动相：以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B，所述流动相A和流动相B的体积比为30：70；

柱温：45℃；

检测波长：300nm。

实验例：

为证明本发明的科学性与合理性，发明人开展了大量实验研究，部分摘录如下：

1、色谱条件考察试验

以实施例1-5中制备的待测土壤样品溶液、水体样品溶液和标准工作溶液进行高效液相色谱测定，通过对色谱条件的不同进样量、流速、柱温、波长等进行考察，测定结果不受影响的程度。

1.1进样量的考察

色谱条件如下：

色谱柱：Shim-pack GIST C18,250×4.6mm，5μm；进样量：20μL、25μL、30μL、35μL、40μL；流速：1.0mL/min；流动相：以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B，所述流动相A和流动相B的体积比为30：70；柱温：40℃；检测波长：296nm。

结果显示：本测试方法进样量在20～40μL之间变化对测定结果影响不大，分离度均能达到检测效果，进样量为30μL时，测定所得色谱峰峰形最好，故为优选进样量。

1.2流速的考察

色谱条件如下：

色谱柱：Shim-pack GIST C18,250×4.6mm，5μm；进样量：30μL；流速：0.5mL/min、0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min、1.5mL/min；流动相：以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B，所述流动相A和流动相B的体积比为30：70；柱温：40℃；检测波长：296nm。

结果显示：本测试方法流速在0.5～1.5mL/min之间变化对测定结果影响不大，分离度均能达到检测效果，流速为1.0mL/min时，分离效果最好，且出峰时间短，故为优选流速。

1.3柱温的考察

色谱条件如下：

色谱柱：Shim-pack GIST C18,250×4.6mm，5μm；进样量：30μL；流速：1.0mL/min；流动相：以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B，所述流动相A和流动相B的体积比为30：70；柱温：35℃、38℃、40℃、42℃、45℃；检测波长：296nm。

结果显示：本测试方法柱温在35～45℃之间变化对测定结果影响不大，分离度均能达到检测效果，柱温为30℃时，测定所得色谱峰分离度最好，且出峰时间短，故为优选柱温。

1.4检测波长的考察

色谱条件如下：

色谱柱：Shim-pack GIST C18,250×4.6mm，5μm；进样量：30μL；流速：1.0mL/min；流动相：以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B，所述流动相A和流动相B的体积比为30：70；柱温：40℃；检测波长：290nm、294nm、296nm、298nm、300nm。

结果显示：本测试方法检测波长在290～300nm之间变化对测定结果影响不大，分离度均能达到检测效果，检测波长为296nm时，测定所得色谱峰峰形最好，分离度最佳，故为优选检测波长。

2、方法学验证试验

2.1专属性试验

用本发明实施例1的HPLC分析方法测定水体空白样品、水体添加回收率样品、土壤空白样品、土壤添加回收率样品，比较水体和土壤空白样品和添加回收率样品的图谱，4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮在8.4min出峰，且空白样品在该时间点无干扰峰，结果表明该方法对4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的专属性好。

2.1线性试验

用本发明实施例1的HPLC分析方法测定实施例1中配制的系列浓度为10.0μg/L、20.0μg/L、40.0μg/L、60.0μg/L、80.0μg/L、100.0μg/L、200.0μg/L、400.0μg/L的标准工作溶液，分析结果见表1。当4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮浓度在10.0μg/L～400.0μg/L范围时，y与x之间呈线性关系，线性回归方程y＝62.33x-24.72，线性相关系数R

表1：线性试验结果

2.3重复性试验

选择实施例1中浓度为80.0μg/L的4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮标准工作溶液用于方法重复性试验，重复进样6次。分析结果见表2、图3，目标峰的RSD

表：2：重复性试验结果

2.4检出限和定量限

选择实施例1中浓度为10.0μg/L的4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮标准工作溶液用于检出限试验，20.0μg/L的4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮标准工作溶液用于定量限试验，分别重复进样3次，由S/N计算出LOD和LOQ。分析结果见表3、图4、图5，本方法对4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮的LOD为6.42μg/L，LOQ为17.60μg/L。

表3：检出限和定量限

2.5土壤和水体样品添加回收率

2.5.1土壤样品添加回收率

分别称取10g水稻土于两个250mL锥形瓶中，分别加入0.1mL浓度分别为10.0mg/L、100.0mg/L的4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮标准工作溶液，旋涡混匀，制成两个浓度分别为0.10mg/kg和1.0mg/kg的土壤回收率样品。加入49.0mL乙腈和1.0mL甲酸至上述锥形瓶中，超声15min，静置后取上清液用0.22μm滤膜，滤液备用。每个浓度样品均平行制作5份，同时做土壤空白试验。按本发明的HPLC操作条件测定4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮浓度。

分析结果详见表4、图6、图7、图8，2种不同浓度的4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮在土壤中的平均添加回收率分别为104.9％和98.2％，回收率相对标准偏差分别为3.0％和1.1％。

表4：土壤中添加回收率结果

2.5.2水体样品添加回收率

分别取0.2mL、1.0mL浓度为10mg/L、100mg/L的标准工作液于100mL容量瓶中，用UP水定容，分别得到20μg/L和1.0mg/L的水体回收率样品。取20μg/L的水体回收率样品10mL于比色管中，加入足量NaCl，再加入10mL乙腈提取，用力振荡，乙腈分层后，取出上清液加入适量Na

分析结果详见表5、图9、图10、图11，2种不同浓度的4-(4-硝基苯基)-3-吗啉酮在水中的平均添加回收率分别为80.3％和98.4％，回收率相对标准偏差分别为8.6％和1.6％。

表5：水中添加回收率结果

上述仅为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例、实验例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。