一种人参组培不定根的发酵培养基及其应用

技术领域

本说明书涉及生物领域，特别涉及人参组培不定根工业化发酵培养基及发酵工艺。

背景技术

人参(panax ginseng c.a.mey.)是五加科人参属植物，分布于中国、日本、韩国，其根茎是名贵的中药材，号称“百草之王”。人参味甘、微苦，微温，具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智等功效，多用于体虚欲脱，脾虚食少，肺虚喘咳，津伤口渴，惊悸失眠等。人参皂苷是人参主要的活性成分，有抗疲劳、延缓衰老、调节中枢神经系统、提高机体免疫力、改善心脑血管供血不足、抑制肿瘤细胞生长等功效。近年来，人参被广泛地用在各类化妆品、保健品、饮品中，人参的市场前景非常广阔。但是野生人参中皂苷含量低，稀有人参皂苷的来源极为有限，限制了其在功能性食品和药物中的应用。

木本植物用培养基(改良型WPM)是1981年由Lloyd和McCown为山月桂茎尖培养专业设计，根据WPM培养基改良而来，相对WPM培养基而言，使用了硫酸钾替换了硝酸钾，硝酸铵的含量也降低到了WPM培养基的1/4，氮盐也主要以硝酸钙的形式供应。

硝酸盐，常见的如硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠等，均列入我国《易制爆危险化学品名录(2011年版)》。近几年来国家加强了对危险化学品的管控力度，在未持有相关证件的情况下不能购买硝酸盐，使用硝酸盐的企业也要求具备相关的存储设施。硝酸盐价格便宜利润低，大多数试剂公司不愿意为了低利润办理繁琐的证件。

在硝酸铵运输、储存、配置使用过程中，存在易爆性，有重大生产安全隐患，为满足植物组织培养需要，一些生产厂家推出了成品改良型WPM培养基，有固体粉末改良型WPM培养基和液体改良型WPM培养基。固体粉末改良型WPM培养基价格高，不适用于工业化繁育。而购买成品液体改良型WPM培养基问题较多。一是运输难度加大，增加生产成本；二是储存期限短，由于液体改良型WPM培养基含有钙离子，易产生沉淀，同时含有的有机质易酸化，这两种情况均会使得培养基的成分发生变化。因此，探索一种替代硝酸铵和硝酸钾的工业化组织培养的培养基原料势在必行。

发明内容

有鉴于此，本申请提供了一种新的发酵培养基，用于人参组培不定根的发酵培养。

本申请公开了一种人参组培不定根，其特征在于，所述人参组培不定根中人参皂苷Rd的质量百分比大于0.1％。

本申请还提供了一种用于培养上述的人参组培不定根的培养基，所述培养基除水外还包括盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、甘氨酸、肌醇、硼酸、一水硫酸锰、磷酸二氢钾、EDTA铁钠、七水硫酸镁、五水硫酸铜、七水硫酸锌、硫酸钾、二水钼酸钠、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵钙。

本申请还提供了上述的培养基用于人参组培不定根组培的用途。

本申请还提供了上述人参组培不定根的组培方法，包括以下步骤：a.将人参组培不定根种子培养；b.采用如权利要求3-6任一所述的培养基发酵培养，收获人参组培不定根。

本申请中的实施例带来的有益效果包括但不限于：(1)在1台发酵罐内可实现多级发酵，减少因转料可出现染菌风险、管道清洗或堵塞等风险，同时可减少种子罐的投资费用；(2)在发酵初期添加或在收料前10～15天通过无菌管路进行添加蒙古栎提取物，有利于提高人参组培不定根总皂苷含量和单体皂苷含量和组成丰富度。

附图说明

本申请将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，其中：

图1为根据本申请一些实施例所示的各实验组人参组培不定根生长状态图；

图2为根据本申请一些实施例所示的各实验组对比图液相分析对比图；

图3为根据本申请一些实施例所示的对照组中人参皂苷的液相分析图；

图4为根据本申请一些实施例所示的实验1组中人参皂苷的液相分析图；

图5为根据本申请一些实施例所示的实验2组中人参皂苷的液相分析图；

图6为根据本申请一些实施例所示的实验3组中人参皂苷的液相分析图；

图7为根据本申请一些实施例所示的实验4组中人参皂苷的液相分析图；

图8为根据本申请一些实施例所示的实验5组中人参皂苷的液相分析图；

图9为根据本申请一些实施例所示的实验6组中人参皂苷的液相分析图；

图10为根据本申请一些实施例所示的实验7组中人参皂苷的液相分析图；

图11为根据本申请一些实施例所示的实验8组中人参皂苷的液相分析图；

图12为根据本申请一些实施例所示的实验9组中人参皂苷的液相分析图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标号代表相同结构或操作。

如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。

本说明书中使用了流程图用来说明根据本说明书的实施例的系统所执行的操作。应当理解的是，前面或后面操作不一定按照顺序来精确地执行。相反，可以按照倒序或同时处理各个步骤。同时，也可以将其他操作添加到这些过程中，或从这些过程移除某一步或数步操作。

不定根(adventitious root)是植物的茎或叶上所发生的根。在组织培养中，由愈伤组织长出的根，也称不定根。人参组培不定根是人参茎上长出的须根，拥有很强再生能力，人参组培不定根主要成分主要是人参皂苷，人参皂苷按其皂苷元结构不同可分为3种类型：齐墩果酸型皂苷如Ro，属于齐墩果烷型五环三萜皂苷，普遍存在于含有三萜皂苷的植物中；原人参二醇型皂苷如Rb1、Rb2、Rd；原人参三醇型皂苷如Re、Rg1、Rg2等。后两类均属于达玛烷型的四环三萜皂苷，是人参的主要活性成分之一。其中原人参二醇型皂苷Rd作为人参皂苷主要活性单体之一，具有保护心血管系统、保护神经系统、抗衰老、抗肿瘤等多种药理作用。

本申请提供了一种人参组培不定根，所述人参组培不定根中人参皂苷Rd的质量百分比大于0.1％。人参皂苷Rd(ginsenoside Rd，GSRd)是人参皂苷的主要活性单体之一，属于达玛烷型人参皂苷中的二醇型。GSRd在人参属植物中的含量较低，但却具有较强的生物活性，其药理作用受到国内外学者的广泛关注。研究表明，GSRd能够保护心血管及肾脏功能,发挥抗肿瘤、调节免疫等多种药理作用，对于中枢神经系统亦显示出良好的神经保护效应。

在一些实施例中，所述人参组培不定根中总皂苷的质量百分比可以为2.7％～6.1％。在一些实施例中，人参组培不定根中总皂苷的质量百分比可以为3.0％～5.5％。在一些实施例中，人参组培不定根中总皂苷的质量百分比可以为3.5％～5.0％。在一些实施例中，人参组培不定根中总皂苷的质量百分比可以为4.0％～4.5％。

在一些实施例中，人参组培不定根中人参皂苷的质量百分比可以为2.4％～5.5％。例如，人参组培不定根中人参皂苷的质量百分比可以为3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。

在一些实施例中，所述人参组培不定根中人参皂苷Rd的质量百分比可以为0.1％～1.0％。在一些实施例中，所述人参组培不定根中人参皂苷Rd的质量百分比可以为0.2％～0.9％。在一些实施例中，所述人参组培不定根中人参皂苷Rd的质量百分比可以为0.3％～0.8％。在一些实施例中，所述人参组培不定根中人参皂苷Rd的质量百分比可以为0.4％～0.7％。一些实施例中，所述人参组培不定根中人参皂苷Rd的质量百分比可以为0.5％～0.6％。在一些实施例中，优选的，所述人参组培不定根中人参皂苷Rd的质量百分比可以为0.18％～1.0％。

本申请还提供一种用于培养上述的人参组培不定根的培养基，所述培养基除水外还包括盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、甘氨酸、肌醇、硼酸、一水硫酸锰、磷酸二氢钾、EDTA铁钠、七水硫酸镁、五水硫酸铜、七水硫酸锌、硫酸钾、二水钼酸钠、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵钙。

在一些实施例中，所述培养基中，盐酸硫胺素0.00005g/L～0.00015g/L、盐酸吡哆醇0.00045g/L～0.00055g/L、烟酸0.00045g/L～0.00055g/L、甘氨酸0.0015g/L～0.0025g/L、肌醇0.05g/L～0.15g/L、硼酸0.0057g/L～0.0067g/L、一水硫酸锰0.0164g/L～0.0174g/L、磷酸二氢钾0.15g/L～0.19g/L、EDTA铁钠0.0362g/L～0.0372g/L、七水硫酸镁0.3～0.5g/L、五水硫酸铜0.0001g/L～0.0004g/L、七水硫酸锌0.006g/L～0.01g/L、硫酸钾0.94g/L～1.04g/L、二水钼酸钠0.0001g/L～0.0003g/L、硫酸铵0.1g/L～0.5g/L、氯化铵0.1g/L～0.5g/L、硝酸铵钙0.25g/L～3.00g/L。

培养基中氮素来源于硝酸钾和硝酸铵。硝酸钾提供硝态氮，硝酸铵同时提供铵态氮和硝态氮。铵态氮是还原态，为阳离子；硝态氮是氧化氮，为阴离子。作物对于铵态氮和硝态氮的偏好不同，但是二者同作为植物氮源的供给者各有职能，互不取代。在土壤中，铵根离子除可以直接被植物吸收外，还可以通过亚硝化细菌可将土壤中的铵态氮转化为亚硝态氮，之后通过硝化细菌将亚硝态氮转化为硝态氮，可以满足植物生长的氮素需求。但是在组织培养中，不存在硝化细菌和亚硝化细菌，必须同时提供铵态氮和硝态氮，否则，难以维持植物组织培养的营养需求。

硝酸铵钙，是一种植物肥料，为白色圆形造粒，可溶于水，是一种含氮和速效钙的新型高效复合肥料，其肥效快，有快速补充氮素的特点，可同时满足铵态氮和硝态氮的需求。硝酸铵钙市场上易购买，纯度可达99％，能够满足培养基配制的需求。在一些实施例中，所述硝酸铵钙浓度可以为0.25～3g/L。例如，所述硝酸铵钙浓度可以为0.25g/L、0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，优选的，所述硝酸铵钙浓度可以为2g/L。

在一些实施例中，所述氯化铵的浓度可以为0.1～0.5g/L。例如，所述氯化铵的浓度可以为0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，优选的，所述氯化铵的浓度可以为0.2g/L。

在一些实施例中，所述发酵培养基中硫酸铵的浓度可以为0.1～0.5g/L。例如，所述发酵培养基中硫酸铵的浓度可以为0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，优选的，所述发酵培养基中硫酸铵的浓度可以为0.3g/L。

在一些实施例中，所述培养基还可以包括蔗糖和3-吲哚丁酸。其中蔗糖为培养基提供碳源和能量来源。3-吲哚丁酸是一种常用广谱性的植物生长调节剂，可以促进细胞分裂，诱导形成不定根，表现为根多、根直、根粗、根毛多。在一些实施例中，所述培养基中，所述蔗糖浓度可以为30g/L。在一些实施例中，所述培养基中，所述3-吲哚丁酸浓度可以为3mg/L～7mg/L。在一些实施例中，所述培养基中，优选的，所述3-吲哚丁酸的浓度可以为5mg/L。

在一些实施例中，所述培养基还可以包括茉莉酸甲酯、蒙古栎粉末和/或蒙古栎提取物。

在一些实施例中，所述培养基中，所述蒙古栎粉末浓度可以为0.05～0.5g/L。例如，所述蒙古栎粉末浓度可以为0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.35g/L、0.4g/L、0.45g/L、0.5g/L。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，所述蒙古栎粉末可以通过粉粹、干燥蒙古栎果实获得。

在一些实施例中，所述培养基中，所述蒙古栎提取物以干物质计，浓度可以为0.03～0.1g/L。例如，所述蒙古栎提取物浓度可以为0.05g/L、0.06g/L、0.07g/L、0.08g/L、0.09g/L。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，所述培养基中，所述蒙古栎提取物以干物质计，优选浓度可以为0.06g/L。在一些实施例中，所述培养基中，所述蒙古栎提取物中，以干物质计，可以含质量百分比20～50％多糖和4～20％单宁。

本申请中的蒙古栎提取物，是蒙古栎粉末经提取溶剂提取制得的提取物。在一些实施例中，所述提取溶剂可以是水、醇或其组合。在一些实施例中，所述醇可以是甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、叔丁醇、正戊醇、2-戊醇、叔戊醇、正己醇、2-己醇、3-己醇、丙二醇、丙三醇、丁二醇、丁三醇、丁四醇、戊二醇、戊三醇、季戊四醇、己二醇、己三醇、己四醇等。在一些实施例中，优选的，所述提取溶剂可以是水、乙醇或其组合(即乙醇水溶液)。本申请提取所用的乙醇水溶液的混合比例没有特别限制，优选3～7:7～3的混合比，进一步优选4～6:6～4的混合比。

本申请中的蒙古栎提取物用水、乙醇或其组合进行提取时，要进行加热提取，加热温度没有特别的限制，优选加热温度为70～100℃，更优选80～100℃。加热时间也没有特别限制，优选为0.5～2小时，更优选为1小时。

在一些实施例中，蒙古栎提取物的起始植物材料可以是新鲜的、冷冻的或干燥的蒙古栎材料。在一些实施例中，蒙古栎提取物可以呈例如干粉的形式，诸如由树的不同部分研磨的干粉。在一些实施例中，所述蒙古栎提取物可以是干燥品。在一些实施例中，所述蒙古栎提取物可以呈液体或干燥的浓缩固体形式。

如无特别说明，本文所用的蒙古栎提取物可以通过任何常规方法获得，例如水提或醇提。本申请的蒙古栎提取物可来源于蒙古栎的不同部分，包括树皮(树干、树枝或根)、根、芽、树枝、幼芽、叶、果实、或它们的组合。在一些实施例中，优选的，所述蒙古栎提取物可以来源于蒙古栎果实。

具体的，蒙古栎提取物可以通过以下方法制得：取蒙古栎粉末，加入纯化水，料液比为1：25，浸泡1小时，在100℃回流提取1小时，提取液浓缩后冷却静沉，收集上清液，干燥，制得蒙古栎提取物。

具体的，蒙古栎提取物还可以通过以下方法制得：取蒙古栎粉末，用40％乙醇进行提取，加入40％乙醇溶液，液比为1：25，浸泡1小时后，在83℃下回流提取1小时，提取液浓缩后冷却静沉，收集上清液，干燥，制得蒙古栎提取物2。

蒙古栎(学名：Quercus mongolica Fisch.ex Ledeb.)属壳斗科、栎属，落叶乔木，高达30米，树皮灰褐色，深纵裂。树冠卵圆形。单叶互生、叶片倒卵形，叶波状齿缘，叶表面深绿色，背面淡绿色，花单性，雌雄同株，坚果卵形或椭圆形，种子具肉质子叶。蒙古栎，又名柞树、柞栎、橡子树，蒙古栎的果实称作橡子。橡子外表硬壳，棕红色，内仁如花生仁，淀粉含量达60％左右，既可食又可作纺织工业浆纱用的原料。橡子号称是比水稻、小麦“资格”还要老的粮食。人们食用橡子的历史可以追溯到公元前600多年，在饥荒之年，人们把橡子碾碎，制成橡子面充饥。研究表明，橡子仁含蛋白质8.52％、脂肪4.56％、粗纤维9.73％，还含有18种氨基酸和丰富的矿物质元素以及糖类等，其营养价值和热值均与玉米、高粱相近，是一种有很高开发利用价值的野生植物资源。

诱导子(elicitor)是植物抗病生理过程中诱发植物产生植物抗毒素和引起植物过敏反应(hypersensitive reaction，HR，亦称抗性反应或自身防御反应self-defensereaction)的因子，包括侵染植物的微生物及植物细胞内的分子。

诱导子在植物与微生物的相互作用中，能快速、高度专一性地诱导特定基因的表达。近年来，愈来愈多的研究证明在植物次生代谢过程中，某些生物诱导子(如酵母提取物、真菌菌丝体和植物细胞壁片断等)或非生物诱导子(如紫外线、pH值、重金属盐等)能作为一种特定的生化信号，快速、专一和有选择地诱导特定基因的表达，从而调节植物细胞次生代谢产物的合成。针对不同药用植物，不同次级代谢产物，不同诱导子的效果则不尽相同。非生物诱导子虽对次级代谢产物积累有较好的效果，但也常常会使药用植物的生物量减少。

茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate，MeJA)是亚麻酸衍生的具有环戊酮基团的化合物。目前，茉莉酸甲酯被认为是高等植物体内的内源生长调节物质，具有广泛的生理功能。本申请研究了茉莉酸甲酯对人参组培不定根中皂苷表达的调控作用，结果表明茉莉酸甲酯调控后人参组培不定根中人参皂苷Rd的表达量达到1.82mg/g～9.51mg/g，且人参组培不定根培养物在一定茉莉酸甲酯添加量范围内培养时，人参皂苷表达量会随着茉莉酸甲酯添加量升高而提高，但超过适宜浓度后人参皂苷表达量不再提高，生长量也会受到限制。为进一步提高人参组培不定根人参皂苷表达量，本申请开展了双诱导子结合的方式进行调控。采用可食用的蒙古栎果实进行简单的提取，获得的蒙古栎提取物与茉莉酸甲酯进行组合，筛选适宜配比和添加方式，诱导人参组培不定根次生代谢产物皂苷的表达。目前该研究内容未见同类报道。

在一些实施例中，所述培养基中，所述茉莉酸甲酯浓度可以为1～5质量ppm。例如，所述茉莉酸甲酯浓度可以为1质量ppm、2质量ppm、3质量ppm、4质量ppm、5质量ppm。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，所述培养基中，优选的，所述茉莉酸甲酯浓度可以为2质量ppm。“ppm”是指基于培养基的总质量计的百万分之质量份数。

在一些实施例中，所述培养基还可以包括微量元素。在一些实施例中，微量元素可以包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。微量元素在作物体内含量虽少，但它对植物的生长发育起着至关重要的作用，是植物体内酶或辅酶的组成部分，具有很强的专一性，是作物生长发育不可缺少的和不可相互代替的。因此当植物缺乏任何一种微量元素的时候，生长发育都会受到抑制，导致减产和品质下降。当植物在微量元素充足的情况下，生理机能就会十分旺盛，这有利于作物对大量元素的吸收利用，还可改善细胞原生质的胶体化学性质，从而使原生质的浓度增加，增强作物对不良环境的抗逆性。

在一些实施例中，所述培养基的pH值可以为4.80～6.8。例如，所述培养基的pH值可以为4.8、5、5.5、5.8、6、6.5、6.8。还包括以上述端值的组合为特征的任意范围，此处不再赘述。在一些实施例中，优选的，所述培养基的pH值可以为5.8。

本申请还提供上述的培养基用于人参组培不定根组培的用途。

本申请还提供上述人参组培不定根的组培方法，包括以下步骤：a.将人参组培不定根种子培养；b.采用上述的培养基发酵培养，收获人参组培不定根。

在一些实施例中，步骤a中所述种子培养用培养基可以为添加有蔗糖和吲哚丁酸的改良wpm培养基。在一些实施例中，种子培养用培养基中，所述蔗糖的浓度可以为30g/L。在一些实施例中，种子培养用培养基中，所述吲哚丁酸的浓度可以为3mg/L～7mg/L。在一些实施例中，种子培养用培养基中，优选的，所述吲哚丁酸的浓度可以为5mg/L。

在一些实施例中，步骤a中所述种子培养用培养基可以为不添加硝酸铵、四水硝酸钙和氯化钙的改良wpm培养基。在一些实施例中，步骤a中改良wpm培养基可以包括盐酸硫胺素0.0001g/L、盐酸吡哆醇0.0005g/L、烟酸0.0005g/L、甘氨酸0.002g/L、肌醇0.1g/L、二水钼酸钠0.00025g/L、五水硫酸铜0.00025g/L、硼酸0.0062g/L、七水硫酸锌0.0086g/L、一水硫酸锰0.0169g/L、七水硫酸镁0.392g/L、磷酸二氢钾0.17g/L、EDTA铁钠0.0367g/L、硫酸钾0.99g/L、硝酸铵0.4g/L、四水硝酸钙0.55g/L及氯化钙0.18g/L。

在一些实施例中，步骤a中所述培养的时间可以为28～32天。在一些实施例中，步骤a中所述培养的时间可以为30天。

在一些实施例中，步骤a中所述培养的通气速率可以为0.015vvm～0.025vvm。在一些实施例中，步骤a中所述培养的通气速率可以为0.02vvm。

在一些实施例中，步骤b中所述发酵的时间可以为55天～65天。在一些实施例中，步骤b中所述发酵的时间可以为60天。

在一些实施例中，步骤b中所述发酵的通气速率可以为0.035vvm～0.045vvm。

在一些实施例中，所述培养或发酵的温度可以为19℃～23℃。

在一些实施例中，所述培养或发酵可以为黑暗条件下培养或发酵。

在一些实施例中，步骤b中，在所述收获的前8～12天可以添加茉莉酸甲酯。在一些实施例中，步骤b中，在所述收获的前10天可以添加茉莉酸甲酯。

在一些实施例中，步骤b中，在所述收获的前8～12天可以添加蒙古栎提取物或蒙古栎粉末。在一些实施例中，步骤b中，在所述收获的前10天可以添加蒙古栎提取物或蒙古栎粉末。在一些实施例中，蒙古栎提取物可以通过无菌过滤的方式添加。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。人参组培不定根发酵培养基配方GSM01和改良wpm培养基配方见表1。

表1改良wpm和GSM01培养基配方对比图

实施例1--蒙古栎粉末或蒙古栎提取物制备

1)蒙古栎粉末制备：取蒙古栎果实适量，干燥后粉碎，过20目筛，收集粉末即为蒙古栎粉末，备用。

2)蒙古栎提取物1制备：取蒙古栎粉末，加入纯化水，料液比为1：25，浸泡1小时，在100℃回流提取1小时，提取液浓缩后冷却静沉，收集上清液，干燥，制得蒙古栎提取物1。

蒙古栎提取物1检测：蒙古栎提取物1采用硫酸蒽酮法检测总糖含量为40％，FD试剂显色法测定单宁含量为13％。

3)蒙古栎提取物2制备：取蒙古栎粉末，用40％乙醇进行提取，加入40％乙醇溶液，液比为1：25，浸泡1小时后，在83℃下回流提取1小时，提取液浓缩后冷却静沉，收集上清液，干燥，制得蒙古栎提取物2。

蒙古栎提取物2检测：蒙古栎提取物2用硫酸蒽酮法检测总糖含量为24％，FD试剂显色法测定单宁含量为9％。

实施例2--人参组培不定根增殖培养

1)培养基配制及灭菌：分别在改良wpm培养基和GSM01培养基配方的基础上添加蔗糖30g/L、3-吲哚丁酸5mg/L，pH调整至5.80，在121℃下灭菌30min。

2)实验设计：根据实验设计，将改良wpm培养基+MJ为对照组，GSM01培养基+MJ为实验培养基，并不同时期、添加不同浓度的蒙古栎粉末或蒙古栎提取物，实验设计表格如表2所示。

表2对照组和实验组

3)液体培养方法：将人参组培不定根接种到上述配制好的改良wpm培养基和GSM01培养基中。接种比为0.5％，通气速率为0.02vvm，培养温度为23℃±2℃，在暗条件下发酵60天，并在收获前10天通过无菌过滤的方式添加2ppm的MJ。

4)实验样品处理：实验组样品分别在发酵初期和收获前10天，按照上述表2分别往培养基中添加蒙古栎粉末或蒙古栎提取物。其中发酵初期蒙古栎粉末的加入方式为液体培养基配制完成后，按照实验规定的加入量称取蒙古栎粉末后倒入培养基中，与培养基共同进行灭菌。发酵初期蒙古栎提取物的加入方式为通过无菌过滤的方式添加到灭菌后的液体培养基中。收料前添加蒙古栎提取物的方式为收获前10天通过无菌过滤的方式添加。

5)检测分析：发酵结束后人参组培不定根从培养基中取出，用纯化水洗净培养基，离心后称量鲜重，再放入鼓风干燥箱进行干燥，干燥条件为60℃～65℃，干燥时间为12小时，干燥结束后按照GB/T 19506标准检测样品中的人参总皂苷和人参皂苷含量，结果见表3，生长状态参见图1。

表3添加蒙古栎提取物对人参组培不定根培养物生长调节作用对比表

6)实验结果：人参组培不定根在各个培养基中的生长情况、生长量、总皂苷和人参皂苷合计见表3、表4及图1-图12。

表4添加蒙古栎提取物对人参组培不定根培养物生长调节作用比较

7)实验结论：从表3和表4中可以看出，实验7组即在收获前10天，往GSM01培养基中添加0.06g/L蒙古栎提取物，其人参组培不定根鲜重、总皂苷和人参皂苷含量明显优于其他实验组。

实施例3：发酵工艺

1)种子培养基配制及灭菌：在改良wpm培养基基础上添加蔗糖30g/L、吲哚丁酸5mg/L，pH调整至5.80，在121℃下灭菌30min。

2)种子制备阶段：将人参组培不定根接种到改良wpm培养基。接种比为0.5％，通气速率为0.02vvm，培养温度为23℃±2℃，在暗条件下发酵30天，备用。

3)发酵培养基配制及灭菌：在GSM01培养基基础上添加蔗糖30g/L、3-吲哚丁酸5mg/L，pH调整至5.80，在121℃下灭菌30min。

4)发酵阶段：将种子剪切后排净种子培养基，通过无菌管路灌装发酵培养基。接种比为2％，通气速率为0.04vvm，培养温度为23℃±2℃，在暗条件下发酵60天，收获前10天通过无菌过滤的方式添加2ppm的MJ和0.06g/L蒙古栎提取物。

5)检测分析：发酵结束后人参组培不定根从培养基中取出，用纯化水洗净培养基，离心后称量鲜重，再放入鼓风干燥箱进行干燥，干燥条件为60℃～65℃，干燥时间为12小时，干燥结束后按照GB/T 19506标准检测样品中的人参总皂苷和人参皂苷含量。

6)结果：通过上述发酵工艺人参组培不定根鲜重可达到1200kg，总皂苷含量为5.95％，人参皂苷含量为53.41mg/g，与实施例2人参组培不定根增殖培养基筛选实验结果中实验7组结果相似，可应用于工业化放大发酵。

上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。

同时，本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。

一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20％的变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中，数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本说明书一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值，在具体实施例中，此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。

最后，应当理解的是，本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此，作为示例而非限制，本说明书实施例的替代配置可视为与本说明书的教导一致。相应地，本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。