生产纳豆激酶的重组基因工程菌及应用

声明：本发明是在2022年3月30号申请的专利号2022103268312_、专利名称“一种用于提高纳豆激酶分泌效率的信号肽及其应用”基础上的分案。_

技术领域

本发明涉及一种生产纳豆激酶的重组基因工程菌及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

纳豆激酶(Nattokinase，NK，EC 3.4.21.62)是在纳豆发酵过程中，其中的纳豆芽孢杆菌利用黄豆中的营养，发酵产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶。该酶因其高效安全的溶栓能力，在心脑血管疾病领域掀起研究热潮。在此之前，常用临床溶栓药物主要有链激酶、尿激酶和纤维酶原激活因子等，但此类药物存在成本高昂、安全性低且药效短等弊端，不宜进行规模化生产。纳豆激酶无论在成本还是安全性方面均有显著优势，特别是它可直接作用于纤维蛋白，大大提高溶栓效率，使其与上述溶栓药物相比具有独特优越性和广阔开发前景。此外，纳豆激酶被证实在血压血脂调节方面有显著效果，且在抗疲劳、抗菌、抗氧化、调节内分泌等方面有研究价值，是一种高潜力的膳食补充剂，在食品工业上具有较大开发意义。

Nakamura等人(1992)通过当时较为精确的鸟枪法首次克隆了纳豆激酶基因，并对其一级结构进行深入解析，测定了该酶的全基因序列，从此科研工作者开始从分子水平，利用基因工程手段对纳豆激酶基因或其宿主进行改造和优化。刘北域等人从纳豆芽孢杆菌中钓取纳豆激酶原基因，于E.coli JF1125中构建温度诱导型表达质粒pESX-1，实现了纳豆激酶在大肠杆菌中的有效表达。除此之外，其余宿主，例如毕赤酵母(Pichia pastoris)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)以及草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)等均实现了纳豆激酶的有效表达。

为了提高纳豆激酶外源表达水平，研究者在表达元件优化上也开展了多项工作。例如Wu等人尝试用启动子(Paprv)启动纳豆激酶的转录表达，并通过点突变改造其核心-35和-10序列，发现-10区的突变改造使酶活提高了1.36倍。在分子水平上改造原始基因及其关键元件，可能显著提高纳豆激酶酶活力。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种生产纳豆激酶的重组基因工程菌及其应用，通过对信号肽进行改造，筛选改造后的信号肽，优化纳豆激酶蛋白表达框，构建枯草芽孢杆菌纳豆激酶高表达菌株，提高蛋白酶活力。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种生产纳豆激酶的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌为在枯草芽孢杆菌WB800中转入重组质粒获得，所述重组质粒包括如SEQ ID N0.3所示的信号肽的基因和如SEQ ID N0.7所示的来源于枯草芽孢杆菌N2的纳豆激酶基因，所述信号肽的基因融合到所述纳豆激酶基因的N端。

本发明还提供所述重组基因工程菌在生产纳豆激酶中的应用。

本发明与现有技术相比的有益效果：

1、本发明通过在核苷酸序列为SEQ ID N0.6，即原纳豆激酶信号肽基因的基础上，构建各种信号肽与纳豆激酶编码基因相结合的表达载体，结合高通量的筛选方法，筛选出能提高纳豆激酶分泌的信号肽。同时构建该信号肽与纳豆激酶酶原编码基因相结合的表达载体，提高了纳豆激酶酶原的分泌表达。

2、本发明提供了一种核苷酸片段，具有很强的分泌表达活性的信号肽，能实现纳豆激酶的高表达，特别是为枯草芽孢杆菌表达纳豆激酶基因提供了有效的元件。

3、本发明通过融合信号肽，可以使纳豆激酶分泌量增加，酶活得到进一步提高。

4、本发明通过融合信号肽，提高了纳豆激酶酶原分泌表达。

附图说明

图1是实施例1中质粒PSPX质粒构建示意图；

图2是实施例1中扩增信号肽1片段电泳图；其中泳道M：marker DNA；泳道1为构建的信号肽1的片段；

图3是实施例1中扩增信号肽2片段电泳图；其中泳道M：marker DNA；泳道1为构建的信号肽2的片段；

图4是实施例1中扩增信号肽3片段电泳图；其中泳道M：marker DNA；泳道1为构建的信号肽3的片段；

图5是实施例1中扩增信号肽4片段电泳图；其中泳道M：marker DNA；泳道1为构建的信号肽4的片段；

图6是实施例1中扩增信号肽5片段电泳图；其中泳道M：marker DNA；泳道1为构建的信号肽5的片段；

图7实施例2中构建信号肽1与原信号肽相比，纳豆激酶酶活力的比较；

图8实施例2中构建信号肽2与原信号肽相比，纳豆激酶酶活力的比较；

图9实施例2中构建信号肽3与原信号肽相比，纳豆激酶酶活力的比较；

图10实施例2中构建信号肽4与原信号肽相比，纳豆激酶酶活力的比较；

图11实施例2中构建信号肽5与原信号肽相比，纳豆激酶酶活力的比较。

具体实施方式

以下实施例中所采用的的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、DNA片段连接、凝胶电泳等具体参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J，Russell DW，Janssen K，Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)。枯草芽孢杆菌WB800可以购买商业菌株，本实施例所用的枯草芽孢杆菌WB800为中国海洋大学食品学院应用微生物实验室保藏；本实施例中所提到的核苷酸序列和氨基酸序列见表1。

枯草芽孢杆菌N2(Bacillus subtilis)是由中国海洋大学食品学院应用微生物实验室筛选并于2020年3月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存号CGMCC NO.19541，保存地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例1纳豆激酶高效分泌表达的信号肽的筛选

通过优化纳豆激酶的信号肽，构建各种信号肽与纳豆激酶编码基因相结合的表达载体，结合高通量的筛选方法，从克隆中获得不同程度提高纳豆激酶分泌效果的信号肽，具体包括以下步骤：

(1)构建pP43NMK-NKF载体：提取枯草芽孢杆菌N2基因组DNA(天根，细菌基因组提取试剂盒),以两段人工合成片段SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9从枯草芽孢杆菌N2基因组DNA中PCR扩增钓取纳豆激酶基因；以两段人工合成片段SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.11从pP43NMK中PCR扩增得到线性化pP43NMK片段；利用DNA无缝克隆(Clon Express II OneStep Cloning Kit试剂盒)重组连接纳豆激酶基因(SEQ ID N0.7)和线性化pP43NMK片段，构建重组克隆载体pP43NMK-NKF。

(2)构建信号肽缺失型线性化载体PSP0：设计引物SEQ ID N0.12、SEQ ID N0.13基于pP43NMK-NKF,进行线性化载体扩增，扩增体系50μl：2×Phanta Max Buffer(Mg

(3)信号肽的钓取及纯化：

设计引物①SEQ ID N0.14、SEQ ID N0.15②SEQ ID N0.16、SEQ ID N0.17③SEQID N0.18、SEQ ID N0.19④SEQ ID N0.20、SEQ ID N0.21⑤SEQ ID N0.22、SEQ ID N0.23；第一对引物(SEQ ID N0.14、SEQ ID N0.15)对应信号肽1，设计的理念是将原信号肽核苷酸序列(SEQ ID N0.6)的第一个碱基从G突变成A，其次是在核苷酸序列的末尾加入ATG三个碱基；第2对引物对应信号肽2，第4对引物对应信号肽4，第5对引物对应信号肽5，设计的理念是除了将原信号肽核苷酸序列的第一个碱基从G突变成A，以及在核苷酸序列的末尾加入ATG三个碱基外，通过设计引物来增加信号肽N端正电荷数；第3对引物对应信号肽3，设计的理念是除了将原信号肽核苷酸序列的第一个碱基从G突变成A，以及在核苷酸序列的末尾加入ATG三个碱基外，通过设计引物，来增加信号肽核心H区的长度。原信号肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.24。

以枯草芽孢杆菌WB800基因组为模板，选择梯度PCR的方式钓取目的基因，扩增体系50μl：5×PrimeSTAR Buffer(Mg

(4)信号肽引导的纳豆激酶克隆载体PSPX的构建及验证：根据所获纯化信号肽片段及PSP0载体的DNA浓度，进行稀释，以保证线性化载体和目的片段摩尔比为1:2进行重组连接，信号肽的基因融合到核苷酸序列是SEQ ID N0.7所示序列的纳豆激酶基因的N端，使融合后的基因编码的N端融合有相应信号肽，形成重组基因，将该重组基因连接到表达质粒中形成重组质粒，将连接后的体系热激法转化E.coli DH5α，然后涂布LB(AMP)平板进行阳性重组子的筛选。以pP43NMK载体通用引物对构建的载体PSPX(见图1)进行单克隆测序验证。

(5)信号肽表达载体的构建及验证：将测序正确的转化子活化后提取质粒(

实施例2信号肽介导的纳豆激酶表达水平的检测

(1)将阳性转化子接种5mL液体LB(Kana)中，孵育后提取质粒测序，将转入正确质粒的转化子接入到TB培养基(Kana)中，37℃、180r/min震荡培养48h，取发酵液于8000r/min离心10min，获得酶液。

(2)参照日本纳豆激酶协会制定的紫外分光光度法，酶活力定义：1单位(1FU)定义为在本程序规定的条件下，使上清液在OD

(3)纳豆激酶酶活的测定：与纳豆激酶原始信号肽SEQ ID N0.6相比，工筛选出5个使纳豆激酶活性提高的信号肽，分别为由SEQ ID N0.1氨基酸序列编码的信号肽1，可以使纳豆激酶的酶活力由22.3FU/mL增加至171FU/mL(见图7)；由SEQ ID N0.2氨基酸序列编码的信号肽2，可以使纳豆激酶的酶活力由22.3FU/mL增加至207.7FU/mL(见图8)；由SEQ IDN0.3氨基酸序列编码的信号肽，可以使纳豆激酶的酶活力由22.3FU/mL增加至208.3FU/mL(见图9)；由SEQ ID N0.4氨基酸序列编码的信号肽，可以使纳豆激酶的酶活力由22.3FU/mL增加至225.4FU/mL(见图10)；由SEQ ID N0.5氨基酸序列编码的信号肽，可以使纳豆激酶的酶活力由22.3FU/mL增加至235.2FU/mL(见图11)。

表1.本实施例中所用到的所有核苷酸和氨基酸序列

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