一种在人体全血中检测脐带源间充质干细胞含量的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种在人体全血中检测脐带源间充质干细胞含量的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类来源于发育早期中胚层和外胚层的多功能干细胞，具有成体干细胞的自我更新和多向分化潜能，可以分化成多种结缔组织细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，在体内分布较广泛。MSCs在一定条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，因此在不同的组织中均存在MSCs，如脂肪、胎盘、肌肉、血液、牙髓以及脐带等。MSCs可以治疗自身免疫性疾病、炎症和退行性疾病，且在各种动物模型治疗中应用广泛。其中，脐带源间充质干细胞具有较高的增殖和自我更新能力，其免疫原性低，且不存在道德伦理问题，取材方便，是一种在兽医和人类医学应用中有广阔前景的间充质干细胞来源。

研究表明，MSCs具有多向分化能力、免疫调节作用、归巢能力和旁分泌作用，有助于损伤组织修复。MSCs还能够抑制免疫系统过度激活，抑制炎症反应，同时提高机体免疫力，增强抗病毒的能力。MSCs能够不受组织相容性分子的约束，从而使其免疫原性非常低，导致其对自身和异体的免疫细胞都可以实现免疫调节作用。MSCs能够通过分泌定量的细胞因子等方式激活体内的T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等的分裂增殖、分泌等从而发挥调理作用。研究发现，经脂多糖活化的MSCs能够表达趋化因子，并分泌大量炎症因子，如白细胞介素8、巨噬细胞迁移抑制因子募集中性粒细胞。MSCs可分泌肝细胞生长因子、肿瘤生长因子-β、白细胞介素6、白细胞介素10等30种可溶性因子调节抑制T细胞活化和增殖，抑制炎症反应。

MSCs的药代动力学(Pharmacokinetics，PK)研究不仅可以预测血药水平，制定最佳给药方案、计量和给药频度，指导合理用药；还可以表征生物效能，药物相互作用及浓度，因此具有重要意义。然而目前MSCs在体内分布和代谢研究常采用细胞体外标记后再移植入体内的方法，主要的标记方法有荧光素酶、近外红染料、荧光蛋白和磁性离子等，相应地检测方法有生物发光成像、磁共振成像、单光子发射CT(computer tomography)扫描等，可以动态观察干细胞在体内的分布情况。但以上研究手段经常用于动物中，对人体有一定放射性伤害，同时，某些标记手段会对MSCs的活性有影响，比如，同位素标记有可能损伤MSCs活力和分化能力；而新型的纳米碳量子点追踪MSCs体内动态的同时，可以促进骨髓MSCs向成骨细胞分化，人为地提高了MSCs的清除速率。鉴于以上现状，目前MSCs的药代动力学研究还主要存在于非临床及动物实验阶段，在临床治疗阶段的药代动力学的研究鲜有报道，因此亟需开发一种既不损伤MSCs活性，并且不会给人体带来其他损伤的间充质干细胞含量检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种既不损伤MSCs活性，并且不会给人体带来其他损伤的间充质干细胞含量检测方法及其在MSCs药代动力学研究中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种人体全血中间充质干细胞含量的检测方法。

本发明提供的人体全血中间充质干细胞含量的检测方法包括如下步骤：向女性体内输注来源于男孩脐带的间充质干细胞或间充质干细胞制剂，然后通过qPCR(荧光定量PCR)定量检测输注间充质干细胞或间充质干细胞制剂后的女性全血基因组DNA中SRY基因的拷贝数获得人体全血中的间充质干细胞含量。

上述方法中，所述SRY基因位于人Y染色体基因组上，其核苷酸序列如序列1第415-1301位所示。

上述方法中，所述qPCR定量检测输注间充质干细胞或间充质干细胞制剂后的女性全血基因组DNA中SRY基因的拷贝数的方法包括如下步骤：

(d1)从输注间充质干细胞或间充质干细胞制剂后的女性全血样本中提取基因组DNA；

(d2)以所述基因组DNA为模板，采用用于检测SRY基因的引物对进行qPCR，获得Cq值；

(d3)将所述Cq值代入标准曲线方程，从而计算所述基因组DNA中SRY基因的拷贝数，该拷贝数即为全血样本中的间充质干细胞个数；

所述标准曲线方程按照如下获得：用系列已知拷贝数的含有所述SRY基因的质粒标准品溶液替代所述基因组DNA进行步骤(d1)-(d2)，测得各拷贝数的质粒标准品溶液对应的Cq值，从而获得质粒标准品溶液拷贝数与Cq值之间的标准曲线方程。

进一步的，所述基因组DNA为从输注间充质干细胞或间充质干细胞制剂3小时后的女性全血样本中提取的基因组DNA。

所述基因组DNA的提取可采用Qiagen公司全血DNA提取试剂盒QIAamp DNA BloodMini Kit进行，具体可包括如下步骤：

1)吸取蛋白酶加入至离心管底部；

2)完成步骤1)后，向离心管中加入全血样本；

3)完成步骤2)后，向离心管中加入Buffer AL，漩涡混匀；

4)完成步骤3)后，转移离心管于恒温金属浴56℃保温10min；

5)完成步骤4)后，短暂离心，移除离心管盖的液珠；

6)完成步骤5)后，向离心管中加入96-100％乙醇溶液，漩涡混匀后短暂离心，移除离心管盖的液体；

7)完成步骤6)后，将离心管中的混合物转移至提取柱中，离心(8000rpm离心1min)，弃掉有滤液的收集管，换新的收集管；

8)完成步骤7)后，打开提取柱管盖，加入Buffer AW1，开盖静置5min，使洗涤液在重力的作用下缓慢渗透过吸附膜，以彻底洗脱盐分等污染物，离心(8000rpm离心1min)，弃掉有滤液的收集管，换新的收集管；

9)完成步骤8)后，打开提取柱管盖，加入Buffer AW2，离心(14000rpm离心3min)；

10)完成步骤9)后，将提取柱放入新的收集管中，高速离心；

11)完成步骤10)后，弃去含有滤液的收集管，将提取柱放入干净的离心管中，打开提取柱，加入Buffer AE，室温放置数分钟后，离心(8000rpm离心1min)，收集滤液于离心管中，即为从全血样本中提取得到的基因组DNA。

再进一步的，所述用于检测SRY基因的引物对由序列2所示的单链DNA和序列3所示的单链DNA组成。

含有所述SRY基因的质粒标准品为将所述SRY基因插入至pUC19质粒载体后得到的质粒，该质粒的核苷酸序列具体如序列1所示。

更进一步的，所述系列已知拷贝数的质粒标准品溶液为含有2×10

所述qPCR扩增体系(总体积20μL)具体如下：基因组DNA/质粒标准品2μL、正向引物0.4μL、反向引物0.4μL、TB

所述qPCR扩增程序具体如下：

a)95℃30秒(Ramp rate：4.4℃/秒)1cycle；

b)95℃5秒(Ramp rate：4.4℃/秒)，60℃30秒(Ramp rate：2.2℃/秒，AcquisitionMode：Single)40cycles；

c)95℃5秒(Ramp rate：4.4℃/秒)，60℃1分钟(Ramp rate：2.2℃/秒)95℃(Ramprate：0.11℃/秒，Acquisition Mode：Continuous，Acquisitions：5per℃)1cycle；

d)50℃30秒(Ramp rate：2.2℃/秒)1cycle。

上述方法在人体血液内间充质干细胞药代动力学研究中的应用也属于本发明的保护范围。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了成套试剂。

本发明提供的成套试剂包括上述含有所述SRY基因的质粒标准品和上述用于检测SRY基因的引物对。

进一步的，所述成套试剂还包括来源于男孩脐带的间充质干细胞或间充质干细胞制剂。

上述任一所述方法或成套试剂中，所述来源于男孩脐带的间充质干细胞的具体分离方法如下：取离体的脐带进行消毒，得到消毒后脐带；然后将消毒后脐带清洗后剪成1-2cm小段，得到脐带小段；再将脐带小段清洗后剪成1-2mm3组织块，接种于培养瓶中，采用胎牛血清完全培养基(90％DMEM/F12基础培养基+10％胎牛血清)，置于5％CO

所述来源于男孩脐带的间充质干细胞制剂的具体制备方法如下：取离体的男孩脐带进行消毒，得到消毒后脐带；然后将消毒后脐带清洗后剪成1-2cm小段，得到脐带小段；再将脐带小段清洗后剪成1-2mm3组织块，接种于培养瓶中，采用胎牛血清完全培养基(90％DMEM/F12基础培养基+10％胎牛血清)，置于5％CO

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了上述成套试剂的新用途。

本发明提供了上述成套试剂在如下e1)-e4)任一种中的应用：

e1)检测人体全血中间充质干细胞含量；

e2)制备检测人体全血中间充质干细胞含量的产品；

e3)人体血液内间充质干细胞药代动力学研究；

e4)制备人体血液内间充质干细胞药代动力学研究的产品。

上述任一所述应用中，所述间充质干细胞为脐带源间充质干细胞。

本发明提供了一种在人体全血中检测脐带源间充质干细胞含量的方法，该方法采用含有人SRY(sex-determining region Y gene)基因的质粒为标准品，利用荧光定量PCR方法，根据定量循环数(Cq，Quantification cycle)折算，可以定量检测人体全血gDNA中脐带源间充质干细胞或其制剂的SRY基因片段的拷贝数。由于人SRY基因为Y染色体基因片段，即1个细胞为1个拷贝基因组，真实含量即为定量实测值，由此可以根据全血基因组DNA中的SRY基因片段的拷贝数定量人体全血中脐带间充质干细胞含量。经验证表明，本发明提供的脐带源间充质干细胞含量检测方法可靠、准确、并有稳定性指示能力，可用于间充质干细胞在人体血液中药代动力学研究。

附图说明

图1为成年女性全血提取的基因组DNA的熔解曲线。

图2为来源于男孩脐带的间充质干细胞提取的基因组DNA的熔解曲线。

图3为标准品扩增曲线。

图4为标准品熔解曲线。

图5为标准曲线。

图6为临床女性患者全血样本提取的基因组DNA的熔解曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的来源于男孩脐带(新生儿产妇来源于中国人民解放军总医院，无肝炎、梅毒、艾滋病等传染性疾病，产妇及家属对脐带用于试验研究均知情同意)的间充质干细胞的具体分离方法如下：取离体的脐带进行消毒，得到消毒后脐带；然后将消毒后脐带清洗后剪成1-2cm小段，得到脐带小段；再将脐带小段清洗后剪成1-2mm3组织块，接种于培养瓶中，采用胎牛血清完全培养基(90％DMEM/F12基础培养基+10％胎牛血清)，置于5％CO

下述实施例中的脐带源间充质干细胞制剂来源于中源协和细胞基因有限公司，具体制备方法如下：取离体的男孩脐带(新生儿产妇来源于中国人民解放军总医院，无肝炎、梅毒、艾滋病等传染性疾病，产妇及家属对脐带用于试验研究均知情同意)进行消毒，得到消毒后脐带；然后将消毒后脐带清洗后剪成1-2cm小段，得到脐带小段；再将脐带小段清洗后剪成1-2mm3组织块，接种于培养瓶中，采用胎牛血清完全培养基(90％DMEM/F12基础培养基+10％胎牛血清)，置于5％CO

实施例1、人体全血中脐带源间充质干细胞含量检测方法的建立

本发明提供的人体全血中脐带源间充质干细胞含量的检测方法如下：向女性体内输注来源于男孩脐带的间充质干细胞，然后通过qPCR定量检测输注间充质干细胞后的女性全血基因组DNA中SRY基因的拷贝数获得人体全血中脐带源间充质干细胞含量。

qPCR定量检测输注间充质干细胞后的女性全血基因组DNA中SRY基因的拷贝数的方法如下：采用含有SRY基因的质粒为标准品，以含有不同SRY基因拷贝数的质粒标准品溶液为模板进行qPCR，建立质粒拷贝数与定量循环数(Cq，Quantification cycle)的标准曲线方程，然后以输注来源于男孩脐带的间充质干细胞后的女性全血基因组DNA为模板进行qPCR，得到其定量循环数，并将其代入标准曲线方程中即可获得女性全血基因组DNA中SRY基因的拷贝数。由于人SRY基因为Y染色体基因片段，即1个细胞为1个拷贝基因组，真实含量即为定量实测值，因此女性全血基因组DNA中SRY基因的拷贝数即为人体全血中脐带间充质干细胞的数量，由此获得人体全血中脐带源间充质干细胞含量。

实施例2、检测方法的特异性

供试样本：来源于三名健康成年女性的全血样本、来源于三名男孩脐带的间充质干细胞样本。

以从健康成年女性全血样本和来源于男孩脐带的间充质干细胞样本中提取的全血基因组DNA作为荧光定量PCR模板进行扩增反应，通过考察健康成年女性全血和来源于男孩脐带的间充质干细胞提取的全血基因组DNA扩增SRY基因情况来检测本发明建立的人体全血中脐带源间充质干细胞含量检测方法的特异性，结果由熔解曲线按照如下标准进行评估：要求熔解曲线温度呈单峰，峰窄而尖，峰值≥80℃。具体步骤如下：

1、全血基因组DNA的提取

使用Qiagen公司全血DNA提取试剂盒QIAamp DNA Blood Mini Kit(货号：51104)提取供试样本的全血基因组DNA，具体步骤如下：

1)吸取20μL QIAGEN蛋白酶加入到1.5mL离心管底部。

2)向1.5mL离心管中加入200μL样品。

3)加入200μL Buffer AL到样本中，漩涡混匀15s，保证充分混合。

4)转移离心管于恒温金属浴56℃保温10min。

5)短暂离心，移除离心管盖的液珠。

6)往样品中加入200μL 96-100％乙醇溶液，漩涡混匀15s，混匀后，短暂离心，移除离心管盖的液体。

7)小心地将上一步获得的混合物转移至QIAamp提取柱中，轻轻盖上盖子8000rpm离心1min。弃掉有滤液的收集管，换上新的收集管。

8)轻轻打开提取柱管盖，加入500μL Buffer AW1，开盖静置5min，使洗涤液在重力的作用下缓慢渗透过吸附膜，以彻底洗脱盐分等污染物，以提高提取的DNA质量。8000rpm离心1min。弃掉有滤液的收集管，换上新的收集管。

9)轻轻打开提取柱管盖，加入500μL Buffer AW2，14000rpm离心3min。

10)将提取柱放入新的收集管中，高速离心1min。

11)弃去含有滤液的收集管，将QIAamp提取柱放入干净的1.5mL离心管中。小心地打开提取柱，加入200μL Buffer AE。在室温(15–25℃)放置1min后，8000rpm离心1min收集滤液于离心管中，即为提取的全血基因组DNA。

2、荧光定量PCR扩增

1)用于检测人SRY基因的引物对包含正向引物SRY-F和反向引物SRY-R，其中正向引物SRY-F结合于人SRY基因所示序列的第500-519位，反向引物SRY-R结合于人SRY基因所示序列的第599-618位。委托北京擎科生物有限公司合成用于检测人SRY基因的引物对。引物序列信息如下：

SRY-F：AATTGCAGTTTGCTTCCCGC(序列2)；

SRY-R：AGCTGGTGCTCCATTCTTGA(序列3)。

2)以步骤1中提取的全血基因组DNA为模板，采用步骤1)中的引物对进行荧光定量PCR扩增。

荧光定量PCR扩增体系(总体积20μL)如下：总DNA/质粒2μL、正向引物0.4μL、反向引物0.4μL、TB

荧光定量PCR扩增程序如下：

a)95℃30秒(Ramp rate：4.4℃/秒)1cycle；

b)95℃5秒(Ramp rate：4.4℃/秒)，60℃30秒(Ramp rate：2.2℃/秒，AcquisitionMode：Single)40cycles；

c)95℃5秒(Ramp rate：4.4℃/秒)，60℃1分钟(Ramp rate：2.2℃/秒)95℃(Ramprate：0.11℃/秒，Acquisition Mode：Continuous，Acquisitions：5per℃)1cycle；

d)50℃30秒(Ramp rate：2.2℃/秒)1cycle。

结果见图1和图2。结果显示：三名女性全血一些复孔有些许扩增情况，但其熔解曲线峰值均＜80℃，是由引物二聚体造成，没有特异性扩增，未在女性体内检测到SRY(图1)；三名来源于男孩脐带的间充质干细胞熔解曲线温度呈单峰，峰窄而尖，峰值在86℃左右(图2)。证明本发明检测方法特异性良好，满足检测需求。

实施例3、质粒标准品及标准曲线的制备

1、质粒标准品的制备

委托金斯瑞生物科技有限公司合成SRY基因序列并将其插入到pUC19质粒载体中，得到大小为3573bp的重组质粒，并将其命名为pUC19-SRY。pUC19-SRY质粒的核苷酸序列如序列1所示，其中第415-1301位为SRY基因序列。

2、标准曲线的制备

取浓度为1μg/μL的pUC19-SRY质粒溶液，根据公式(6.02×10

将浓度为2.55×10

表1、标准曲线制备

分别将2μL表1中的SD1～SD7加入实施例2中的荧光定量PCR扩增体系中，得到质粒拷贝数分别为2×10

结果见图3-图5。结果显示：扩增曲线呈S型(图3)，扩增产物无引物二聚体，熔解曲线峰型较好，特异性强(图4)，当pUC19-SRY质粒标准品拷贝数范围在20～2×10

实施例4、检测方法的定量限

基于实施例3中拷贝数分别为2×10

结果见表2。结果显示：拷贝数分别为2×10

表2、实测浓度分析结果

实施例5、方法学验证

1、供试样本

健康成年女性全血(来源于中国人名解放军总医院)和脐带源间充质干细胞制剂。

2、验证样本

将间充质干细胞制剂浓度调整至5×10

验证所使用的供试品为血液中加标样本，即在女性全血中分别加入高(10

表3、验证样本配制

3、方法的加标回收率和灵敏度

按照实施例2中的方法分别将全血样本、以及HQC、MQC和LQC样本进行全血基因组DNA提取和荧光定量PCR扩增，计算加标回收率(加标回收率＝实际测定值/加标理论值*100％)。另准备LLQC共24份进行加标提取扩增，考察方法灵敏度，检出率≥95％即为方法灵敏度。

结果见表4和表5。加标回收率结果显示：加入高、中、低细胞量的样本的加标回收率均在2％左右，这是由于前期全血基因组DNA提取试剂盒的效率的原因，但使用该方法回收率检出结果非常稳定。灵敏度结果显示：检出数量为24/24，检出率为100％，Cq值结果详见表5，证明本发明检测方法的灵敏度为500cells/样本，灵敏度较高。

表4、加标回收率结果

表5、灵敏度结果

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4、方法的精密度

1名检验人员(人员A)参照表3制备6份MQC，按照实施例2中的方法进行全血基因组DNA提取和荧光定量PCR扩增，分析样本重复之间的相对标准偏差(RSD)；在不同的时间另一名检验人员(人员B)制备与人员A相同的6份样本MQC，进行全血基因组DNA提取和荧光定量PCR扩增，再次分析6个样本之间的RSD，同时分析两名人员之间共12份样本之间的中间精密度。

结果见表6。结果显示：不同人员样本重复的相对标准偏差为6％和18％，两名人员不同时间12份样本的RSD为32％，均在50％之内。该结果符合方法学验证的要求，方法稳定可靠。

表6、精密度结果

5、方法的耐用性

1)将如下各浓度：10

结果见表7。结果显示：冻融5次检测结果的R

表7、冻融耐用性结果

2)将女性全血中加入10

结果见表8。结果显示：含有间充质干细胞的血液基因组DNA在保存14天后，差异百分比(RPD，RPD＝[(放置后测定值–当日测定值)/当日测定值]×100％)在-0.61％～0.60％之间，证明-20℃冻存14天对本发明检测方法无影响，该检测方法稳定可靠。

表8、低温保存耐用性结果

实施例6、临床应用

供试样本：

向经诊断患有失代偿期肝硬化的成年女性个体输注间充质干细胞制剂前静脉采集的血液样本。

向经诊断患有失代偿期肝硬化的成年女性个体输注间充质干细胞制剂3小时后静脉采集的血液样本。

所有样本均来源于北京302医院，患者均知情同意。

检测方法：按照实施例2中全血基因组DNA提取步骤进行供试样本全血基因组DNA的提取和荧光定量PCR扩增。

结果见图6。结果显示：输注间充质干细胞制剂前的样本没有特异性扩增曲线(图6中的灰色线)，检测结果为阴性；而输注间充质干细胞制剂3小时后的样本熔解曲线呈单峰(图6中的绿色线)，检测结果为阳性，即在输注间充质干细胞制剂后的供试血液样本中特异性检出间充质干细胞，Cq值为33.26，根据标准曲线得到的定量结果为26copies(26个间充质干细胞)。由于提取的全血基因组DNA样本体积为200μL，换算可得在1mL血液样本中可检出130个间充质干细胞。

以上结果证明本发明检测方法可用于实际临床中MSCs在人体血液中含量的测定，以便于后续药代动力学研究。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。