表达免疫系统-刺激分子的溶瘤性单纯疱疹病毒载体

技术领域

本发明总体上涉及表达刺激免疫系统的分子的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)载体。

背景技术

溶瘤病毒(OV)已经成为通过溶瘤效应特异性破坏癌细胞的一种治疗方案，其杀伤机制的特征在于，通过病毒裂解行复制的过程使癌细胞裂解。

本发明克服了目前的商业化溶瘤病毒的缺点，并且毒性低、表达水平高、稳定性好。

发明内容

简而言之，本文披露内容涉及保护针对IL12、IL15和/或IL受体15α亚单位中的一种或多种的单纯疱疹病毒载体(HSV载体)。在一种实施方式中，单纯疱疹病毒HSV载体包含IL12、IL15和IL15受体α亚单位的表达盒，表达盒的侧翼具有经修饰的ICP47启动子。

在一种实施方式中，所述经修饰的ICP47启动子的序列至少包含SEQ ID No.584。

在一种实施方式中，所述经修饰的ICP47启动子的序列为SEQ ID No.584。

在一种实施方式中，IL12、IL15和IL15受体α亚单位的编码序列之间的框内具有编码自剪切肽2A的核酸序列。

在一种实施方式中，所述自剪切肽2A的氨基酸序列为：

VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP、QCTNYALLKLAGDVESNPGP、ATNF-SLLKQAGDVEENPGP、HYAGYFADLLIHDIETNPGP、GIFNAHYAGYFADLLIHDIETNPGP、KAVRGYHADYYKQRLIHDVEMNPGP、GATNFSLLKLAGDVELNPGP、EGRGSLLTCGDVEENPGP、AARQMLLLLSGDVETNPGP、FLRKRTQLLMSGDVESNPGP、GSWTDILLLLSGDVETNPGP、TRAEUEDELIRAGIESNPGP、AKFQIDKILISGDVELNPGP、SKFQIDKILISGDIELNPGP、SSIIRTKMLVSGDVEENPGP或CDAQRQKLLLSGDIEQNPGP。

在一种实施方式中，一个或多个IRES序列位于IL12、IL15和IL15受体α亚单位的编码序列之间。

在一种实施方式中，IL15和IL15受体α亚单位通过双向启动子表达。

在一种实施方式中，IL15和IL15受体α亚单位各自跟随一个编码Lys5或Glu5的核酸序列。

在一种实施方式中，hIL15受体α亚单位选自由变体1(SEQ ID NO:3)、变体2(SEQID NO:4)、变体3(SEQ ID NO:5)、变体4(SEQ ID NO:6)组成的组。

在一种实施方式中，包含IL12、IL15和IL15受体α亚单位的表达盒被插入到HSV的内部重复区或HSV基因组的末端重复区中。

在一种实施方式中，单纯疱疹病毒HSV载体进一步包含一种或多种PD-L1阻断肽的表达盒。

在一种实施方式中，PD-L1阻断肽的表达盒被插入HSV病毒基因的UL3和UL4之间。

在一种实施方式中，单纯疱疹病毒HSV载体进一步包含编码连接至所述PD-L1阻断肽的3’-端的Fc区的序列。

在一种实施方式中，连接至所述PD-L1阻断肽的3’-端的Fc区的序列为编码IgG4Fc区域的序列。

在一种实施方式中，在单纯疱疹病毒HSV载体的ICP4或ICP27调控区中进一步包含NFkB和OCT4/SOX2增强元件。

在一种实施方式中，单纯疱疹病毒HSV载体的ICP34.5基因部分缺失，或无功能。

本文披露的内容还涉及一种制剂，该制剂由下列组分组成：

利用根据权利要求1至15任一项所述的单纯疱疹病毒HSV载体所表达的病毒的悬液，甘油，水；

其中，制剂中甘油的浓度为5

本文披露的内容还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的单纯疱疹病毒HSV载体，和可药用载体。

本文披露的内容还涉及本文所述的单纯疱疹病毒HSV载体，或本文所述的制剂，或本文所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。

在一种实施方式中，所述癌症选自肝癌，胃癌，肠癌，肺癌，乳腺癌，鼻咽癌，头颈部肿瘤，膀胱癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、子宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌、皮肤癌、急性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、急性或慢性骨髓性白血病、黑色素瘤、子宫内膜癌、头颈癌、成胶质细胞瘤、骨肉瘤白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和肉瘤。

在一种实施方式中，所述的治疗癌症通过皮下注射、瘤内注射或静脉注射的方式来给药

发明内容部分已经简要地介绍了某些构思，在具体实施方式部分中将对其进行进一步详细描述。除非另外记载，否则发明内容部分既不是意在确定本文要求保护主题的关键或必要特征，也不是意在限制本文保护主题的范围。

发明的效果

本发明克服了目前的商业化溶瘤病毒的缺点，并且毒性低、表达水平高、稳定性好。

本发明通过对病毒结构的改造，例如对病毒某些基因启动子区域的改造，使得经过改造的病毒在感染细胞后能够在更长时间存在于被感染的细胞中躲避免疫细胞攻击，从而可以更好地复制与表达外源基因。

本发明还对载体所携带的外源基因进行了改进，例如构建外源多肽与适当的末端结构形成的融合蛋白，使表达的蛋白具有良好的稳定性，适于实际应用。

本发明还提供了保存病毒的优化的介质，在利用本发明的载体表达出病毒后，优化的介质可在较长时间内保持病毒活性，便于载体及病毒的工业应用。

下文中将详细描述一种或多种实施方式。与一种示例性实施方式结合示出或者描述的特征可以与其他实施方式的特征组合。因此，能够将本文所述的各种实施方式中的任一种进行组合以提供进一步的实施方式。当有必要采用本文中所确定的各专利、申请或公开的构思时，能够改变这些实施方式的方面以提供更进一步的实施方式。根据说明书、附图和权利要求书将能够了解其他的特征、目的和优势。

附图说明

根据附图和各种实施方式的以下详细描述将能够了解本文披露内容的示例性特征、其性质和各种优势。参照附图描述了非限制性和非穷尽性的实施方式，其中，除非另外指出，在各视图中类似的标记和标号代表类似的部分。附图中元件的大小和相对位置不一定是按比例绘制。例如，为了改善附图的可读性而选择、放大、放置各元件的形状。为了在附图中易于识别，已经选择了如所绘制的元件的特定形状。下文中参照附图描述了一种或多种实施方式，其中：

图1A和图1B是示例性oHSV载体的示意图。

图2示出了病毒hVG001-1-2的经修饰的ICP34.5区(SEQ ID NO:572)的示意图。

图3示出了病毒hVG001-1-2的经修饰的UL54启动子区(SEQ ID NO:573)的示意图。

图4示出了具有PD-L1阻断子插入的hVG001-1-2病毒基因组(SEQ ID NO:574)的示意图。

图5示出了hVG001-1-2修饰的TR区(SEQ ID NO:575)的示意图。

图6A-图6C示出了在细胞感染hVG001-1-2之后IL-12表达的ELISA和蛋白质印迹分析表达。

图7A-图7C示出了在细胞感染hVG001-1-2之后IL-15表达的ELISA和蛋白质印迹分析表达。

图8A-图8C示出了在细胞感染hVG001-1-2之后IgG4表达的ELISA和蛋白质印迹分析表达。

图9A-图9C为：(A)示例性构建体的示意图，其中bi-CMV启动子驱动IL-15Rα和IL-15的Sushi结构域的表达，以及(B-C)DNA序列和示意图(SEQ ID No:557)。

图10A-图10C为：(A)示例性构建体的示意图，其中bi-CMV启动子驱动IL-15和IL-15Rα变体4的表达，以及(B-C)DNA序列和示意图(SEQ ID No:558)。

图11A-图11C为：(A)示例性构建体的示意图，其中bi-CMV启动子驱动IL-15-K5和IL-15RαSushi结构域-E5的表达，以及(B-C)DNA序列和示意图(SEQ ID No:559)。

图12A-图12D为：(A)示例性构建体的示意图，其中bi-CMV启动子驱动IL-15-K5和IL-15Rα变体4-E5的表达，以及(B-D)DNA序列和示意图(SEQ IDNo:560)。

图13A-图13D为：(A)示例性构建体的示意图，其中EF1α启动子控制IL-15-IRES-IL-15RαSushi结构域的表达，以及(B-D)DNA序列和示意图(SEQ IDNo:561)。

图14A-图14D为：(A)示例性构建体的示意图，其中EF1α启动子控制IL-15-IRES-IL-15Rα变体4的表达，以及(B-D)DNA序列和示意图(SEQ ID No:562)。

图15A-图15D为：(A)示例性构建体的示意图，其中EF1α启动子控制IL-15K5-IRES-IL-15RαSushi结构域E5的表达，以及(B-D)DNA序列和示意图(SEQ ID No:563)。

图16A-图16D为：(A)示例性构建体的示意图，其中EF1α启动子控制IL-15K5-IRES-IL-15Rα变体4E5的表达，以及(B-D)DNA序列和示意图(SEQ IDNo:564)。

图17A-图17E为：(A)示例性构建体的示意图，其中CMV启动子控制IL-12-p2A-IL-15-p2A-IL-15RαSushi结构域的表达，以及(B-E)DNA序列和示意图(SEQ ID No:565)。

图18A-图18E为：(A)示例性构建体的示意图，其中CMV启动子控制IL-12-p2A-IL-15-p2A-IL-15Rα变体1的表达，以及(B-E)DNA序列和示意图(SEQ ID No:566)。

图19A-图19D为：(A)示例性构建体的示意图，其中CMV启动子控制IL-12-p2A-IL-15K5-p2A-IL-15RαSushi结构域E5的表达，以及(B-D)DNA序列和示意图(SEQ ID No:567)。

图20A、图20B、图20C、图20D、图20D续为：(A)示例性构建体的示意图，其中CMV启动子控制IL-12-p2A-IL-15K5-p2A-IL-15Rα变体1-E5的表达，以及(B)、(C)、(D)、(D)续为DNA序列和示意图(SEQ ID No:568)。

图21A、图21B、图21C示出了通过阻断肽结合至PD-1的PD-L1的百分比抑制的图表。

图22A-图22B示出了PD-L1抑制肽通过抗-CD3刺激的人外周血单核细胞对靶细胞的细胞毒性的影响。

图23A和图23B示出了仅IL-12、仅IL15加IL-15Rα、以及IL-12和IL15/1L-15Rα共同对在人外周血单核细胞中产生IFNγ和TNFα的影响。

图24A和图24B示出了IL-12和IL15/IL-15Rα通过外周血单核细胞对U87和MDA-MB-23肿瘤细胞的细胞毒性的影响。

图25A-图25C示出了用携带PD-L1阻断肽或者人IL15/15Ra的病毒(VG001-PLBh和VG001-15h)感染肿瘤细胞后IL12,IL15和PD-L1阻断肽的表达。图25D、图25E示出了用携带PD-L1阻断肽或者人IL15/15Ra的病毒(VG001-PLBh和VG001-15h)感染肿瘤细胞后的结果。

图26A-图26D示出了各种构建体的体外测定的结果。图26A-图26B示出了用表达IL-12、IL-15和PD-L1阻断子的IL-TF-Fc质粒进行细胞转染的结果。图26C-图26D示出了包括hVG001-1-2在内的多种突变体病毒进行细胞转染的结果。

图27A-图27E示出了在人肿瘤细胞系和Vero细胞系上进行的针对hVG001-1-2和HSV-345的细胞活力测定的结果。

图28A-图28J示出了各种构建体的体外测定的结果。图28A-图28E示出了mVG001-1-2和HSV-345在小鼠肿瘤细胞系和Vero细胞系上的细胞活力测定的结果；图28F-图28H示出了在CT26小鼠肿瘤细胞的mVG001-1-2感染之后转基因表达的表征,图28I-图28J示出了用mVG001-1-2感染CT26细胞后刺激外周单核细胞释放细胞毒性因子的表征。

图29A-图29C示出了在各种细胞系的hVG001-1-2或VG001-1.7感染之后转基因表达的体外表征的结果。图29D-图29E显示了被感染的肿瘤细胞刺激外周单核细胞释放细胞因子和细胞杀伤活性。

图30A-图30G示出了评估hVG001-1-2在体外杀死各种人类癌细胞的能力的测定结果。

图31A-图31G示出了mVG001-1-2和hVG001-1-2构建体在体的抑制肿瘤生长的结果。

图32A-图32C示出了不同病毒在三种不同人细胞系上的生长曲线。

图33A-图33D示出了mVG001-1-2和HSV-345在小鼠肿瘤细胞系和Vero细胞系上的生长曲线。

图34A-图34E示出了hVG001-1-2和HSV-345在人肿瘤细胞系和Vero细胞系上的生长曲线。

图35A-图35D示出了病毒改性的影响。

图36A-图36D体外表达的外源基因的有效性。

图37A和图37B提供了小鼠模型中注射病毒后病毒携带的外源基因在瘤内的表达。

图38A-图38C提供了VG001-1-2在免疫应答方面的影响。

图39是经修饰的示例性oHSV病毒载体(VG001-1-2)的示意图。

图40示出病毒VG001-1-2的经修饰的ICP34.5区域(SEQ ID NO:599)。

图41示出病毒VG001-1-2的经修饰的UL54启动子区域(SEQ ID NO:596)。

图42示出VG001-1-2中插入了PD-L1阻断子的区域(SEQ ID NO:589)。

图43示出VG001-1-2中经修饰的末端重复(terminal repeats,TR)区域(SEQ IDNO:576)，该区域携带编码IL-12、IL-15和IL-15受体α亚单位的表达盒，并具有US2(ICP47)侧翼。

图44为短(S)型启动子A(SEQ ID NO:583)的示意图。

图45为中(M)型启动子A(SEQ ID NO:584)的示意图。

图46为长(L)型启动子A(SEQ ID NO:585)的示意图。

图47为启动子B(survivin)(SEQ ID NO:586)的示意图。

图48A-图48F为VG001-1-2中携带的IL12-IL15-IL15RA1表达盒及其侧翼的序列(SEQ ID NO:576)。

图49A-图49C为VG001-1-2中经修饰的UL54(ICP27)启动子-调控区的序列(SEQ IDNO.596)。

图50A-图50D为VG001-1-2中在UL3和UL4之间的基因区域中插入PD-L1阻断子的序列(SEQ ID No.589)。

图51为VG001-1-2中包含的经修饰的ICP34.5区的序列(SEQ ID NO.599)。

图52为短(S)型启动子A的序列(SEQ ID NO:583)。

图53为中(M)型启动子A的序列(SEQ ID NO:584)。

图54为长(S)型启动子A的序列(SEQ ID NO:585)。

图55为启动子B(survivin)的序列(SEQ ID NO:586)。

图56A-图56B示出VG001-1-2病毒对(A)人类癌细胞、(B)小鼠癌细胞造成细胞毒性的测定结果。

图57A-图57C示出细胞感染VG001-1-2病毒后(A)表达IL-12、(B)表达IL-15、(C)表达PD-L1阻断子。

图58示出对细胞感染VG001-1-2后产生的PD-L1阻断子进行ELISA分析的结果。

图59示出对细胞感染VG001-1-2后产生的PD-L1阻断子进行基于细胞的分析的结果。

图60A-图60D示出IL-12、IL-15/IL-15RA和PD-L1阻断子在体外协同地促进免疫细胞功能。

图61A-图61D示出VG001-1-2病毒肿瘤内接种的效果。

图62A-图62B示出用mVG001-1-2病毒处理肿瘤细胞产生的基因表达和T细胞活性的效果。

图63A-图63D示出mVG001-1-2处理对肿瘤内淋巴细胞群的影响。

图64A-图64B示出最小剂量人IL12或人IL15/IL15RA对免疫细胞功能的影响。

图65A、图65B示出VG001-1-2病毒的生物分布。

图66示出对接受VG001-1-2处理的荷瘤小鼠进行免疫相关基因表达水平定量检测的结果。

图67示出感染不同病毒后的细胞的流式分析结果。

图68示出以不同配方的介质保存的病毒的滴度分析结果。

图69示出病毒表达的不同结构的融合蛋白的稳定性测试结果。

图70示出VG001-1-2载体的结构。

具体实施方式

通过本文中包括的本发明优选实施方式和实施例的如下详细描述可以更容易地理解本文披露内容。

披露概述

通过参照本文中所包括的本发明优选实施方式和实施例的以下详细描述可以更容易地理解本发明。简言之，本文披露内容提供了溶瘤性单纯疱疹病毒1型或2型载体，其表达免疫刺激分子。代表性的载体包含编码一种或多种IL-12、IL-15和IL-15Rα的表达盒。某些载体编码鼠或人IL-12、人IL-15、人IL-15Rα。在某些实施方式中，该载体编码鼠或人IL-12、hIL15和hIL15受体α亚单位。在其他的实施方式中，该载体编码hIL-12、HIL15和HIL15受体α亚单位。这三种蛋白可以在一个、两个或三个转录本上表达。当在同一个转录本上表达时，继而发生的转录后过程导致单个蛋白的表达。在这样的情况下，编码区被编码自剪切肽2A或者IRES序列隔开。该编码区也可以通过双向启动子表达。该HSV载体可选地表达其能够分泌的一种或多种PD-L1阻断肽。

A.

溶瘤病毒是一种优选地以选择性方式裂解癌细胞的病毒(oncolysis)。在分化细胞中选择性复制超过非分化细胞的病毒经常是溶瘤性的。适合用于本文的溶瘤病毒包括单纯疱疹病毒1和2，也可以包括非人的疱疹病毒，例如BHV或者其他。

单纯疱疹病毒(HSV)1和2是感染人的疱疹病毒科的成员。HSV基因组含有两个独特区，其被称为长独特(UL)区和短独特(US)区。这些区域中每一个的侧翼具有一对反向末端重复序列。存在75种已知的开放阅读框。该病毒基因组已被工程化改造以开发用于例如，癌症治疗中的溶瘤病毒。可以通过HSV ICP34.5(也被称作γ34.5)基因的突变实现HSV的肿瘤选择性复制。HSV含有ICP34.5的两个拷贝，已知使ICP34.5基因的一个或两个拷贝失活的突变体缺少神经毒力，即，非致病的/非神经毒性的并且是溶瘤性的。

适合的溶瘤性HSV可以来源于HSV-1或HSV-2，包括任何实验室毒株或临床分离物。在一些实施方式中，oHSV可以是或者可以来源于实验室毒株HSV-1株17、HSV-1株F、或HSV-2株HG52之一。在其他实施方式中，其可以是任何临床分离毒株或其他非实验室毒株JS-1。其他适合的HSV-1病毒包括HrrR3(Goldsten和Weller,J.Virol.62,196-205,1988)；G2O7(Mineta等人，Nature Medicine.1(9):938-943,1995；Kooby等人，The FASEB Journal,13(11):1325-1334,1999)；G47Delta(Todo等人Proceedings of the National Academy ofSciences.2001；98(11):6396-6401)；HSV 1716(Mace等人Head&Neck,2008；30(8):1045-1051；Harrow等人，GeneTherapy.2004；11(22):1648-1658)；HF10(Nakao等人，CancerGeneTherapy.2011；18(3):167-175)；NV1020(Fong等人，Molecular Therapy,2009；17(2):389-394)；T-VEC(Andtbacka等人，Journal of Clinical Oncology,2015:33(25):2780-8)；J100(Gaston等人，PloS one,2013；8(11):e81768)；M002(Parker等人，Proceedings ofthe National Academy of Sciences,2000；97(5):2208-2213)；NV1042(Passer等人，Cancer Gene Therapy.2013；20(1):17-24)；G2O7-IL2(Carew等人，Molecular Therapy,2001；4(3):250-256)；rQNestin34.5(Kambara等人，Cancer Research,2005；65(7):2832-2839)；G47Δ-mIL-18(Fukuhara等人，Cancer Research,2005；65(23):10663-10668)；以及在题为“HSV Vectors with Enhanced Replication in Cancer Cells(在癌细胞中增强复制的HSV载体)”的PCT/US2017/030308和题为“Compositions and Methods of UsingStat1/3Inhibitors with Oncolytic Herpes Virus(利用Stat1/3抑制子和溶瘤性疱疹病毒的组合物和方法)”的PCT/US2017/018539等PCT申请中披露的那些载体，上述全部内容以引用方式结合与本文作为参考。

oHSV载体可以具有至少一个γ34.5基因的修饰、突变、或缺失。该载体缺少完整的γ34.5基因。在一些实施方式中，两个基因均缺失、发生突变或经修饰。在其他实施方式中，一个基因缺失而另一个基因发生突变或经修饰。能够缺失任一个内源(native)γ34.5基因。在一种实施方式中，包含γ34.5基因和ICP4基因的末端重复区域缺失。突变(例如核苷酸改变、插入和缺失)使得该基因不可表达或者产物失活。可以用miRNA靶序列在其3’UTR中对γ34.5基因进行修饰。该靶序列结合在肿瘤细胞中的表达低于在其正常对照物中表达的miRNA。在一些实施方式中，体外构建该经修饰的或突变的γ34.5基因并将其插入到oHSV载体中作为病毒基因的替代物。当该经修饰的或突变的γ34.5基因仅替代一个γ34.5基因时，另一个γ34.5基因缺失。γ34.5基因可以包含另外的变化，例如具有外源启动子。

oHSV可以具有另外的突变，其可以包括失能突变(例如，缺失、取代、插入)，其会影响病毒的毒力或其复制的能力。例如，可以在ICP6、ICPO、ICP4、ICP27、ICP47、ICP 24、ICP56中的任意一种或多种中进行突变。优选地，这些基因(可选地在其中适合的该基因的两个拷贝中)之一中的突变会导致HSV不能表达相应的功能性多肽(或该能力下降)。在一些实施方式中，用在靶细胞中选择性激活的，或者在诱导子递送后可诱导的或在细胞事件后或特定环境中可诱导的启动子来替代病毒基因的启动子。在特定的实施方式中，肿瘤特异性启动子驱动HSV复制至关重要的病毒基因的表达。在某些实施方式中，ICP4或ICP27或二者的表达受到外源启动子的控制，例如，肿瘤特异性启动子。示例性的肿瘤特异性启动子包括生存素(survivin)或端粒酶(telomerase)；其他适合的肿瘤特异性启动子可以特异于单一肿瘤类型并且是本领域已知的。可以存在其他元件。在一些情况下，存在增强子(例如NF-kB/OCT4/SOX2增强子)，例如在ICP4或ICP27或二者的调控区中。而且，5’UTR可以是外源性的，例如来自生长因子基因(例如FGF)的5’UTR。

oHSV还可以具有非HSV来源的基因和核苷酸序列。例如，oHSV基因组中可以具有编码前药的序列、编码细胞因子或其他免疫刺激因子的序列、肿瘤特异性启动子、可诱导的启动子、增强子、与宿主T细胞同源的序列、以及其他序列。示例性的序列编码IL12、IL15、OX40L、PD-L1阻断子或PD-1阻断子。对于编码产物的序列，其操作性地连接至表达所需或者所期望的启动子序列和其他调控序列(例如，增强子、多腺苷酸化信号序列)。

病毒基因的调控区可以被修饰以包含影响表达的应答元件。示例性的应答元件包括NF-κB、Oct-3/4-SOX2、增强子、沉默子、cAMP应答元件、CAAT增强子结合序列和隔离子的应答元件。也可以包括其他应答元件。可以用不同启动子来替换该病毒启动子。该启动子的选择取决于因素的数量，例如想要使用的HSV载体、患者的治疗、基本状态或病况、以及应用诱导子的难易程度(针对可诱导的启动子)。对于癌症治疗，通常当启动子被替换时，其会具有细胞特异性或组织特异性或肿瘤特异性启动子。肿瘤特异性、细胞特异性和组织特异性启动子是本领域已知的。其他基因元件也可以被修饰。例如，可以用外源UTR替换病毒基因的5’UTR。

B.

oHSV载体包含编码一种或多种免疫刺激分子(例如，IL-12、IL-15和IL-15Rα)的核酸序列。序列表中列出了示例性IL-12、IL-15和IL-15Rα的氨基酸序列(SEQ ID NOs:1-6)。编码该氨基酸序列的任意DNA序列是适合的，但通常会针对指定接受oHSV的受试者群体中的优选表达来选择密码子。

1.IL-12

白介素12(IL-12)主要由树枝状细胞、巨噬细胞和单核细胞相应于细菌(例如，脂多糖类)、病原体或活化的T细胞产生。IL-12能够诱导IFNγ产生、细胞增殖，并激活自然杀伤细胞和T细胞。其对于T细胞分化为Th1细胞也是关键的。IL-12还能够抑制肿瘤生长。鼠IL-12对于鼠和人细胞的活性相等，并且均适合于在oHSV载体中使用。

生物学活性IL-12是一种异源二聚体分子，其由通过二硫桥共价连接的35kDa(p35)和40kDa(p40)亚单位构成。两个亚单位的同时表达对于产生异源二聚体是必要的。在oHSV载体中，IL-12表达可以多种方式实现。能够在单独的构建体中表达两个亚单位，每一个具有一个启动子，或者在一个构建体中从双向启动子开始表达，或者从一个在编码区中具有例如IRES或自切割肽的元件的构建体开始表达。可替代地，该亚单位能够作为单链表达。例如，能够通过将p40和p35的编码区与接头连接来产生能性单链IL-12融合蛋白，该接头通常由Ser或Gly构成或者由Ser和Gly的组合构成，例如Ser5、(Gly4Ser)3或Gly6Ser(例如，Lieschke等人，Nature Biotechnology 15:35,1997；Lode等人，PNAS 95:2475,1998；替代性融合构建体还参见WO 2015/095249)。通常以使得该结构与具有最大的灵活度的方式选择接头的序列和长度(Chen等人，Adv Drug Deliv Rev.65:1357,2013)。能够利用计算机程序来选择接头序列。一种这样的程序被称作LINKER(Crasto和Feng，Protein EngDesign&Selection 13:309)。一种示例性的单链IL-12具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。可以进行氨基酸取代、插入和缺失，只要该IL-12保持功能即可。

2.IL-15

IL-15是一种调控自然杀伤细胞以及T细胞激活和增殖的细胞因子，并且能够具有其他的生物学活性。存在信号肽序列不同并且具有完全相同的成熟蛋白序列的两种同种型,。具有较长信号肽的同种型的序列(有时被称作LSP-IL15)的GenBank(NCBI)登陆号为NP000576，而具有较短信号肽的同种型的序列(有时被称作SSP-IL15)的登陆号为NP 751915。任一同种型都适合于在oHSV载体中使用。可以存在氨基酸插入、缺失和取代，例如在多态性中发现的，只要该蛋白结合IL-15即可。

在一些实施方式中，IL-15和IL-15Rα均具有选择性二聚体化的卷曲螺旋的C-末端肽。文献中教导了大量适合的肽(参见，例如，Tripet等人，Protein Engineering9:1029,1996；Aronsson等人,Sci Rep 5:14063,2015)。通常，卷曲螺旋的氨基酸序列具有hpphppp形式的疏水性(h)和极性(p)残基的七肽重复。两种示例性的卷曲螺旋为K螺旋(KVSALKE,SEQ ID No.7)和E螺旋(EVSALEK,SEQ ID NO.8)。通常，使用3-6个串联拷贝。在本文中的一些实施方式中，均使用5个串联拷贝。K5(KVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKE,SEQ IDNO.9)和E5(EVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEK,SEQ ID NO.10)。K螺旋和E螺旋被设计为带有相反电荷，因此IL-15与一种卷曲螺旋融合，而IL-15Rα则融合至带相反电荷的卷曲螺旋。SEQ ID NO:12中示出了融合于E5的示例性Sushi结构域，SEQ ID NO:13中示出了融合于E5的示例性IL-15Rα变体4，SEQ ID NO:14中示出了融合于E5的示例性IL-15Rα变体1，以及SEQ ID NO:15中示出了融合于K5的示例性IL-15。

3.IL-15Rα亚单位

白介素-15受体α亚单位(IL-15Rα)是结合IL-15的复合物的三个亚单位之一。该α亚单位以高亲和性结合IL-15并且能够独立于其他亚单位独立地结合于IL-15。存在至少四种变体(同种型)，本文中称作变体1(NP 002180.1)(SEQ ID NO:3)；变体2(NP 751950.2)(SEQ ID NO:4)；变体3(NP 001230468.1)(SEQ ID NO:5)；和变体4(NP_001243694)(SEQ IDNO:6)。α亚单位含有Sushi结构域(aka补体调节蛋白(complement control protein，CCP)、短同源重复序列(short consensus repeats，SCRs)或SUSHI重复)，其是保留IL-15结合活性的最短区域。典型的Sushi结构域为约60-70个氨基酸，其含有含有形成两个二硫键的四个半胱氨酸并且在蛋白质-蛋白质相互作用中是共有基序。IL-15Rα的Sushi结构域包含残基31至约95(对应于变体1)(SEQ ID NO:11)。Sushi结构域在其他变体中的位置是已知的。sIL-15Rα中半胱氨酸的氨基酸取代消除了其抑制急性炎症的能力并且T细胞在体内响应于同种异型抗原(Wei等人，J Immunol.167:277,2001)。

oHSV载体包含编码IL-15Rα、IL-15Rα的变体或Sushi结构域的核酸序列。通常，该蛋白由先导肽表达，而在一些实施方式中，该先导肽来自IL-15Rα。其他的先导肽是本领域已知的。可以存在氨基酸取代，只要该蛋白结合IL-15即可。自然替代、多态性是已知的。

4.PD-L1阻断肽

程序性死亡配体1(PD-L1)在抑制免疫系统方面起作用，可能是由于结合PD-1受体的作用。阻断蛋白质-蛋白质相互作用已经显示出能够改善癌症治疗。

oHSV载体可以表达PD-L1阻断肽。适合的肽包括TAHPSPSPRSAGQF(SEQ IDNO:16)、EYRMSPSNQT(SEQ ID NO:17)、YYRMSPSNQT(SEQ ID NO:18)、TRYPSPSPKPEGRF(SEQ ID NO:19)和WNRLSPSNQT(SEQ ID NO:20)。其他适合的肽包括表4中列出的那些(SEQ ID NOs:21-500)。通常，阻断肽由先导序列表达。先导序列是本领域公知的。其包括免疫球蛋白κ链先导序列(METDTLLLWVLLLWVPGSTG；SEQ ID NO:501)和IL-2先导序列(MYRMQLLSCIALSLALVTNS；SEQ ID NO:502)。当存在多于一个阻断肽时，该肽通常会被赋予柔性的连接肽分离。该接头通常为Gly或Ser或者富含Gly/Ser。在(SEQ ID NOs:503-519)中示出了适合接头的实例(还参见，Chichili等人，Protein Science 22:153,2013)。可以有一个肽拷贝或者两个拷贝或者三个拷贝或者更多拷贝。多个拷贝通常是随机的并且可以在拷贝之间具有接头。该阻断肽构建体还可以在肽的C-末端包含Fc序列，或者具有或不具有铰链区的免疫球蛋白Fc序列。尽管任何Fc区都是用，但是通常，Fc会是来自IgG亚类之一，例如，人IgG1、人IgG2、人IgG3，以及人IgG4或其鼠对应物。

C.

分子IL-12、IL-15和IL-15Rα在oHSV载体中能够具有各种个不同构造。例如，每一个分子可以各自地从单独的启动子/调控区表达或者从一个或两个单独的启动子/调控区共表达。

在某些实施方式中，该分子中的两种或三种在单个转录本中从一个启动子表达并且它们的编码序列被IRES(内部核糖体进入位点)序列。IRES区吸引真核核糖体翻译起始复合体并因此使得翻译起始能够在mRNA的中部进行并且独立于常用的5’-端帽结构。适合的IRES序列是公知的并且许多适合的IRES序列能够在经实验确认的IRES序列的IRESite’s表达碱基中找到(参见，例如，http://iresite.org/IRESite_web.php？page＝browse_plasmids；2016年5月26日收稿)。

在各种实施方式中，这三种基因以任意顺序存在并且被一个或多个IRES序列隔开。该IRES序列可以相同或者不同。在基因/IRES连接点或IRES/IRES连接点出可以存在另外的序列。

在某些实施方式中，该分子中的两种或三种在单个转录本中从一个启动子表达，并且它们的编码序列被一个或多个自剪切肽2A隔开。这些肽为短肽(约18-22个氨基酸)并且在编码序列之间插入到框内。在翻译期间，核糖体跳过了在2A肽C-端的甘氨酰-脯氨酰肽键的合成，导致2A肽和其相邻最接近下游蛋白之间的切割。因此，它们从相同mRNA产生等摩尔水平的多种基因产物。该"切割"在C-端处的gly-pro残基之间发生，这意味着上游顺反子将会具有加入到其其C-末端的另外残基，而下游顺反子则从脯氨酸开始。SEQ ID NOs:520-535中示出了示例性的p2A肽序列。

影响分子的共表达的其他方式是使用双向启动子。双向启动子是人基因组的共有特征(Trinklein等人，Genome Res 14:62,2004)。双向启动子在两个方向上启动转录并且通常含有调控两种基因的共用元件。除了天然双向启动子之外，已经合成了双向的启动子。一种这样的启动子是bi-CMV。pBI-CMV1是一种哺乳动物双向表达载体，其使得感兴趣的两种蛋白能够组成性表达。蛋白质表达由两种组成性型活化的最小人巨细胞病毒启动子(相反取向的PminCMV1和PminCMV2)驱动。双向CMV启动子示的例性的DNA序列为SEQ IDNO.536。

双向启动子(例如，bi-CMV启动子)主要用于实现hIL15和IL-15Rα(或Sushi结构域)的共表达。当两个分子利用IRES或p2A序列共表达时，通常其为hIL15和IL-15Rα(或Sushi结构域)。在这些情况下，可以利用双向启动子或者作为具有IRES或p2A序列的多顺反转录本共表达IL-12和PD-L1阻断肽，或者其可以从它们自己的启动子/调控区单独表达。

可以使用其他启动子。细胞启动子、病毒启动子等是适合的。该启动子可以是组成型的或可诱导的或细胞/组织特异性的。许多启动子是公知的。可以使用的一种特定启动子是组成型EF-1α启动子。

序列被组装在一个或多个表达盒中。实例提供了示例性的一些表达盒的特定版本。可将该表达盒在不会破坏关键功能(例如，复制)的任意位置插入到HSV基因组中。在某些实施方式中，在首次缺失重复区之后在内部或者末端重复区中插入该表达盒。其他适合的插入区域包括在病毒基因之间，例如，UL3和UL4病毒基因之间、UL50和UL51基因之间、以及在US1和US2之间。

在某些实施方式中，在病毒基因(例如，UL3和UL4、UL50和UL51和/或US1和US2)之间插入表达PD-L1阻断肽的表达盒。在其他实施方式中，插入表达IL-12、IL-15和IL-15Rα的表达盒代替该末端重复区以及在UL3和UL4基因之间插入表达PD-L1肽的表达盒。

D.

提供了可以用于预防、治疗或减轻疾病影响的治疗组合物，所述疾病例如，例如，癌症。更具体地，提供了包含至少一种如本文中所述的溶瘤病毒的治疗组合物。代表性实例包括具有一种或多种IL12、IL15和/或IL受体15α亚单位的表达盒的oHSV。在一种实施方式中，该表达盒表达所有IL12、IL15和IL受体15α亚单位。在优选的实施方式中，该表达盒包含鼠或人IL12、hIL15和hIL15受体α亚单位。

在某些实施方式中，该组合物进一步包含可药用载体。短语“可药用载体”意指包含不会干扰溶瘤病毒生物学活性的效力并且对接受给药的受试者无毒的任意溶媒、稀释剂或赋形剂(通常参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,LippincottWilliams&Wilkins；第21版(2005年5月1日and in The United States PharmacopE1A:TheNational Formulary(USP 40–NF 35和增刊)。

在本文中所述的溶瘤病毒的情形下，适合药用的溶媒的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)、各种形式的润湿剂、无菌溶液等等。另外的可药用载体包括凝胶、可生物吸收的基质材料、含有溶瘤病毒的植入元件、或任何其他的溶媒、递送剂或者分散装置或材料。这样的溶媒能够通过常规方法配置并且能够以有效剂量向受试者施用。另外的可药用赋形剂包括，但不限于，水、盐水、聚乙二醇、透明质酸和乙醇。其中也可以包括可药用盐，例如，无机酸盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等等)和有机酸的盐(例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等等)。可以用于将oHSV递送至靶癌细胞的这样的可药用(药品级)溶媒、稀释剂和赋形剂优选地不会在接受该组合物的个体(受试者)中诱导免疫应答(并且优选地以无不当毒性的方式给药)。

能够以各种不同的浓度提供本文中提供的组合物。例如，所提供的溶瘤病毒的剂量范围可以是约10

在本发明的某些实施方式中，可以使用低于标准的剂量。因此，在某些实施方式中，可以向患者施用小于约10

该组合物可以在有益于稳定货架期的温度下储存，该温度包括室温(约20℃)、4℃、-20℃、-80℃，储存在液氮中。由于预期体内使用的组合物通常不具有防腐剂，因此通常在低温下储存。组合物可以干燥形式(例如，冻干)或液体形式储存。

E.

除了本文中红所述的组合物之外，还提供了利用这样的组合物来治疗或缓解癌症的各种方法，包括向受试者施用有效剂量或者有效量的如本文所述HSV载体的步骤。

术语“有效剂量”和“有效量”是指足以影响目标癌症治疗的溶瘤病毒的量，例如，有效减少目标肿瘤尺寸或载荷的量、或者妨碍靶标肿瘤细胞生长速率的量。更具体地，这样的术语是指，以必要剂量和治疗期间施用，有效达到期望结果的溶瘤病毒的量。例如，在治疗癌症的情形中，本文所述组合物的有效量是引起环节、减小肿瘤负荷和/或防止肿瘤扩散或癌症生长的量。有效量可以根据各种因素变化，例如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重，以及药物配方、施用途径等等，但能够由本领域技术人员常规地确定。

向诊断患有癌症或疑似患有癌症的受试者施用该治疗组合物。受试者可以是人或非人动物。

该组合物用于治疗癌症。如本文中使用的，术语“治疗”或“处理”意指用于获得有益或期望结果的过程，包括临床结果。有益的或期望的临床结果可以包括，但不限于，可检测的或不可检测的疾病的一种或多种症状或病况的缓解或改善、疾病程度的减轻、疾病的稳定(即，未恶化)状态、防止疾病扩散、延迟或减慢疾病发展、疾病状态的缓解或减轻、疾病复发的减少以及控制(部分或全部)。术语“治疗”和“处理”也可以意指相比于不接受治疗的预期存活期而言，存活期延长。

癌症的代表性形式包括癌(carcinomas)白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和肉瘤。进一步的实例包括，但不限于，胆管癌、脑癌(例如，胶质母细胞瘤)、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、CNS癌症(例如，听神经瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤(ependymoma)、胶质母细胞瘤、血管母细胞瘤、髓母细胞瘤、网囊瘤、神经母细胞瘤、少突胶质瘤、松果体瘤和视网膜母细胞瘤)、子宫内膜衬(endometrial lining)癌、造血细胞癌(例如，白血病和淋巴瘤)、肾癌、喉癌、肺癌、肝癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌(例如，黑素瘤和鳞状细胞癌)和甲状腺癌。癌症可以包含实体瘤(例如，肉瘤例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤和骨肉瘤)、弥漫性癌症(例如，白血病)、或这些的一些组合(例如，同时具有实体瘤和弥漫性或弥散性癌细胞的转移性癌症)。癌症能够对于常规治疗具有抗性(例如，常规化疗和/或放疗)。

也可以治疗良性肿瘤和不希望的细胞增殖的其他病症。

本文中所述的oHSV可以通过如下途径给予，例如，口服、局部、肠胃外、全身、动静脉内、肌内、眼内、鞘内、瘤内、皮下或经皮给药。在某些实施方式中，可以通过套管、通过导管、或通过直接注射递送该溶瘤病毒。施用的部位可以是瘤内或远离肿瘤的位置。施用的途径经常取决于待治疗癌症的类型。

本领域内的主治医师基于患者的表达、患者观察加过和各种临床因素，包括例如受试者体型、体表面积、年龄、性别和所施用的特定溶瘤病毒、施用的时间和途径、待治疗的癌症类型、患者的总体健康状况以及患者经历的其他药物治疗，能够容易地确定溶瘤病毒的最佳或适当剂量方案。根据某些实施方式，利用本文所述溶瘤病毒对受试者进行可以与其他类型的治疗联用，例如化疗，例如，利用化疗剂例如依托泊苷、异环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强力霉素等等。

可将oHSV配制成用于临床应用的药物和药物组合物并且可将其与可药用载体、稀释剂、赋形剂或辅料组合。该配方至少部分地取决于施用的途径。适合的配方可以包含无菌培养基中的病毒和抑制剂。该配方可以是流体、凝胶、贴剂或固体形式。可将配方提供给受试者或者医疗专业人士。

优选地施用治疗有效的量。这是一种足以对受试者显示出益处的用量。所施用的实际用量和给药时程将至少部分地取决于癌症的性质、受试者的情况、递送位点以及其他因素。

在本发明的另外实施方式中，溶瘤病毒可以瘤内施用，或者手术切除肿瘤前后施用。

以下实施例是以举例说明的方式提供，而不是以限制的方式提供。

实施例

所有的构建体均利用标准的重组技术产生，包括化学合成。

实施例1

示例性的OHSV载体的示意图

图1A和图1B提供了代表性oHSV载体的示例性示意图。

实施例2

示例性构建体

在本实施例中，提出了各种构建体及其序列。

hVG001-1-2包含经修饰的ICP34.5区(图2；SEQ ID NO.572)、经修饰的UL54启动子-调控区(图3；SEQ ID NO.573)、在UL3和UL4之间的基因区域中插入PD-L1阻断子(图4；SEQ ID No.574)、以及携带编码IL-12、IL-15和IL-15受体α亚单位的表达盒的经修饰的末端重复(TR)区(图5；SEQ ID NO.575)。所述病毒还具有经修饰的和部分缺失的ICP 34.5区。

除了mVG001-1-2在病毒基因组上的相同位置中携带小鼠版本的IL-12和小鼠PD-L1阻断子之外，mVG001-1-2与人版的hVG001-1-2在功能上完全相同，其中hVG001-1-2携带人IL-12和人PD-L1阻断子。

实施例3

后续实施例中使用的缩写

TF-Fc：融合至Fc并且用于构建VG001-1-2的PD-L1阻断肽(TF)。

IL-TF-Fc：携带IL-12、IL-15和PD-L1阻断子的质粒。

HSV-345：ICP34.5-缺失的病毒。

OS-ICP27 2-11：具有Oct4/Sox2结合位点和在不用于构建VG001-1-2的ICP27(OS-ICP27)的启动子-调控区中插入的surviving启动子(OS)的ICP34.5-缺失的病毒。

OS-ICP27 5-7：具有不用于构建VG001-1-2的OS-ICP27突变的ICP34.5-缺失的病毒。

NO-ICP27 1-4-4(也被称作NO-ICP27-145)：具有NF-kB应答元件和在ICP27的转录起始位点的上游145bp处插入到不用于构建VG001-1-2的ICP27(NO-ICP27)的启动子-调控区中的Oct4/Sox2结合位点(NO)的ICP34.5-缺失的病毒。

NO-ICP27 5-2-2(也被称作NO-ICP27-99)：具有NF-kB应答原件和在ICP27的转录起始位点的上游99bp处插入到不用于构建VG001-1-2的ICP27(NO-ICP27)的启动子-调控区中的Oct4/Sox2结合位点(NO)的ICP34.5-缺失的病毒。

VG001-1.7(也被称作HSV 1-VG 001-1.7)：用于构建VG001-1-2的骨架(backbone)病毒(携带外源启动子且poly(A)侧翼(flank)在病毒基因组的缺失的末端重复区中具有空MCS的NO-ICP27 1-4-4突变体，该病毒基因组的缺失的末端重复区随后被用于插入插入IL-12/IL-15表达盒)。

VG001-15h(也被称作VG001-1-2-15h)：携带人IL-15的VG001。

VG001-1215h(也被称作VG001-1-2-1215h)；携带人IL-12和人IL-15的VG001。

VG001-PLBh(也被称作VG001-1-2-PLBh)：携带插入到UL3和UL4之间的基因间区域中的人PD-L1阻断子的VG001。

8-8-15RA1-PDL1b：携带人IL-15和人PD-L1阻断子的VG001。

VG001-1-2-1215PLBm(也被称作mVG001-1-2)：携带小鼠IL-12、人IL-15和小鼠PD-L1阻断子的VG001。

VG001-1-2-1215PLBh(也被称作hVG001-1-2或VG001-1-2)：携带人IL-12、人IL-15和人PD-L1阻断子的VG001。

实施例4

细胞被HVG001-1-2感染后IL-12的表达

在本实施例中，示出了IL-12表达的蛋白质印迹分析和ELISA表达。

图6A示出了VG001-1-2-1215PLBh病毒感染的蛋白质印迹分析结果。用VG001-1-2-1215PLB或VG001-1.7病毒(MOI＝1)感染H460肿瘤细胞24小时。制备细胞裂解液，上样至12％ SDS-PAGE凝胶，并将其转移至PVDF膜。用抗-人IL-12抗体对该膜进行印记分析，之后通过HRP-缀合的抗-小鼠IgG二抗进行分析，并利用Bio-Rad ImageLab系统检测和分析图像。

图6B-图6C示出了VG001-1-2-1215PLBh病毒感染后人IL-12的产生上调。用VG001-1-2-1215PLB或VG001-1.7病毒(MOI＝1)感染LS174T或H460肿瘤细胞48小时。收获感染的细胞上清并将其结合至涂覆有抗-人IL-12捕获抗体的96-孔Immuno Maxisorp平底板。经由生物素化的抗-人IL-12抗体、亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)、和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)底物检测结合。利用读板器在450nm处收集吸光度测量结果。基于人IL-12标准曲线计算经培养的上清中人IL-12的浓度。

实施例5

细胞被HVG001-1-2感染后IL-15的表达

在本实施例中，示出了IL-15表达的蛋白质印迹分析和ELISA表达。

图7A示出了VG001-1-2-1215PLBh病毒感染后的蛋白质印迹分析结果。用VG001-1-2-1215PLB或VG001-1.7病毒(MOI＝1)感染H460肿瘤细胞24小时。制备细胞裂解液，上样至12％ SDS-PAGE凝胶，并将其转移至PVDF膜。用抗-人IL-15抗体对该膜进行印记分析，之后通过HRP-缀合的抗-小鼠IgG二抗进行分析，并利用Bio-Rad ImageLab系统检测和分析图像。

图7B-图7C示出了VG001-1-2-1215PLBh病毒感染后人IL-15产生被上调。用VG001-1-2-1215PLB或VG001-1.7病毒(MOI＝1)感染LS174T或H460肿瘤细胞48小时。收获感染的细胞上清并结合于涂覆有抗-人IL-15捕获抗体的96-孔Immuno Maxisorp平底板。经由生物素化的抗-人IL-15抗体、亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)底物检测结合。利用读板器在450nm处收集吸光度测量结果。基于人IL-15标准曲线计算经培养的上清中人IL-15的浓度。

实施例6

细胞被HVG001-1-2感染后IL-4的表达

在本实施例中，示出了IgG4表达的蛋白质印迹分析和ELISA表达。

图8A示出了VG001-1-2-1215PLBh病毒感染后的蛋白质印迹分析结果。用VG001-1-2-1215PLB或VG001-1.7病毒(MOI＝1)感染H460肿瘤细胞24小时。制备细胞裂解液，上样至12％ SDS-PAGE凝胶，并将其转移至PVDF膜。用HRP-缀合的抗-人IgG抗体对膜进行印记分析，并利用Bio-Rad ImageLab系统检测和分析图像。

图8B-图8C示出了VG001-1-2-1215PLBh病毒感染后人PD-L1阻断子(融合至人Fc区)产生被上调。用VG001-1-2-1215PLB或VG001-1.7病毒(MOI＝1)感染LS174T或H460肿瘤细胞48小时。收获感染的细胞上清并结合于涂覆有抗-人IgG4捕获抗体的96-孔ImmunoMaxisorp平底板。经由生物素化的抗-人IgG4抗体、亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)、和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)底物检测结合。利用读板器在450nm处收集吸光度测量结果。基于人IL-4标准曲线计算经培养的上清中人IL-4的浓度。

实施例7

包含PD-L1阻断肽的构建体

用Igκ链先导序列(SEQ ID NO:501)产生PD-L1阻断肽。当同一构建体中具有两种或更多种阻断肽时，将其与富含Gly-Ser的序列(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:503)连接。制备以下构建体。

仅TF：METDTLLLWVLLLWVPGSTGTAHPSPSPRSAGQF(SEQ ID NO:537)；

ET+TF：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGEYRMSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTAHPSPSPRSAGQF(SEQ IDNO:538)；

YT+TF：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGYYRMSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTAHPSPSPRSAGQF(SEQ IDNO:539)；

小鼠TF：METDTLLLWVLLLWVPGSTGTRYPSPSPKPEGRF(SEQ ID NO:540)；

小鼠WT+TF：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGWNRLSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTRYPSPSPKPEGRF(SEQ IDNO:541)。

Triple TF+ET：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGTAHPSPSPRSAGQFTAHPSPSPRSAGQFTAHPSPSPRSAGQFGGGGSGGGGSGGGGSEYRMSPSNQTEYRMSPSNQTEYRMSPSNQT(SEQ ID NO:542)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGEYRMSPSNQTEYRMSPSNQTEYRMSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTAHPSPSPRSAGQFTAHPSPSPRSAGQFTAHPSPSPRSAGQF(SEQ ID NO:543)。

利用IL-2信号序列(MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:502)、和人IgG4 Fc区(具有铰链区)(SEQ ID NO:544)或鼠IgG1 Fc区(具有铰链区)(SEQ ID NO:545)来制备其他的构建体。该构建体为：

仅TF：

MYRMQLLSCIALSLALVTNSTAHPSPSPRSAGQFISAMVRSPPCPSCPAPEFLGG

PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTK

PREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPR

EPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:546)

ET+TF：

MYRMQLLSCIALSLALVTNSEYRMSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTAHPSPSPRSAGQFISAMVRSPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO:547)

YT+TF：

MYRMQLLSCIALSLALVTNSYYRMSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTAHPSPSPRSAGQFISAMVRSPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO:548)

小鼠TF：

MYRMQLLSCIALSLALVTNSTRYPSPSPKPEGRFISAMVRSGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:549)

小鼠WT+TF：

MYRMQLLSCIALSLALVTNSWNRLSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTRYPSPSPKPEGRFISAMVRSGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ IDNO:550)。

实施例8

在双向CMV启动子的控制下包含IL-15和IL-15Rα的构建体

在本实施例中，产生了各种构建体以在双向CMV启动子的控制下共表达IL-15和IL-15Rα。

在构建体1中，bi-CMV启动子驱动IL-15Rα和IL-15的Sushi结构域的表达(图9，SEQID No.557)。

在构建体2中，bi-CMV启动子驱动IL-15和IL-15Rα变体4的表达(图10，SEQIDNo.558)。

在构建体3中，bi-CMV启动子驱动IL-15-K5和IL-15RαSushi结构域-E5的表达(图11，SEQ ID No.559)。

在构建体4中，bi-CMV启动子驱动IL-15-K5和IL-15Rα变体4-E5的表达(图12，SEQID No.560)。

实施例9

在EF1α启动子控制下包含IL-15和IL-15Rα基因的构建体

在本实施例中，产生各种构建体以在EF1α启动子(SEQ ID NO:551)的控制下在多顺反子转录本中表达IL-15和IL-15Rα。IL-15和IL-15Rα通过示例性IRES序列(SEQ ID NO:552)连接。

在构建体1中，EF1α启动子控制IL-15-IRES-IL-15RαSushi结构域的表达(图13，SEQ ID No.561)。

在构建体2中，EF1α启动子控制IL-15-IRES-IL-15Rα变体4的表达(图14，SEQ IDNo.562)。

在构建体3中，EF1α启动子控制IL-15K5-IRES-IL-15RαSushi结构域E5的表达(图15，SEQ ID No.563)。

在构建体4中，EF1α启动子控制IL-15K5-IRES-IL-15Rα变体4E5的表达(图16，SEQID No.564)。

实施例10

在CMV启动子的控制下包含IL-12、IL-15和IL-15Rα基因的构建体

在本实施例中，产生各种构建体以在CMV启动子的控制下在多顺反子转录本中表达IL-12、IL-15和IL-15Rα。IL-12、IL-15和IL-15Rα通过示例性的p2A序列(SEQ ID NO:554)连接。

在构建体1中，CMV启动子(SEQ ID NO:553)控制

IL-12-p2A-IL-15-p2A-IL-15RαSushi结构域的表达(图17，SEQ ID Nos.565,569)。

在构建体2中，CMV启动子控制IL-12-p2A-IL-15-p2A-IL-15Rα变体1的表达(图18，SEQ ID Nos.566,570)。

在构建体3中，CMV启动控制IL-12-p2A-IL-15K5-p2A-IL-15RαSushi结构域E5的表达(图19，SEQ ID Nos.567,571)。

在构建体4中，CMV启动子控制IL-12-p2A-IL-15K5-IRES-IL-15Rα变体1E5的表达(图20，SEQ ID Nos.568,572)。

实施例11

插入到UL3和UL4之间的包含PD-L1阻断子的构建体

在本实施例中，产生构建体以在碱基829和830之间的基因间区域中表达PD-L1阻断肽。在SEQ ID NO:556中，碱基1-675:UL3编码序列；碱基676-829:UL3和UL4之间的区域和PD-L1阻断子盒的上游；碱基830-833:UL3和UL4之间的区域PD-L1阻断子盒的下游；碱基834-1433:UL4编码序列。

实施例12

通过阻断肽抑制人PD-L1结合于PD-1

在4℃将重组体人PD-L1 Fc蛋白涂覆于96-孔平底板的底部过夜。在涂覆板过夜之后，向板的每个孔中加入不同PD-L1阻断子并在室温下孵育2小时，之后加入重组体人PD-1Fc蛋白。随后将生物素化的抗-人IgG抗体和和链霉亲和素-HRP加入到每个孔中，并且通过加入TMB底物来检测人PD-1与PD-L1的结合。通过微读板器在450nm波长处测量显色。通过与非合成的肽对照来计算抑制百分比。图21示出了肽ET、ET+TF、YT、YT+TF、TW、TW+TF、WT、WT+TF和TF以两种不同浓度(3μM和10μM)产生的百分比抑制。在10μM时，抑制范围为约22％至约48％。

实施例13

通过阻断肽结合的阻断PD-L1增强针对肿瘤细胞的细胞毒性

用抗-CD3抗体+人IL-2刺激人外周血单核细胞(PBMC)24小时并且随后与不同的合成PD-L1阻断子和钙黄绿素-AM标记的靶细胞一起孵育4小时。孵育4小时后收获经培养上清的细胞，并且通过微读板器测量释放的钙黄绿素-AM荧光。基于下式计算细胞毒性的百分比：[(样品读数–最小释放)/(最大释放–最小释放)]×100。

图22A-图22B示出了四种不同肿瘤细胞的结果：H460、U87、LS147T和MDA-MB-231细胞。在一些肿瘤细胞上，除了TF之外针对所有肽的细胞毒性统计学显著增加。

实施例14

IL-12和IL-15在细胞因子产生方面的协同效应

人PBMC与培养基对照、仅IL-12、仅IL-15RA、或组合的IL-12、IL-15和IL-15Rα1+中和抗-IL-12或抗-IL-15抗体一起孵育48小时。收获经培养的细胞上清用于通过ELISA测定人IFNγ和TNFα的产生。

图23A和图23B示出了细胞因子产生的结果。IL-12和IL-15Rα1组合导致细胞因子人IFNγ和TNFα的统计学显著增加。抗-IL-12抗体抑制其产生。

实施例15

IL-12和IL-15针对肿瘤细胞在细胞毒性方面的协同效应

人PBMC与肿瘤靶细胞以及培养基对照，仅IL-12，仅IL-15RA，或组合的IL-12、IL-15和IL-15RA1+中和抗-IL-12或抗-IL-15抗体一起孵育24小时。收获经培养的细胞上清用于通过LDH测量细胞毒性。基于下式计算细胞毒性的百分比：[(样品读数–最小释放)/(最大释放–最小释放)]×100。

图24A和图24B示出了IL-12和IL-15一起以统计学显著的方式增加细胞毒性。在MDA-MB-231细胞系上，添加抗-IL-12或IL-15抗体显著减少该效应。

实施例16

病毒VG001-1-2-PLBH和VG001-1-2-15H的体外效力

在本实施例中，将3×10

实施例17

各种构建体的体外效力

图26A-图26D示出了各种构建体的体外测定的结果。

图26A-图26B示出了用携带IL-12、IL-15和PD-L1阻断子的IL-TF-Fc质粒转染细胞的结果。在图26A-图26B中，用IL-TF-Fc质粒DNA转染不同的肿瘤细胞系24小时，并且随后将人PBMC加入到培养物中。24小时后收获细胞上清以用于通过LDH测定定量分析细胞毒性(图26A)，并且在48小时后用于通过ELISA测定来检测人IFNg产生(图26B)。

图26C-图26D示出了用各种包括hVG001-1-2的突变体病毒感染细胞的结果。病毒编码的IL12、IL15和PD-L1阻断子协同地增加IFNg产生和细胞毒性。将H460肿瘤细胞接种到96孔板的每一个孔中并在37℃培养过夜。第二天，用指定病毒以MOI＝1感染接种的细胞24小时。随后将人PBMC加入到培养物中并且共孵育24小时以通过LDH测定评估细胞毒性(图26C)，或者共孵育48小时以通过ELISA评估人IFNg产生(图26D)。对于细胞毒性测定，基于下式计算细胞毒性的百分比：[(实际读数–最小释放)/(最大释放–最小释放)]×100％。收获自仅与培养基一起孵育的肿瘤细胞的上清用作最小释放，而收获自与裂解缓冲液一起孵育的肿瘤细胞的上清用作最大释放。

在图27A-图27E中，用VG001-1-2-1212PLBh(VG001-1-2h)和HSV-345病毒以MOI 0、0.04、0.2、1和5感染一组9种不同的人肿瘤细胞系(+Vero细胞)。利用MTT测定在感染后48小时定量分析细胞活力。

图28A-图28J示出了各种构建体的体外测定的结果。图28A-图28E示出了在小鼠肿瘤细胞系和Vero细胞系上进行的mVG001-1-2和HSV-345的细胞活力测定的结果；图28F-图28J示出了在CT26小鼠肿瘤细胞感染mVG001-1-2或VG001-1.7之后的转基因表达的表征。

在图28A-图28E中，用VG001-1-2m和HSV-345病毒以MOI 0、0.04、0.2、1和5感染一组6只不同小鼠肿瘤细胞系(+Vero细胞)。在感染后48小时，利用MTT测定定量分析细胞活力。

在图28F-图28J中，将3×10

在图29A-图29E中，将3×10

在图30A-图30G中，在感染后72小时且MOI为0至5的条件下，在各种人类癌细胞(包括U87、MCF7、H460、LNCaP、LS174T、MDA、和PC3)中评估VG001-1-2-1215PLBh(hVG001-1-2)病毒的抗肿瘤效果。通过MTT测定定量分析细胞存活百分比。在所测定的全部人肿瘤细胞系中，VG001-1-2-1215PLBh病毒表现出强力的T细胞杀伤能力。

实施例18

VG001-1-2病毒构建体的体内效力

在图31A-图31B中，对A20鼠B-细胞淋巴瘤肿瘤荷瘤BALB/c小鼠进行5次瘤内注射总共1×10

在图31C-图31D中，向CT26鼠结肠癌荷瘤BALB/c小鼠进行5次瘤内注射总共5×10

在图31E-图31G中，评估了小鼠中异种移植人前列腺肿瘤的oHSV治疗。在十二只小鼠的右侧下腹部移植LNCaP人前列腺肿瘤细胞。移植后35天，随机选择组的6只动物两次瘤内注射总共5×10

(hVG001-1-2)病毒，而其余6只动物作为载体对照并且两次注射相等体积的PBS。利用两种不同方法测量肿瘤尺寸。卡尺测量表示为，相比于病毒或PBS时的肿瘤体积，在给定时间点肿瘤体积的倍数变化(图31E)。在研究期间，用VG001-1-2-1215PLBh病毒处理的荷瘤小鼠表现出明显的肿瘤萎缩，在15天结束时肿瘤尺寸减小超过50％，而在相同时间段内用载体处理的小鼠显示出肿瘤体积的大约3倍增加。还利用全动物生物发光成像系统(IVISImaging System；Xenogen,Mountain View,CA)监测了肿瘤生长。对信号强度进行定量分析，作为每秒检测到的所有光子的总和(图31F)。相比于PBS处理的对照，利用IVIS的肿瘤生长的定量成像示出了用oHSV处理的动物中肿瘤尺寸的甚至更显著减小，肿瘤移植后50天利用荧光沉降至不可检测水平(图31G；左侧为两只载体对照，右侧为两只oHSV-处理的小鼠)。

实施例19

HVG001-1-2在细胞系中的复制

图32A-图32C、图33A-图33D和图34A-图34E中的生长曲线和细胞毒性表达示出了hVG001-1-2病毒复制以及亲代HSV-345病毒。这些表达还示出了，相比于人细胞系，该病毒在小鼠肿瘤细胞系中也不生长，但已知HSV-1在小鼠细胞中生长不良。

实施例20

病毒改性的评估

仅用培养基、仅用重组体IL-12、仅用重组体IL-15、或者用具有或不具有抗-IL-12(6mg/ml)或抗-IL-15(0.5mg/ml)中和抗体的IL-12+不同形式的IL-15/IL-15RA1复合物刺激人PBMC48小时。随后针对人IFNg收获经培养的上清并且如图35A和图35B中所示利用ELISA测定人TNFa产生。

为了评估针对肿瘤细胞的细胞毒性，将钙黄绿素-AM-标记的肿瘤细胞与经刺激的人PBMC共同孵育24小时。收获上清以用于测量释放的荧光。将从钙黄绿素-标记的肿瘤细胞收获的上清与仅用作最小释放的培养基一起孵育，并且将收获自钙黄绿素-标记的肿瘤细胞的上清与用作最大释放的裂解缓冲液一起孵育。基于下式计算细胞毒性百分比：[(实际读数–最小释放)/(最大释放–最小释放)]×100％。图35C中示出了U87肿瘤细胞的细胞毒性结果，图35D中示出了MDA-MB-231肿瘤细胞的细胞毒性结果。

实施例21

体外有效表达

仅用培养基、仅用重组体IL-12、仅用重组体IL-15、或者用具有或不具有抗-IL-12(6mg/ml)或抗-IL-15(0.5mg/ml)中和抗体的IL-1+IL-15/IL-15RA1复合物刺激人外周血单核细胞(PBMCs)48小时。随后收获经培养的上清用于人IFNg和人TNFa产生，如图36A和图36B中所示利用ELISA测定。

为了评估针对肿瘤细胞的细胞毒性，将1×10

实施例22

感染VG001-1-2h的肿瘤细胞产生人IL-12、人IL-15/IL15Ra和人IgG4

简言之，将LNCaP细胞移植到裸鼠中并接受溶媒、ICP27-、或VG001-1-2h病毒的注射。在注射后120小时收获血清和肿瘤样品，并通过ELISA评价人IL-12、人IL-15/IL-15Ra和人IgG4的产生。图37A中示出了结果。

将Fadu细胞移植到裸鼠中并接受溶媒、HSV 1-VG 001-1.7或VG001-1-2h病毒注射。在注射后24小时收获肿瘤样品，并通过ELISA评价人IL-12、人IL-15/IL-15Ra和人IgG4产生。图37B中示出了结果。

实施例23

VG001-1-2m在免疫应答中的效果

将CT26结肠癌细胞植入到balb/c小鼠中并接受PBS、HSV 1-VG 001-1.7或VG001-1-2m病毒注射。在注射后24小时收获肿瘤细胞，并通过流式细胞计来测量CD8+T细胞、CD4+T细胞、或NK细胞的百分比。图38A-图38C中示出了结果。

实施例24

另一种示例性构建体

在本实施例中，对构建体进行进一步改造，特别是对位于IL12-IL15-IL15RA1表达盒侧翼的US12(ICP47)启动子区域进行改造，从而提出了另一种构建体及其序列。

VG001-1-2包含经修饰的ICP34.5区(图40；SEQ ID NO.599)、经修饰的UL54启动子-调控区(图41；SEQ ID NO.596)、在UL3和UL4之间的基因区域中插入PD-L1阻断子(图42；SEQ ID No.589)、以及携带编码IL-12、IL-15和IL-15受体α亚单位(IL12-IL15-IL15RA1)的表达盒的经修饰的末端重复(TR)区(图43；SEQ ID NO.576)。IL12-IL15-IL15RA1表达盒所表达的蛋白序列为SEQ ID No.577。SEQ ID No.578-582分别为IL12、IL15、IL15RA1、自剪切连接肽P2A上游、自剪切连接肽P2A的序列。

VG001-1-2携带人IL-12和人PD-L1阻断子。mVG001-1-2为相应的小鼠版本，与VG001-1-2相比，mVG001-1-2除了在病毒基因组上的相同位置中携带的是小鼠版本的IL-12和小鼠版本的PD-L1阻断子之外，在功能上与VG001-1-2完全相同。

对VG001-1-2携带的IL12-IL15-IL15RA1表达盒侧翼的US12(ICP47)启动子区域进行改造，构建多种侧翼US12(ICP47)启动子的版本：短(short,S；SEQ IDNo.583)、中(medium,M；SEQ ID No.584)、长(long,L；SEQ ID No.585)、survivin(SEQ ID No.586)等版本，根据侧翼ICP47启动子版本的不同，相应的VG001-1-2可具体分为VG001-1-2(S)、VG001-1-2(M)、VG001-1-2(L)、VG001-1-2(surviving)等版本。在随后的实施例中，除非另有说明，VG001-1-2是指VG001-1-2(M)，即载体携带的IL12-IL15-IL15RA1表达盒侧翼具有中(M)版本ICP47启动子。VG001-1-2载体的结构示于图70。

实施例25

VG001-1-2的细胞毒性

如图56A所示，用VG001-1-2病毒(MOI为0、0.04、0.2、1、5)感染U87、H460、MCF-7、LS174T和MDA-MB-231等人癌细胞单层，感染后72小时通过MTT测定法对细胞存活百分比进行定量，以评价VG001-1-2的细胞毒性。如图56B所示，用mVG001-1-2病毒(MOI为0、0.04、0.2、1、5)感染四种小鼠肿瘤细胞系B16-F10、4T1、CT26和A20，感染后72小时通过MTT测定法对细胞活力进行定量。

实施例26

VG001-1-2表达的IL12、IL15和PD-L1阻断子的体外表征

如图57所示，用VG001-1-2或其骨架病毒HSV 1-VG 001-1.7(MOI＝1)感染H460人肺癌细胞和LS174T结肠癌细胞24小时。通过免疫印迹(左栏)和ELISA(右栏)定量转基因表达。图57A示出人IL-2的表达，图57B示出人IL-5的表达，图57C示出PD-L1阻断子的表达。

实施例27

VG001-1-2表达的PD-L1阻断子的体外表征

如图58所示，将从VG001-1-2感染的293FT细胞收获的含TF+Fc肽的上清液与重组人PD-1Fc混合，并与人PD-L1 Fc包被的96孔Immuno Maxisorp平底板结合。通过生物素化的抗PD-1抗体、链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP)和3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物检测结合。用读板器在450nm收集吸光度测量值。将人PD-1/PD-L1抑制的增加百分比(％)与无肽样品进行比较。

实施例28

VG001-1-2表达的IL12的体外表征

图59示出TF+Fc肽处理的基于细胞的测定结果。用1μg/ml的PHA和50ng/ml的PMA活化5×10

实施例29

IL-12、IL-15/IL-15RA和PD-L1阻断子协同增强免疫细胞功能

用人PBMC处理过表达IL12、IL15/IL15RA或共表达IL12和IL15/IL15RA的U87人神经胶质瘤细胞和MDA-MB-231人乳腺癌细胞。

图60A示出通过ELISA测定细胞因子IFN-γ和TNF-α的产生。

图60B示出通过LDH测定免疫细胞诱导的细胞毒性。

图60C示出通过病毒编码的IL12，IL15和PD-L1阻断剂协同实现PBMC活化：将H460肿瘤细胞接种到96孔板的每个孔中，并在37℃下培养过夜，然后用MOI＝1的VG001-1-2病毒感染24小时，并与人PBMC共孵育48小时。通过ELISA定量IFN-γ的产生。测试的病毒包括HSV1-VG 001-1.7(无免疫调节剂)，HSV 1-VG001-1.7-PDL1b(PD-L1阻断子)，HSV 1-VG 001-1.7-15RA1(IL15/IL15RA)，HSV 1-VG 001-1.7-RA1-PDL1b(IL15/IL15RA+PD-L1阻断子)，HSV 1-VG001-1.7-h1215(IL12)+IL15/IL15RA)和VG001-1-2(IL12+IL15/IL15RA+PD-L1阻断子)。

图60D示出将PHA活化的人PBMC(n＝4)与重组人PD-L1蛋白和来自VG001-1-2感染细胞的上清液共温育48小时。IL-1和/或IL15的抗体介导的中和与PD-L1阻断剂的耗尽一起进行。与来自未感染细胞的上清液共孵育用作阴性对照。通过ELISA评估人IFN-γ的产生。

实施例30

VG001-1-2肿瘤内接种的体内功效

图61A示出VG001-1-2在U87人胶质母细胞瘤模型中的功效：将U87细胞植入7只裸鼠的下胁腹，然后以2天的间隔两次瘤内注射1×10

图61B示出免疫介导的非注射远端肿瘤的远隔清除：将A20细胞植入免疫活性小鼠的胁腹两侧。将mVG001-1-2或HSV 1-VG 001-1.7骨架病毒以5×10

图61C示出用mVG001-1-2处理的小鼠受到保护，免于CT26肿瘤再攻击：将CT26细胞植入16只免疫活性BALB/C小鼠的下胁腹，其中8只动物随机分配到mVG001-1-2治疗组，另外8只动物分配到载体对照组。在肿瘤植入后21天，所有8只载体对照动物死于肿瘤负荷。mVG001-1-2处理组中没有动物死于肿瘤，但由于非肿瘤相关病症，该组中的4只动物死亡。mVG001-1-2处理组中存活的4只小鼠在注射后90天在相同位置重新植入CT26细胞。

图61D示出与未用mVG001-1-2处理的年龄匹配的对照小鼠相比，在mVG001-1-2处理的动物中CT26再攻毒后7天的肿瘤大小。

实施例31

用MVG001-1-2处理的肿瘤中的基因表达和T细胞活性

如图62所示，向BALB/c小鼠植入CT26肿瘤细胞，然后连续5天以5×10

实施例32

MVG001-1-2处理对肿瘤内淋巴细胞群的影响

如图63A所示，BALB/c小鼠接受CT26细胞植入，8天后分5次注射PBS、HSV1-VG 001-1.7骨架或mVG001-1-2病毒。最后一次注射后24或120小时收获肿瘤。通过流式细胞术分析肿瘤块内不同T细胞亚群(图63B)和免疫抑制细胞(图63C)的百分比。图63D示出用针对CD3和穿孔素的单克隆抗体和针对HSV-1的多克隆抗体，对切下的以PBS对照(载体)或mVG001-1-2处理的CT26肿瘤切片进行免疫组织化学分析。

实施例33

最小剂量人IL12或人IL15/IL15RA对免疫细胞功能的影响

如图64所示，将从转染的293FT细胞上清液中收获的人IL-12与PHA刺激的人PBMC共培养48小时。通过ELISA评估人IFN-γ产生。如图64B所示，用表达人IL12或人IL15/IL15RA的质粒转染293FT细胞48小时，收获上清液并与PHA刺激的人PBMC共培养48小时，通过MTT测定评估细胞增殖。

实施例34

病毒的生物分布

如图65A、图65B所示，对携带LS174T肿瘤的裸鼠以5×10

实施例35

qPCR测量

将小鼠CT26肿瘤细胞植入小鼠中，通过每天注射mVG001-1-2、对照病毒HSV1-VG001-1.7(共5×10

实施例36

感染不同结构的病毒的细胞感染表面MHC的变化

为了解经过启动子改造的VG001-1-2病毒对细胞的影响，分别用VG001-1-2和野生型(VG001-1-2-1215PLBh，ICP47启动子未经改造)病毒以相同的条件感染细胞。

具体而言：将293T细胞铺在6孔板中(1×106细胞/孔)，以加入了10％血清的DMEM培养液培养。待细胞长成单层后，每孔分别加入1×106pfu(MOI＝1)的下列病毒或空白培养液：

a.VG001-1-2病毒(2个孔)

b.野生型病毒(2个孔)

c.只加培养液的不感染对照(2个孔)

病毒感染后将细胞培养过夜，然后以750ul胰蛋白酶消化细胞，加入1ml DMEM,并转移细胞置于流式细胞管，将细胞离心(1500RPM,5min)，去除上清后用2ml PBS洗涤细胞，重复洗涤一次，去除PBS。上述a-c三组各有1孔加入抗MHC(组织相容性复合体)蛋白的抗体(Anti-Hu HLA-ABC):用100ul PBS+2％ FBS悬浮细胞，加入2ul抗体。另外各1孔加100ulPBS+2％ FBS，不加抗体。在黑暗中孵育1小时，去除抗体，用3ml PBS+2％ FBS洗涤细胞，离心细胞(1500RPM,5min)，弃去大部分细胞洗涤液后进行流式细胞分析。结果见图67。

由图67可见，野生型HSV-1病毒感染造成细胞表面MHC蛋白表达量有所降低减。出乎意料的是，感染VG001-1-2病毒的细胞，其MHC表达水平甚至更进一步低于感染野生型HSV-1病毒的细胞。由此可见，相比于野生型病毒，通过改造ICP47启动子，VG001-1-2病毒在感染细胞后能够在更长时间存在于被感染的细胞中躲避免疫细胞攻击，从而可以更好地复制与表达外源基因。

实施例37溶瘤病毒稳定剂的探索性试验

为了优化保存溶瘤病毒的介质，对不同配方的介质进行测试。制备一批VG001-1-2病毒样品，按照表1的配方和条件保存病毒。

表1保存病毒的不同配方的介质

照表1准备样品，放入37℃温箱，48小时后，将上述样品转入-80℃冰箱，直到做病毒滴度检测。其中样品G8在滴定前从-80℃冰箱中取出原始病毒，稀释后与其他七组样品同时做病毒滴定。G8的结果为判定其他组病毒样品稳定性的参考标准。

将Vero细胞按每孔8×10

表2病毒滴定稀释过程

将已经换好不含FBS培养基的六孔板分别从37度培养箱中取出，吸去培养基，每孔加入1ml的稀释液，每个样品做4个复孔(2个六孔板/样品)。每孔1ml病毒稀释液加入后，放入37度培养箱，病毒吸附60分钟，吸出病毒液体，再加入2ml/孔的MEM(无FBS)培养液与甲基纤维素(1.5％)，放入37度培养箱中培养96小时。

96小时后，弃覆盖物，每孔加1ml 4％戊二醛溶液，室温放置30min后弃液，再加入2％结晶紫染色液染色，1ml/孔，室温染色15min，用软化水轻冲洗，晾干。六孔板晾干后，由于病毒引起的死亡细胞不着色，形成白色斑点，在医用观片灯下计数空斑。

结果计算：取孔内空斑数20～150个的孔作为滴度计数，取平均数后乘病毒稀释度，如管6的孔中空斑平均数为20个，即病毒滴度为20×10

测得各组病毒滴度的结果见图68。测试结果表明，在37℃以配方G5保存的病毒活性保持良好，与-80℃保存的病毒的活性基本无区别。虽然通常认为增加蔗糖可以提高病毒液的稳定性，但出乎意料的是，HSV-1溶瘤病毒在有蔗糖存在的情况下，无论是否有甘油存在，都不利于保持病毒活性。

实施例38蛋白在小鼠血清中的稳定性探索性研究

VG001-1-2携带人PD-L1阻断肽(TF)，PD-L1阻断肽的C-末端可包含Fc序列。Fc可来自IgG亚类之一，为了解TF末端融合不同来源的Fc序列所形成的各种融合蛋白的稳定性，进行以下实验。

细胞培养

293细胞用含双抗和10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，在含有5％ CO

质粒提取：对于VG001-1-2，在其PD-L1编码区域末端分别插入编码IgG1 Fc或IgG4Fc片段的序列，得到质粒VG001-1-2-Fc1和VG001-1-2-Fc4，二者分别能够表达融合IgG1 Fc的PD-L1、融合IgG4 Fc的PD-L1。将上述两个质粒用热激法分别转化大肠杆菌BL21，在LB+AMP的细菌培养板上过夜37℃培养，挑出单菌落，放入LB+AMP液体培养基(2-3ml)中37°摇床(150rpm/分)过夜培养。

从上述培养和浑浊的培养基中提取质粒，标记Fc-1和Fc-4，以及提取日期。

在琼脂糖电泳上，鉴定提取质粒的质量，同时用DNA浓度检测仪，检测质粒DNA的浓度。

2.3质粒转染

将293细胞铺在6孔板，放在细胞培养箱中过夜贴壁培养。

将上述两个质粒，根据质粒浓度，按照质粒转染的说明书的方法，混合质粒与质粒转染试剂以及无血清培养基。加入293细胞上，孵育4小时之后，换为6％FBS血清的培养基继续培养48小时。

质粒转染后，于48小时取上清(2ml)。

所有样品上清样品冻在-80℃冰箱。

2.4蛋白与血清的混合

取上述转染后的上清(2mL)和小鼠血清从-80℃取出，放在冰上融化后，按表3的配方制备样品。

表3：混合样品的配置

制备好样品后，样品组G01/G02转入-20℃冰箱保存，其余各组放入37℃温箱，样品组G1/G2在第14天转入-20C冰箱保存，样品组G3/G4在第28天转入-20℃冰箱保存。全部样品收集结束后待ELISA检测。

样品的ELISA检测

样品于冰上解冻。每个样品取出300ul，做ELISA检测，每个孔100ul，每个样品三个重复。按照试剂盒的说明，计算出每个样品中蛋白的含量。

1)用试剂盒中的抗体包被ELISA板，4℃过夜；

2)用试剂盒中的洗液把包被的ELISA板子洗两次，每次洗涤都用吸水纸吸干孔里的液体；

3)加入封闭液，室温封闭2小时；

4)用洗液洗涤两次后，加入配置好的标准曲线和上述样品以及Assay buffer，每个样品2个重复；

5)用封板膜防止孔中液体蒸发，室温放置2小时孵育；

6)孵育结束，用洗涤液洗涤四次，每次均用吸水纸晾干孔中液体；

7)按照试剂盒要求，加入100ul/孔的检测抗体，封板后，室温孵育1小时；

8)孵育结束，用洗涤液洗涤四次，每次均用吸水纸晾干孔中液体；

9)每孔加入100ul底物，室温避光孵育15分钟；

10)每孔再加入100ul终止液，室温孵育10-20分钟；

11)调试ELISA酶标仪，在450nm和570nm的波长下读板；

12)按照试剂盒的要求，分析数据。

根据ELISA结果，判定每个样品中的TF-Fc与ELISA试剂盒中IgG4或者IgG1抗体结合的能力，得出IgG1 Fc与IgG4 Fc融合蛋白在小鼠血清中的稳定性(图69)。

由测试结果可见，与传统的认为相反，TF与IgG1 Fc融合的结构在血清中不如与IgG4 Fc融合的结构稳定。在28天之后，TF-IgG4Fc融合蛋白与PD-L1结合的能力与TF-IgG1Fc融合蛋白相比明显更高，具有统计学显著差异(p＝0.01)。

以下为本文披露内容的其他示例性的实施方式：

1)一种HSV载体，其表达IL12、IL15和/或IL受体15α亚单位中的一种或多种。在一种实施方式中，该HSV载体包含表达IL12、IL15和该IL受体15α亚单位的表达盒。在各种实施方式中，被表达的IL12、IL15和IL15受体α亚单位序列是哺乳动物来源的(例如，鼠或人来源)。在优选的实施方式中，该表达盒表达鼠或人IL12、鼠或人IL15以及鼠或人IL15受体α亚单位。在另外的实施方式中，该表达盒表达鼠或人IL12、hIL15、以及鼠和h15受体α亚单位。

2)实施方式1的HSV载体，其中编码自剪切肽2A的核酸序列位于IL12、IL15和IL15受体α亚单位的编码序列之间的框内。在优选的实施方式中，IL12为鼠或人序列，IL15为人序列并且IL15受体α亚单位为人序列。

3)实施方式2的HSV载体，其中该核酸序列编码选自

VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP、QCTNYALLKLAGDVESNPGP、ATNF-SLLKQAGDVEENPGP、HYAGYFADLLIHDIETNPGP、GIFN-AHYAGYFADLLIHDIETNPGP、KAVRGYHADYYKQRLIHDVEMNPGP、GATNF-SLLKLAGDVELNPGP、EGRGSLLTCGDVEENPGP、AARQMLLLLSGDVETNPGP、FLRKRTQLLMSGDVESNPGP、GSWTDILLLLSGDVETNPGP、TRAEUEDELIRAGIESNPGP、AKFQIDKILISGDVELNPGP、SKFQIDKILISGDIELNPGP、SSIIRTKMLVSGDVEENPGP和CDAQRQKLLLSGDIEQNPGP的自剪切肽2A。

4)实施方式1至3的HSV载体，其中一个或多个IRES序列位于IL12、IL15和IL15受体α亚单位的编码序列之间。在优选的实施方式中，IL12是鼠或人序列，IL15是人序列，以及IL15受体α亚单位是人序列。

5)实施方式1至4的HSV载体，其中该IL15和IL15受体α亚单位利用IRES序列共表达。在优选的实施方式中，IL12是鼠或人序列，IL15是人序列，以及IL15受体α亚单位是人序列。

6)实施方式1至5中任一项的HSV载体，其中该IL15和IL15受体α亚单位通过双向启动子表达。在优选的实施方式中，IL12是鼠或人序列，IL15是人序列，以及IL15受体α亚单位是人序列。

7)实施方式6的HSV载体，其中该双向启动子是bi-CMV。

8)实施方式1至7中任一项的HSV载体，其中IL15和IL15受体α亚单位中的每一个在编码Lys5或Glu5的核酸序列之后。在优选的实施方式中，IL12是鼠或人序列、IL15是人序列、以及IL15受体α亚单位是人序列。

9)实施方式1至8中任一项的HSV载体，其中该hIL15受体α亚单位选自由变体1、变体2、变体3和变体4组成的组。

10)实施方式1至9中任一项的HSV载体，进一步包含一种或多种PD-L1阻断肽的表达盒，或者，其中所述表达盒包含一种或多种PD-L1阻断肽。

11)实施方式1至10中任一项的HSV载体，进一步包含编码多个PD-L1阻断肽之间的肽接头的序列。

12)实施方式1至11中任一项的HSV载体，在多个PD-L1阻断肽之间进一步包含一个或多个IRES序列。

13)实施方式1至12中任一项的HSV载体，进一步包含编码连接至所述PD-L1阻断肽的3’-端的Fc区的序列。

14)实施方式1至13中任一项的HSV载体，其中将表达盒插入到内部重复区或HSV基因组的末端重复区中。

15)实施方式10的HSV载体，其中将编码PD-L1阻断肽的序列插入到病毒基因之间，例如，UL3和UL4病毒基因之间、UL50和UL51基因之间、和/或US1和US2之间。

16)实施方式1至15中任一项的HSV载体，在ICP4或ICP27调控区中进一步包含NFkB和OCT4/SOX2增强元件。

17)实施方式1至16中任一项的HSV载体，其中ICP34.5基因缺失。

18)实施方式1至17中任一项的HSV载体，其中该表达盒包含至少一个双向CMV启动子。

19)实施方式1至18中任一项的HSV载体，其中该表达盒包含至少一个细胞启动子。

20)实施方式1至19中任一项的HSV载体，将该IL12/IL15/IL15受体α亚单位的表达盒插入到内部重复区或末端重复区中，其中原始病毒序列被所述表达盒替换。

21)实施方式1-20中任一项的HSV载体，其中该HSV为HSV-1或HSV-2。

22)实施方式1至21中任一项的HSV载体，其中通过包含在肿瘤细胞中低表达的miRNA的靶序列的3’UTR来调控该ICP34.5基因。

23)一种药物组合物，包含实施方式1至22中任一项的HSV载体，和可药用载体。

24)治疗癌症的方法，包括向患者施用实施方式1至22中任一项的HSV载体，或实施方式23的药物组合物。

25)根据实施方式24的方法，其中所述癌症选自由癌(carcinomas)、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和肉瘤组成的组。

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本文所述的具体方法和组合物代表优选的非限制性实施方式，并且是示例性的而并非意在作为对本发明范围的限制。本领域技术人员在阅读本说明书后，将产生其他目的、方面和实施方式，并且包含在权利要求范围所定义的发明精神中。对于本领域技术人员来说，很容易理解，在不偏离本发明的范围和精神的情况下可以对本文所公开的发明进行不同的替换和修改。本文中适当地说明性地描述的发明可以在没有任何元素或元素、或限制或限制的情况下实施，而这些元素或元素、或限制或限制在本文中不必具体披露。因此，例如，在本文的每一实例中，在本发明的非限制性实施例或实例中，术语“包含”、“包括”、“含有”等将被扩展地和不受限制地理解。本文适当地阐述的方法和方法可以不同的步骤顺序来实施，并且它们不一定限于本文或权利要求中所示的步骤顺序。

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