一种用于宫颈癌原代细胞的培养基和培养方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体而言，涉及用于在体外培养或扩增原代宫颈癌上皮细胞的培养基及培养方法。

背景技术

宫颈癌的发病率和病死率均居全球女性恶性肿瘤的第四位，而在发展中国家中是仅次于乳腺癌的第二大恶性肿瘤。全世界每年发病50万人，我国每年13万人发病，且近来年发病年龄趋于年轻化。目前宫颈癌的手术、放射治疗及化学治疗，已经成为成熟的治疗方法。但对于某些局部晚期宫颈癌患者并未取得令人满意的疗效。随着针对宫颈癌分子靶点的研究深入，新的靶向治疗药物不断涌现，给患者带来了新的希望。但是，目前对宫颈癌有确切疗效的靶向治疗药物还很有限，其远期效果及毒副作用尚待进一步研究。除了基因检测选取靶向药物，体外对宫颈癌病人样本进行原代细胞培养已经成为未来体外预测疗效和指导临床用药的重要手段，但是体外快速获得宫颈癌原代细胞一直是亟待解决的技术问题。

功能性测试是指在体外对抗肿瘤药物在癌症患者细胞上的敏感性进行检测的方法。应用这一方法的关键在于开发生长周期短且能够代表宫颈癌患者自身生物学特性的肿瘤细胞模型。另外，所述细胞模型应操作便捷，能快速高效地预测临床用药的疗效，从而及时给予癌症患者精准用药指导。然而，取自癌症患者的原代肿瘤细胞在体外建立细胞模型的成功率往往很低，生长周期长，并存在成纤维细胞等间质细胞过度增殖等问题，制约着这一领域的发展。目前有两种培养原代上皮细胞/干细胞的技术在肿瘤细胞功能性测试应用领域发展得相对成熟。一种是使用经辐射的饲养细胞和ROCK激酶抑制剂Y27632来促进原代上皮细胞的生长以考察个体患者的药物敏感性的技术，即细胞条件重编程技术(Liu等，AmJ Pathol，180：599-607，2012)。另一种技术是体外3D培养成体干细胞从而获得类似于组织器官的类器官技术(Hans Clevers等，Cell，11，172(1-2)：373-386，2018)。

然而，这两种技术都存在一定的局限性。细胞重编程技术是一种将患者自体原代上皮细胞与鼠源性饲养细胞共培养的技术。在对患者原代细胞进行药物敏感性测试时，这些鼠源性细胞的存在会干扰患者自体原代细胞的药物敏感性检测结果；但如果撤除鼠源性饲养细胞，病人自体原代细胞就脱离了重编程环境，细胞的增殖速率和细胞内信号通路会发生明显的改变(Liu等，Am J Pathol，183(6)：1862-1870，2013；Liu等，Cell Death Dis.，9(7)：750，2018)，从而使患者自体原代细胞对药物的响应结果受到较大影响。类器官技术是将患者自体原代上皮细胞包埋在细胞外基质内进行体外三维立体培养的技术，该技术无需饲养细胞，因此不存在鼠源性饲养细胞的干扰问题。但是类器官技术的培养基内需添加多种特定的生长因子(如Wnt蛋白和R-spondin家族蛋白)，成本昂贵，不适于普及到临床进行大规模应用。另外，类器官在整个培养过程中均需将细胞包埋在细胞外基质胶中，其细胞接种、传代和药物敏感性测试的铺板步骤相较于2D培养操作繁琐费时，且该技术所形成的类器官大小尺寸不好控制，易出现部分类器官生长过大而导致内部发生坏死的情况。因此，类器官技术相较于2D培养技术可操作性和适用性不强，需要专业技术人员操作，不适合大规模广泛应用于临床体外药物敏感性检测(Nick Barker，Nat Cell Biol，18(3)：246-54，2016)。

鉴于以上技术的局限性，临床上需要开发一种原代宫颈癌上皮细胞培养技术，其培养周期短，成本可控，操作便捷，不受外源性细胞干扰。在将该技术应用于构建原代宫颈癌肿瘤细胞模型时，所培养的宫颈癌肿瘤细胞能代表宫颈癌患者自身的生物学特性。通过体外评估抗肿瘤药物在不同癌症患者个体所衍生的细胞模型上的敏感性，来提高临床上抗肿瘤药物的响应率，减少不合适的药物给患者造成的痛苦及医疗资源的浪费。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种用于培养原代宫颈癌上皮细胞的培养基以及使用该培养基的原代宫颈癌上皮细胞的培养方法。采用本发明的原代宫颈癌上皮细胞培养基和培养方法进行细胞培养，能够实现体外培养周期短、成本可控、操作便捷并不受外源性细胞干扰的目的。在该技术应用于构建原代宫颈癌肿瘤细胞模型时，能够获得具有宫颈癌患者自身生物学特性的原代宫颈癌肿瘤细胞，并能够应用于新药筛选和体外药物敏感性检测。

本发明的一个方面在于提供一种用于培养原代宫颈癌上皮细胞的原代细胞培养基，其含有MST1/2激酶抑制剂；选自Y27632、法舒地尔、和H-1152中的至少一种的ROCK激酶抑制剂；成纤维细胞生长因子7(FGF7)；B27添加剂和N2添加剂中的至少一种添加剂；肝细胞生长因子(HGF)；胰岛素样生长因子1(IGF-1)；CHIR99021；和选自A83-01、SB431542、Repsox、SB505124、SB525334、SD208、LY36494、和SJN2511中的至少一种的TGFβI型受体抑制剂，所述MST1/2激酶抑制剂包括式(I)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，

其中，

R

R

R

R

优选的实施方式中，MST1/2激酶抑制剂包括式(Ia)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，

其中，

R

R

R

优选地，所述MST1/2抑制剂是选自以下化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物中的至少一种。

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最优选地，本发明的MST1/2激酶抑制剂为化合物1。

在本发明的实施方式中，MST1/2激酶抑制剂在培养基中的含量通常为2μM～20μM，优选为5μM～20μM。

在又一实施方式中，ROCK激酶抑制剂优选地为Y27632。另外优选的，ROCK激酶抑制剂在培养基中的含量通常为2μM～20μM，优选为10μM。

在优选的实施方式中，所述成纤维细胞生长因子7的含量为2ng/ml～40ng/ml，更优选为10ng/ml～40ng/ml；所述B27添加剂或N2添加剂在培养基中的体积浓度为1:25～1:100，更优选为1:50～1:100；所述肝细胞生长因子的含量为2ng/ml～40ng/ml，更优选为10ng/ml～40ng/ml；所述胰岛素样生长因子1的含量为2ng/ml～40ng/ml，更优选为10ng/ml；所述CHIR99021的含量为1μM～10μM，更优选为1μM～3μM；所述TGFβI型受体抑制剂优选A83-01，且TGFβI型受体抑制剂的含量为50nM～500nM，更优选为100nM～500nM。

本发明的培养基配方还含有选自DMEM/F12、DMEM、F12或RPMI-1640的初始培养基；和选自链霉素/青霉素、两性霉素B和Primocin中的一种或多种的抗生素。在一些的实施方式中，初始培养基优选为DMEM/F12，抗生素优选为Primocin。在进一步优选的实施方式中，Primocin在培养基中的含量为25～400μg/mL，优选为50～200μg/mL。

本发明的培养基配方成分与细胞条件重编程培养基和宫颈癌上皮细胞类器官培养基成分相比，添加了MST1/2激酶抑制剂，且不包含血清、牛垂体提取物等不确定成分，也不包含Wnt激动剂、R-spondin家族蛋白、BMP抑制剂等类器官培养所必须的龛因子，并且不包含烟酰胺(Nicotinamide)和N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine)，从而大大降低了培养基的成本，简化了配制培养基的操作流程，实现了成本可控和操作便捷的原代宫颈癌上皮细胞的体外培养。

本发明中，原代宫颈癌上皮细胞可以为宫颈癌肿瘤细胞、正常宫颈癌上皮细胞、宫颈癌上皮干细胞。

本发明的一个方面在于提供一种原代宫颈癌上皮细胞的培养方法，其包括以下步骤：

(1)按上述配方配制本发明的原代细胞培养基。

(2)用细胞外基质胶稀释液包被培养器皿。

具体地，该细胞外基质胶使用低生长因子型细胞外基质胶，例如，可采用市售的Matrigel(购自康宁公司)或BME(购自Trevigen公司)。更具体而言，用无血清的培养基稀释细胞外基质胶，培养基可以是DMEM/F12(购自康宁公司)。细胞外基质胶的稀释比例为1:50-1:400，优选为1:100-1:200。包被方法为将稀释后的细胞外基质胶加入培养器皿内，使其完全覆盖培养器皿底部，静置包被30分钟以上，优选在37℃条件下静置包被，优选包被时间为30～60分钟。包被结束后吸弃多余的细胞外基质胶稀释液，培养器皿备用。

(3)从宫颈癌组织分离得到原代宫颈癌上皮细胞。

原代宫颈癌上皮细胞例如可以来源于宫颈癌手术样本或者活检样本。宫颈癌手术样本例如来源于进行过说明并获得同意的宫颈癌肿瘤患者手术切除的癌组织样本。在患者手术切除后或者活检取样后的半小时内进行上述组织样本的收集。更具体而言，在无菌环境下，切取非坏死部位的组织样本，其体积在0.5cm

在生物安全柜内，将组织样本转移至细胞培养皿内，用组织运输液润洗组织样本，将组织样本表面的血细胞清洗掉。将润洗后的组织样本转移至另一个新的培养皿内，加入1-3mL组织运输液，用无菌手术刀片和手术镊将组织样本分割为体积小于3mm

将组织样本碎块转移至离心管内，用台式离心机(Sigma公司3-18K)以1000～3000转/分钟离心3～5分钟；弃上清，按1:1比例加入组织运输液和组织消化液(使用量约为每10mg组织使用5mL组织消化液，其中组织消化液的配制方法为：将1～2mg/mL胶原酶Ⅱ、1～2mg/mL胶原酶Ⅳ、50～100U/mL脱氧核糖核酸Ⅰ、0.5～1mg/mL透明质酸酶、0.1～0.5mg/mL氯化钙、5～10mg/mL牛血清白蛋白溶于体积比1:1的HBSS和RPMI-1640中)，标记样本编号，封口膜密封，以37℃、200～300转恒温摇床(知楚仪器ZQLY-180N)消化，每间隔1小时观察消化是否完成；若未见明显组织块即可终止消化，否则继续消化，直至消化充分，消化时间范围为4～8小时。消化完成后，细胞滤网(细胞筛孔径为例如70μm)过滤掉未消化的组织团块，滤网上的组织团块用组织运输液冲洗，将残留细胞冲入离心管中，用台式离心机以1000～3000转/分钟离心3～5分钟。弃上清，观察剩余细胞团是否含有血细胞，若有血细胞，加3～5mL血细胞裂解液(购自Sigma公司)，混匀，4℃裂解10～20分钟，5分钟摇晃混匀一次，裂解结束后取出，以1000～3000转/分钟离心3～5分钟。弃上清，加入本发明的原代细胞培养基重悬，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。

(4)在包被好的培养器皿内接种步骤(3)中分离得到的原代宫颈癌上皮细胞，并采用步骤(1)中的原代细胞培养基进行培养。

更具体而言，在多孔板的一个孔中按2×10

该接种步骤无需使用饲养细胞，相比细胞条件重编程技术，免去了培养和辐照饲养细胞的操作步骤。该步骤相比类器官技术，也无需在冰上将原代细胞和基质胶混匀后形成胶滴，并等待胶滴凝固后加入培养基，预先包被好的培养器皿可直接用于原代细胞接种。此外，包被培养器皿仅需少量稀释后的细胞外基质胶，相比类器官技术，节约了价格昂贵的细胞外基质胶的使用量，也简化了操作步骤。

任选地，接种后的原代宫颈癌上皮细胞在培养8～16天后，当培养容器内形成的细胞克隆汇合达到底面积80％，弃去上清，加入0.5～2mL 0.05％胰酶(购自Thermo Fisher公司)进行细胞消化，室温下孵育5～20分钟；然后用含有例如5％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液1～4mL重悬消化处理后的细胞，以1000～3000转/分钟离心3～5分钟，使用本发明的原代细胞培养基将消化后的单细胞重悬，将所得到的细胞悬液置入包被有细胞外基质胶的T25细胞培养瓶中继续扩大培养。T25细胞培养瓶的包被操作同步骤(2)。

扩增的宫颈癌上皮细胞呈2D生长，避免了类器官技术扩增出现的类器官大小不均一和生长过大的类器官出现内部坏死等情况。

本发明还提供一种用于评估或筛选治疗宫颈癌疾病的药物的方法，其包括以下步骤：

(1)使用本发明的原代宫颈癌上皮细胞的培养方法培养宫颈癌上皮细胞；

(2)选定需要检测的药物并按照所需浓度梯度进行稀释；

(3)对(1)中培养得到的宫颈癌上皮细胞添加稀释后的所述药物；

(4)进行细胞活性测试。

本发明的有益效果包括：

(1)提高原代宫颈癌上皮细胞培养的成功率，成功率达到80％以上；

(2)保证体外原代培养的宫颈癌上皮细胞能够保持原代细胞来源病人的病理表型和异质性；

(3)所培养的原代宫颈癌上皮细胞不受成纤维细胞干扰，能得到纯化的宫颈癌上皮细胞；

(4)培养基成分不含血清，所以不受不同批次血清质量和数量的影响；

(5)扩增宫颈癌上皮细胞效率高，只要有10

(6)传代步骤无需冰上操作和解离基质胶，10-15分钟内即可完成细胞的消化传代；

(7)培养成本可控，原代宫颈癌细胞培养基无需加入价格昂贵的Wnt激动剂、R-spondin家族蛋白、BMP抑制剂等因子，是对已有原代宫颈癌上皮细胞或类器官培养基的简化和改进，细胞接种也无需使用浓度较高的细胞外基质与原代细胞混合形成胶滴，而只需使用少量细胞外基质胶制备的稀释液，节约了成本较高的细胞外基质的用量；

(8)操作便捷，该技术相比条件重编程技术，无需培养饲养细胞并对饲养细胞进行辐射，避免了不同批次饲养细胞的质量和数量影响原代细胞培养效率的问题，药物筛选的铺板和检测的对象只有原代宫颈癌上皮细胞，而不受细胞条件重编程技术所需的共培养体系中饲养细胞的干扰；相比类器官技术，本发明采用的细胞外基质胶的包被方法，培养器皿可预先准备，无需像类器官技术一样将细胞包埋于基质胶内，所述技术操作步骤简便易行；

(9)所述技术培养获得的宫颈癌上皮细胞数量大，均一化程度高，适合高通量筛选新候选化合物，并为病人提供高通量药物体外敏感性功能测试。

采用本实施方式的细胞培养基，可培养来源于包括人的或其他哺乳动物的宫颈癌上皮细胞，包括宫颈癌肿瘤细胞、正常宫颈上皮细胞、宫颈癌上皮干细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织。同时本发明技术的培养基还可以用于开发体外宫颈癌原代细胞扩增培养的试剂盒。

另外，通过本实施方式的培养方法获得的细胞可应用于再生医疗、宫颈癌上皮细胞的基础医学研究、药物应答的筛选、以及来源于宫颈癌疾病的新药研发等。

附图说明

图1A-1H是显示各添加因子的浓度对宫颈癌原代细胞增殖的影响的图。

图2A和2B是将从1例宫颈癌临床组织样本分离得到的细胞采用本发明的培养基FCM分别培养至第4天和第12天的宫颈癌肿瘤细胞在倒置显微镜下拍摄的照片。

图3A-3C是从1例宫颈癌手术切除样本分离得到的细胞采用三种不同培养基条件下培养15天后在倒置显微镜下拍摄的照片。

图4是从9例宫颈癌手术切除样本分离得到的细胞在三种不同培养基条件下培养16天后得到细胞增殖效果的比较图。

图5是将从1例宫颈癌临床组织样本分离得到的细胞分别采用三种不同培养基条件培养所获得的细胞生长曲线对比图。

图6是从1例宫颈癌手术切除样本分离得到的细胞采用本发明的培养基FCM培养获得的宫颈癌肿瘤细胞的免疫组化结果对比图。

图7显示从3例宫颈癌手术切除样本分离得到的细胞按照本发明的方法培养所获得的宫颈癌上皮细胞在8种不同药物影响下的细胞活性曲线。

具体实施方式

本说明书中，上皮细胞包括从上皮组织获取的已分化的上皮细胞及上皮干细胞。“上皮干细胞”是指具有长期的自我更新能力和向上皮细胞分化的细胞，是指来源于上皮组织的干细胞。作为上皮组织，可例举例如宫颈、角膜、口腔粘膜、皮肤、结膜、膀胱、肾小管、肾脏、消化器官(食道、胃、十二指肠、小肠(包括空肠及回肠)、大肠(包括结肠))、肝脏、胰脏、乳腺、唾液腺、泪腺、前列腺、毛根、气管、肺等。其中，本实施方式的细胞培养基较好是用于培养来源于宫颈上皮细胞的培养基。

此外，本说明书中，“上皮肿瘤细胞”是指来源于上述的上皮组织的细胞肿瘤化而得的细胞。

本说明书中，“类器官”是指通过使细胞在受控的空间内高密度地自发组织和聚集而成的三维立体的、类似于器官的细胞组织体。

[MST1/2激酶抑制剂的制备实施例]

本说明书中，MST1/2激酶抑制剂是指直接或间接地对MST1/2信号传导进行负调节的任意的抑制剂。一般来说，MST1/2激酶抑制剂例如与MST1/2激酶结合并降低其活性。由于MST1和MST2的结构具有相似性，MST1/2激酶抑制剂也可以是例如与MST1或MST2结合并降低其活性的化合物。

1.MST1/2激酶抑制剂化合物1的制备

4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯

2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A2)：在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸(2.0克)后加入甲醇(30毫升)，随后冰浴下滴加二氯亚砜(1.2毫升)。反应体系在85℃反应过夜。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得白色固体，直接用于下一步。

2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A3)：在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2克)后加入丙酮(30毫升)和碳酸钾(2.2克)，然后用冰盐浴使体系冷却到-10℃，接着缓慢加入2,4-二氯-5-硝基嘧啶(3.1克)的丙酮溶液。反应体系在室温搅拌过夜。反应结束后，过滤，滤液在减压下除去溶剂，残留物经加压硅胶柱层析提纯后得化合物A3。LC/MS：M+H 359.0。

2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A4)：在圆底烧瓶中加入2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2.5克)后加入醋酸(50毫升)和铁粉(3.9克)。反应体系在60℃搅拌两小时。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得物用饱和碳酸氢钠中和至碱性。乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经乙醚洗涤后得化合物A4。LC/MS：M+H 297.0。

2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A5)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(2克)和N,N-二甲基乙酰胺(10毫升)，冷却至-35℃，加入碘甲烷(0.9毫升)，随后加入氢化钠(615毫克)，反应体系继续搅拌两小时。反应结束后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经乙醚洗涤后得化合物A5。LC/MS：M+H325.0。

4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(1)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(100毫克)、磺胺(53毫克)、对甲苯磺酸(53毫克)和仲丁醇(5毫升)。反应体系在120℃搅拌过夜。反应结束后，过滤，甲醇和乙醚洗涤得化合物1。LC/MS：M+H 461.1。

2.本发明的其他MST1/2抑制剂化合物的制备

本发明的其他MST1/2抑制剂化合物按照与化合物1类似的方法合成，其结构及质谱数据如下表所示。

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[实施例1]

人原代宫颈癌上皮细胞的分离

宫颈癌组织样本来源于进行过说明并获得同意的宫颈癌肿瘤患者手术切除癌组织样本。下面以其中一例样本(编号CCa2)进行说明。

在患者手术切除或活检后的半小时内进行上述组织样本的收集。更具体而言，在无菌环境下，切取非坏死部位的组织样本，其体积在0.5cm

表1组织运输液配方

表2组织消化液配方

在生物安全柜内，将组织样本(编号CCa2)转移至100mm细胞培养皿(购自NEST公司)内，用组织运输液润洗组织样本，将组织样本表面的残留的血液清洗掉，并剔除组织样本表面的脂肪等多余的组织。将润洗后的组织样本转移至另一个新的100mm培养皿内，加入2mL运输液，用无菌手术刀片和手术镊将组织样本分割为体积小于3mm

将组织样本碎块转移至15mL离心管内，用台式离心机(Sigma公司3-18K)以1500转/分钟离心4分钟；弃上清，按1:1比例加入组织运输液和组织消化液(使用量为每10mg组织使用约5mL组织消化液，具体配制见表2)，标记样本编号，封口膜密封，以37℃、300转恒温摇床(知楚仪器ZQLY-180N)消化，每间隔1小时观察消化是否完成。

消化完成后，70μm滤网过滤掉未消化的组织团块，滤网上的组织团块用组织运输液冲洗，将残留细胞冲入离心管中，1500转/分钟离心4分钟。

弃上清，观察剩余细胞团是否含有血细胞，若有血细胞，加3mL血细胞裂解液(购自Sigma公司)，混匀，4℃裂解15分钟，5分钟摇晃混匀一次，裂解结束后取出，以1500转/分钟离心4分钟。弃上清，得到消化分离后的宫颈癌原代细胞，加入基础培养基(BM)重悬，其中，基础培养基是由市售的DMEM/F-12培养基中加入0.2体积％Primocin(购自Invivogen公司，浓度为50mg/mL)，以得到100μg/mL的最终浓度。使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数为162万。

[实施例2]

原代宫颈癌上皮细胞培养基的优化

(1)不同因子的作用

将细胞外基质胶

配制基础培养基(缩写为BM)：向市售的DMEM/F-12培养基中加入0.2体积％Primocin(购自Invivogen公司，浓度为50mg/mL)，以得到100μg/mL的最终浓度，配制得到BM。

接着，在基础培养基(BM)中分别加入不同种类和不同浓度的添加剂因子(表3)，配制成含有不同添加成分的宫颈癌上皮细胞培养基。

表3不同组分培养基的配制(浓度为终浓度)

将按照实施例1相同方法从宫颈癌组织分离得到的宫颈癌肿瘤细胞(编号CCa5)以3000个/well的细胞密度接种在384孔培养板内，按50μl/孔加入不同成分的培养基，表面消毒后置于37℃、5％CO

(2)所添加因子的不同浓度对本专利获得的宫颈癌原代细胞的增殖作用

将细胞外基质胶(

配制本实施例的原代宫颈癌上皮细胞培养基：向基础培养基(BM)中以最终浓度40ng/ml的条件添加成纤维细胞生长因子7(FGF7)，以最终浓度40ng/ml的条件添加肝细胞生长因子(HGF)，以最终浓度40ng/ml的条件添加胰岛素样生长因子1(IGF-1)，以最终浓度1:50体积比的条件添加B27添加剂，以最终浓度5μM的条件添加化合物1，以最终浓度10μM的条件添加Y27632，以最终浓度500nM的条件添加TGFβ1抑制剂A83-01，以最终浓度10μM的条件添加CHIR99021，制备原代宫颈癌上皮细胞培养基。

使用与实施例1同样的方法从宫颈癌患者的癌组织(编号CCa8)中分离获得癌组织来源的宫颈癌上皮细胞。接着，将癌组织来源的宫颈癌上皮细胞用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。然后按4×10

接着，配制以下8种配方培养基进行实验：

配方1：上述培养基组分中不含B27添加剂；

配方2：上述培养基组分中不含成纤维细胞生长因子7；

配方3：上述培养基组分中不含胰岛素样生长因子1；

配方4：上述培养基组分中不含肝细胞生长因子；

配方5：上述培养基组分中不含Y27632；

配方6：上述培养基组分中不含化合物1；

配方7：上述培养基组分中不含A83-01；

配方8：上述培养基组分中不含CHIR99021。

分别使用上述配方1～8来稀释上述消化后的细胞悬液，按照每孔1万细胞，250微升体积种入48孔板中。

在使用配方1的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的B27添加剂每孔250微升，B27添加剂的终浓度分别为1:100、1:50、1:25；并使用配方1的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方2的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的成纤维细胞生长因子7每孔250微升，成纤维细胞生长因子7的终浓度分别为40ng/mL、10ng/mL、2ng/mL；并使用配方2的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方3的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的胰岛素样生长因子1每孔250微升，胰岛素样生长因子1的终浓度分别为40ng/mL、10ng/mL、2ng/mL；并使用配方3的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方4的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的肝细胞生长因子每孔250微升，肝细胞生长因子的终浓度分别为40ng/mL、10ng/mL、2ng/mL；并使用配方4的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方5的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的Y27632每孔250微升，Y27632的终浓度分别为20μM、10μM、2μM；并使用配方5的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方6的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的化合物1每孔250微升，化合物1的终浓度分别为20μM、5μM、2μM；并使用配方6的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方7的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的A83-01每孔250微升，A83-01的终浓度分别为500nM、100nM、50nM；并使用配方7的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方8的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的CHIR99021每孔250微升，CHIR99021的终浓度分别为10μM、3μM、1μM；并使用配方8的培养基设置对照孔(BC)。

待细胞扩增至48孔的85％左右消化计数，分别参比对照孔(BC)细胞数计算比值，将结果分别示于图1A～1H。图1A～图1H中，比值为使用各培养基培养一代得到的细胞数与对应的对照孔培养一代得到的细胞数的比。比值大于1说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果优于对照孔培养基，比值小于1，则说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果较对照孔培养基促增殖效果弱。

根据图1A～1H的结果，B27添加剂在培养基中的体积浓度优选为1:25～1:100，更优选1:50～1:100；成纤维细胞生长因子7的含量优选为2ng/ml～40ng/ml，更优选10ng/ml～40ng/ml；胰岛素样生长因子1的含量优选为2ng/ml～40ng/ml，更优选为10ng/ml～40ng/ml；肝细胞生长因子的含量优选为2ng/ml～40ng/ml，更优选10ng/ml～40ng/ml；Y27632的含量优选为2μM～20μM，更优选为2μM～10μM；化合物1的含量优选为2μM～20μM，更优选为5μM～20μM；A83-01的含量优选为50nM～500nM，更优选为100nM～500nM；CHIR99021的含量优选为1μM～10μM，更优选为1μM～3μM。

根据以上个组分的优选浓度，配制本发明的优选培养基配方FCM，其包含：基础培养基(BM)、10ng/ml成纤维细胞生长因子7(FGF7)、10ng/ml肝细胞生长因子(HGF)、10ng/ml胰岛素样生长因子1(IGF-1)、1:50体积比的B27添加剂、5μM化合物1、10μM Y27632、500nMA83-01、和3μM CHIR99021。

[实施例3]

宫颈癌组织来源的原代宫颈癌肿瘤细胞的培养

使用与实施例1同样的方法从宫颈癌患者的癌组织(样本编号CCa15)中分离获得癌组织来源的宫颈癌上皮细胞。接着，将癌组织来源的宫颈癌上皮细胞用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。然后按4×10

图2A是本实施例按4×10

[实施例4]

不同培养基对宫颈癌组织来源的原代宫颈癌肿瘤细胞的促增殖效果

(1)不同培养基对初代原代细胞克隆形成的影响和增殖效果的比较

使用与实施例2同样的方法制备原代宫颈癌上皮细胞培养基FCM，和作为对照的基础培养基BM。另外制备文献培养基RM作为另一对照例，配制步骤参见(马丽萍等，吉林医学，42(6):1289-1293，2021)，培养基配方见表4。

表4文献培养基(RM)成分

使用与实施例1同样的方法获得宫颈癌组织来源的原代宫颈癌肿瘤细胞(编号CCa10)。接着，按照相同的密度(4×10

A.本发明技术：按4×10

B.按4×10

C.按4×10

上述三种培养中，每4天对三种培养条件下培养的细胞进行换液。同时观察24孔板中各培养基培养下细胞形成克隆和细胞增殖状态，使用显微镜(Invitrogen公司EVOSM500)进行拍照记录细胞生长状况。

对于采用本发明技术培养的原代宫颈癌肿瘤细胞(编号CCa10)，分别在培养板内细胞生长达到底面积的80％左右时，弃去24孔板内的培养基上清，加入500μL 0.05％胰酶(购自GIBCO公司)对细胞进行消化，37℃下孵育10分钟，直至显微镜(Invitrogen公司EVOSM500)下能观察到细胞已经消化完全，即用含有5％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液1mL终止消化，并收集至15mL离心管内，1500rpm离心4分钟后，弃上清。使用本发明的培养基重悬离心后的细胞沉淀，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数为19万。另二种培养条件下培养的细胞采用如上述同样的操作方式进行消化和计数，使用培养基FM和CM培养得到的细胞总数分别是4.5万和4.6万。

图3A-3C的细胞照片为编号CCa10的样本在三种不同的培养条件下培养至第15天时的镜下照片(10倍倒置相差显微镜下)：其中图3A为CCa10使用基础培养基BM培养至第15天时的镜下照片；图3B为CCa10使用本专利培养基FCM培养至第15天时的镜下照片；图3C为CCa10使用文献培养基RM培养至第15天时的镜下照片。从图中可以看出，样本CCa10使用基础培养基BM(图3A)培养15天不能形成细胞克隆；使用文献培养基RM(图3C)培养15天不能形成细胞克隆，且细胞状态不佳；使用本发明的培养基FCM(图3B)培养15天细胞形成克隆，且促增殖效果明显。

图4是9例宫颈癌病人样本按照实施例1的方法获得的宫颈癌原代细胞在以上三种不同培养基条件下培养16天后得到细胞增殖效果的比较图，其中√代表有一般的克隆形成能力和促增殖效果，√√代表有较明显的克隆形成能力和促增殖效果，√√√代表有较强的克隆形成能力和促增殖效果，×代表不能形成克隆。从图6中可以确认，本发明的培养基在对宫颈癌组织来源获得的原代细胞进行培养时，克隆形成能力和促细胞增殖效果、以及培养成功率都较其他两种培养条件有明显优势。

(2)不同培养基对原代宫颈癌肿瘤细胞的持续培养和生长曲线的绘制

使用与本实施例(1)中同样的方法获得原代宫颈癌上皮细胞培养基FCM，以及作为对照的培养基BM和RM。

使用与本实施例(1)中同样的方法将宫颈癌组织来源的原代宫颈癌肿瘤细胞(编号CCa5)分别在三种培养基条件下培养，并进行消化传代和计数。

当传代后的细胞在培养板内生长再次达到约80％板底面积时，再次按上述操作方法消化收集所培养获得的细胞并计数。同样按4×10

以下为原代宫颈癌上皮细胞在不同培养条件下细胞的扩增倍数(PopulationDoubling)的计算公式：

Population Doubling(PD)＝3.32*log10(消化后细胞总数/初始种入细胞数)，公式参见(Chapman等.Stem Cell Research&Therapy 2014,5:60)。

图5是采用Graphpad Prism软件绘制的三种不同培养条件下的细胞CCa5的生长曲线。横坐标表示细胞培养的天数，纵坐标是累计的细胞增殖倍数，表示细胞在培养周期内扩增的倍数，数值越大表示细胞在一定周期内扩增的次数越多，即扩增得到的细胞数也就越多，斜率代表的是细胞扩增的速率。从图中可以确认本发明的培养基FCM培养的宫颈癌上皮细胞的增殖速率优于其他两种培养条件。

[实施例5]

原代宫颈癌组织和传代培养后的宫颈癌细胞免疫组化鉴定

从一例宫颈癌患者的临床手术切除样本取出约绿豆粒大小的癌组织(样本编号CCa14)，浸泡在1mL 4％多聚甲醛中固定。剩余癌组织使用与实施例1相同的方法获得宫颈癌上皮细胞(样本编号CCa14)。使用实施例3的方法采用本发明的培养基FCM将样本CCa14持续培养至第三代。

采用免疫组化法检测样本CCa14原始组织和持续培养至第三代得到的原代细胞中与宫颈癌相关的重要生物标记物的表达。4％多聚甲醛固定后的组织，经石蜡包埋，用切片机切成4μm厚的组织切片。随后进行常规的免疫组织化学检测(具体步骤参见Li等，NatureConmunication，(2018)9:2983)。所使用的一抗为P16抗体(购自Affinit公司)、P63抗体(购自CST公司)和Ki67抗体(购自CST公司)。

由图6可以确认，采用本发明的培养基培养的宫颈癌肿瘤细胞(样本编号CCa14)培养至第3代时，细胞上与宫颈癌相关的生物标记物的表达情况与细胞来源的原始组织切片的标记物表达情况基本一致。说明采用本发明的培养基所培养的细胞保持了宫颈癌病人癌组织的原始病理特性。

[实施例6]

癌组织来源的宫颈癌肿瘤细胞的药物敏感性功能测试

下面以宫颈癌患者手术切除样本为例，说明由病人来源的宫颈癌肿瘤样本培养得到的宫颈癌肿瘤细胞可以用于检测病人肿瘤细胞对不同药物的敏感性。

一、原代宫颈癌肿瘤细胞的铺板：按照实施例1中方法得到的分离后的宫颈癌肿瘤细胞(编号CCa5、编号CCa6和编号CCa9)悬液，按照4×10

二、药物梯度实验：

(1)采用浓度梯度稀释的方法配制药物贮存板：分别吸取40μL的10μM待测药物母液作为最高浓度，再分别从中吸取10μL加入到含20μL的DMSO的0.5mL的EP管中，再从上述EP管中吸取10μL到第二个已装有20μL的DMSO的0.5mL的EP管中，即按照1:3稀释药品。重复以上方法，依次稀释，最后得到加药所需的7种浓度。将不同浓度的药物加入384孔药物储存板中。溶剂对照组各孔加入等体积的DMSO作为对照。本实施例中，待测药物为顺铂(购自MCE公司)、紫杉醇(购自MCE公司)、5-氟尿嘧啶(5-F，购自MCE公司)、拓扑替康(购自MCE公司)、硼替佐米(购自MCE公司)、安罗替尼(购自MCE公司)、帕唑帕尼(购自MCE公司)、和阿帕替尼(购自MCE公司)和。

(2)使用高通量自动化工作站(Perkin Elmer公司JANUS)将384孔药物贮存板内的不同浓度药物和溶剂对照加入到铺有宫颈癌肿瘤细胞的384孔细胞培养板中，药物组和溶剂对照组都各设3个复孔。每孔加入药物体积为100nL。

(3)细胞活性检测：给药72小时后，用Cell Titer-Glo检测试剂(购自Promega公司)检测加药培养后细胞的化学发光数值，化学发光数值的大小反映细胞活力以及药物对细胞活力的影响，每孔加入10μL配制好的Cell Titer-Glo检测液，混匀后使用酶标仪(Perkin Elmer公司Envision)检测化学发光数值。按照公式细胞存活率(％)＝加药孔化学发光数值/对照孔化学发光数值*100％，计算得到不同药物作用细胞后的细胞存活率，使用Graphpad Prism软件作图并计算半数抑制率IC

(4)药物敏感性测试结果如图7所示。

图7分别表示从三个不同的宫颈癌患者的手术切除癌组织样本(编号CCa5、编号CCa6和编号CCa9)所培养获得的宫颈癌肿瘤细胞，对四个化疗药物顺铂、紫杉醇、5-氟尿嘧啶和拓扑替康的药物敏感性和对四个靶向药物硼替佐米、安罗替尼、帕唑帕尼和阿帕替尼的敏感性。结果显示，同一病人的细胞对不同浓度药物作用时的敏感性不同，不同病人的细胞对在同一种药物的敏感性也不同，根据结果可以判断宫颈癌病人在临床使用该种药物时的有效性。

工业应用性

本发明提供一种用于培养原代宫颈癌上皮细胞的培养基及培养方法，可将培养得到的细胞应用于药物的疗效评估和筛选。因而，本发明适于工业应用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本说明书基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。