韩国芽孢八叠球菌JZ-2及其应用

技术领域

本发明涉及微生物及固化重金属技术领域，具体地说，涉及一株韩国芽孢八叠球菌JZ-2及其应用。

背景技术

由于人类活动导致重金属通过各种途径进入环境，造成土壤、水体重金属污染日益严重。研究显示，1972-2017年，世界5大洲168条河流和71个湖泊中12种重金属浓度普遍提高，超出世界卫生组织制定的阈值标准。土壤重金属污染不仅破坏生态环境，还会导致种植的农副产品重金属超标。因此，修复重金属污染土壤迫在眉睫。

传统的土壤重金属污染修复主要有物理和化学法，但因其高成本、高能耗、低效率、会影响土壤原有结构和功能，易造成二次污染等缺点不适合大面积应用。植物修复能安全有效去除土壤重金属，但植物自身生长受自然环境因素影响较大，且深层污染难修复。与上述方法相比，微生物修复具有环境友好、适应快且可边生产边修复等优点，其中以微生物诱导碳酸盐沉淀(microbial induced carbonate precipitation，MICP)为核心的生物矿化技术，因其环境友好性已成为当前国内外研究的热点。

微生物诱导碳酸盐沉淀主要通过微生物分泌脲酶水解尿素，产生CO

发明内容

本发明的目的是提供一株韩国芽孢八叠球菌JZ-2及其应用。

本发明的另一目的是提供重金属污染土壤修复的方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一株碳酸盐矿化菌株-韩国芽孢八叠球菌(Sporosarcina koreensis)JZ-2，菌株JZ-2现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.25437，保藏日期2022年8月3日。

第二方面，本发明提供含有所述韩国芽孢八叠球菌JZ-2菌剂。

第三方面，本发明提供所述韩国芽孢八叠球菌JZ-2或含有所述韩国芽孢八叠球菌JZ-2菌剂在重金属污染环境修复中的应用。

第四方面，本发明提供重金属污染土壤修复的方法，包括以下步骤：

(1)在液体培养基中培养权利要求1所述韩国芽孢八叠球菌JZ-2，培养完成后离心收集菌体，菌体经清洗重悬于0.8％-1.0％氯化钠溶液中，得到菌悬液；

(2)将步骤(1)所得菌悬液与海藻酸钠溶液混合，用注射器将混合液滴加到氯化钙溶液中，置于4℃冰箱固定化后，用PBS缓冲液冲洗并干燥得到固定化菌剂；

(3)将步骤(2)所得固定化菌剂与营养液同时施用于重金属污染土壤。

进一步地，步骤(1)中，所述液体培养基的成分为：10g/L蛋白胨、3g/L牛肉膏、5g/L氯化钠和20g/L尿素，pH7.0。

进一步地，步骤(2)中，将所述菌悬液与所述海藻酸钠溶液混合后，所得混合液中海藻酸钠的浓度为2％-4％，细菌浓度为OD

所述氯化钙溶液的浓度为1％-3％。

进一步地，步骤(3)中，所述营养液的成分为：10g/L蛋白胨、3g/L牛肉膏、5g/L氯化钠、20g/L尿素和5g/L氯化钙。

进一步地，步骤(3)中，所述固定化菌剂的施用量为土壤质量的1.5％-2.5％，所述营养液的施用量为土壤质量的15％-20％。

本发明中，所述重金属包括但不限于Cd、Pb。

进一步地，所述重金属污染土壤中Cd含量不高于10mg/kg，和/或Pb含量不高于500mg/kg。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明从污染土壤中筛选出对重金属Cd和Pb具有耐受性，脲酶活性高的碳酸盐矿化菌，能够水解尿素并产生大量CO

(二)使用3％海藻酸钠和2％氯化钙制备的固定化菌剂能够大大提高菌株的存活率，抵抗污染土壤复杂环境的影响，增强了重金属的修复效果，同时固定化菌剂方便保存，相比于菌悬液能够存放更久。

(三)经过21天的修复，土壤可交换态Cd含量由61.9％降低至5.9％，可交换态Pb含量由46.7％降低至2.8％，碳酸盐结合态Cd含量由16.2％升高至65.1％，碳酸盐结合态Pb含量由21.3％提高至62％，土壤Cd和Pb的含量大幅降低，同时不会产生二次污染，菌株JZ-2在土壤重金属修复中的应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明韩国芽孢八叠球菌JZ-2的电镜图(A)和革兰氏染色(B)结果。

图2为本发明较佳实施例中韩国芽孢八叠球菌JZ-2的生长代谢特性。

图3为本发明韩国芽孢八叠球菌JZ-2在平板中的Cd和Pb抗性。

图4为本发明较佳实施例中制备的海藻酸钠菌剂的尺寸(A和B)和电镜图(C和D)。

图5为本发明较佳实施例中不同处理下韩国芽孢八叠球菌JZ-2修复21天后土壤各形态Cd和Pb含量。

具体实施方式

本发明提供一种对Cd和Pb具有耐受性的菌株，并利用该菌株进行重金属Cd和Pb污染土壤的修复。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一株碳酸盐矿化菌株，韩国芽孢八叠球菌Sporosarcina koreensisJZ-2，保藏编号CGMCC No.25437。

进一步地，所述碳酸盐矿化菌菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步地，本发明提供所述碳酸盐矿化菌在修复土壤重金属中的应用，包括如下步骤：

(1)将所述韩国芽孢八叠球菌Sporosarcina koreensis JZ-2，在液体培养基中培养24小时，培养完成后离心冲洗并重新悬于0.9％的氯化钠溶液中，得到高浓度菌悬液。

(2)将步骤(1)中的高浓度菌悬液加入海藻酸钠溶液中混合均匀，使用无菌注射器缓慢滴入氯化钙溶液中，处理后得到固定化菌剂。

(3)将步骤(2)中固定化菌剂与营养液同时施用于重金属污染土壤，搅拌均匀，在室温下修复21天。

进一步地，步骤(1)中，液体培养基的成分为：10g/L蛋白胨、3g/L牛肉膏、5g/L氯化钠和20g/L尿素，pH 7.0。

进一步地，步骤(2)中，混合后海藻酸钠溶液的浓度为3％，细菌浓度为OD

进一步地，步骤(2)中，氯化钙浓度为2％。

进一步地，步骤(2)中，处理是指将海藻酸钠菌剂置于氯化钙溶液中在4℃冰箱稳定2小时，随后用PBS缓冲液冲洗并干燥。

进一步地，步骤(3)中，营养液的成分为：10g/L蛋白胨、3g/L牛肉膏、5g/L氯化钠、20g/L尿素和5g/L氯化钙。

进一步地，步骤(3)中，重金属污染土壤为Cd含量不高于10mg/kg或Pb含量不高于500mg/kg的污染土。

进一步地，步骤(3)中，固定化菌剂的施用量为土壤质量的2％，加入营养液的施用量为土壤质量的20％。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1韩国芽孢八叠球菌JZ-2的分离与鉴定

土壤样品来源于河南济源一处受Cd污染的农田(N 35°5′2″，E 112°31′8")。

取1g土壤样品添加到10ml无菌水中充分震荡，30分钟后取土壤浸出液进行梯度稀释，涂布于选择培养基上，30℃恒温培养，挑选周围培养基变红的单个菌落并多次纯化，直至菌落的形态稳定。

选择培养基的成分为：10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠、3g/L牛肉膏、15g/L琼脂、20g/L尿素和0.01g/L酚酞。

将筛选到的JZ-2菌株在选择培养基上培养2天后进行革兰氏染色，通过显微镜观察到细胞为短杆状，革兰氏阳性菌，扫描电镜显示其直径约为0.4μm。如图1(A和B)所示。

使用16s rDNA测序技术获得分离菌株的16s rDNA碱基序列，如SEQ ID NO：1所示。将获得的序列通过NCBI数据库进行比对，最终确定该菌株与韩国芽孢八叠球菌(Sporosarcina koreensis)的同源性超过99％，命名为Sporosarcina koreensis JZ-2。

实施例2菌株JZ-2的生长代谢特性

配制50ml液体培养基，于超净工作台中接种菌株后，置于30℃、120r/min的摇床中培养48小时，期间每6小时取一次样。使用对二甲氨基苯甲醛显色法测定尿素浓度，使用酸碱滴定法测定碳酸根浓度，使用纳氏试剂测定氨浓度，结果如图2所示。

结果显示，尿素浓度在前18小时内迅速降低，在初始添加20g/L尿素的情况下，48小时后菌株JZ-2水解了93.6％的尿素。同时碳酸根和氨浓度则快速升高，最高可达16g/L和8.3g/L，表明分离菌JZ-2具有较强的尿素水解能力。

实施例3菌株JZ-2的抗逆性

使用Cd(NO

结果如图3所示，重金属显著抑制细菌的生长，在平板中韩国芽孢八叠球菌JZ-2的最大Cd抗性为10mg/L，最大Pb抗性为400mg/L。

以1％的接菌量在50mL高温灭菌的液体培养基中接种JZ-2，并调节温度为20、30、40℃，使用0.1mol/L的NaOH和HCl调节初始pH为5、6、7、8、9、10，在120r/min的摇床中培养48小时，观察细菌生长情况。结果表明JZ-2在20-40℃和pH6-10条件下均能正常生长(表1)。

表1不同温度和pH下JZ-2的生长情况

实施例4海藻酸钠固定化菌剂的制备和优化

将筛选的韩国芽孢八叠球菌JZ-2接种到液体培养基，培养24小时后取出置于5000r/min的离心机中离心并弃去上清液，菌株用去离子水冲洗后，重新悬浮于0.9％氯化钠溶液中得到高浓度菌悬液。

配制海藻酸钠溶液和1％、2％、3％氯化钙溶液加热煮沸，灭菌后置于超净工作台中冷却至室温，向海藻酸钠溶液中加入高浓度菌悬液混合均匀，使最终溶液的海藻酸钠含量为2％、3％和4％，细菌浓度为OD

分别将不同浓度的两种溶液混合，通过形成微球的形态来判断制备菌剂最适的海藻酸钠和氯化钙浓度。结果见表2。

表2海藻酸钠和氯化钙浓度对微球形态的影响

通过优化实验可知，当海藻酸钠浓度≥4％时，溶液粘性较大，所得菌剂不能形成规则球形；而当氯化钙浓度≤1％时，菌剂的稳定性较差，容易形变破碎。因此，制备菌剂最适的海藻酸钠浓度为2％-3％，氯化钙浓度也为2％-3％。

测量制得的海藻酸钠菌剂的尺寸并使用扫描电镜观察其形态，结果如图4所示，海藻酸钠菌剂为乳白色球形，直径约为3.5mm(图4，A和B)，表面被海藻酸钙覆盖，微观下存在大量褶皱(图4C)。其内部为多孔结构，可以观察到分离菌菌株被包裹其中(图4D)。

实施例5土壤重金属的修复

从安徽农业大学农萃园获得实验用土，使用Cd(NO

取50g干燥土壤于烧杯中，121℃高压灭菌备用。两种重金属污染土壤分别设置对照组、无菌的海藻酸钠、菌悬液和海藻酸钠菌剂4个实验组，以2％的接菌量等量加入菌悬液和海藻酸钠菌剂。随后向每个烧杯中添加10ml营养液搅拌均匀，使土壤的含水率为20％，每天称重计算液体损耗，添加等量的无菌水使整个实验周期中水土比恒定。将土样置于室温条件下修复21天。

21天后取样，使用五步提取法提取不同形态重金属，具体方法如下：

(1)可交换态Cd和Pb：1g土中添加8ml 1mol/L的氯化镁，室温下震荡(200r/min)1小时，4000r/min离心10min取上清液。

(2)碳酸盐结合态Cd和Pb：在(1)剩余土样中添加1mol/L乙酸钠，醋酸调节pH为5，室温下震荡8小时，4000r/min离心10min取上清液。

(3)铁锰氧化物结合态Cd和Pb：在(2)中剩余土样中添加20ml 0.04mol/L的盐酸羟胺溶液，在96±3℃水浴中震荡4小时，4000r/min离心10min取上清液。盐酸羟胺溶液为0.04mol盐酸羟胺溶于25％醋酸溶液中制得。

(4)有机质结合态Cd和Pb：在(3)中剩余土样中添加3ml 0.02mol/L硝酸和5ml30％过氧化氢，调节pH为2，85±2℃水浴震荡3小时。取出后冷却至25±1℃，加入5ml3.2mol/L乙酸铵的20％硝酸溶液，稀释至20ml，震荡30分钟后4000r/min离心10min取上清液。

(5)残渣态Cd和Pb：使用王水对(4)中残渣进行消解，消解后的残渣经针头过滤器过滤后定容至25ml。

修复21d后土壤重金属形态如图4所示，添加海藻酸钠菌剂后土壤可交换态Cd含量由初始的61.9％降低到5.9％，降低了56％，可交换态Pb含量由初始的46.7％降低到2.8％，降低了43.9％。而添加菌悬液的修复组，可交换态Cd和可交换态Pb分别降低43.9％和36.7％，表明固定化菌剂对土壤Cd和Pb的修复效果优于菌悬液。同时，修复后土壤碳酸盐结合态Cd和Pb含量显著增加，表明Sporosarcina koreensis JZ-2通过将重金属诱导矿化为碳酸盐形态(图5)，从而大大降低重金属的有效性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。