一种室温条件下具有扩增活性的DNA聚合酶及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种室温条件下具有扩增活性的DNA聚合酶及其应用。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)技术问世以来，对整个生命科学的发展产生了深远影响，成为人们在体外获得目标基因的最常用的方法之一，已在各个领域得到了应用。但是，使用PCR技术扩增时，除了DNA聚合酶外，还必须配备大型且昂贵的热循环仪，这极大地限制了PCR技术在资源受限的环境中以及临时医疗检测分析中的应用。而与需要复杂的热循环仪介导变性、退火和延伸的PCR技术相比，等温扩增技术可以在室温或简单条件(例如水浴)下即可实现快速有效的扩增，其已成为一种有前途替代PCR技术的方法。

等温扩增技术是体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加恒温扩增酶和特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。目前已应用的恒温扩增酶(如Bst聚合酶、phi29聚合酶)不仅需要进口，而且价格昂贵，极大的限制了应用。因此，开发新的恒温扩增酶具有重要价值。

发明内容

本发明的目的为提供新的DNA聚合酶。

本发明首先保护蛋白质IME199DNAP，其为C1)-C4)中任一种：

C1)氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

C2)在C1)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

C3)将C1)或C2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有DNA聚合酶活性、3’→5’核酸外切酶活性、链置换活性和/或引物酶活性的蛋白质；

C4)与将C1)或C2)所示的蛋白质的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性且具有DNA聚合酶活性、3’→5’核酸外切酶活性、链置换活性和/或引物酶活性的蛋白质。

其中，SEQ ID NO:2由779个氨基酸残基组成。

为了使C1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO:2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

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上述C3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述C3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述C3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还保护编码上述任一所述蛋白质IME199DNAP的核酸分子。

所述编码上述任一所述蛋白质IME199DNAP的核酸分子可为如下e1)或e2)或e3)所示的DNA分子：

e1)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质IME199DNAP的DNA分子；

e3)在严格条件下与e1)或e2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质IME199DNAP的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID NO:1由2340个核苷酸组成，SEQ ID NO:1的核苷酸编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述任一所述蛋白质IME199DNAP的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的上述任一所述蛋白质IME199DNAP的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述任一所述蛋白质IME199DNAP，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质IME199DNAP的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物也属于本发明的保护范围。

所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1自5’末端起第1至2337位(即去掉了终止子)所示的DNA分子，得到的重组质粒。

所述重组载体具体可为重组质粒pET28a-IME199DNAP。重组质粒pET28a-IME199DNAP可为将pET28a质粒的限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ之间的DNA小片段替换为SEQID NO：1自5’末端起第1至2337位所示的DNA分子(即去掉了终止子)，得到的重组质粒。

所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物可为将含有上述任一所述核酸分子的重组载体导入出发微生物得到的重组菌。

所述出发微生物可为大肠杆菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。

所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物具体可为重组大肠杆菌。所述重组大肠杆菌可为将重组质粒pET28a-IME199DNAP转化导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。

本发明还保护上述任一所述蛋白质IME199DNAP、上述任一所述核酸分子或含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物在制备DNA聚合酶或作为DNA聚合酶中的应用。

温度和pH值均对上述任一所述蛋白质IME199DNAP的DNA聚合酶活性具有重要影响。蛋白质IME199DNAP在温度为20-30℃(如20℃或30℃)的范围内均具有良好的DNA聚合酶活性。蛋白质IME199DNAP在pH值为pH3.5-9.5(如pH3.5、pH4.5、pH5.5、pH6.5、pH7.5、pH8.5或pH9.5)的范围内均具有良好的DNA聚合酶活性。

上述应用中，所述DNA聚合酶具有3’→5’核酸外切酶活性和/或链置换活性。

本发明还保护上述任一所述蛋白质IME199DNAP、上述任一所述核酸分子或含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物在制备引物酶或作为引物酶中的应用。

上述任一所述蛋白质IME199DNAP、上述任一所述核酸分子或含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物在扩增DNA中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述DNA可为单链DNA或双链DNA。

上述应用中，所述扩增DNA，可以使用引物，也可以不使用引物。

本发明提供的蛋白质IME199DNAP具有DNA聚合酶活性、3’→5’核酸外切酶活性和链置换活性，能在室温(20-30℃)、pH值3.5-9.5的条件下利用随机引物或固定引物指数扩增单链DNA和双链DNA；同时蛋白质IME199DNAP还具有引物酶活性，可以在没有引物的情况下扩增单链DNA和双链DNA。由此可见，蛋白质IME199DNAP可以在室温(20℃-30℃)利用引物或无引物的情况下高效扩增单链DNA和双链DNA，同时该酶具有链置换活性，可用于等温扩增。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中步骤二的SDS-PAGE结果。

图2为蛋白质IME199DNAP的DNA聚合酶活性检测。

图3为蛋白质IME199DNAP的3’→5’核酸外切酶活性检测。

图4为温度对蛋白质IME199DNAP作为DNA聚合酶活性的影响。

图5为pH值对蛋白质IME199DNAP作为DNA聚合酶活性的影响。

图6为蛋白质IME199DNAP利用引物扩增单链DNA的检测结果。

图7为蛋白质IME199DNAP利用引物扩增双链DNA的检测结果。

图8为蛋白质IME199DNAP在无引物条件下扩增单链DNA和双链DNA的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、蛋白质IME199DNAP的表达与纯化

一、重组质粒pET28a-IME199DNAP的构建

1、以屎肠球菌噬菌体IME199的基因组(序列登录号NC_049931.1)为模板，采用SEQID NO：3所示的引物199DNAP-F：5'-cagcaaatgggtcgc

反应条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸5min。

2、用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET28a质粒(记载于如下文献中：Ping Li，Hong Lin，Zhiqiang Mi，Shaozhen Xing，Yigang Tong，Jingxue Wang.Screening ofPolyvalent Phage-Resistant Escherichia coli Strains Based on Phage ReceptorAnalysis.Front.Microbiol.，18April 2019.文献中该质粒的名称为pET-28a)，回收约5.3kb的载体骨架。

3、将步骤1回收的PCR扩增产物和步骤2回收的载体骨架混合，之后使用同源重组酶(南京诺唯赞)进行重组，得到重组质粒pET28a-IME199DNAP。

重组条件：37℃孵育30min，冰上冷却。

将重组质粒pET28a-IME199DNAP进行测序。根据测序结果，对重组质粒pET28a-IME199DNAP进行结构描述如下：将pET28a质粒的限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ之间的DNA小片段替换为SEQ ID NO：1自5’末端起第1至2337位所示的DNA分子，得到的重组质粒。

重组质粒pET28a-IME199DNAP表达蛋白质IME199DNAP，蛋白质IME199DNAP的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

二、蛋白质IME199DNAP的表达与纯化

1、将重组质粒pET28a-IME199DNAP转化导入大肠杆菌BL21(DE3)(北京全式金生物)中，得到重组大肠杆菌。

2、将重组大肠杆菌的单菌落接种于5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，得到培养菌液1；之后将2mL培养菌液1接种于200mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养，得到OD

3、将培养菌液2置于冰上冷却30min，之后加入IPTG并使其在体系中的浓度为0.1mM，16℃诱导培养16-20h，得到培养菌液3。

4、取培养菌液3，4℃、10000×g离心15min，收集菌体。

5、将步骤4收集的菌体用LB溶液(含20mM Tris、500mM NaCl、30mM咪唑和10％甘油的水溶液)重悬，得到菌悬液。

6、取步骤5得到的菌悬液，用低温高压细胞破碎仪于4℃下破碎菌体，之后4℃、7000×g离心1h，收集上清液。

7、将步骤6收集的上清液缓慢流经镍柱(目的为吸附带有His标签的目的蛋白即蛋白质IME199DNAP)；之后用WB溶液(含20mM Tris、500mM NaCl、50mM咪唑和10％甘油的水溶液)洗脱镍柱以除去未结合的蛋白质IME199DNAP；接着用EB溶液(含20mM Tris、500mMNaCl、500mM咪唑和10％甘油的水溶液)洗脱镍柱(目的为洗掉带有His标签的蛋白质IME199DNAP)，收集洗脱液；最后用RB溶液(含20mM Tris、500mM NaCl、700mM咪唑和10％甘油的水溶液)冲洗镍柱。

8、将步骤7收集的洗脱液用30KD超滤管浓缩至2mL，然后进样于分子筛色谱柱进行分离，收集出峰最高时的流出液；最后将收集的流出液用30KD超滤管浓缩至1mL，得到蛋白浓缩液。

向蛋白浓缩液中加入50％(v/v)甘油水溶液，-80℃保存。

9、提取重组大肠杆菌的总蛋白。提取培养菌液2的总蛋白。之后将重组大肠杆菌的总蛋白、培养菌液2的总蛋白、步骤6收集的上清液、步骤7收集的洗脱液和蛋白浓缩液进行SDS-PAGE。

检测结果见图1(Marker为蛋白Marker，A为重组大肠杆菌的总蛋白，B为培养菌液2的总蛋白，C为上清液，D为洗脱液，E为蛋白浓缩液)。结果表明，步骤6收集的上清液、步骤7收集的洗脱液和蛋白浓缩液中均含有蛋白质IME199DNAP，与预期大小完全一致。

实施例2、检测蛋白质IME199DNAP的DNA聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性

一、蛋白质IME199DNAP的DNA聚合酶活性

1、底物的制备

将序列甲：5′FAM-tcctaacgagattagttttgctgt-3′和序列乙：5′-cccatacaaataaaccaaaaaacaatacagcaaaactaatctcgttagga-3′进行退火，得到底物。

退火程序为：95℃加热3min，然后自然冷却至室温。

2、制备反应体系。反应体系为20μL，由底物、pH7.5、50mM的Tris-HCl缓冲液、MgCl

3、取步骤2制备的反应体系，30℃反应15min，得到反应液。之后分别取10μL反应液进行20％聚丙烯酰胺凝胶电泳。

检测结果见图2(M为荧光标记的不同长度的序列)。结果表明，蛋白质IME199DNAP可以将不完整的DNA链合成完整的DNA链，即蛋白质IME199DNAP具有DNA聚合酶活性，且100nM的蛋白质IME199DNAP就表现出良好的DNA聚合酶活性。

二、蛋白质IME199DNAP的3’→5’核酸外切酶活性

1、底物的制备

同步骤一中1。

2、制备反应体系。反应体系为20μL，由底物、pH7.5、50mM的Tris-HCl缓冲液、MgCl

3、取步骤2制备的反应体系，30℃反应15min，得到反应液。之后分别取10μL反应液进行20％聚丙烯酰胺凝胶电泳。

检测结果见图3(M为荧光标记的不同长度的序列)。结果显示，在没有dNTPs存在的反应体系内，蛋白质IME199DNAP可以将底物降解。由此可见，蛋白质IME199DNAP具有3’→5’核酸外切酶活性。

三、温度对蛋白质IME199DNAP作为DNA聚合酶活性的影响

1、底物的制备

同步骤一中1。

2、制备反应体系。反应体系为20μL，由底物、pH7.5、50mM的Tris-HCl缓冲液、MgCl

3、取步骤2制备的反应体系，20℃、30℃、37℃、45℃、55℃、65℃或75℃反应15min，得到反应液。之后取10μL反应液进行20％聚丙烯酰胺凝胶电泳。

检测结果见图4(M为荧光标记的不同长度的序列)。结果表明，温度对蛋白质IME199DNAP的DNA聚合酶活性具有重要影响，蛋白质IME199DNAP在温度为20-30℃的范围内均具有良好的DNA聚合酶活性。

四、pH值对蛋白质IME199DNAP作为DNA聚合酶活性的影响

1、底物的制备

同步骤一中1。

2、制备反应体系。反应体系为20μL，由底物、Tris-HCl缓冲液、MgCl

3、取步骤2制备的反应体系，30℃反应15min，得到反应液。之后取10μL反应液进行20％聚丙烯酰胺凝胶电泳。

检测结果见图5(M为荧光标记的不同长度的序列)。结果表明，pH值对蛋白质IME199DNAP的DNA聚合酶活性具有重要影响，蛋白质IME199DNAP在pH值为pH3.5-9.5的范围内均具有良好的DNA聚合酶活性。

实施例3、蛋白质IME199DNAP的链置换活性

M13mp18单链DNA为美国NEB公司的产品，其为单链、环状DNA，大小为7.25kb。

质粒pUC19为美国NEB公司的产品，其为双链、环状DNA，大小为2686bp。

一、蛋白质IME199DNAP利用引物扩增单链DNA

1、制备反应体系

反应体系为25μL，由M13mp18单链DNA(作为底物)、pH7.5、50mM的Tris-HCl缓冲液、引物(核苷酸序列为5′-TCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTG-3′)、MgCl

2、取步骤1制备的反应体系，20℃反应20min、40min、60min或120min，得到反应液。之后将10μL反应液和M13mp18单链DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳。

检测结果见图6(M为15K的Maker，1为M13mp18单链DNA，2为反应20min，3为反应40min，4为反应60min，5为反应120min)。结果表明，蛋白质IME199DNAP在20℃条件下能够复制M13mp18单链DNA的DNA序列，产生的复制产物(大于15Kb)比M13mp18单链DNA的全长还要大，表明蛋白质IME199DNAP具有链置换活性。

二、蛋白质IME199DNAP利用引物扩增双链DNA

1、制备反应体系

反应体系为25μL，由质粒pUC19(作为底物)、pH7.5、50mM的Tris-HCl缓冲液、随机引物6bp(美国NEB公司的产品)、MgCl

2、取步骤1制备的反应体系，20℃反应10min、20min、40min、60min或120min，得到反应液。之后将10μL反应液和质粒pUC19进行1％琼脂糖凝胶电泳。

检测结果见图7(M为15K的Maker，1为质粒pUC19，2为反应10min，3为反应20min，4为反应40min，5为反应60min，6为反应120min)。结果表明，蛋白质IME199DNAP在20℃条件下能够复制质粒pUC19的DNA序列,产生的复制产物(大于15Kb)比pUC19大很多，表明蛋白质IME199DNAP具有链置换活性。

上述结果表明，蛋白质IME199DNAP具有DNA聚合酶活性、3’→5’核酸外切酶活性和链置换活性，可以利用引物(随机引物或固定引物)扩增单链DNA和双链DNA。

三、蛋白质IME199DNAP在无引物条件下扩增单链DNA和双链DNA

1、制备反应体系

反应体系为20μL，由底物(质粒pUC19或M13mp18单链DNA)、pH7.5、50mM的Tris-HCl缓冲液、MgCl

2、取步骤1制备的反应体系，20℃反应3h。反应期间，分别在反应第0h、第1h、第2h和第3h取样，用Qubit检测DNA含量。

检测结果见图8。结果表明，蛋白质IME199DNAP在室温(20℃)无引物条件下能够复制M13mp18单链DNA的DNA序列和质粒pUC19的DNA序列。

由此可见，蛋白质IME199DNAP具有引物酶活性，能在没有引物的情况下扩增单链DNA和双链DNA。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。