一种弱化RNA解旋酶提高产甘油假丝酵母生长及环境耐受性的方法

技术领域

本发明涉及一种弱化RNA解旋酶提高产甘油假丝酵母生长及环境耐受性的方法，属于生物技术领域。

背景技术

微生物在工业发酵过程中面临着多重环境压力，如高温、渗透压、高糖、乙酸、过氧化氢等，产甘油假丝酵母是从自然界筛选到的一株高产甘油的工业抗逆菌株，可耐渗透压、耐高温、耐有机酸、氧化压力等，是一株潜在的优秀工业生物技术宿主。

产甘油假丝酵母作为一株非传统酵母，与模式菌株Saccharomyces cerevisiae相比具有更优秀的耐高渗能力。已有研究表明，在高渗透压条件下，细胞会通过改变细胞内具有渗透调节功能的物质如糖类(蔗糖和果糖)、糖醇(甘露糖和甲基化肌醇)、复合糖(海藻糖、棉子糖和果聚糖)等代谢物积累来平衡渗透压。同时，高渗条件会诱导胞浆内钙离子积累，触发钙调神经磷酸酶途径，进而调节胞内离子动态平衡。此外，高盐条件还会使得细胞膜的流动性和通透性发生改变，从而减弱钠离子内流引起的细胞毒性。

RNA解旋酶作为一类依赖于ATP的解旋酶，能够解开RNA双链，参与pre-mRNA的剪接、核糖体的生物发生，核质转运、翻译、RNA降解以及结构基因表达等过程。RNA解旋酶还参与植物对环境压力的响应，如在大麦中RNA解旋酶HVD1参与盐胁迫响应。同样的，在真菌中RNA解旋酶也参与了环境压力的响应。

发明内容

本发明首先反向PCR克隆获取带有DBP7及其部分5’端非编码区的反义序列，并将其命名为Cgantidbp7a或Cgantidbp7b，其中产甘油假丝酵母的DBP7同源基因，将其命名为CgDBP7基因。通过在产甘油假丝酵母尿嘧啶缺陷株中整合表达Cgantidbp7a或Cgantidbp7b，弱化RNA解旋酶DBP7后，产甘油假丝酵母对于高盐的耐受性能提高。

本发明提供了一种重组产甘油假丝酵母，所述重组产甘油假丝酵母在其基因组上整合表达了RNA解旋酶CgDBP7的反义序列，所述RNA解旋酶CgDBP7的反义序列如SEQIDNO.1、SEQ ID NO.2所示或SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述RNA解旋酶CgDBP7的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

所述RNA解旋酶CgDBP7的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述反义序列的整合位点为产甘油假丝酵母基因组上的5.8S位点。

在本发明的一种实施方式中，所述重组产甘油假丝酵母是以产甘油假丝酵母CCTCC M93018为底盘细胞。

在本发明的一种实施方式中，采用pURGAPU质粒为整合表达载体。

本发明提供了一种提高产甘油假丝酵母生物量的方法，所述方法为，在产甘油假丝酵母的基因组上整合表达了RNA解旋酶CgDBP7的反义序列，所述RNA解旋酶CgDBP7的反义序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示或SEQ ID NO.5所示。

所述反义序列的整合位点为产甘油假丝酵母基因组上的5.8S位点。

在本发明的一种实施方式中，所述产甘油假丝酵母为产甘油假丝酵母CCTCCM93018。

在本发明的一种实施方式中，以pURGAPU质粒为整合表达载体。

本发明提供了一种提高重组产甘油假丝酵母在压力胁迫环境下的耐受性的方法，所述方法为在产甘油假丝酵母在其基因组上整合表达了RNA解旋酶CgDBP7的反义序列，所述RNA解旋酶CgDBP7的反义序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示或SEQ ID NO.5所示；所述压力胁迫包括但不限于温度胁迫、渗透压胁迫、葡萄糖胁迫、有机酸胁迫、氧化剂胁迫，所述反义序列的整合位点为产甘油假丝酵母基因组上的5.8S位点。

在本发明的一种实施方式中，所述压力胁迫环境为温度44℃或120mmol/L的乙酸或3g/L的糠醛或400g/L的山梨醇或1mol/L的NaCl或350g/L的葡萄糖。

在本发明的一种实施方式中，所述产甘油假丝酵母为产甘油假丝酵母CCTCCM93018。

在本发明的一种实施方式中，以pURGAPU质粒为整合表达载体。

本发明还提供了一种构建上述重组产甘油假丝酵母的方法，所述方法为：

(1)以产甘油假丝酵母基因组为模板，分别利用上下游引物Cgantidbp7aF和Cgantidbp7aR；Cgantidbp7bF和Cgantidbp7bR通过PCR扩增获得Cgantidbp7a和Cgantidbp7b即DBP7及其部分5’端非编码区反义序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示；引物序列(5'-3')如下所示：

Cgantidbp7aF:acacaattacaaaaaggatccCTTTTATGCTTGATTTCTTGTCTTTTT；

Cgantidbp7aR:gtcgccgttttcgagggtaccATACAGCATTCAAGAGAACCGTTACG；

Cgantidbp7bF:acacaattacaaaaaggatccAAGGATGATACAATTTGGCCATTT；

Cgantidbp7bR:gtcgccgttttcgagggtaccCTGTTCAACGTGCCTTGGCG；

其中，小写部分为同源臂序列；

(2)构建含有Cgantidbp7a、Cgantidbp7b的整合表达载体，并将载体用HindⅢ酶切线性化之后转化到Candida glycerinogenes CCTCC M93018尿嘧啶缺陷株中；

(3)采用菌落PCR检测方法对步骤(2)得到的重组C.glycerinogenes进行验证；

(4)进一步通过点板实验和摇瓶培养的生长情况分析鉴定重组C.glycerinogenes的生长及多种环境胁迫条件下的耐受性。

本发明还提供了一种提高产甘油假丝酵母NaCl耐受性的方法，所述方法为整合表达了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示来源于产甘油假丝酵母的反向序列Cgantidbp7a。

在本发明的一种实施方式中，所述产甘油假丝酵母为Candida glycerinogenesCCTCC M93018。

有益效果

(1)本发明利用来源于Candida glycerinogenes CCTCC M93018的基因Cgantidbp7a来提高产甘油假丝酵母的生长能力，采用本发明提供的方法，在Candidaglycerinogenes CCTCC M93018中反义抑制CgDBP7基因，可以提高Candidaglycerinogenes CCTCC M93018的生长能力。

(2)采用本发明提供的方法，在Candida glycerinogenes CCTCC M93018中反义抑制CgDBP7后重组菌株在多种环境压力胁迫条件下，包括但不限于温度胁迫、渗透压胁迫、葡萄糖胁迫条件下生长能力有所提高。

(3)采用本发明提供的方法，在Candida glycerinogenes CCTCC M93018中反义抑制CgDBP7后使重组菌株在1mol/L NaCl胁迫下，其生物量相较于对照菌株提高了10.91％。

附图说明

图1：CgDBP7琼脂糖凝胶电泳图。

图2：Cgantidbp7a、Cgantidbp7b琼脂糖凝胶电泳图。

图3：30℃条件下重组菌株生长情况；其中，C.gUra5回补为对照菌株。

图4：胁迫条件下重组菌株生长情况；其中，C.gUra5回补为对照菌株。

图5：不同RNA解旋酶在胁迫条件下的生长情况；其中，C.gUra5回补为对照菌株。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的pURGAPU质粒记载于公开号为CN112553098B的中国发明专利文本中。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

YPD培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，若配制固体培养基加入20g/L琼脂粉。

MM培养基(g/L)：YNB 6.7，葡萄糖20，pH6.2-6.5，若配制固体培养基则在液体培养基基础上加入20g/L琼脂粉。

LB培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，若配制固体培养基则在液体培养基基础上加入20g/L琼脂粉。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

耐受性能测定：

(1)点板实验：

将产甘油假丝酵母重组菌株转接至10mL MM液体培养基中，30℃，200rpm/min摇瓶培养12h后按照2％(v/v)的接种量转接至新的10mL MM培养基中30℃，200rpm/min摇瓶培养4-8h作为种子液。将种子液OD

(2)摇瓶实验：

培养基中添加不同的胁迫条件，在30℃，100rpm/min条件下，每隔8h，用紫外分光光度计测定其在波长为600nm的吸光值。

下述实施例中所涉及的感受态的转化方法如下：

转化方法采用醋酸锂转化法，步骤如下：

Candida glycerinogenes CCTCC M93018尿嘧啶缺陷株接入YPD液体培养基中30℃，200rpm/min进行摇瓶培养，当OD

实施例1：反义抑制RNA解旋酶CgDBP7的重组产甘油假丝酵母的制备

具体步骤如下：

(1)以产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M93018)基因组为模板，利用上下游引物Cgantidbp7aF、Cgantidbp7aR、Cgantidbp7bF、Cgantidbp7bR，通过PCR获取Cgantidbp7a、Cgantidbp7b基因片段，PCR反应体系如下(50μL)：25μL Prime STAR MaxPremix(2×)，15pmol引物，150ng模板，加双蒸水至50μL(引物为上海生工生物工程有限公司合成，其余购自TaKaRa公司)，扩增反应条件如下：98℃，10s；60℃，15s；72℃，1kb/min，35个循环。扩增产物电泳完毕后(如图2所示)进行切胶回收，回收程序按照试剂盒说明进行(柱回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司)，获得反义序列Cgantidbp7a、Cgantidbp7b(核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示)。

引物序列(5'3')如下所示：

Cgantidbp7aF:acacaattacaaaaaggatccCTTTTATGCTTGATTTCTTGTCTTTTT；

Cgantidbp7aR:gtcgccgttttcgagggtaccATACAGCATTCAAGAGAACCGTTACG。

Cgantidbp7bF:acacaattacaaaaaggatccAAGGATGATACAATTTGGCCATTT；

Cgantidbp7bR:gtcgccgttttcgagggtaccCTGTTCAACGTGCCTTGGCG；

其中，小写部分为同源臂序列；

(2)将步骤(1)获得的Cgantidbp7a、Cgantidbp7b产物与pURGAPU表达载体(该质粒整合位点为5.8S)通过同源重组的方法完成连接；

分别制备得到重组载体pURGAPU-Cgantidbp7a、pURGAPU-Cgantidbp7b；

分别将连接产物转化至大肠杆菌JM109，挑取平板上菌体转接至加入氨苄卡纳青霉素的LB液体培养基中37℃，200rpm培养10～12h，提取质粒(质粒抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司)。提取的质粒用HindⅢ快切酶进行酶切，酶切反应体系如下(100μL)：5μLHindⅢ快切酶，10μL Quickcut buffer，模板终浓度为200～300ng/μL,加双蒸水至100μL(快切酶及配套Quickcut buffer购自TaKaRa公司)，37℃水浴2h，将线性化质粒进行柱回收，回收程序按试剂盒说明进行(柱回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司)。

(3)分别将回收的线性化质粒转化产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenesCCTCC M93018)尿嘧啶缺陷株中，制备得到重组产甘油假丝酵母C.glycerinogenes CCTCCM93018/pURGAPU-Cgantidbp7a、C.glycerinogenes CCTCC M93018/pURGAPU-Cgantidbp7b。

对照菌株：

按照上述方法，将线性化的空载质粒pURGAPU转化至产甘油假丝酵母Candidaglycerinogenes CCTCC M93018尿嘧啶缺陷株中，制备得到对照菌株：重组产甘油假丝酵母C.glycerinogenes CCTCC M93018/pURGAPU。

实施例2：重组产甘油假丝酵母生长测定

(1)分别将实施例1制备得到的重组产甘油假丝酵母C.glycerinogenes CCTCCM93018/pURGAPU、C.glycerinogenes CCTCC M93018/pURGAPU-Cgantidbp7a、C.glycerinogenes CCTCC M93018/pURGAPU-Cgantidbp7b接种至MM液体培养基中，在30℃、200r/min条件下培养12小时，分别制备得到种子液；

(2)分别将制备得到的种子液按照2％(v/v)的接种量，接种至MM液体培养基中，在30℃、200r/min条件下培养得到二级种子液；

(3)将所得二级种子液在MM固体培养基上进行点板实验，置于30℃培养箱中培养24～48h，点板结果如图3所示。

另将步骤(2)所培养的二级种子液接种至MM培养基中，30℃、100r/min摇瓶培养，每隔8h，测定C.glycerinogenes生长情况，结果如表1所示；

将C.glycerinogenes CCTCC M93018/pURGAPU按照上述方式进行培养，同时作为对照，测定C.glycerinogenes生长情况，结果如表1所示。

表1：30℃条件下菌株生长情况(OD

从实验结果可知，在30℃未添加胁迫条件下，反义抑制序列构建的反义抑制重组菌株具有明显的生长优势，点板结果表明其中反义抑制重组菌株a的生长优势更为明显，在56h时，反义抑制菌株a的生物量比对照菌株增加16.93％。

以上结果表明，反义抑制RNA解旋酶DBP7对于产甘油假丝酵母的生长具有明显的正向影响。

实施例3：重组产甘油假丝酵母压力条件下生长情况测定

(1)分别将实施例1制备得到的重组产甘油假丝酵母(C.glycerinogenes CCTCCM93018/pURGAPU)、C.glycerinogenes CCTCC M93018/pURGAPU-Cgantidbp7a、C.glycerinogenes CCTCC M93018/pURGAPU-Cgantidbp7b接种至MM液体培养基中，在30℃、200r/min条件下培养12小时，制备得到种子液；

(2)将制备得到的种子液按照2％(v/v)的接种量，接种至MM液体培养基中30℃、200r/min条件下培养得到二级种子液；

(3)将所得二级种子液在加入了不同压力元素的MM固体培养基上进行点板实验，置于30℃培养箱中培养24～60h；

所述压力元素分别为：1mol/L的NaCl溶液；终浓度为120mmol/L的乙酸；终浓度为3g/L的糠醛；终浓度为400g/L的山梨醇；终浓度为350g/L的葡萄糖；44℃的高温环境，点板结果如图4所示。

(4)将步骤(2)所得二级种子液接种至添加了压力元素的MM液体培养基中30℃、100r/min条件进行摇瓶培养；

所述压力元素为1mol/L的NaCl溶液胁迫或终浓度为120mmol/L的乙酸胁迫；

每隔8h，测定C.glycerinogenes生长情况；将C.glycerinogenes CCTCC M93018/pURGAPU按照上述方式进行培养，作为对照，结果如表2、表3及图4所示；

表2：重组产甘油假丝酵母菌株对NaCl的耐受性(OD

表3：重组产甘油假丝酵母菌株对乙酸的耐受性(OD

实验结果可知，在1mol/L的NaCl条件下，反义抑制重组菌株具有明显的生长优势，反义抑制重组菌株的生物量相较于对照菌株增加了10.91％。

从以上结果可知弱化RNA解旋酶DBP7能够有效提高产甘油假丝酵母在高盐胁迫条件下的耐受性。

实施例4：反义抑制RNA解旋酶重组菌株的制备

具体步骤如下：

(1)以产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M93018)基因组为模板，利用上下游引物Cgantidbp7F、Cgantidbp7R、Cgantided1F、Cgantided1R通过PCR获取Cgantidbp7、Cgantided1基因片段，PCR反应体系如下(50μL)：25μL Prime STAR MaxPremix(2×)，15pmol引物，150ng模板，加双蒸水至50μL(引物为上海生工生物工程有限公司合成，其余购自TaKaRa公司)，扩增反应条件如下：98℃，10s；60℃，15s；72℃，1kb/min，35个循环。扩增产物电泳完毕后(如图1所示)进行切胶回收，回收程序按照试剂盒说明进行(柱回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司)，获得Dbp7、Ded1基因反义序列(核苷酸序列如SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6所示)。

引物序列(5'3')如下所示：

Cgantidbp7F:acacaattacaaaaaggatccAGCAAAGTTAAACTCTTCGTTTTGC；

Cgantidbp7R:gtcgccgttttcgagggtaccATGGCTGACAATGATGATGGG；

Cgantided1F:acacaattacaaaaaggatccCCACCATTGAGAAGATGAGTTGTT；

Cgantided1R:gtcgccgttttcgagggtaccATGGCATACGTTCCTCCACACA；

(2)将步骤(1)获得的Cgantidbp7、Cgantided1产物与pURGAPU表达载体通过同源重组的方法完成连接；

分别制备得到重组载体pURGAPU-Cgantidbp7、pURGAPU-Cgantided1。

并分别将连接产物转化至大肠杆菌JM109，挑取平板上菌体转接至加入氨苄卡纳青霉素的LB液体培养基中37℃，200rpm/min培养10～12h，提取质粒(质粒抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司)。提取的质粒用HindⅢ快切酶进行酶切，酶切反应体系如下(100μL)：5μL HindⅢ快切酶，10μL Quickcut buffer，模板终浓度为100～200ng/μL,加双蒸水至100μL(快切酶及配套Quickcut buffer购自TaKaRa公司)，37℃水浴2h，将线性化质粒进行柱回收，回收程序按试剂盒说明进行(柱回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司)。

(3)分别将回收的线性化质粒转化产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenesCCTCC M93018)尿嘧啶缺陷株中，制备得到重组产甘油假丝酵母C.glycerinogenes CCTCCM93018/pURGAPU-Cgantidbp7、C.glycerinogenes CCTCC M93018/pURGAPU-Cgantided1。

对照菌株：

按照上述方法，将线性化的空载质粒转化至产甘油假丝酵母Candidaglycerinogenes CCTCC M93018尿嘧啶缺陷株中，制备得到对照菌株：重组产甘油假丝酵母C.glycerinogenes CCTCC M93018/pURGAPU。

实施例5：反义抑制RNA解旋酶重组菌株抗逆性能分析

(1)将实施例4制备得到的重组产甘油假丝酵母C.glycerinogenes CCTCCM93018/pURGAPU-Cgantidbp7、C.glycerinogenes CCTCC M93018/pURGAPU-Cgantided1接种至MM液体培养基中，在30℃、200r/min条件下培养12小时，制备得到种子液；

(2)将制备得到的种子液按照2％(v/v)的接种量，接种至MM液体培养基中30℃、200r/min条件下培养得到二级种子液；

(3)将所得二级种子液在加入了不同压力的MM固体培养基上进行点板，置于30℃培养箱中培养24～60h。

所述压力元素分别为：1mol/L的NaCl溶液；终浓度为120mmol/L的乙酸；终浓度为3g/L的糠醛；终浓度为400g/L的山梨醇；终浓度为350g/L的葡萄糖，终浓度为10mmol/L的过氧化氢；30℃、44℃的温度环境，点板结果如图5所示。

(4)另将C.glycerinogenes CCTCC M93018/pURGAPU-Cgantidbp7、C.glycerinogenes CCTCC M93018/pURGAPU-Cgantided1按照上述方式接种至加入不同胁迫(1mol/L的NaCl溶液；终浓度为120mmol/L的乙酸；终浓度为3g/L的糠醛；终浓度为400g/L的山梨醇；终浓度为350g/L的葡萄糖，终浓度为10mmol/L的过氧化氢；30℃、44℃的温度环境)的YPD培养基中，30℃，200r/min摇瓶培养，每隔6h，测定C.glycerinogenes生长情况；将C.glycerinogenes CCTCC M93018/pURGAPU按照上述方式进行培养，作为对照，结果如表4及图5所示；

表4：42h时不同胁迫条件下重组菌株生长情况

表中，对照菌株为：C.glycerinogenes CCTCC M93018/pURGAPU，C.g-antidbp7为：C.glycerinogenes CCTCC M93018/pURGAPU-Cgantidbp7、C.g-antided1为C.glycerinogenes CCTCC M93018/pURGAPU-Cgantided1。

结果显示，相较于弱化其他RNA解旋酶的表达，弱化RNA解旋酶DBP7能够显著改善产甘油假丝酵母在压力条件下的生长。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。