C620-0580在制备抗胶质瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物技术领域，涉及小分子化合物C620-0580在制备抗胶质瘤药物中的应用。

背景技术

胶质瘤是常见的中枢神经系统肿瘤，根据恶性程度不同分为4级，其中胶质母细胞瘤是恶性程度最高的。临床治疗胶质瘤的方式主要以手术联合放化疗，至今为止替莫唑胺是唯一用于治疗胶质瘤的一线化疗药，且胶质瘤的高侵袭性，边界不清，存在在手术切除后易复发，替莫唑胺耐药等问题。在2018年，电场治疗已被写入指南，尽管在结合外科手术，放疗，全身疗法(包括化学疗法、靶向疗法)等多种方式联合治疗，但胶质母细胞瘤临床总体预后仍然很差，长期生存率低。近年来肿瘤的分子靶向治疗及免疫治疗是临床研究的热点，肿瘤的靶向治疗研究取得了很大的成果，很多其他癌种的靶向药物在临床上取得很好的疗效，而胶质瘤的靶向药物目前只有抗血管生成药物贝伐单抗，且贝伐单抗仍然处于二线治疗方案，且获益甚微，胶质瘤的靶向治疗仍然进展缓慢。所以亟需研究开发新的胶质瘤的靶向治疗药物。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种可靶向治疗胶质母细胞瘤的关于核转运蛋白的小分子靶向药物。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.KPNA2蛋白的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步，KPNA2蛋白的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用中，所述肿瘤为胶质瘤。

进一步，KPNA2蛋白的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用中，所述KPNA2蛋白的抑制剂为C620-0580。

进一步，C620-0580的药物使用浓度至少为5mg/Kg。

进一步，KPNA2蛋白的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用中，所述抗肿瘤如下功能之一：

(1)抑制肿瘤细胞增殖；

(2)抑制肿瘤细胞迁移和侵袭；

(3)抑制肿瘤生长。

2.C620-0580在制备筛选抗肿瘤药物的试剂的应用。

进一步，所述肿瘤的类型为胶质瘤。

3.一种抗肿瘤药物，包含C620-0580和药学上可接受的辅料。

进一步，抗肿瘤药物，所述肿瘤的类型为胶质瘤。

本发明的有益效果在于：本发明筛选到C620-0580，对各种胶质母细胞瘤细胞系均有杀伤效果，IC50检测结果表明化合物C620-0580浓度在20μM-60μM之间对胶质母细胞有显著抑制作用。体外实验证实了小分子化合物C620-0580可以抑制胶质母细胞瘤增殖、侵袭、迁移和克隆形成等作用，体内实验也说明了化合物C620-0580可以抑制胶质母细胞瘤体内肿瘤生长，明显延长小鼠生存期(P＝0.0005)。且毒性试验检测说明了化合物C620-0580毒性低，有效剂量对小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑各器官无明显的影响，充分说明小分子化合物C620-0580能够用于制备抗肿瘤药物中，尤其是抗胶质母细胞瘤的药物中，可成为胶质瘤患者的潜在治疗药物，为胶质瘤靶向治疗提供了新的有效治疗方案。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明中关于小分子化合物C620-0580治疗胶质母细胞瘤体内外实验流程图。

图2为实施例2加样示意图。

图3为KPNA2蛋白纯化后SDS-PAGE检测图。

图4为C620-0580与KPNA2亲和力实验拟合曲线。

图5为C620-0580体外细胞毒性实验结果。

图6为C620-0580处理胶质母细胞瘤细胞LN229后transwell小室侵袭、迁移形成图。

图7为C620-0580处理原代胶质母细胞瘤细胞系GBM1后transwell小室侵袭、迁移形成图。

图8为C620-0580处理LN229、GBM1后克隆形成图。

图9为C620-0580不同浓度处理组与DMSO对照组连续20天腹腔给药对BALB/c小鼠体重的影响。

图10为不同浓度C620-0580与DMSO对照组腹腔给药对BALB/c小鼠各器官大体的影响。

图11为不同浓度C620-0580与DMSO对照组腹腔给药对BALB/c小鼠各器官HE染色的影响。

图12为C620-0580处理组与DMSO对照组对NOD-SCID原位荷瘤小鼠活体荧光成像图。

图13为C620-0580处理组与DMSO对照组对NOD-SCID原位荷瘤小鼠活体荧光值对比图。

图14为C620-0580处理组与DMSO对照组对NOD-SCID原位荷瘤小鼠生存期的影响。

图15为C620-0580处理组与DMSO对照组对荷瘤小鼠大脑切片及Ki67免疫组化染色。

图16为C620-0580在各种胶质母细胞瘤细胞系中的IC50检测结果。

图17为筛选化合物的体外细胞毒性检测结果。

图18为核筛选到靶向药物C620-0580的WB结果。

图19为C620-0580的NMR核磁检测图谱。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

图1为本发明中关于小分子化合物C620-0580治疗胶质母细胞瘤体内外实验流程图。具体实验为先在体外检测胶质母细胞瘤细胞系小分子化合物IC50，检测体外C620-0580对胶质母细胞瘤细胞系的杀伤效果，细胞增殖，侵袭迁移等实验；其次为体内实验，构建胶质母细胞瘤原位移植瘤模型，在种瘤7天后进行腹腔给药，给药剂量为5mg/kg，每日给药，对照组以与实验组相同溶剂进行腹腔给药。在给药处理后的每周进行活体荧光成像检测种瘤的大小，并记录生存期。(多形性胶质母细胞瘤(GBM)是成人中最常见的原发性恶性脑瘤形式，也是中枢神经系统最致命的癌症。尽管在了解肿瘤发生的分子机制方面取得了进展，但大多数目前的治疗仍然无效，包括靶向治疗，例如EGFR和VEGF靶向药物。人类GBM细胞系：U87和T98G；分离自新鲜肿瘤组织的GBM原代细胞：GBM1和GBM2：GBM1和U87是MGMT-缺陷的GBM细胞；GBM2和T98G是MGMT-阳性的GBM细胞。)

小分子化合物C620-0580体外细胞IC50检测

1、胶质母细胞瘤细胞系LN229、T98G、U87、GBM1、GBM2、GBM3用PBS洗2次后，弃PBS，加入1ml胰酶消化，吹散细胞呈悬液移至15ml离心管，800rmp离心5min，再用DMEM完全培养基重悬，计数。

2、取细胞悬液加入DMEM完全培养基接种至96孔板中，每孔1000个/100ul。37℃，5％CO

3、待细胞贴壁后弃上清，加入含不同浓度C620-0580的DMEM完全培养基。培养箱继续培养。

4、药物处理72小时后弃含药物的培养基，加入10％CCK8浓度的DMEM，37℃继续孵育2h后，450nm波长测OD值，计算药物IC50。

图16所示为C620-0580在各种胶质母细胞瘤细胞系中的IC50检测。小分子化合物对各种胶质母细胞瘤细胞系均有杀伤效果，IC50在20μM-60μM之间，结果表明化合物C620-0580浓度在20μM-60μM之间对胶质母细胞有显著抑制作用。

本发明针对于胶质瘤中特异性高表达的核浆转运蛋白，在类药化合物库chemdivV2017(specs～1469931)中，筛选到35种化合物，进一步体外细胞毒性检测(如图17所示)，再利用小分子化合物抑制KPNA2转运的cargo蛋白入核筛选到靶向药物C620-0580(如图18所示)。

本发明先在体外实验证实了小分子化合物C620-0580可以抑制胶质母细胞瘤增殖、侵袭、迁移和克隆形成等功能。进一步进行体内构建原位成瘤模型，腹腔给药实验也说明了化合物C620-0580可以抑制胶质母细胞瘤体内肿瘤生长，明显延长小鼠生存期。并且化合物C620-0580与KPNA2蛋白有强亲和力，KPNA2是C620-0580有效的靶点。毒性试验检测说明了化合物C620-0580毒性低，有效剂量对小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑各器官无明显的影响，可成为靶向KPNA2高表达胶质瘤患者的潜在治疗药物，为胶质瘤靶向治疗提供了新的治疗方案。

实验流程应为：

1、筛选到化合物C620-0580；

2、纯化KPNA2蛋白，并与化合物进行亲和力检测，证实化合物与KPNA2蛋白有强亲和力；

3、化合物在不同细胞系中IC50检测；

4、化合物杀伤胶质母细胞瘤细胞系体，体外细胞毒性实验，侵袭迁移等实验；

5、体内动物实验：急性毒性试验——长毒实验——颅内成瘤后给药治疗实验。

实施例1KPNA2蛋白纯化：

1、取Rosstta BL21感受态(卡梅德生物公司，中国)一只100μl，放置冰上化冻，超净工作台内取1.5ml无菌离心管，并均分50μl感受态细胞。

2、KPNA2质粒(天津卡梅德生物科技有限公司，ABX12606-2 COA)20μl，在超净工作台中将质粒加入到感受态细胞中，轻轻混匀后，冰浴30min。

3、42℃热击90S后立即冰浴5min，取30μl涂布LB(含50μg/ml卡那霉素或氨苄青霉素)平板，37℃培养14h(过夜培养)后挑取单克隆进行活化培养。

4、从LB平板中挑取单克隆，加入2ml LB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)活化至菌体OD600为0.6-0.8后，转接到5ml LB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)培养至菌体OD600为0.6-0.8后加入浓度为1mM的IPTG进行37℃诱导表达4h，16℃诱导30h后收集菌体。

5、取诱导表达前与诱导后各条件的菌体进行超声破碎后，取上清和沉淀制样SDS-PAGE分析。

6、放大表达：从步骤4表达鉴定中选取最优克隆菌株，37℃扩大培养300ml，加入IPTG150μl 37℃诱导4h后收取培养基上清。离心，上清经过0.22μg过滤后进行Ni柱亲和富集纯化获得KPNA2纯化蛋白。图3为KPNA2蛋白纯化后SDS-PAGE检测图，从左至右依次为M:Marker；泳道1：流穿；泳道2-7：不同咪唑浓度洗脱产物。

实施例2

小分子化合物C620-0580与KPNA2蛋白亲和力检测

检测仪器：Octet RE96E，fortebio，NTA(厂家：Fortebio，货号：18-5101)，能够特异地捕获HIS标签蛋白用于动力学检测。

1、蛋白稀释：用PBS将KPNA2蛋白稀释成20μg/mL，用于后续固化。

2、化合物稀释：取购置的C620-0580粉末(chemdiv,Inc.上海陶素生化有限公司代理，分子结构式及QC检测结果如图19所示)溶于DMSO配制成50mM浓度溶液。用PBST将50mM浓度的C620-0580化合物稀释成100倍，以此为最高浓度，用1％DMSO+PBST进行2倍梯度稀释，共6个浓度，用于后续分析。

C620-0580，分子式：C

3、NTA固化蛋白检测化合物：将以上样品和试剂按照图2所示顺序加入样品板，其中C1-C6及D1-D12孔中加入200μL的1％DMSO+PBST；C7-C12孔中加入200μL不同浓度的C620-0580，浓度依次为15.6μM、31.3μM、62.5μM、125μM、250μM、500μM，设置程序，进行信号检测，检测结果如图4所示，SSG R^2值均在0.99以上。结果表明不同浓度的C620-0580与KPNA2均有强的亲和力。图4为纯化后蛋白与化合物C620-0580亲和力实验拟合曲线。

实施例3

小分子化合物C620-0580体外细胞毒性实验

1、LN229、GBM1用PBS洗2次后，弃PBS，加入1ml胰酶消化，吹散细胞呈悬液移至15ml离心管，800rmp离心5min，再用DMEM完全培养基重悬，计数。

2、取细胞悬液加入DMEM完全培养基接种至96孔板中，1000个/100ul。37℃，5％CO

3、待细胞贴壁后弃上清，加入含20uM C620-0580的DMEM完全培养基。培养箱继续培养。

4、药物分别处理3、6、12、24、48、72、92小时后弃掉含药物的培养基，加入10％CCK8浓度的DMEM，37℃继续孵育2h后，450nm波长测OD值。

实验结果如图5所示，由图5可知，C620-0580处理对胶质母细胞瘤细胞系LN229及原代胶质母细胞瘤细胞系GBM1的抑制增殖的效果随时间增加而增强。

Transwell侵袭、迁移实验

1、将-20℃保存的Matrigel胶于4℃融化，配制与无血清DMED按照1:1的工作液，4℃保存备用。

2、侵袭铺胶：取Matrigel胶工作液20μl均匀铺在Transwell小室中，小室置于24孔板中，37℃孵箱中晾干；

3、分别将胶质母细胞瘤细胞LN229、GBM1用温热PBS清洗2次后，加入1ml Accutase酶消化，吹散细胞呈悬液移至15ml离心管，800rmp离心5min，再用无血清DMEM重悬，计数。

4、取400μl含有10％FBS的DMED加入新的24孔板中。

5、计数的细胞配置成40000个/200μl细胞悬液，加入Transwell小室上层(侵袭铺胶，迁移未铺胶)，再将小室轻轻放入步骤4中的培养基中，避免底部有气泡。

6、待37℃培养箱侵袭24h，迁移16h后，取出小室用PBS洗3次。

7、4％多聚甲醛溶液，室温固定15min，PBS洗3次。

结晶紫染色20min，流水轻轻冲洗，用棉棒轻轻擦干净小室上层细胞，在显微镜下拍照，计数统计。transwell小室侵袭、迁移实验结果如图6和图7所示，图8是克隆形成实验图。

图6-8为C620-0580处理对胶质母细胞瘤细胞系LN229及原代胶质母细胞瘤细胞系GBM1的抑制增殖的效果，及处理组与DMSO对照组的胶质瘤细胞transwell小室侵袭、迁移、克隆形成图。结果表明，C620-0580能显著抑制胶质母细胞瘤的增殖随时间增加而增强，且可抑制胶质母细胞瘤体外侵袭、迁移、克隆形成能力。

实施例4

C620-0580急性毒性试验

1、剂量设置与分组：溶剂对照组、100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg、800mg/kg，共九组，每组动物数量十只。

2、腹腔给药，10ml/kg，单次给药。

3、溶剂对照组注射10％二甲基乙酰胺，容积为10ml/kg。给药组小鼠观察情况如下腹腔注射给药，记录各组小鼠给药后每天的精神状态，活动，饮食进水，大小便情况，观察时间为14天，统计各组小鼠死亡数量，用Bliss法计算小鼠的半数致死量(LD50)，LD50＝414.7±70.2(342.9～483.3)mg/kg。

表1小鼠腹腔注射不同剂量的C620-0580后死亡情况(n＝10)

表2半数致死量LD50计算结果(Bliss法)

实施例5

C620-0580低剂量长时间毒性检测

1、根据急性毒性试验的LD50，设置1/10以下的给药浓度梯度，连续每日给药。

2、记录小鼠的体重，精神状态等情况(图9)。

3、20天后取小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑器官，观察各器官大体形态变化(图10)。

4、HE染色各器官石蜡切片，比较给药组与对照组的差异(图11)。

HE染色。

1、脱蜡：在烤灯下将样本烘烤30min，按照二甲苯I(15min)→二甲苯II(15min)进行脱蜡处理；

2、水化：无水酒精I(10min)→无水酒精II(10min)→95％酒精(5min)→85％酒精(5min)→75％酒精(5min)的顺序过缸，在自来水下冲洗玻片3min后用超纯水洗涤切片3次，每次5min；

3、核染色：将玻片置于苏木素溶液中20sec后自来水洗净，放入盐酸酒精中分化2sec后自来水冲洗10min进行反蓝；

4、0.5％伊红染液染色20sec；/5、脱水封片：将玻片依次通过75％酒精(3min)→85％酒精(3min)→95％酒精(3min)→100％酒精(5min)→100％酒精(5min)→二甲苯Ⅰ(20min)→二甲苯II(20min)的顺序脱水、透明，放置于通风处过夜后用中性树脂封片并采图(图11)。

图9为C620-0580不同浓度处理组与DMSO对照组连续20天腹腔给药对BALB/c小鼠体重的影响。结果显示，不同浓度C620-0580腹腔给药对小鼠体重无明显影响。图10为不同浓度C620-0580与DMSO对照组腹腔给药对BALB/c小鼠各器官大体的影响。图11为不同浓度C620-0580与DMSO对照组腹腔给药对BALB/c小鼠各器官HE染色的影响。从图9-图11的结果可以看出，C620-0580组20mg/kg及以下浓度对小鼠各器官无明显影响。

实施例6

配制C620-0580小鼠腹腔给药溶液。

取购置的C620-0580粉末，用DMSO配制成20mg/ml的母液。取40μl的母液加入240μl的聚乙二醇(PEG300)，混匀澄清以后加入80μl的吐温80，混匀澄清以后加入440μl的蒸馏水即配制成10mg/kg的给药浓度，5mg/kg给药浓度则相应比例稀释。

原位移植瘤模型构建及C620-0580体内给药：

1、胶质母细胞瘤细胞系LN229转染luciferase病毒。

2、收集LN229细胞，种瘤细胞量为每只nod-scid小鼠2×10

3、购买4-6周龄雌性NOD/SCID小鼠(购于集萃药康生物公司)，小鼠用戊巴比妥钠麻醉剂麻醉，用微量进样器取LN229细胞悬液5μl。

4、LN229细胞注射位点为右脑半球，鼠脑前正中线相交与外眦连线后4mm，右3mm处，进针4mm。缓慢进针并缓慢注射细胞，待细胞注射完后，停留30s，再缓慢拔针。

5、在种瘤7天后进行腹腔给药，给药剂量为5mg/kg，每日给药，对照组(实验组同浓度DMSO)以与实验组相同溶剂进行腹腔给药，给药剂量为5mg/kg，每日给药，对照组以与实验组相同溶剂进行腹腔给药。分别在0天，种瘤7天后，以及给药处理后的每周进行原位活体荧光成像检测移植瘤的大小，并记录生存期。并分别将C620-0580处理组与DMSO对照组的荷瘤小鼠大脑切片以及Ki67免疫组化染色。

原位活体荧光成像检测移植瘤大小：

颅内移植瘤构建成瘤后检测活体成像小鼠成瘤情况，随机分组对照组及给药组开始给药，给药7天、14天、21天。每次向每只小鼠腹腔注射200uL Luciferin工作液，随后用IVIS活体动物成像仪观察实验组与对照组小鼠的各自的成瘤情况(图12)，统计荧光强度(图13)。

生存期统计

记录给药组及对照组荷瘤小鼠死亡时间，统计并计算两组生存期(图14)。结果显示，C620-0580能延长荷瘤小鼠的生存期。

免疫组化染色。

1、取对照组及给药组小鼠大脑，福尔马林固定1天后，包埋蜡块进行石蜡切片。

2、石蜡切片脱蜡水合：在65度烘箱内烤30min，按照二甲苯I(15min)→二甲苯II(15min)进行脱蜡处理→无水乙醇I(10min)→无水乙醇II(10min)→95％乙醇(5min)→85％乙醇(5min)→75％乙醇(5min)的顺序过缸，在蒸馏水洗涤切片3次，每次5min；

3、抗原修复：向电磁炉上压力锅中加入柠檬酸修复液进行酸修复，将玻片放倒至全部淹没于修复液中，待升压上汽后继续加热2.5min后终止修复，放凉至室温；

4、阻断内源性过氧化物酶：选用新鲜配制的2％ H

5、封闭：甩干切片周围水分，组画笔画圈组织样本，滴加即用型山羊封闭血清37℃封闭30min；

6、一抗孵育：甩干玻片上血清，在切片表面滴加Ki67一抗(#9449，CST，美国)，用抗体稀释液液将一抗按照1:1000配比稀释，置于湿盒内4℃孵育过夜；

7、孵育二抗：PBS洗4次，每次持续5min，最后一次洗涤时加入Tween-20；在切片表面滴加通用二抗DAKO(DAKO EnVision FLEX,High pH，美国)，湿盒37℃孵育30min；

8、显色：按照1：50的比例混匀DAB显色A、B液，滴加DAB工作液至玻片上，每片40uL，显色完毕后用自来水漂洗终止；

9、染核：将玻片置于苏木素溶液中2min后自来水洗净，放入盐酸酒精中分化2秒后自来水冲洗进行反蓝；

10、脱水封片：将玻片依次通过75％酒精(3min)→85％酒精(3min)→95％酒精(3min)→100％酒精(5min)→100％酒精(5min)→二甲苯Ⅰ(20min)→二甲苯II(20min)的顺序脱水、透明，放置于通风处过夜后用中性树脂封片。

图12为C620-0580处理组与DMSO对照组对NOD-SCID原位荷瘤小鼠活体荧光成像图。结果显示，C620-0580能显著抑制胶质母细胞瘤原位移植瘤生长。

图13为C620-0580处理组与DMSO对照组对NOD-SCID原位荷瘤小鼠活体荧光值对比图，由图12和图13的结果显示，C620-0580能显著抑制胶质母细胞瘤原位移植瘤生长。

图14为C620-0580处理组与DMSO对照组对NOD-SCID原位荷瘤小鼠生存期的影响。结果显示，C620-0580能延长荷瘤小鼠的生存期。

图15为C620-0580处理组与DMSO对照组对荷瘤小鼠大脑切片及Ki67免疫组化染色。结果显示，C620-0580能显著抑制肿瘤大小及降低胶质母细胞瘤Ki67阳性表达，抑制胶质母细胞瘤增殖。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。