一种基于CRISPR/Cas13a快速检测blaKPC基因的方法

技术领域

本发明属生物检测技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas13a快速检测blaKPC基因的方法。

背景技术

由于近年来碳青酶烯类抗生素的大量使用和滥用，这类被誉为革兰阴性杆菌最后一道防线的药物已面临破防的风险，碳青霉烯类耐药肠杆菌(Carbapenem-ResistantEnterobacteriaceae，CRE)的出现和传播流行已成为全球抗感染面对的可怕对手，自2017年起CRE更被WTO列为21世纪最重要的耐药病原菌之一。其中，产生碳青霉烯酶是CRE最重要的耐药机制，根据Amber分类主要包括A、B、D三类酶，A类和D类同属丝氨酸酶，B类则是金属酶。据中国细菌耐药监测网2021年监测结果报告，我国临床分离CRE中碳青霉烯酶分布特征目前仍以KPC酶为主，而KPC酶属于碳青霉烯酶中的A类水解丝氨酸酶，细菌通过产KPC酶水解碳青霉烯类抗生素使其失去活性从而产生耐药性。由于CRE产生碳青霉烯酶类型不同，其对碳青霉烯类抗生素的作用方式和耐药程度也截然不同，由此临床对其治疗用药方向必须具有精确性和针对性。譬如对于产KPC水解酶和NDM金属酶这两种CRE，前者酶活性可被阿维巴坦抑制，产酶菌株通常仅对替加环素、多粘菌素或头孢他啶-阿维巴坦敏感；后者酶活性不能被阿维巴坦抑制，产酶菌株通常仅对替加环素和多粘菌素敏感，少数菌株对氨曲南敏感。2020年发布的《肠杆菌目细菌碳青霉烯酶的实验室检测和临床报告规范专家共识》也表明了发现CRE感染时，检测并报告了碳青霉烯酶对临床尽早尽快精准抗感染治疗具有重要的指导价值。

目前微生物实验室多采用药敏表型检测的方法指导抗菌药物使用，该方法结果直观但需要进行细菌分离培养。对于碳青霉烯酶常见的表型检测办法有Carba NP试验、改良碳青霉烯灭活试验(modified carbapenem inactivation method，mCIM)、EDTA碳青霉烯灭活试验(EDTA-carbapenem inactivation method，eCIM)、碳青霉烯酶抑制剂增强试验，可以看到检测方法在不断进步优化虽易于检测，但只能初步鉴别碳青霉烯酶的产酶类型，无法明确耐药菌株的分子流行病学特征，更无法克服假阳性、假阴性和过夜培养耗时长的缺点。对于碳青霉烯酶常见的基因型检测方法主要包括荧光定量PCR和DNA测序等分子检测技术，虽然能大大缩短检测时长并直接检测碳青霉烯酶基因型，但其通常使用的试剂仪器费用高昂，对技术环境配置和操作人员要求也较高，较难普及至基层应用。近年来，核酸等温扩增技术越来越多应用于细菌的快速检测，由于其能在某一特定温度实现核酸的快速扩增，克服了传统PCR反应条件繁琐、检测时间长的缺点，在基层检测和即时检验方面都表现出巨大的优越性和便利性。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术需要2对引物，反应时间需40分钟左右，但60～65℃的温度条件使反应易产生气溶胶导致结果假阳性、加阴性率高。同为核酸等温扩增技术，重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)技术只需一对特异性引物，在37～40℃反应十数分钟便可实现指数式扩增。目前RPA技术的检测方式包括琼脂糖凝胶电泳和直接荧光探针法。有大量研究包括本研究验证(图1)发现RPA产物通过琼脂糖凝胶电泳检测会出现拖带且电泳条带不清晰的现象，需经过纯化才能改善，无疑使操作更加繁琐。同时，一些低仪器配置地区实验室的病原微生物检测能力有限。多种因素迫切需要开发一种能大量投入应用于临床、操作简便、仪器试剂要求配置低、快速高效、灵敏特异的针对碳青霉烯酶类耐药基因blaKPC基因新式检测技术。

成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白13a(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 13a，CRISPR/Cas13a)是CRISPR/Cas蛋白家族新晋的一种核酸酶成员，近年来在扩展RNA干扰、基因编辑和分子诊断多个领域应用中备受青睐。与被熟知的Cas9需利用tracrRNA和crRNA结合切割DNA不同，Cas13a只需crRNA就可结合并切割RNA。Cas13a还具有附带切割效应，其HEPN结构域被crRNA识别并激活后，形成Cas13a-crRNA-靶RNA复合物，从而特异性水解靶RNA及非特异性水解周围RNA分子。研究可利用Cas13a这一特性，识别到靶RNA后对检测反应中加入的RNA荧光探针携带的淬灭基团进行非特异切割，实现荧光信号检测。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供一种检测blaKPC基因的试剂。

本发明第二方面的目的，在于提供一种试剂盒。

本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的试剂和/或本发明第二方面的试剂盒的应用。

本发明第四方面的目的，在于提供一种非疾病诊断的基于CRISPR/Cas13a的blaKPC基因的检测方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种检测blaKPC基因的试剂，所述试剂包括检测blaKPC基因的crRNA和/或扩增blaKPC基因的引物对；所述crRNA包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列能够与Cas蛋白结合，所述向导序列与所述引物对的扩增产物序列相匹配。

优选地，所述引物包括引物1、引物2和引物3中的至少一种；

KPC-F1:5’-CACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTCT-3’(SEQ ID NO:1)；

KPC-R1:5’-AATTGGCGGCGGCGTTATCACTG TATTG-3’(SEQ ID NO:2)；

所述引物2的序列为：

KPC-F2:5’-GTTCTGCTGTCTTGTCTCTCAT-3’(SEQ ID NO:3)；

KPC-R2:5’-CGGCGGCGTTATCACTGTATTG-3’(SEQ ID NO:4)；

所述引物3的序列为：

KPC-F3:5’-CTTCAGCAACAAATTGGCGGCGGCGTTATC-3’(SEQ ID NO:5)；

KPC-R3:5’-CCACTGTGCAGCTCATTCAAGGGCTTTCTT-3’(SEQ ID NO:6)。

优选地，所述KPC-R1和所述KPC-R2包含T7启动子序列，所述T7启动子序列如SEQID NO:8所示。

进一步优选地，所述T7启动子序列位于所述KPC-R1或所述KPC-R2的5’端。

优选地，所述KPC-F3包含T7启动子序列，所述T7启动子序列如SEQ ID NO:9所示。

进一步优选地，所述T7启动子序列位于所述KPC-F3的5’端。

优选地，所述crRNA序列为

5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUCACCCAUCUCGGAAAAAUAUCUGACAAC-3’(SEQ ID NO:7)

优选地，所述锚定序列为

5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC-3’(SEQ ID NO:10)；

优选地，所述向导序列为5’-UCACCCAUCUCGGAAAAAUAUCUGACAAC-3’(SEQ ID NO:11)

优选地，所述Cas蛋白为Cas13a；进一步为LwaCas13a。

根据Cas13a蛋白的特点，在扩增的基因片段序列直接设计特异识别青霉烯酶类耐药基因blaKPC基因的crRNA，在NCBI中进行blast，显示是特异的青霉烯酶类耐药基因blaKPC基因序列。

优选地，所述引物对可用于RPA技术和/或普通PCR技术。

本发明第二方面，提供一种包含第一方面的试剂的试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括Cas蛋白。

优选地，所述Cas蛋白选自LwaCas13a、LbaCas13a、CamCas13a、LbuCas13a、LshCas13a、RcaCas13a、HheCas13a、PprCas13a、LseCas13a、LbmCas13a或LbnCas13a中的至少一种；进一步为LwaCas13a。

优选地，所述试剂盒还包括RPA缓冲液、T7 RNA聚合酶、RNase抑制剂、dNTPs的至少一种。

优选地，所述试剂盒还包括信号报告探针。

优选地，所述信号报告探包含核酸序列，所述核酸序列的5'端修饰荧光基团，3'端修饰淬灭基团。

优选地，所述信号报告探的核酸序列为5’-UUUUUU-3’。

优选地，所述荧光基团为FAM、HEX、HTX、VIC、TAMRA、ROX和CY5中的至少一种；进一步为FAM。

优选地，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2和BHQ3中的至少一种；进一步为BHQ1。

通过引入信号报告探针，利用Cas13a的附带切割效应，可以放大体系中的检测信号，提高检测的灵敏度。

本发明第三方面，提供本发明第一方面的试剂和/或本发明第二方面的试剂盒在1)～6)中任一种中的应用；

1)碳青霉烯酶类耐药基因blaKPC基因的检测；

2)制备检测碳青霉烯酶类耐药基因blaKPC基因的产品；

3)检测待测样本是否含有碳青霉烯酶类耐药基因blaKPC基因；

4)制备检测待测样本是否含有碳青霉烯酶类耐药基因blaKPC基因的产品；

5)筛选碳青酶烯类耐药肠杆菌的抗菌药物；

6)制备筛选碳青酶烯类耐药肠杆菌的抗菌药物的产品；

上述应用用于非疾病的诊断与治疗。

本发明第四方面，提供一种非疾病诊断目的的基于CRISPR/Cas13a的blaKPC基因的检测方法，包括采用本发明第一方面的试剂和/或本发明第二方面的试剂盒的步骤。

优选地，所述检测方法具体包括以下步骤：

(1)提取待测样本的核酸；

(2)将本发明第一方面中的引物对与步骤(1)中的核酸混合，进行RPA等温扩增，得到RPA扩增产物；

(3)将步骤(1)所述的RPA扩增产物与本发明第一方面中的crRNA、本发明第二方面中的Cas蛋白、信号报告探针、RPA缓冲液、T7 RNA聚合酶、RNase抑制剂和dNTPs混合，进行CRISPR反应检测，读取检测信号；

(4)根据检测信号判定待测样本是否含有blaKPC基因。

通过加入基于RPA反应的核酸扩增步骤，不仅使该检测技术的应用范围扩大到RNA和DNA都可以检测，同时明显提高了检测的灵敏度。

优选地，步骤(2)中所述RPA等温扩增的条件为37～40℃反应20～30分钟。

优选地，步骤(2)中所述RPA等温扩增的反应体系还包括醋酸镁和Primer FreeRehydration Buffer。

优选地，步骤(2)所述RPA等温扩增的反应体系每50μL包括20～25μM本发明一方面的引物、650～700mM醋酸镁和Primer Free Rehydration Buffer。

优选地，步骤(3)所述检测荧光强度采用荧光定量PCR仪进行。

优选地，步骤(3)所述反应的条件为37～40℃反应40～50分钟。

优选地，所述检测方法的结果判定方法为：终点相对荧光强度(Final RFI)＞3600时，表示有检测信号，结果判为阳性；终点相对荧光强度(Final RFI)≤3600时，表示无检测信号，结果判定为阴性。

本发明的有益效果是：

本发明提供的检测碳青霉烯酶类耐药基因blaKPC基因的试剂，该试剂中的引物对可用于普通PCR技术、RPA等温扩增技术以检测快速、准确的检测碳青霉烯酶类耐药基因blaKPC基因，其灵敏度高，特异性较强。针对碳青霉烯酶类耐药基因blaKPC基因特异性的设计的crRNA可与blaKPC基因保守序列特异性形成互补双链，与其他碳青霉烯酶类耐药基因不存在交叉反应，提高了blaKPC基因检测的特异性。

本发明所提供的一种基于CRISPR/Cas13a的碳青霉烯酶类耐药基因blaKPC基因检测的方法，不仅克服了PCR或DNA测序等分子检测技术存在的操作繁琐、仪器昂贵、对实验场地和人员要求比较高、难以适用于现场大规模筛查的缺点，其两个扩增检测环节均在恒温下进行，因此整个检测过程只需一台便携恒温荧光信号检测仪即可完成，非常适用于基层单位和环境条件有限的战场使用。同时，本发明提供的检测方法的在步骤(3)CRISPR/Cas13a检测环节仅20分钟左右即可检测到信号，即可以认为本发明提供的检测方法可在一小时左右完成检测，比传统PCR大大缩短了检测时间。最低可检测出2.5copies/μL DNA，表现出优异的灵敏度。将本方法应用于检测临床菌株是否携带blaKPC基因，比较CRISPR/Cas13a检测与DNA测序技术的对blaKPC基因的检出率，检测结果一致性高，同时对其他耐药基因检测无交叉反应，证明其灵敏度高、特异性强。将本方法应用于直接检测痰标本中细菌是否携带blaKPC基因，结果依然表现了优秀的灵敏度和准确性，检出结果与DNA测序、普通PCR扩增均高度一致，同时与痰标本分离培养-药敏质谱鉴定结果也相符合。

进一步的，该检测方法为CRE感染的早期快速筛查诊断和阐明所感染CRE具体的耐药基因型提供一种新的技术手段，从而为产KPC型CRE和重症感染患者的抗感染治疗提供一个准确方向，对监控院内细菌碳青酶烯酶类药物耐药性分子流行病学特征分布和传播都也具有重要意义。同时为在RPA-Cas13a系统中延伸引进多个靶标通道同时检测多个耐药基因的未来研究奠定基础。

附图说明

图1为RPA方法检测阳性标准菌株肺炎克雷伯杆菌(ATCC BAA-1705)的琼脂糖凝胶电泳图，图中，M为2000bp的DNA Marker，1为应用引物1检测，2为应用引物2检测，3为应用引物3检测。

图2为普通PCR方法检测阳性标准菌株肺炎克雷伯杆菌(ATCC BAA-1705)的琼脂糖凝胶电泳图，图中，M为2000bp的DNA Marker，1为应用引物1检测，2为应用引物2检测，3为应用引物3检测。

图3为CRISPR/Cas13a检测不同稀释浓度的阳性标准菌株肺炎克雷伯杆菌(ATCCBAA-1705)RPA扩增产物的扩增曲线。

图4为实施例3的CRISPR/Cas13a快速检测方法检测10

图5为实施例3的CRISPR/Cas13a快速检测方法检测标准菌株的扩增曲线。

图6为实施例3的CRISPR/Cas13a快速检测方法检测临床菌株DNA所携带blaKPC基因的相对荧光强度结果统计图。

图7为普通PCR扩增-琼脂糖凝胶电泳检测临床痰标本的电泳图，其中，M为2000bp的DNA Marker，标号1～8为DNA测序blaKPC基因阳性的痰液样本，编号9为DNA测序blaKPC基因阴性的痰液样本，10为阴性标准菌株大肠埃希菌(ATCC 25922)，11和12为阳性标准菌株肺炎克雷伯杆菌(ATCC BAA-1705)。

图8为普通PCR扩增-琼脂糖凝胶电泳检测临床痰标本的电泳图，其中，M为2000bp的DNA Marker，标号12为阳性标准菌株肺炎克雷伯杆菌(ATCC BAA-1705)，13～23分别表示DNA测序blaKPC基因阴性的痰液样本。

图9为实施例3的CRISPR/Cas13a快速检测方法检测痰标本中细菌携带blaKPC基因的扩增曲线。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。

实施例1碳青霉烯酶类耐药基因blaKPC基因的RPA引物、crRNA的设计以及标准品的构建

1.RPA引物、crRNA的设计

根据NCBI上公布的84组blaKPC基因家族的完整CDS序列，应用DNAMAN进行多个序列比对检索出对blaKPC基因的特异性高度保守区域。根据RPA专用引物设计原则，引物长度宜为30～35bp，扩增片段不宜超过500bp，GC含量宜在40％～60％。利用NCBI平台的Nucleotide BLAST和Peimer Premier 5设计针对blaKPC基因的RPA引物和crRNA，并进行初步验证，选择二级结构、发卡结构和引物二聚体出现可能性最小的三对候选引物(相关序列见表1)，在引物1和引物2的反向引物的5’端分别连接T7启动子序列atatttaatacgactcactataggg(SEQ ID NO:8)，引物3的正向引物的5’端连接T7启动子序列gaaattaatacgactcactataggg(SEQ ID NO:9)。在RNA-probe的5’端修饰荧光基团FAM，在3’端修饰淬灭基团BHQ1。采用PCR扩增-凝胶琼脂电泳技术和RPA-Cas13a检测体系进行最优引物对的筛选和验证。以上RPA引物、crRNA均送由广州捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 blaKPC基因的RPA引物、crRNA序列和探针序列

注：KPC-CrRNA序列中，下划线标记的序列为锚定序列，未标记下划线的序列向导序列。

2.标准品的构建

以PGH为载体，扩增blaKPC基因的特异性高度保守区片段，构建克雷伯杆菌目的基因质粒KPC-PC6813Gn/H5128-3(由广州捷瑞生物工程有限公司合成)，作为标准品质粒。以携带blaKPC基因的肺炎克雷伯杆菌(ATCC BAA-1705)作为阳性标准菌株，以不携带blaKPC基因的肺炎克雷伯杆菌(ATCC 700603)、大肠埃希菌(ATCC 25922)作为阴性标准菌株。

实施例2blaKPC基因的RPA引物对筛选

(1)待测样品的DNA提取

采用硅胶纯化技术提取标准菌株的DNA，具体步骤如下：刮取肺炎克雷伯杆菌(ATCC BAA-1705)或其他标准菌株的菌落配置1mL的1麦氏比浊菌悬液，10000×g离心1分钟，弃去上清，收集细菌菌泥；根据细菌DNA提取试剂盒(Hipure Bacteria DNA Kit，Magen生物)说明书，向细菌菌泥中加入220μL Buffer STE Plus、30μL Lysozyme和10μL RNase A涡旋重悬细菌，室温静置10分钟；加入250μL Buffer DL和10μL Proteinase K 70℃消化10分钟；加入250μL无水乙醇，转移至硅胶柱10000×g离心1分钟过滤洗脱；加入500μL BufferGW1，10000×g离心1分钟洗脱蛋白质和其他杂质；加入650μL Buffer GW，10000×g离心1分钟洗涤除去盐分；最后加入100μL Buffer AE，静置3分钟后10000×g离心1分钟洗脱DNA，将溶液收集到离心管中，备用。

(2)RPA和普通PCR扩增blaKPC目的基因片段

所提取的阳性标准菌株肺炎克雷伯杆菌(ATCC BAA-1705)的DNA经超微量分光光度计检测浓度为55.05ng/μL，加入RNase-free Water进行10倍梯度稀释，稀释得到原浓度的1/10，1/100，1/1000DNA稀释样本。以55.05ng/μL DNA样本为模板，利用表1的三对引物对blaKPC基因进行RPA和普通PCR扩增，并进行琼脂凝胶电泳检测，评估其扩增效果。其中，RPA扩增blaKPC目的基因片段具体如下：50μL RPA扩增反应体系：RNase-free Water 11.2μL，Primer Free Rehydration Buffer 29.5μL，引物KPC-F&KPC-R(10μM)各2.4μL，280mM醋酸镁2.5μL，模板2μL，上述成分加至装有冻干粉的基础反应管(TwistDx生物，TwistAmp BasicTABAS03KIT-96t)中，振荡混匀后，置于ABI GeneAmp PCR System 9700PCR仪设置39℃反应20分钟。普通PCR扩增反应体系及扩增程序如下：20μL PCR扩增反应体系：RNase-freeWater 7μL，ApexHF HS DNA聚合酶预混液(湖南艾科瑞生物工程有限公司)10μL，引物KPC-F&KPC-R(10μM)各0.5μL，模板2μL振荡混匀后置于ABI GeneAmp PCR System 9700PCR仪，扩增程序：98℃预热10分钟；98℃10秒，60℃5秒，72℃10秒，40个循环；最后72℃孵育10分钟。

琼脂凝胶电泳检测RPA或普通PCR扩增产物具体如下：配制1.2％琼脂凝胶，设计电泳体系：RPA或PCR扩增产物9μL/孔，6×loading Buffer(北京全式金生物技术股份有限公司)1μL/孔，另外设置Marker孔加入2000bp DNA Marker(北京全式金生物技术股份有限公司)5μL，琼脂置于含10×TAE缓冲液的电泳槽220V电泳30min，将扩增完毕的RPA或PCR扩增产物置于凝胶成像系统中成像并拍取照片。

(3)CRISPR/Cas13a检测RPA扩增产物

利用CRISPR/Cas13a检测体系对RPA扩增产物进行检测进行检测，评估其扩增效果，其中以肺炎克雷伯杆菌(ATCC 700603)、大肠埃希菌(ATCC 25922)(DNA提取方法同上)作为阴性对照，RNase-free Water作为空白对照。其中，20μL的RPA-Cas13a检测体系如下：RNase-free Water 11.7μL，10×T7 RNA Polymerase Buffer(TaKaRa)2μL，T7 RNAPolymerase(50U/μL，TaKaRa)0.5μL，dNTP Mixture(25μM，Beyotime Biotechnology)0.8μL，LwaCas13a蛋白(1μM，广州博徕斯生物科技股份有限公司)1μL，crRNA(1μM)0.5μL，RNaseInhibitor(40U/μL，Beyotime Biotechnology)0.5μL，FAM荧光探针(10μM，广州博徕斯生物科技股份有限公司)1μL，RPA扩增产物2μL，加入PCR反应管振荡混匀后置于Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪，37℃反应45分钟，每分钟记为一个反应循环，记录每循环的相对荧光强度(Relative Fluorescence Intensity，RFI)。FAM荧光探针为含6个碱基的短链RNA，其一端修饰了荧光基团FAM，另一端修饰了荧光淬灭基团BHQ1，当此FAM荧光探针处于完整状态时，由于荧光共振能量转移(FRET)作用，荧光信号被淬灭，体系不会发荧光，一旦Cas13a酶在crRNA的指引下被靶标序列激活其RNA酶活性，即可切断此短链RNA，从而荧光基团与淬灭基团距离变远，荧光淬灭机制失效，体系发荧光。

利用表1中三对引物对blaKPC基因进行RPA和普通PCR扩增并进行琼脂凝胶电泳，结果表明，在RPA扩增中，三对引物均能扩增出目的条带，但条带模糊并且存在拖带现象(图1)。在普通PCR扩增中，3对引物均能扩增出目的条带，但引物1出现非特异性扩增，分析其原因可能是产生了引物二聚体；引物2和引物3的扩增出的目的条带清晰，对blaKPC基因具有较好的扩增效果(图2)。进一步采用CRISPR/Cas13a检测体系对不同浓度的阳性标准菌株肺炎克雷伯杆菌(ATCC BAA-1705)的DNA模板进行检测，结果表明，阴性对照和空白对照无明显荧光信号，引物3在1/10至1/1000DNA稀释样本扩增反应中均表达较高的荧光信号；而引物2在低浓度的扩增反应中终点荧光信号明显低于引物3；引物1在低浓度产物的扩增反应中荧光信号微弱，在中高浓度1/100稀释样本的扩增反应中终点荧光信号显著低于引物2和引物3(图3)。综上，选用引物3作为最优引物用于建立检测blaKPC基因的CRISPR/Cas13a检测体系。

实施例3碳青霉烯酶类耐药基因blaKPC基因的CRISPR/Cas13a快速检测方法的建立

一种基于CRISPR/Cas13a快速检测blaKPC基因的方法，包括以下步骤：

(1)待测样品的DNA提取

采用硅胶纯化技术提取菌液DNA，具体同实施例2。当待测样品为痰液时，在DNA提取前，将痰液样本加入等体积的胰蛋白酶，混匀室温放置60分钟，使其充分液化，10000×g离心3分钟进行细菌DNA富集处理后，弃上清液，后续提取步骤同实施例2。

(2)RPA扩增blaKPC目的基因片段

将引物3(KPC-F3&KPC-R3)稀释至10μM，以标准品质粒KPC-PC6813Gn/H5128-3或所提取DNA作为模板，通过RPA扩增blaKPC的目的基因片段，具体如下：50μL RPA扩增反应体系：RNase-free Water 11.2μL，Primer Free Rehydration Buffer 29.5μL，引物KPC-F3&KPC-R3(10μM)各2.4μL，280mM醋酸镁2.5μL，模板2μL，上述成分加至装有冻干粉的基础反应管(TwistDx生物，TwistAmp Basic TABAS03KIT-96t)中，振荡混匀后，置于ABI GeneAmpPCR System 9700PCR仪设置39℃反应20min。

(3)CRISPR/Cas13a检测RPA扩增产物

20μL CRISPR/Cas13a检测体系包括以下成分：RNase-free Water 11.7μL，10×T7RNA Polymerase Buffer(TaKaRa)2μL，T7 RNA Polymerase(50U/μL，TaKaRa生物)0.5μL，dNTP Mixture(25μM，Beyotime Biotechnology)0.8μL，LwaCas13a蛋白(1μM，广州博徕斯生物科技股份有限公司)1μL，crRNA(1μM)0.5μL，RNase Inhibitor(40U/μL，BeyotimeBiotechnology)0.5μL，FAM荧光探针(10μM，广州博徕斯生物科技股份有限公司)1μL，RPA扩增产物2μL，加入PCR反应管振荡混匀后置于Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪，37℃反应45分钟，每分钟记为一个反应循环，记录每循环的相对荧光强度。

实施例4灵敏度评估

本实施例用于评估实施例3所建立的碳青霉烯酶类耐药基因blaKPC基因的CRISPR/Cas13a快速检测方法的灵敏度。

在本发明中，检测低限(Lowest limit detection，LLD)被定义为样品的单次检测信号超过空白对照均值的3倍空白标准差，认为具99.7％的可能性样品内含有分析物，即本发明中，待测样本的终点相对荧光强度

表2空白对照重复试验终点相对荧光强度

通过利用实施例3所建立的方法对RNase-free Water进行重复检测，结果如表2所示，根据表2计算

进一步将标准品质粒KPC-PC6813Gn/H5128-3用RNase-free Water溶解后，进行10倍梯度稀释至10

实施例5准确性评估

本实施例用于评估实施例3的CRISPR/Cas13a快速检测方法的准确性。

使用实施例3的CRISPR/Cas13a快速检测方法对标准菌株大肠埃希菌(ATCC25922)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)、肺炎克雷伯菌(ATCC BAA-1705)、肺炎克雷伯菌(ATCC700603)进行检测，结果如图5所示，仅携带有blaKPC基因的肺炎克雷伯菌(ATCC BAA-1705)出现荧光扩增曲线，其他不携带blaKPC基因为阴性标准菌株均不能扩增出相应的荧光扩增曲线，结果与预期相符，表明实施例3所建立的碳青霉烯酶类耐药基因blaKPC基因的CRISPR/Cas13a快速检测方法准确性较好。

实施例6临床菌株的检测

使用实施例3的CRISPR/Cas13a快速检测方法对取至2021年1月～6月采用甘油管冷冻保藏法-80℃保存于本院(中国人民解放军南部战区总医院)微生物实验室疑似CRE菌株(共96株)进行检测，上述96株疑似CRE菌株来自非同一患者的痰液或血培养标本分离得到。同时将上述菌株经血琼脂平板(江门凯林生物)培养后进行VITEK MS质谱鉴定和DNA测序，结果表明上述菌株中存在共52株携带blaKPC基因的CRE，其中包括46株肺炎克雷伯杆菌、2株大肠埃希菌、2株产气肠杆菌和2株阴沟肠杆菌；14株不携blaKPC基因的CRE，其中3株为肺炎克雷伯杆菌和11株为大肠埃希菌；余下30株为普遍敏感细菌，包括11株肺炎克雷伯杆菌、7株大肠埃希菌、3株产气肠杆菌、2株阴沟肠杆菌、2株奇异变形杆菌、2株伤寒沙门菌、2株铜绿假单胞菌和1株为金黄色葡萄球菌。CRISPR/Cas13a快速检测结果如图6所示，共49株携带blaKPC基因的CRE均检测出明显的荧光信号，其余菌株无荧光信号产生，结果与VITEK MS质谱鉴定和DNA测序的结果相符，以DNA测序为金标准方法，实施例3的CRISPR/Cas13a快速检测方法的灵敏度为49/52×100％＝94.2％，特异性44/44×100％＝100％。

实施例7临床痰样本的检测

采集2021年11月本院(中国人民解放军南部战区总医院)疑似细菌感染患者的20份痰液标本，利用实施例3的碳青霉烯酶类耐药基因blaKPC基因的CRISPR/Cas13a快速检测方法以及普通PCR(具体步骤同实施例2)进行检测。同时，对上述20份痰液标本进行DNA提取后送至生工生物公司进行DNA测序，DNA测序结果显示共8份痰液样本检测出blaKPC基因，其余12份痰液样本没有检测出blaKPC基因。

普通PCR扩增结果如图7和图8所示，共10份样本扩增出了目的条带(其中11和12为阳性标准菌株肺炎克雷伯杆菌(ATCC BAA-1705)，与DNA测序结果一致。CRISPR/Cas13a快速检测显示，除阳性标准菌株肺炎克雷伯杆菌(ATCC BAA-1705)出现荧光扩增曲线之外，还有8份样本出现荧光扩增曲线，阴性标准菌株大肠埃希菌(ATCC 25922)以及另外12份样本均无荧光扩增曲线，结果与DNA测序结果以及普通PCR扩增结果一致(图9)，表明该方法能特异、灵敏、准确地检测出携带碳青霉烯类耐药基因blaKPC的标本。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。