虎杖苷在制备预防和/或治疗免疫抑制性疾病的药物中的用途

技术领域

本申请涉及医药领域，特别是涉及虎杖苷在制备预防和/或治疗免疫抑制性疾病的药物中的用途。

背景技术

免疫系统(immune system)是机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统，由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成。免疫系统具有识别和排除抗原性异物、与机体其他系统相互协调，共同维持机体内环境稳定和生理平衡的功能。免疫力下降会导致机体免疫系统出现各种缺陷，从而导致机体单核细胞和巨噬细胞数量发生变化，并影响其吞噬能力和趋化反应，使机体更易被病原体侵袭，造成一系列临床症状。Tian Wenmin等人在《NatureCommunications》发表的“Immune suppression in the early stage of COVID-19disease”的研究论文报道了新型冠状病毒感染患者早期大多会出现免疫抑制特征，这使得关于免疫调节方面的研究更有意义。很多中草药、中草药提取物以及化合物都可以调节机体免疫功能。川牛膝水提物对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的免疫功能具有改善作用。苦丁茶冬青多糖能够通过促进淋巴细胞增殖、增强细胞抗氧化能力及诱导炎性细胞因子分泌等途径提高小鼠脾脏淋巴细胞免疫活性，发挥其免疫调节作用。还有白术多糖、桔梗提取物、冬虫夏草和牛樟芝肉桂多糖等都可以改善小鼠的免疫功能。同时对新冠有显著疗效的宣肺败毒方也可以有效缓解环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的免疫功能。

虎杖苷(polydatin，PD)，化学名为3,4'-5-三羟基二苯乙烯-3-β-D-葡萄糖苷，又称为白藜芦醇苷，是从植物虎杖中提取分离出来的一种二苯乙烯类化合物，分子式为C

发明内容

本申请的发明人通过深入研究，发现虎杖苷能够增强小鼠免疫抑制模型的淋巴细胞的增殖，从而可以用来预防和/或治疗免疫抑制性疾病，进而用于制备预防和/或治疗免疫抑制性疾病的药物。

本申请第一方面提供了虎杖苷在制备预防和/或治疗免疫抑制性疾病的药物中的用途。

在本申请的一些实施方式中，所述免疫抑制性疾病包括感染性疾病、结缔组织病、血液系统疾病、癌症或皮肤病伴随的免疫系统抑制状态中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，所述感染性疾病包括新型冠状病毒感染、上呼吸道感染、消化道感染或泌尿系统感染中的至少一种；所述结缔组织病包括类风湿性关节炎、结核病、皮肌炎、系统性红斑狼疮或干燥综合征中的至少一种；所述血液系统疾病包括艾滋病或传染性单核细胞增多症中的至少一种；所述癌症包括肝癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、白血病或淋巴瘤中的至少一种。

本申请第二方面提供了一种用于制备预防和/或治疗免疫抑制性疾病的药物组合物，其包括虎杖苷。

在本申请的一些实施方式中，所述虎杖苷是以单体的形式提供，或以包含其的植物提取物的形式提供。

在本申请的一些实施方式中，所述植物提取物选自虎杖提取物。

在本申请的一些实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。

在本申请的一些实施方式中，所述药学上可接受的载体或赋形剂选自溶剂、稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、助悬剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂或抗氧化剂中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，所述药物组合物配制为散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、乳剂、混悬剂或酊剂中的任意一种剂型。

虎杖苷能够通过提高小鼠免疫抑制模型的体重和免疫脏器指数，改善肝脏、脾脏和胸腺的病理损伤程度，提高血清中IgG、IgM和IFN-γ的表达水平，增加脾脏组织中IL-2和IL-4和脾细胞中CD4

当然，实施本申请的任一产品或方法并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施例。

图1A显示了虎杖苷在给药期间对免疫抑制小鼠的体重变化的影响；

图1B显示了虎杖苷在给药后第11天对免疫抑制小鼠的体重变化的影响；

图1C显示了虎杖苷对免疫抑制小鼠胸腺指数的影响；

图2显示了虎杖苷对免疫抑制小鼠肝脏、脾脏、胸腺组织病理结构的影响；

图3A显示了虎杖苷对免疫抑制小鼠血清中IgG含量的影响；

图3B显示了虎杖苷对免疫抑制小鼠血清中IgM含量的影响；

图3C显示了虎杖苷对免疫抑制小鼠血清中IFN-γ含量的影响；

图4A显示了虎杖苷对免疫抑制小鼠脾脏组织中IL-2细胞因子的影响；

图4B显示了虎杖苷对免疫抑制小鼠脾脏组织中IL-4细胞因子的影响；

图5显示了虎杖苷对免疫抑制小鼠脾细胞增殖情况的影响；

图6A为虎杖苷对免疫抑制小鼠T淋巴细胞亚群CD4

图6B显示了虎杖苷对免疫抑制小鼠T淋巴细胞亚群CD4

图6C显示了虎杖苷对免疫抑制小鼠T淋巴细胞亚群CD8

图6D显示了虎杖苷对免疫抑制小鼠T淋巴细胞亚群CD4

图7显示了虎杖苷对小鼠脾细胞毒性的影响；

图8显示了虎杖苷对小鼠脾细胞增殖的影响；

图9A显示了用小鼠CD19

图9B显示了用小鼠CD3

图10A显示了虎杖苷对小鼠T细胞增殖的影响；

图10B显示了虎杖苷对小鼠B细胞增殖的影响。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员基于本申请所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

本申请第一方面提供了虎杖苷在制备预防和/或治疗免疫抑制性疾病的药物中的用途。

本申请的发明人通过深入研究，发现虎杖苷能够通过提高小鼠免疫抑制模型的体重和免疫脏器指数，改善肝脏、脾脏和胸腺的病理损伤程度，提高血清中IgG、IgM和IFN-γ的表达水平，增加脾脏组织中IL-2和IL-4和脾细胞中CD4

本申请中，术语“治疗”具有其一般含义，并且在本申请中特别地是指对已经罹患免疫抑制性疾病的哺乳动物个体(优选为人)采用本申请的药物进行处理，以期望对所述疾病产生治疗、治愈、缓解、减轻等作用。类似地，如本申请使用的术语“预防”具有其一般含义，并且在本申请中特别地是指对可能罹患免疫抑制性疾病或者对免疫抑制性疾病具有罹患风险的哺乳动物个体采用本申请的药物进行处理，以期望对所述疾病产生防止、预防、阻止、隔断等作用。

在本申请的一些实施方式中，所述免疫抑制性疾病包括感染性疾病、结缔组织病、血液系统疾病、癌症或皮肤病伴随的免疫系统抑制状态中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，所述感染性疾病包括新型冠状病毒感染、上呼吸道感染、消化道感染或泌尿系统感染中的至少一种；所述结缔组织病包括类风湿性关节炎、结核病、皮肌炎、系统性红斑狼疮或干燥综合征中的至少一种；所述血液系统疾病包括艾滋病或传染性单核细胞增多症中的至少一种；所述癌症包括肝癌、大肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、白血病或淋巴瘤中的至少一种。

在本申请中的虎杖苷主要应用于免疫力低下的人群，例如老年人、儿童或重病患者；其可应用于预防和/或治疗免疫抑制性疾病，所述免疫抑制性疾病包括但不限于上述提到的疾病种类。

本申请第二方面提供了一种用于制备预防和/或治疗免疫抑制性疾病的药物组合物，其包括虎杖苷。

在本申请的一些实施方式中，所述虎杖苷是以单体的形式提供，或以包含其的植物提取物的形式提供。

在本申请的一些实施方式中，所述植物提取物选自虎杖提取物。

本申请对虎杖提取物的提取方式没有特别限制，本领域技术人员可以通过现有技术提取，例如，可以按照料液质量体积比为1g:6-10mL将虎杖用60-80vol％甲醇水溶液或乙醇水溶液进行回流提取，提取时间为3-5小时，提取温度为常温，提取次数为2-3次，得到包含虎杖苷的虎杖提取物。

在一些实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。

在本申请中，“药学上可接受的”表示以通常用药剂量使用时没有实质的毒性作用，从而可被政府或与其相当的国际组织批准或者已被批准用于动物，更特别地用于人，或者被登录在药典上。

本申请药物组合物中可用的“药学上可接受的载体或赋形剂”可以是药物制剂领域中任何常规的载体，特定载体的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学上可接受的载体或赋形剂包括药学领域常规的溶剂、稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、助悬剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂和抗氧化剂等。必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。

如本申请使用的术语“药物组合物”具有其一般含义。此外，本申请的“药物组合物”还可以以保健品、功能性食品、食品、食品添加剂等形式存在或提供。可采用制药领域特别是制剂领域中的常规技术，通过药品生产中常用的提取分离纯化手段得到本申请的药物组合物的原料的有效成分，任选地与一种或更多种药学可接受的载体或赋形剂混合，然后形成所需的剂型，来制备本申请的药物组合物。根据本申请的药物组合物，其为可以适用于口服给药的药物制剂、适用于胃肠外注射(例如静脉注射、皮下注射)的药物制剂(例如溶液剂)、适用于表面给药的药物制剂(例如软膏剂、贴剂或乳膏剂)或适用于直肠给药的药物制剂(例如栓剂)等。用于口服施用的剂型可包括例如片剂、丸剂、滴丸剂、硬胶囊剂或软胶囊剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、酊剂、糖浆剂、散剂、粉剂、细粒剂、颗粒剂、小丸剂、酏剂等，并不限于此。除了活性成分外，这些制剂还可包含稀释剂(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和甘氨酸)、润滑剂(例如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其镁盐、钙盐和聚乙二醇)。片剂还可包含粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷。必要时，其还可包含药用添加剂，例如崩解剂(如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐)、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂等。片剂可根据常用的混合、造粒或包衣的方法制备。

本申请药物组合物以虎杖苷的药学可接受的剂量，即施用剂量，可以根据待治疗对象的年龄、性别和体重、待治疗的具体疾病或病理状态、疾病或病理状态的严重程度、施用途径和诊断者的判断而改变。考虑这些因素确定施用剂量在本领域技术人员的水平范围内。一般的剂量可以是25-300mg/kg/日，具体地40-60mg/kg/日。然而，本申请的范围不以任何方式受限于所述施用剂量。

以下结合具体实施例对本申请进行详细说明。

材料与方法

虎杖苷信息

虎杖苷(polydatin，CAS号：27208-80-6)购自成都埃法生物科技有限公司，结构式如下：

下述实施例中所用实验材料和方法，如无特别说明，均为常规材料和方法。

实验试剂

试验所用试剂见表1。

表1 实验试剂

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实验仪器

实验所用仪器见表2。

表2 实验仪器

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主要溶液配制

虎杖苷混悬液的配制：

用纯水溶解虎杖苷粉末，配制成5mg/mL浓度的虎杖苷混悬液，现配现用。

造模药环磷酰胺溶液的配制：

精密称取24mg环磷酰胺粉末，加入3mL的生理盐水配制成8mg/mL浓度的环磷酰胺溶液，现配现用，避光保存。

虎杖苷梯度溶液的配制：

用二甲基亚砜配制虎杖苷母液(160mM)，-20℃避光保存。使用时采用二甲基亚砜将160mM的虎杖苷母液依次梯度稀释为80mM、40mM、20mM、10mM的虎杖苷溶液。

实验动物

SPF级6-8周龄的雄性BALB/c小鼠，体重为22±2g，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证编号：SCXK(京)2019-0010。小鼠于温度20～26℃，湿度40％～70％的环境内饲养。所有实验程序均经天津中医药大学实验动物伦理委员会批准实施(批准号：TCM-LAEC2021128)。

小鼠免疫抑制模型的建立

将6-8周龄的30只雄性BALB/c小鼠随机分为3组，包括正常组、模型组、虎杖苷组(PD组)。正常组腹腔注射生理盐水(0.1mL/10g)，其余各组腹腔注射环磷酰胺溶液(80mg/kg，0.1mL/10g)，每天1次，连续3天；PD组于造模第一天开始灌胃给虎杖苷混悬液(50mg/kg，0.1mL/10g)，模型组灌胃等量纯水；PD组连续给药10天，每天给药1次，隔天记录小鼠体重。实验期间小鼠自由饮水饮食，在第11天处死小鼠前取血，处死后分离免疫脏器，用于后续观察及检测。

统计学方法

实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，使用Graphpad 8.0软件进行数据统计分析，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)评估多组间均值的差异，p<0.05时认为结果具有统计学差异显著性，当p<0.01认为结果有极显著差异。

实施例1 虎杖苷对免疫抑制小鼠体重及免疫脏器指数的影响

小鼠体重及免疫脏器指数是评估小鼠免疫功能的重要指标。正常组、模型组、PD组小鼠从第1天开始记录体重，每天1次，连续11天；在第11天分别处死正常组、模型组、PD组小鼠后，分离胸腺，称重，按照以下公式计算小鼠胸腺指数：

胸腺指数(％)＝胸腺重量/小鼠体重×100％。

正常组、模型组、PD组小鼠体重结果如图1A和1B所示，与正常组相比，模型组小鼠体重明显持续下降，PD给药后小鼠体重在第7天出现上升趋势，在第11天，与模型组小鼠相比，PD组小鼠体重显著升高(

实施例2 虎杖苷对免疫抑制小鼠肝脏、脾脏、胸腺组织病理结构的影响

为了进一步验证虎杖苷对免疫抑制小鼠的免疫调节作用，本实施例采用苏木精-伊红染色(HE染色)的方法对正常组、模型组和PD组小鼠脾脏、胸腺和肝脏组织进行染色，观察小鼠脾脏、胸腺和肝脏组织的变化。具体步骤如下：

(1)取小鼠脾脏、胸腺和肝脏组织，置于含有10vol％中性福尔马林的固定液中固定24小时以上；

(2)上述组织经固定后，分别用80vol％、90vol％、95vol％、95vol％、100vol％、100vol％的乙醇溶液脱水，各1小时，之后包埋在石蜡中，切成5μm厚的切片；

(3)将步骤(2)得到的组织切片用二甲苯I 5分钟-二甲苯II 5分钟处理进行脱石蜡，通过100vol％、100vol％、95vol％、85vol％、75vol％的乙醇溶液分别处理5分钟重新水化；

(4)将步骤(3)水化后的组织切片放入苏木精染液中6分钟，蒸馏水洗去浮色；

(5)将步骤(4)得到的组织切片用分化液分化3分钟，流水冲洗2次，每次2分钟；

(6)将步骤(5)得到的组织切片置于伊红染液中30秒，然后用蒸馏水洗2-3秒；

(7)将步骤(6)得到的组织切片依次放入75vol％、85vol％、95vol％乙醇溶液中处理2-3秒，在100vol％II乙醇和100vol％I乙醇中各处理1分钟，二甲苯II和二甲苯I各处理1分钟；中性树胶封片；

(8)显微镜镜检，图像采集分析。

结果如图2所示，正常组小鼠肝部组织中肝窦和肝板结构清晰，模型组小鼠肝窦和肝板排列紊乱，细胞间隙增大，PD组小鼠较模型组小鼠有明显改善；正常组小鼠脾脏红髓和白髓分界明显，没有出血现象，模型组小鼠脾脏红髓和白髓混杂萎缩，局部出血，PD组小鼠损伤较模型组明显减轻；正常组小鼠胸腺的皮质、髓质和胸腺小体的形态结构明显，模型组小鼠胸腺结构混乱，有出血现象，PD给药后有所改善。上述结果表明虎杖苷可以明显改善免疫抑制小鼠肝脏、脾脏和胸腺的病理损伤程度。

实施例3 虎杖苷对免疫抑制小鼠血清中免疫球蛋白和细胞因子含量的影响

小鼠摘眼球取血，收集于1.5mL EP管中室温静置30分钟，3500rpm离心10分钟，吸取上清转移至另一个1.5mL EP管中，-80℃保存。实验前将血清于室温中复融，用IgM检测试剂盒、IgG检测试剂盒和小鼠IFN-γELISA试剂盒分别检测血清中IgG、IgM和IFN-γ的含量，具体实验操作依据试剂盒说明进行，酶标仪于450nm处检测各指标吸光度值。

按照上述血清中免疫球蛋白和炎性因子含量的检测方法，检测了正常组、模型组和PD组小鼠外周血中IgG，IgM和IFN-γ的水平，结果如图3A-3C所示。

图3A-图3B结果显示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠血清中IgG和IgM的浓度明显降低(*P<0.05，**P<0.01)，而PD组小鼠血清中IgG和IgM的浓度升高。同样，如图3C所示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠血清中细胞因子IFN-γ的水平下降，PD组小鼠IFN-γ的含量增加。上述结果表明虎杖苷具有显著的免疫调节作用。

实施例4 对免疫抑制小鼠脾脏组织中细胞因子含量的影响

为了更直接验证虎杖苷对免疫抑制小鼠的免疫调节作用，采用脾脏组织中炎症因子mRNA水平的检测方法，从正常组、模型组和PD组小鼠脾脏组织中根据RNA提取试剂盒进行RNA提取，提取后的RNA经反转录成cDNA后检测IL-2、IL-4在小鼠脾脏组织中的含量变化，具体步骤如下：

(1)脾脏组织总RNA的提取及浓度测定：

将小鼠脾脏组织切成1×1mm

(2)RNA反转录合成cDNA：

取1.5μL样品总RNA检测RNA浓度后按照RNA反转录试剂盒将其合成cDNA，具体操作步骤如下：

a.按照表3配制20μL的反转录反应体系；

b.将其涡旋混匀并短暂离心10s后；样品于42℃孵育15分钟；

c.85℃孵育5s，使5×TransScript All-in-One No-RT Control和gDNA Remover失活；

d.插在冰上，使样品冷却后将样品放入-80℃保存备用。

反转录体系见表3。

表3 反转录体系

(3)实时定量RT-PCR

a.按照PCR试剂盒说明书指导，根据一定比例稀释目标基因的引物(如表4所示)，并将甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为内参，配制20μL的PCR反应体系(如表5所示)；配置完成后涡旋混匀并短暂离心，进行实时定量PCR实验；

b.反应循环条件为：95℃，10s；60℃，30s；72℃，30s，共循环40次进行扩增；添加熔解曲线：65℃到95℃之间；

c.使用美国Bio-Rad公司实时定量PCR仪中的分析软件调整基线和阈值后进行数据分析：每个样品每次反应的Ct值，减去内参基因的Ct值得到其ΔCt值，与对照组相比后，取2-ΔΔCt的数值进行统计即可。

RT-PCR引物序列见表4。

表4 RT-PCR引物序列

PCR反应体系见表5。

表5 PCR反应体系

结果如图4A-4B所示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠脾脏组织中IL-2、IL-4的mRNA水平下降(*p<0.05)；与模型组小鼠相比，PD给药后可上调小鼠脾脏组织中IL-2、IL-4的mRNA水平，但没有显著性。上述结果表明虎杖苷预防和/或治疗免疫抑制性疾病的作用与炎症反应关系密切。

实施例5 虎杖苷对免疫抑制小鼠脾细胞增殖情况的影响

将新鲜取出的脾脏用预冷的1×PBS缓冲液冲洗，用注射器的一端进行研磨后通过70目筛网获得均匀的脾细胞悬液。将脾细胞悬液转移至15mL离心管中，在1000rpm，4℃条件下离心8分钟，吸弃上清，加入红细胞裂解液裂解红细胞，冰上静置5分钟后，在1000rpm，4℃条件下离心8分钟，吸弃上清，加入1×PBS缓冲液洗涤，在1000rpm，4℃条件下离心8分钟，吸弃上清，得到脾细胞。将得到的脾细胞重悬于含20vol％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，得到细胞悬液。

取上述细胞悬液以5×10

采用上述检测方法，观察虎杖苷对正常组、模型组和PD组小鼠脾细胞增殖的作用，结果如图5所示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠脾细胞增殖能力下降；与模型组小鼠相比，PD组小鼠脾细胞增殖能力有所恢复。上述结果表明虎杖苷可以促进脾细胞增殖。

实施例6 虎杖苷对免疫抑制小鼠脾细胞中CD4

作为细胞免疫重要内容的T细胞及亚群的检测在一些疾病的免疫功能和预后判断以及指导治疗中有重要作用。T细胞按其分化抗原和免疫功能可分为CD4

将新鲜取出的脾脏用预冷的1×PBS缓冲液冲洗，用注射器的一端进行研磨后通过70目筛网获得均匀的脾细胞悬液。将脾细胞悬液转移至15mL离心管中，在1000rpm，4℃条件下离心8分钟，吸弃上清，加入红细胞裂解液裂解红细胞，冰上静置5分钟后，在1000rpm，4℃条件下离心8分钟，吸弃上清，加入1×PBS缓冲液洗涤，在1000rpm，4℃条件下离心8分钟，吸弃上清，得到脾细胞。将得到的脾细胞加入1×PBS缓冲液重悬后备用，得到细胞悬液。

取上述细胞悬液，并调整密度至1×10

采用上述检测方法，观察虎杖苷对正常组、模型组和PD组小鼠脾细胞中CD4

实施例7 虎杖苷对于脾细胞的毒性作用

取正常BABL/C雄性小鼠，获取脾细胞(步骤同实施例5中脾细胞的获取)，将细胞重悬于含20vol％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，得到细胞悬液。细胞悬液以5×10

采用上述检测方法，观察虎杖苷对小鼠脾细胞的毒性作用，结果如图7所示，虎杖苷对于脾细胞没有明显毒性作用。

实施例8 虎杖苷对脾细胞的增殖的影响

取正常BABL/C雄性小鼠，获取脾细胞(步骤同实施例5中脾细胞的获取)，将细胞重悬于含20vol％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，得到细胞悬液。细胞悬液以5×10

采用上述检测方法，观察虎杖苷对小鼠脾细胞的增殖作用，结果如图8所示，与空白对照组相比，PD能够增强小鼠脾细胞的增殖(**p<0.01)，并且有剂量依赖性。

实施例9 磁珠分选鉴定结果

小鼠CD3

(1)获取脾细胞(步骤同实施例5中脾细胞获取)，用ImunoSepTM Buffer(#604050)调整细胞浓度至10

(2)与分选试剂B混合孵育10分钟，再添加ImunoSepTM Buffer至2.5mL，并用1mLTip吹打3次混合均匀；

(3)将盛有细胞悬液的5mL流式管插入磁极中，使流式管底部通过磁极底部孔道，直至接触到工作台面。在室温条件下静置5分钟。保持流式管在磁极中，将磁极和流式管一同拿起，迅速管中液体倒掉。重复分选3次。用1mL ImunoSepTM Buffer冲洗流式管壁上的细胞至15mL离心管，即目的细胞悬液。

采用上述磁珠分选实验方法，观察小鼠B淋巴细胞亚群CD19

实施例10 虎杖苷对T细胞和B细胞增殖的影响

获取脾细胞(步骤同实施例5中脾细胞获取)，再通过实施例9中的磁珠分选实验方法得到B细胞或者T细胞，将B细胞或者T细胞重悬于含20vol％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，得到B细胞悬液或T细胞悬液。B细胞悬液或T细胞悬液以5×10

采用上述检测方法，将分选得到的小鼠T细胞或者B细胞用于检测虎杖苷对小鼠T细胞和B细胞的增殖作用，结果如图10A和图10B所示，与空白对照组相比，PD能够增强T细胞和B细胞的增殖(*p<0.05,**p<0.01)；与ConA组相比，PD能增强ConA组对T细胞的增殖作用(

本申请通过研究虎杖苷对小鼠免疫抑制模型的治疗作用，发现虎杖苷能够通过提高小鼠免疫抑制模型的体重和免疫脏器指数，改善肝脏、脾脏和胸腺的病理损伤程度，提高血清中IgG、IgM和IFN-γ的表达水平，增加脾脏组织中IL-2和IL-4和脾细胞中CD4

以上所述仅为本申请的较佳实施例，并非用于限定本申请的保护范围。凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本申请的保护范围内。