与甜瓜白粉病抗性相关基因CmVDAC及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程及分子生物学技术领域，具体涉及与甜瓜白粉病抗性相关基因

背景技术

甜瓜白粉病是世界性病害，严重影响产量和品质，抗病品种选育是解决这一问题的有效途径。但由于白粉菌生理小种多、小种分化速度快，使得抗性材料不能保证对白粉病的持久抗性，因此利用分子生物学技术开展甜瓜白粉病广谱抗性研究，鉴定提高白粉病抗性的基因，解析基因功能，对于创制优良抗病材料，对白粉病防治工作具有重要的意义。

VDAC是电压依赖性阴离子通道（voltage-dependent anion channel）蛋白，是一种由一个小的多基因家族编码的位于线粒体外膜的离子通道蛋白，依赖电压来调节其对阴阳离子的选择性。线粒体中的VDAC通道蛋白起着“开关”的作用，决定线粒体的命运方向：正常呼吸或抑制线粒体新陈代谢（后者引起细胞凋亡和细胞死亡）。VDAC是一种高度保守的蛋白，目前在所有经检测的真核生物物种中都存在。VDAC异构体在许多植物中被鉴定出来，如拟南芥、水稻、小麦和葡萄等。VDAC在植物的生长发育（生长、叶片和花粉发育）、生物或非生物胁迫（病害、低温、干旱、盐胁迫等）引起的细胞程序性死亡等都发挥重要的作用。VDAC在甜瓜上有关白粉病抗性的方面还未见报道，甜瓜VDAC基因功能的开发应用，将为创制和筛选甜瓜特色种质资源，改善甜瓜白粉病抗性，减少农药施用，保证舌尖上的安全提供帮助，具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了与甜瓜白粉病抗性相关基因

本发明包含甜瓜

本发明提供与甜瓜白粉病抗性相关基因，所述基因为

作为优选，所述

作为进一步优选，所述

本发明还提供上述的与甜瓜白粉病抗性相关基因在制备白粉病抗性甜瓜中的应用。

作为优选，所述应用为在甜瓜中过表达

本发明的有益效果为：目前甜瓜白粉病抗性基因大多为针对某一种生理小种，广谱性抗白粉病的基因较少，在甜瓜线粒体上和白粉病有关的基因很少有相关报道。本发明首次在甜瓜中发现

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为抗病材料野生甜瓜和感病材料厚皮甜瓜分别接种白粉病菌后

图2为VIGS介导的抗病材料野生甜瓜

图3为在拟南芥上过表达

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。

实施例1 甜瓜

通过GENE BANK中拟南芥的基因数据库，发现拟南芥中有四个

甜瓜的

ATGGGCAGTTCTCCAGCGCCATTTTCAGATATTGGCAAAAAGGCCAAAGACCTCTTAACCAAAGACTACAACTTCGATCACAAGTTTACCCTGTTGCTACCGAACTCCGATGGAATGGGACTAACTGCCACCGGTTTGAAGCGGGATCAAATTTTTATTGGTGATATCAGTACCCTGTACAAGAGTGGAAAGACAACCGTGGATGTGAAAGTTGATACGTATTCAAACGTTTCTACAAAAGTGACCGTGACTGATATTTTACCAACTACCAAGGCCACGCTTAGCTTCAGAGTACCTGATCACAAGTCGGGCAAGCTGGATGTTCAGTACTTCCACCCTCATGCAGCTATTGATTCGAGTATTGGTCTCCACCCCAGTCCACTTTTGGAATTTTCAGCTGCAATCGGTAGCAAGAATTTTAGTTTAGGTGGTGATGTGGGATTTGATACTACTTCTGCTTCATTCACAAAATACAATGCCGGAATCAGCTTGAATAAGTCAGACTTTTCTGCGGCTCTTATGCTAACTGACAAAGGACAGGCTCTGAAGGCATCTTATATTCATTCATTGGATCCTCTTAATGAGACTATGGTAGCGGCTGAAATGACTCACAAGTTCTCCACCTCTGAAAACTCCTTTACCATTGGAAGTTCTCATGTTCTGGATCCAGTTACGCTCATGAAAACACGATTCTCCGACAAAGGAAAAGCAGCTATGCTTTTCCAACGAGAGTGGAGGCCAAAATCTTTGGTGACTCTGTCAGCTGAGTATGACTCAAAAGCTATCGATTCATCTCCCAAGATAGGCCTTGCTATTGCTCTGAAGCCTTGA

甜瓜的

MGSSPAPFSDIGKKAKDLLTKDYNFDHKFTLLLPNSDGMGLTATGLKRDQIFIGDISTLYKSGKTTVDVKVDTYSNVSTKVTVTDILPTTKATLSFRVPDHKSGKLDVQYFHPHAAIDSSIGLHPSPLLEFSAAIGSKNFSLGGDVGFDTTSASFTKYNAGISLNKSDFSAALMLTDKGQALKASYIHSLDPLNETMVAAEMTHKFSTSENSFTIGSSHVLDPVTLMKTRFSDKGKAAMLFQREWRPKSLVTLSAEYDSKAIDSSPKIGLAIALKP

实施例2 甜瓜

选用抗白粉病菌的野生甜瓜（RM，以下简称“抗病材料野生甜瓜”）和易感白粉病菌的厚皮甜瓜（HM，以下简称“感病材料厚皮甜瓜”）为实验材料。

以浓度为10

参照文献[程鸿]的方法，以浓度为10

利用特定引物进行PCR扩增，并使用ACTIN2为内参，荧光定量检测使用abm®EvaGreen qPCR MasterMix-ROX试剂盒，具体为：冰上制备扩增混合液，扩增混合液由abm®EvaGreen qPCR MasterMix-ROX 10㎕、PCR Forward Primer（10μM）0.8㎕、PCR ReversePrimer（10μM）0.8㎕、cDNA模板1㎕，再加入RNase Free dH

引物序列为：

VDAC-F：AGGTGGTGATGTGGGATTTG；

VDAC-R：GAGCCTGTCCTTTGTCAGTTAG；

ACTIN2-F：CTACGAACTTCCTGATGGACAAG；

ACTIN2-R：CCAATGAGAGATGGCTGGAATAG。

结果如图1所示，接种白粉病前，抗病材料野生甜瓜（RM）的

图1为抗病材料野生甜瓜和感病材料厚皮甜瓜分别接种白粉病菌后的

实施例3 VIGS介导的

构建沉默表达载体pTRV2+gene，连接目的基因后转化感受态细胞，用注射法直接将含有表达载体的农杆菌液注射进抗白粉病菌的野生甜瓜（RM）叶片中，利用瞬时表达系统，沉默叶片中CmVDAC，从而观测严重缺失VDAC蛋白的叶片，对白粉病菌的抵抗能力变化。具体方法如下：

1 设计引物

引物序列为：

TRV2

TRV2

基因的扩增和胶回收

PCR反应液为：PrimesSTAR Max Premix 10㎕、Former primer 0.5㎕、Reverseprimer 0.5㎕、cDNA模板 1㎕，灭菌ddH

其中，PCR反应中使用的引物为步骤1中所述引物；cDNA模板为实施例2中抗白粉病菌的野生甜瓜叶片经提取和反转录得到的。

将PCR反应产物1%琼脂糖凝胶电泳并进行胶回收，在紫外灯下快速切取含有目标条带的凝胶，转移到2ml的离心管，按照胶回收试剂盒（百泰克胶回收试剂盒）说明操作进行胶回收。

线性化载体pTRV2+gene构建

载体pTRV2-K（上海鹿鸣生物）线性化：用EcoRI和BamHI双酶切质粒pTRV2-K，酶切后，琼脂糖凝胶电泳进行结果检测，切取载体大片段对应条带的凝胶，百泰克胶回收试剂盒回收酶切产物；双酶切反应体系为：2×Tango buffer 4㎕、EcoRⅠ 1㎕、BamHⅠ 2㎕、质粒1㎍、dH

目的片段与载体的连接

将步骤2的VDAC DNA 片段和步骤3的线性化载体以一定的摩尔比加到 EP 管中进行重组反应（目的片段与载体的摩尔比在3:1-10:1之间）；混匀后在 37℃放置20 min；立即进行转化，剩余连接液可保存在 4℃或-20℃待用。

转化感受态细胞

冰上融化一管 100㎕的DH5a感受态细胞，轻弹管壁使细胞重悬起来。加入10㎕步骤4的反应液到感受态细胞中，轻弹数下，置冰上孵育45 min；42℃水浴中热激90 s后快速放入冰上2 min；加入 500㎕的LB液体培养基，37℃孵育 60 min；5000 g离心1 min收集菌体，根据需要将一定量的菌体均匀的涂布在含Kana抗生素平板上，用灭菌的玻璃珠涂布，待菌液被琼脂吸收后，37℃倒置过夜；菌落PCR进行阳性单克隆鉴定，测序正确的即为TRV2+Gene质粒。

转化农杆菌Gv3101

利用 Plasmid Mini Kit I(OMEGA，货号:D6943-01)进行质粒提取。

提取测序正确的 TRV2+Gene质粒；质粒转化农杆菌：取出Gv3101感受态细胞，冰上融化；加入5-10㎕ TRV2+Gene质粒，轻微混匀，冰浴10 min；液氮速冻5min；37℃水浴5min、冰浴5min；加入800㎕无抗LB液体培养基，28℃摇3-4 h；4000 rpm离心1min，取适量菌涂布在含Kana+庆大的平板上(TRV2+VDAC抗性：Kana+庆大)，28℃倒置培养；待单菌落长出后，选3-6个单菌落做菌落PCR验证。

甜瓜苗子的种植

将抗白粉病的野生甜瓜种子泡水4h，然后在25-28℃的人工气候箱内催芽，3天后，播种在10 × 10cm的营养钵基质中。约半个月后，在第一片及以后的真叶上开展人工注射侵染液。

甜瓜叶片的侵染叶注射及白粉病菌的接种

用渗透缓冲液 10 mmol/L MES 和 MgCl

结果见图2，由图2可知：注射后，抗病材料的野生甜瓜株，VIGS介导的

结果说明：沉默表达

图2为VIGS介导的抗病材料野生甜瓜

实施例4

由于甜瓜材料的特殊性，遗传转化尚不成熟，直接转化甜瓜较为困难，而拟南芥为模式植物，遗传转化体系已基本完善，因此本发明利用模式植物拟南芥来开展

1 设计引物

引物序列为：

CAM

CAM+VDAC

2 CmVDAC

CmVDAC

线性化载体PART-CAM构建

载体 pART-CAM 的线性化：用XhoI 和 XbaI 双酶切质粒 pART-CAM，酶切后，琼脂糖凝胶电泳进行结果检测，切取载体大片段对应条带的凝胶，百泰克胶回收试剂盒回收酶切产物；双酶切反应体系为：2×Tango buffer 4㎕、Xhol 1㎕、Xbal 2㎕、质粒1㎍、dH

目的片段与载体的连接

目的片段与载体的连接的具体方法与实施例3步骤4中相同。

转化感受态细胞

转化感受态细胞的具体方法与实施例3步骤5的不同之处为：筛选培养基的抗生素为链霉素 (Str)，其余均与实施例3步骤5相同。

转化农杆菌Gv3101

转化农杆菌Gv3101的具体方法与实施例3步骤6的不同之处为：筛选培养基为CAM+VDAC抗性：壮观+庆大，其余均与实施例3步骤6相同。

模式植物拟南芥植株的种植

常规方法种植拟南芥，待长出两片真叶后，选择长势好的拟南芥进行单株移栽，覆膜保湿一天，拟南芥抽苔开花后，剪去主苔花序，以促进腋生花序生长。当植株花蕾较多时，剪去已结果荚进行下一步转基因试验。

花絮侵染法转化拟南芥

取出本实施例步骤6制备的含阳性重组质粒的农杆菌菌液，按1:100 的比例接种于5 mL的含有抗生素的LB液体培养基中，在 28℃ 150rpm条件下活化1~2d；按1:50的比例将活化的农杆菌菌液接种在250 mL的LB液体培养基中（含抗生素），28℃150rpm过夜培养；5000 rpm 离心 10 min，弃掉培养液，用 500 mL 5%的蔗糖溶液（含有终浓度为0.03%的silwet L-77）重悬菌体，配成转化液混匀后待用。

转化前将拟南芥浇透水，剪去果荚。将花序浸入转化液中，轻轻摇动，浸染1 min后移出，抖掉植株上多余的转化液，用保鲜膜将植株包好，侧放于托盘中，避光共培养24h，去膜后直立放置培养，约7d后再转化第二次；在培养室中继续培养拟南芥，收集全部成熟的种子，记作 T0 代，干燥后放4℃冰箱保存。

转基因拟南芥抗性筛选

取少量 T0代转基因拟南芥种子于1.5 mL离心管中，加入1 mL蒸馏水，浸泡5min收集种子。加入1mL，75 %乙醇，振荡洗涤45s，收集种子。加入1 mL无菌水，振荡洗涤2min，重复2次，收集种子。加入1mL 2% 84消毒液，消毒种子10min，收集种子。加入1 mL无菌水，振荡洗涤2min，收集种子，重复5次。种子播种于含有Kana抗生素的MS培养基中。选取生长健壮，叶片绿色的拟南芥移载至培养基质中，置于拟南芥培养箱培养。采取相同方法进行抗性筛选直至T3代植株全部为绿色抗性植株，获得转基因拟南芥纯合植株。

对转基因拟南芥和未转基因拟南芥分别接种白粉病菌，接种 7~10 d 后，观测白粉病菌对拟南芥叶片的感染情况。

结果见图3，由图3可知：转基因拟南芥的白粉病发病率为2.1%，对照未转基因拟南芥的白粉病发病率为77.3%。

结果表明：过表达

图3为过表达

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。